JPWO2019155790A1 - ランダムエステル交換リパーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[1]下記の酵素化学的性質を有するリパーゼ、
(1)作用:ランダムエステル交換反応を触媒する、
(2)分子量:N型糖鎖を含まない場合の分子量が約36 kDa(SDS-PAGEによる)、
(3)油脂中での温度安定性:60℃以下で安定(トリカプリリンとステアリン酸メチルを基質とし、カプリリン酸メチル生成量を指標とした評価による)、
(4)油脂中での反応性:40〜80℃で反応させた場合に、80℃で最も高い反応性を示す(カカオバターを基質とし、トリパルミチン生成量を指標とした評価による)。
[2]下記の酵素化学的性質を更に有する、[1]に記載のリパーゼ、
(5)pH安定性:pH3〜7の範囲で安定(30℃、1時間)、
(6)至適pH:6。
[3]N末端アミノ酸配列がVTDEPLENVPGILSHPTI(配列番号1)である、[1]又は[2]に記載のリパーゼ。
[4]カンジダ・パラルゴッサ由来である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載のリパーゼ。
[5]カンジダ・パラルゴッサがNBRC 0966株又はその変異株である、[4]に記載のリパーゼ。
[6]配列番号2に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有するリパーゼ。
[7]等価なアミノ酸配列が、配列番号2に示すアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列である、[6]に記載のリパーゼ。
[8][1]〜[7]のいずれか一項に記載のリパーゼを含む酵素剤。
[9][1]〜[7]のいずれか一項に記載のリパーゼを油脂に作用させるステップを含む、油脂のランダムエステル交換法。
[10]以下のステップ(1)及び(2)を含む、ランダムエステル交換用リパーゼの製造法:
(1)カンジダ・パラルゴッサを培養するステップ;
(2)培養後の培養液及び/又は菌体よりリパーゼを回収するステップ。
[11]カンジダ・パラルゴッサがNBRC 0966株である、[10]に記載の製造法。
[12][1]〜[7]のいずれか一項に記載のリパーゼを油脂に作用させるステップを含む、ランダムエステル交換油脂の製造方法。
[13]以下の(a)〜(c)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるリパーゼ遺伝子:
(a)配列番号2のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列をコードするDNA;
(b)配列番号4又は5の塩基配列からなるDNA;
(c)配列番号4又は5の塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つランダムエステル交換活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[14][13]に記載のリパーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
[15][14]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[16]以下のステップ(i)及び(ii)を含む、リパーゼの製造法:
(i)[15]に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ;
(ii)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。用語「単離された」は、天然の状態、即ち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用される。単離するという人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である、「単離された状態」となる。単離されたものは、天然物自体と明確且つ決定的に相違する。
本発明の第1の局面は、本発明者らが取得・同定に成功し、その有用性を見出した新規リパーゼに関する。本発明のリパーゼ(以下、「本酵素」ともいう)は、以下の酵素化学的性質を備えることを特徴とする。
(1)作用
