JP2023500781A - カンナビノイド類の生成のための操作された微生物 - Google Patents

カンナビノイド類の生成のための操作された微生物 Download PDF

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Abstract

カンナビノイドの生成のための、遺伝子操作された微生物が記載される。遺伝子操作された微生物は、少なくとも１種のカンナビノイド生合成経路の酵素をコードする少なくとも１種の核酸分子を含む。本開示は、遺伝子操作された微生物を使用してカンナビノイドを生成するための方法にも関する。【選択図】 図１

Description

[0002]本開示は、カンナビノイド類の生成のための遺伝子操作された微生物及びそれを含む細胞培養物に関する。遺伝子操作された微生物は、カンナビノイド生合成経路の生成物を生成するための、カンナビノイド生合成経路の酵素をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む。
[0003]有益な各種の植物天然生成物（ＰＮＰｓ）の商品化は、多くの場合、ＰＮＰ生成植物の入手可能性、植物中のＰＮＰｓの低蓄積及び／又は時間がかかり多くの場合非効率的な抽出方法であって常に経済的に実行可能とは限らない抽出方法によって制限される。このように、商業的に興味深いＰＮＰｓの商品化は多くの場合困難を伴う。遺伝子工学及び合成生物学における最近の進歩は、微生物、例えば細菌、酵母及び微細藻類中で異種のＰＮＰｓを生成することを可能にする。例えば、操作された微生物が、抗マラリア薬アルテミシニン及びオピエート（モルヒネ、コデイン）鎮痛剤前駆体のレチクリンを生成すると報告されている（Ｋｅａｓｌｉｎｇ ２０１２；Ｆｏｓｓａｔｉら ２０１４；ＤｅＬｏａｃｈｅら ２０１５）。しかし、遺伝子改変された酵母が生成するレチクリンにおける有益な最終生成物、例えばコデイン及びモルヒネを得るための最後の代謝反応にはまだ成功していない。細菌又は酵母のプラットフォームが、複雑なＰＮＰ経路のアセンブリをサポートしていない場合もある。比較して、微細藻類の細胞は他の微生物よりも有利な点を持つことが示唆されており、それには、植物と類似するタンパク質翻訳後修飾が行われる可能性及び核ゲノム、ミトコンドリアゲノム又は葉緑体ゲノムを介した組換えタンパク質発現が行われる可能性が含まれる（Ｓｉｎｇｈら ２００９）。
[0004]Δ９－テトラヒドロカンナビノール及び他のカンナビノイド類（ＣＢｓ）は、大麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）の向精神特性及び薬効特性に関与するポリケチドである。１１０超のＣＢｓがこれまでに同定されており、それらはすべて脂肪酸及びテルペノイド前駆体に由来する（ＥｌＳｏｈｌｙ及びＳｌａｄｅ ２００５）。大麻のＣＢ生合成経路における最初の代謝物中間体は、カンナビノイド類のポリケチド骨格を形成するオリベトール酸である。ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ；テトラケチドシンターゼ（ｔｅｔｒａｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＴＫＳ）又はオリベトールシンターゼとしても知られる）酵素は、多段階反応において、ヘキサノイル－ＣｏＡを３つのマロニル－ＣｏＡと縮合させてトリオキソドデカノイル－ＣｏＡを形成する。そこからオリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）（ＯＡＣ；３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡ ＣｏＡリアーゼとしても知られる）が分子内アルドール縮合を触媒してＯＡを産する。次のステップでは、ＯＡ骨格への「装飾（ｄｅｃｏｒａｔｉｎｇ）」酵素の連続した作用により、ＣＢの多様化が生じる。ＰＫＳ及びＯＡＣの遺伝子配列が同定され、インビトロで特徴づけられた（Ｌｕｓｓｉｅｒ ２０１２；Ｇａｇｎｅら ２０１２；Ｍａｒｋｓら ２００９；Ｓｔｏｕｔら ２０１２；Ｔａｕｒａら ２００９）。
[0005]本開示は、植物の天然生成物、例えばカンナビノイドの生成のための操作された微生物、例えば微細藻類又はシアノバクテリアについて記載する。
[0006]本明細書に記載の遺伝子操作された微生物の一実施形態では、遺伝子操作された微生物は芳香族プレニルトランスフェラーゼをコードする外来性の核酸分子を含まない。
[0007]本開示は、本明細書に記載の遺伝子操作された微生物及び実質的に糖を含まない培地を含む細胞培養物も提供する。
[0008]本開示は、遺伝子操作された微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物にテトラケチドシンターゼ及びオリベトール酸シクラーゼをコードする少なくとも１種の核酸分子を導入するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法も提供する。