本酵素はリパーゼであり、ランダムエステル交換反応を触媒する。ランダムエステル交換活性は、カカオバター(カカオ脂)を基質とした方法(後述の「ランダムエステル交換活性測定法」)で評価することができる。カカオバターはオレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等を構成脂肪酸として含み、主に2位にオレイン酸が結合したトリグリセリドを主成分とする。その為、パルミチン酸が1位、2位、3位の全てに結合しているトルパルミチン(PPP)はランダムエステル交換反応によってのみ生じる(1位又は3位のパルミチン酸を2位のオレイン酸と交換する必要があり、1位、3位特異的なリパーゼで反応をさせた場合は、2位にパルミチン酸が挿入されたトリグリセリドは生じない)。従って、トリパルミチン生成量を指標としてランダムエステル交換活性を評価することができる。後述のランダムエステル交換活性測定法にて評価した場合に、反応によってトリパルミチン(C48)の生成比が上昇していればランダムエステル交換反応を触媒すると言える。上昇の程度は特に限定されないが、好ましくはΔPPP(%)が0.01以上、より好ましくはΔPPP(%)が0.03以上、更に好ましくはΔPPP(%)が0.05以上であることが望ましい。
本酵素は天然型(カンジダ・パラルゴッサが産生する場合)では糖鎖を含み(即ち、糖タンパク質である)、N型糖鎖除去後の分子量、即ち、N型糖鎖を含まない場合の本酵素の分子量は約36 kDa(SDS-PAGEで測定した分子量)である。
油脂中での温度安定性は、トリカプリリンとステアリン酸メチルを基質とし、カプリリン酸メチル生成量を指標とした方法(詳細は後述する)によって評価することができる。本発明の酵素では、トリカプリリン中、1時間処理した場合、60℃以下であれば90%以上の活性を維持する。このように優れた温度安定性を示す本酵素は、比較的高温での処理が必要な食品用途(例えば融点の高い油脂の加工など)に適する。
油脂中での反応性は、カカオバターを基質とし、トリパルミチン生成量を指標とした方法(詳細は後述する)によって評価することができる。本酵素の油脂中において40〜80℃で反応させた場合に、80℃で最も高い反応性を示す。このように高温での反応性が高いことは、比較的高温での処理が必要な食品用途(例えば融点の高い油脂の加工など)に適する。
(5)pH安定性
本酵素はpH3〜7で安定した活性を示す。例えば、処理に供する酵素溶液のpHが3〜7の範囲内にあれば、30℃、1時間の処理後、最大活性の80%以上の活性を示す。尚、pH安定性は、例えば、pH2〜3のpH域ではグリシン-塩酸緩衝液中、pH3〜6のpH域ではクエン酸緩衝液中、pH6〜8のpH域ではリン酸緩衝液中、pH8〜9のpH域ではTris-塩酸緩衝液中、pH9〜11のpH域では炭酸ナトリウム緩衝液中で測定した結果を基に判断される。
本酵素の至適pHは6である。至適pHは、例えば、ブリトンロビンソン緩衝液(pH2〜9)中で測定した結果を基に判断される。
本酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分(本酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。有効成分である本酵素の精製度は特に問わない。即ち、粗酵素であっても精製酵素であってもよい。賦形剤としては乳糖、ソルビトール、D-マンニトール、マルトデキストリン、白糖等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
本発明の第2の局面は本酵素に関連する核酸を提供する。即ち、本酵素をコードする遺伝子、本酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、本酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
本発明の更なる局面は本酵素の製造法を提供する。本発明の製造法の第1態様では、本酵素を産生する微生物を培養するステップ(ステップ(1))と培養後の培養液及び/又は菌体よりリパーゼを回収するステップ(ステップ(2))を行う。本酵素を産生する微生物はカンジダ・パラルゴッサであり、好ましくは、カンジダ・パラルゴッサNBRC 0966株又はその変異株である。変異株は、紫外線、X線、γ線などの照射、亜硝酸、ヒドロキルアミン、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどによる処理等によって得ることができる。変異株は、本酵素を産生する限り限定されない。変異株として、本酵素の生産性が向上した株、夾雑物の生産性が低減した株、培養が容易になった株、培養液からの回収が容易になった株などが挙げられる。
本発明の更なる局面は本酵素の用途に関し、本酵素を用いた油脂のランダムエステル交換法を提供する。本発明のランダムエステル交換法では本酵素を触媒として用いる。換言すれば、本発明では本酵素を油脂に作用させるステップを行い、当該ステップによって油脂のランダムエステル交換、即ち、油脂中のトリアシルグリセロール(TG又はTAGと略称される)の構成脂肪酸を再編成(再配列)させる。
特に記載がない限り、リパーゼ活性(加水分解活性)の測定はリパーゼキットS(DSファーマ製)を使用し、キット添付のマニュアルに従い行った。但し、緩衝液にはpH7に調整した付属緩衝液を使用し、反応停止液にはアセトンを使用した。以下計算式によってリパーゼ活性を算出した。
U/mL=(A412 sample−A412 blank)×1/0.05 × n
(但し、A412 sampleはサンプルの412nmの吸光度、A412 blankはブランクの412nmの吸光度、0.05はサンプル添加量(mL)、nは希釈倍率)
以下の緩衝液、即ち、1M グリシン-塩酸緩衝液(pH2,3)、1M クエン酸緩衝液(pH3,4,5,6)、1M リン酸緩衝液(pH6,7,8)、1M Tris-塩酸緩衝液(pH8,9)、1M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,10,11)を使用した。酵素溶液を等量の各緩衝液と混合し、30℃にて1時間処理した。処理後のサンプルを用い、以下の方法でリパーゼ活性を測定した。まず、0.5M PIPES溶液(pH7) 0.45mLにリパーゼキットS発色原液0.05mLとリパーゼキットS基質液0.05mLを添加し、30℃で5分間加温した。次に、酵素溶液を0.025mL添加し、正確に15分間反応させた後、1mLのエタノールを添加して反応を停止させた。遠心処理して上清を回収し、吸光度(412nm)を測定した。上記の計算式を用い、リパーゼ活性を算出した。
緩衝液として20mMブリトンロビンソン緩衝液(pH 2,3,4,5,6,7,8,9)を使用した。各緩衝液0.45mLにリパーゼキットS発色原液0.05mLとリパーゼキットS基質液0.05mLを添加し、30℃で5分間加温した。酵素溶液を0.025mL添加し、正確に15分間反応させた後、1mLのリパーゼキットS反応停止液を添加して反応を停止させた。1mLの1M Tris-HCl(pH9)を添加後、直ぐに吸光度(412nm)を測定した。上記の計算式を用い、リパーゼ活性を算出した。
酵素溶液を凍結乾燥させ、酵素1U(リパーゼ活性)あたり1mLのカカオバター(大東カカオ製)と2μLの超純水を添加し、60℃で撹拌しながら反応させた。各測定時間で反応液をサンプリングし、10μLを1mLのヘキサンに溶解させ、ガスクロマトグラフィー用サンプルとした。ガスクロマトグラフィー分析(カラム:DB-1HT(J&W社, 5 m×0.25 mm, df 0.1μm)、温度条件:120℃、4分間保持後、20℃/分の速度で150℃まで昇温、さらに30℃/分の速度で315℃まで昇温後3分間保持、その後1.5℃/分の速度で325℃まで昇温、さらに30℃/分の速度で370℃まで昇温後2分間保持、検出器:FID、キャリアーガス:ヘリウム)により、トリグリセリド分子種中のトリパルミチン(C48)(PPP)の組成比を算出し、C48の生成比の上昇、即ち、「(反応油脂のトリグリセリド画分中のPPPの組成比)−(基質油脂のトリグリセリド画分中のPPPの組成比)」(ΔPPP(%))を指標として、各酵素のランダムエステル交換能を評価した。
(1)温度安定性の評価
凍結乾燥した1U相当の酵素粉末に、トリカプリリン(和光純薬工業(株)製)0.5mLを添加し、よく懸濁した。各温度で1時間熱処理を実施した。各液を60℃で10分間プレインキュベーションした後、60℃で予熱しておいたステアリン酸メチル(和光純薬工業(株)製)0.5mLを添加しよく懸濁し、60℃で酵素反応を2時間行った。反応後の溶液30μLを1mLのヘキサンに溶解させガスクロマトグラフィーのサンプルとした。
5U相当の酵素粉末(凍結乾燥体)をカカオバターに懸濁し、カカオバター1mLあたり2μLの精製水を添加し、反応を開始した。反応開始8時間後のトリパルミチン生成量を反応温度間で比較した。
ランダムエステル交換活性を示す菌を見出すべく、細菌、酵母、糸状菌、放線菌を含む約1500株をスクリーニングに供した。1次スクリーニングでは、大豆油0.5%を含む各プレートにて菌を生育させてハローを形成させ、その後55℃でさらにインキュベートし、ハローが拡大する株を耐熱性リパーゼ生産菌として選抜した。
500mL坂口フラスコに前培養培地100mLを入れて蒸気殺菌後カンジダ・パラルゴッサ(Candida pararugosa)NBRC 0966株を1白金耳接種し、27℃で4日間培養し、前培養液を得た。
<前培養培地>
Yeast extract. (ベクトン・ディッキンソン株式会社製) 0.3%
Malto extract. (ベクトン・ディッキンソン株式会社製) 0.3%
Bacto Peptone (ベクトン・ディッキンソン株式会社製) 0.5%
含水結晶ブドウ糖 1.0%
大豆サラダ油 0.5%
pH 6.2
<本培養培地>
Yeast extract. (ベクトン・ディッキンソン株式会社製) 0.9%
Malto extract. (ベクトン・ディッキンソン株式会社製) 0.9%
Peptone (ベクトン・ディッキンソン株式会社製) 1.5%
含水結晶ブドウ糖(サンエイ糖化製) 3.0%
大豆サラダ油(日清オイリオ) 1.5%
pH 6.2
(1)pH安定性と至適pH
粗酵素粉末を水に溶解し、酵素溶液とした。酵素溶液を用い、上記の測定法でpH安定性と至適pHを測定した。測定結果を図1(pH安定性)と図2(至適pH)に示す。pH3〜7で高い活性維持(30℃で1時間処理後80%以上残存)し、至適pHは6であった。