[0009]本開示は、遺伝子操作された微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物にＳｔｅｅｌｙ１、Ｓｔｅｅｌｙ２又はそのバリアントをコードする少なくとも１種の核酸分子を導入するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法も提供する。
[0010]本開示は、野生型の微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物を２，４－ジヒドロキシ－６－アルキル安息香酸又は２，４－ジヒドロキシ－６－アルキル安息香酸エステルを含む培地中で培養するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法も提供する。
[0011]本開示の他の特徴及び利点が、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかし、本開示の趣旨及び範囲内の種々の変更及び改変がこの詳細な記載から当業者には明らかとなるため、詳細な記載及び具体例は本開示の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示の手段としてのみ与えられていることを理解すべきである。
[0012]ここで本開示を図面に関連させて記載する：
大麻由来の酵素に基づく例示的なカンナビノイド生合成経路を示す図である。 オリベトール酸の生成で終わる、大麻のカンナビノイド生合成経路の一部を示す図である。 形質転換された細胞中のカンナビノイド類を検出するためのＨＰＬＣ法における、時間に対する移動相中の濃度を示す図である。 野生型のＰ．トリコルヌタム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）抽出液で作製した溶媒中に、０、５、１０、２５、５０、７５及び１００ｐｐｍの濃度のカンナビノイドを希釈することによって決定した、（Ａ）ＴＨＣ、（Ｂ）ＣＢＤ及び（Ｃ）ＣＢＮの標準曲線を示す図である。各曲線について、赤線はピークの高さから計算した標準曲線を表し、青線は各濃度でのピークの面積から計算した標準曲線を表す。 野生型のＰ．トリコルヌタム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）抽出液で作製した溶媒中に、０、５、１０、２５、５０、７５及び１００ｐｐｍの濃度のカンナビノイドを希釈することによって決定した、（Ａ）ＴＨＣ、（Ｂ）ＣＢＤ及び（Ｃ）ＣＢＮの標準曲線を示す図である。各曲線について、赤線はピークの高さから計算した標準曲線を表し、青線は各濃度でのピークの面積から計算した標準曲線を表す。 野生型のＰ．トリコルヌタム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）抽出液で作製した溶媒中に、０、５、１０、２５、５０、７５及び１００ｐｐｍの濃度のカンナビノイドを希釈することによって決定した、（Ａ）ＴＨＣ、（Ｂ）ＣＢＤ及び（Ｃ）ＣＢＮの標準曲線を示す図である。各曲線について、赤線はピークの高さから計算した標準曲線を表し、青線は各濃度でのピークの面積から計算した標準曲線を表す。 コンストラクト（Ａ）Ｐｔｒｅｆ１、（Ｂ）Ｐｔｒｅｆ２、（Ｃ）Ｐｔｒｅｆ３、（Ｄ）Ｐｔｒｅｆ７で形質転換されたＰ．トリコルヌタム中のカンナビノイド類の検出のための、ＨＰＬＣクロマトグラム（２８０ｎｍ）を示す図である。（Ｅ）野生型Ｐ．トリコルヌタム対照のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。カンナビノイド類の真正標準物質の保持時間（Ｒｔ）は、ＴＨＣ、１７．８～１８．４分；ＣＢＤ １５．０９～１５．４分；及びＣＢＮ；１７～１７．５分である。 コンストラクト（Ａ）Ｐｔｒｅｆ１、（Ｂ）Ｐｔｒｅｆ２、（Ｃ）Ｐｔｒｅｆ３、（Ｄ）Ｐｔｒｅｆ７で形質転換されたＰ．トリコルヌタム中のカンナビノイド類の検出のための、ＨＰＬＣクロマトグラム（２８０ｎｍ）を示す図である。（Ｅ）野生型Ｐ．トリコルヌタム対照のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。カンナビノイド類の真正標準物質の保持時間（Ｒｔ）は、ＴＨＣ、１７．８～１８．４分；ＣＢＤ １５．０９～１５．４分；及びＣＢＮ；１７～１７．５分である。 コンストラクト（Ａ）Ｐｔｒｅｆ１、（Ｂ）Ｐｔｒｅｆ２、（Ｃ）Ｐｔｒｅｆ３、（Ｄ）Ｐｔｒｅｆ７で形質転換されたＰ．トリコルヌタム中のカンナビノイド類の検出のための、ＨＰＬＣクロマトグラム（２８０ｎｍ）を示す図である。（Ｅ）野生型Ｐ．トリコルヌタム対照のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。