粗酵素粉末を用い、上記の評価法で油脂中での温度安定性と反応性を評価した。結果を図3(温度安定性)と図4(反応性)に示す。60℃まで安定であり(トリカプリリン中、1時間処理した場合、60℃以下であれば90%以上の活性を維持)、温度安定性に優れていた。また、油脂中において40〜80℃の範囲では80℃で最も高い反応性を示した。
粗酵素液を疎水クロマトグラフィー(Butyl-HP(GEヘルスケア製))に供した。カラムは20mMリン酸緩衝液 pH7.0で平衡化し、硫安(0.5→0M) 30CVのリニアグラジエントで溶出した。リパーゼ活性(加水分解活性)を指標に分画した。精製チャートを図5に示す。リパーゼ活性を含む複数の画分を確認できたため、これらの画分をSDS-PAGEに供した。一方、活性がピークとなる画分(活性メインピーク画分)についてはEndo-Hf(New England Biolabs製)で処理し(N型糖鎖の除去)、処理前後の分子量をSDS-PAGEで比較した。
精製画分(画分48〜52を回収し、濃縮脱塩したもの)を使用し、ランダムエステル交換活性を測定した。その結果、精製画分においてもトリパルミチン(PPP)の生成が確認でき(図7)、目的の酵素の精製に成功していることが示された。
C. pararugosa NBRC 0966株を、0.5% 大豆サラダ油を添加したYM培地(Yeast extract. (Bacto) 0.9%、Malto extract. (Bacto) 0.9%、Peptone (Bacto) 1.5%、含水結晶ブドウ糖3.0%、大豆サラダ油1.5%)(pH6.2)にて1日間培養し、菌体を遠心分離で回収した。回収した菌体はTE緩衝液(pH8.0)を用いて、十分に洗浄した。獲得した菌体は、液体窒素下で、乳鉢と乳棒を用いてすり潰した。RNAiso Plus(タカラバイオ製)を使用し、すり潰した菌体から、添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。続いて、OligotexTM -dT30<Super> mRNA Purification Kit(タカラバイオ製)を使用し、抽出したRNAから、添付のプロトコールに従ってmRNAを調製した。
Pichia発現系を利用し、得られたcDNAが目的酵素の遺伝子であることを確認した。cDNA配列(配列番号5)の開始コドンから終始コドンまでをPCRで増幅し、pPick3.5k(サーモフィッシャーサイエンス製)のsnaBIサイトに常法に従ってクローニングし、発現ベクターpPick3.5k-RELを作成した。pPick3.5k-RELを制限酵素SalIで切断し、エタノール沈殿により直鎖状DNAを回収した。回収したDNAを用い、定法に従ってPichia pastris GS115(サーモフィッシャーサイエンス製)をエレクトロポレーションで形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体をBMGY培地(2%バクトペプトン、1%イーストエキストラクト、1%グリセリン、0.67%イーストニトロゲンベース(YNB(硫酸アンモニウムを含む、アミノ酸を含まない))、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、0.00004% D-ビオチン)で30℃、2日間培養し、得られた菌体をBMMY培地(2%バクトペプトン、1%イーストエキストラクト、0.5%メタノール、0.67%イーストニトロゲンベース(YNB(硫酸アンモニウムを含む、アミノ酸を含まない))、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、0.00004% D-ビオチン)に懸濁し、メタノールを適宜添加しながら30℃、3日間培養した。遠心分離により上清を回収し、粗酵素液を得た。得られた粗酵素液のリパーゼ活性を前記方法に従い確認した。
得られた粗酵素液を用いて、ランダムエステル交換活性を前記方法に従い確認した。その結果を図8に示す。トリパルミチン(PPP)の生成が認められ(図8)、配列番号5の配列が目的酵素(ランダムエステル交換活性を示すリパーゼ)の遺伝子(cDNA)であることが確認された。配列番号5の配列がコードする目的酵素のアミノ酸配列を配列番号3に示す。配列番号5の配列の5'末端側63塩基はシグナル配列であり、シグナル配列を除いた配列(配列番号4)が成熟体酵素(シグナルペプチドを含まない)のアミノ酸配列(配列番号2)をコードする。
Claims (16)
- 下記の酵素化学的性質を有するリパーゼ、
(1)作用:ランダムエステル交換反応を触媒する、
(2)分子量:N型糖鎖を含まない場合の分子量が約36 kDa(SDS-PAGEによる)、
(3)油脂中での温度安定性:60℃以下で安定(トリカプリリンとステアリン酸メチルを基質とし、カプリリン酸メチル生成量を指標とした評価による)、
(4)油脂中での反応性:40〜80℃で反応させた場合に、80℃で最も高い反応性を示す(カカオバターを基質とし、トリパルミチン生成量を指標とした評価による)。 - 下記の酵素化学的性質を更に有する、請求項1に記載のリパーゼ、