カンナビノイド類の真正標準物質の保持時間（Ｒｔ）は、ＴＨＣ、１７．８～１８．４分；ＣＢＤ １５．０９～１５．４分；及びＣＢＮ；１７～１７．５分である。 コンストラクト（Ａ）Ｐｔｒｅｆ１、（Ｂ）Ｐｔｒｅｆ２、（Ｃ）Ｐｔｒｅｆ３、（Ｄ）Ｐｔｒｅｆ７で形質転換されたＰ．トリコルヌタム中のカンナビノイド類の検出のための、ＨＰＬＣクロマトグラム（２８０ｎｍ）を示す図である。（Ｅ）野生型Ｐ．トリコルヌタム対照のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。カンナビノイド類の真正標準物質の保持時間（Ｒｔ）は、ＴＨＣ、１７．８～１８．４分；ＣＢＤ １５．０９～１５．４分；及びＣＢＮ；１７～１７．５分である。 コンストラクト（Ａ）Ｐｔｒｅｆ１、（Ｂ）Ｐｔｒｅｆ２、（Ｃ）Ｐｔｒｅｆ３、（Ｄ）Ｐｔｒｅｆ７で形質転換されたＰ．トリコルヌタム中のカンナビノイド類の検出のための、ＨＰＬＣクロマトグラム（２８０ｎｍ）を示す図である。（Ｅ）野生型Ｐ．トリコルヌタム対照のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。カンナビノイド類の真正標準物質の保持時間（Ｒｔ）は、ＴＨＣ、１７．８～１８．４分；ＣＢＤ １５．０９～１５．４分；及びＣＢＮ；１７～１７．５分である。 （Ａ）コンストラクトＧ１Ｃ１で形質転換されたコナミドリムシ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、及び（Ｂ）カンナビノイド標準物質を含む対照試料の、ＵＰＬＣクロマトグラム（２２０ｎｍ）を示す図である。 （Ａ）コンストラクトＧ１Ｃ１で形質転換されたコナミドリムシ（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、及び（Ｂ）カンナビノイド標準物質を含む対照試料の、ＵＰＬＣクロマトグラム（２２０ｎｍ）を示す図である。 コンストラクト（Ａ）Ｐｔｒｅｆ１、（Ｂ）Ｐｔｒｅｆ２、及び（Ｃ）野生型のＰ．トリコルヌタム対照で形質転換されたＰ．トリコルヌタム中のカンナビノイド類の検出のための、ＵＰＬＣクロマトグラム（２２０ｎｍ）を示す図である。 コンストラクト（Ａ）Ｐｔｒｅｆ１、（Ｂ）Ｐｔｒｅｆ２、及び（Ｃ）野生型のＰ．トリコルヌタム対照で形質転換されたＰ．トリコルヌタム中のカンナビノイド類の検出のための、ＵＰＬＣクロマトグラム（２２０ｎｍ）を示す図である。 コンストラクト（Ａ）Ｐｔｒｅｆ１、（Ｂ）Ｐｔｒｅｆ２、及び（Ｃ）野生型のＰ．トリコルヌタム対照で形質転換されたＰ．トリコルヌタム中のカンナビノイド類の検出のための、ＵＰＬＣクロマトグラム（２２０ｎｍ）を示す図である。
〔詳細な説明〕
[0020]本発明者らは、テトラケチドシンターゼ及びオリベトール酸シクラーゼをコードする外来性の核酸分子で形質転換された微細藻類、例えばフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）及びコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）が、その他の外来性のカンナビノイド生合成経路の酵素の非存在下でカンナビノイド類を生成したことを、意外なことに見出した。
[0021]理論に縛られることを望むものではないが、前駆体、例えば、オリベトール又はオリベトール酸の存在下でカンナビノイド類の生成を可能にする大麻中に見出される酵素（例えば芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）、テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）及び／又はカンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ））と類似する活性を有する酵素をコードする遺伝子を、微細藻類のゲノムは含有すると予想される。例えば、Ｐ．トリコルヌタム株ＣＣＡＰ １０５５／１（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ）のゲノムの探索により、活性部位（アミノ酸１０８～３８３、ＡＰＴ）を含有するＡＰＴの一領域に対する８１％のクエリーカバー（ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒ）に対して、３６％の共有同一性（ｓｈａｒｅｄ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する予測タンパク質（ＮＣＢＩ参照配列 ＸＰ ００２１８２０３３．１）が同定される。この予測タンパク質は、プレニル基転移が可能なホモゲンチジン酸ソラネシルトランスフェラーゼ酵素と配列同一性を共有し、ヒドロキシ安息香酸ポリプレニルトランスフェラーゼと配列同一性を共有し、大麻のＡＰＴに類似する保存されたマグネシウム結合部位を含有する。Ｐ．トリコルヌタム内のＡＰＴ活性の他の潜在的な候補としては、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ及び予測タンパク質（ＮＣＢＩ 参照配列：ＸＰ ００２１８０３９２．１）が挙げられる。さらに、Ｈ２Ｏ２を生成する酵素に対するＰ．トリコルヌタムのゲノムの探索により、ＣＢＤＡＳに類似する活性を有し得る、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ様タンパク質及びスペルミンオキシダーゼが同定される。