(5)pH安定性:pH3〜7の範囲で安定(30℃、1時間)、
(6)至適pH:6。 - N末端アミノ酸配列がVTDEPLENVPGILSHPTI(配列番号1)である、請求項1又は2に記載のリパーゼ。
- カンジダ・パラルゴッサ由来である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のリパーゼ。
- カンジダ・パラルゴッサがNBRC 0966株又はその変異株である、請求項4に記載のリパーゼ。
- 配列番号2に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列を有するリパーゼ。
- 等価なアミノ酸配列が、配列番号2に示すアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列である、請求項6に記載のリパーゼ。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のリパーゼを含む酵素剤。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のリパーゼを油脂に作用させるステップを含む、油脂のランダムエステル交換法。
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、ランダムエステル交換用リパーゼの製造法:
(1) カンジダ・パラルゴッサを培養するステップ;
(2)培養後の培養液及び/又は菌体よりリパーゼを回収するステップ。 - カンジダ・パラルゴッサがNBRC 0966株である、請求項10に記載の製造法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のリパーゼを油脂に作用させるステップを含む、ランダムエステル交換油脂の製造方法。
- 以下の(a)〜(c)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるリパーゼ遺伝子:
(a)配列番号2のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列をコードするDNA;
(b)配列番号4又は5の塩基配列からなるDNA;
(c)配列番号4又は5の塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つランダムエステル交換活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項13に記載のリパーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項14に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 以下のステップ(i)及び(ii)を含む、リパーゼの製造法:
(i)請求項15に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ;
(ii)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01501120A (ja) * | 1986-10-17 | 1989-04-20 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 位置非特異性リパーゼ |
JPH0292281A (ja) * | 1988-09-28 | 1990-04-03 | Showa Denko Kk | 新規リパーゼ及びその製造方法 |
JPH0866186A (ja) * | 1994-08-30 | 1996-03-12 | D H Ee Kodo Seisei Chushutsu Gijutsu Kenkyu Kumiai | 新規リパーゼおよびその製造法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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JPH01501120A (ja) * | 1986-10-17 | 1989-04-20 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 位置非特異性リパーゼ |
JPH0292281A (ja) * | 1988-09-28 | 1990-04-03 | Showa Denko Kk | 新規リパーゼ及びその製造方法 |
JPH0866186A (ja) * | 1994-08-30 | 1996-03-12 | D H Ee Kodo Seisei Chushutsu Gijutsu Kenkyu Kumiai | 新規リパーゼおよびその製造法 |
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