[0022]よって、本開示はカンナビノイドを生成することが可能な遺伝子操作された微生物を提供し、遺伝子操作された微生物は光合成微細藻類又はシアノバクテリアであり、遺伝子操作された微生物は芳香族プレニルトランスフェラーゼをコードする外来性の核酸分子を含まない。
[0023]本開示は、カンナビノイドの生成のための遺伝子操作された微生物及び実質的に糖を含まない培地を含む細胞培養物をさらに提供し、遺伝子操作された微生物は光合成微細藻類又はシアノバクテリアであり、遺伝子操作された微生物は芳香族プレニルトランスフェラーゼをコードする外来性の核酸分子を含まない。
[0024]本開示は、遺伝子操作された微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物にテトラケチドシンターゼ及びオリベトール酸シクラーゼをコードする少なくとも１種の核酸分子を導入するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法をさらに提供する。
[0025]本開示は、遺伝子操作された微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物にＳｔｅｅｌｙ１、Ｓｔｅｅｌｙ２又はそのバリアントをコードする少なくとも１種の核酸分子を導入するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法をさらに提供する。
[0026]本開示は、野生型の微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物を２，４－ジヒドロキシ－６－アルキル安息香酸又は２，４－ジヒドロキシ－６－アルキル安息香酸エステルを含む培地中で培養するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法をさらに提供する。
[0027]別段の指示のない限り、本項及び他項に記載の定義及び実施形態は、当業者によって理解されるように適切な、本明細書に記載の本開示のすべての実施形態及び態様に適用できるものとする。
[0028]本開示の範囲を理解する上で、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語及びその派生語は、本明細書で使用される場合、言明される特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を明示するが、他の言明されない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を除外しないオープンエンド型の用語であるものとする。前述は、類似の意味を有する語、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」及びそれらの派生語にも適用される。「成る」という用語及びその派生語は、本明細書で使用される場合、言明される特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在を明示するが、他の言明されない特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの存在は除外するクローズド型の用語であるものとする。「から本質的に成る」という用語は、本明細書で使用される場合、言明される特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップ、並びに特徴、要素、成分、群、整数及び／又はステップの基本的かつ新規な特質（複数可）に物質的に影響を及ぼさないものの存在を明示するものとする。
[0029]本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容上別段の明確な指示がない限り、複数への言及を含む。「さらなる」又は「第２の」成分を含む実施形態では、本明細書で使用される第２の成分は、他の成分又は第１の成分と異なる。「第３の」の成分は、他の、第１の、及び第２の成分と異なり、さらに挙げられる成分すなわち「さらなる」成分も、同様に異なる。
[0030]反対のいかなる指示もない場合、本明細書全体にわたり「％」含有量に対してなされる言及は、ｗ／ｖ（重量／体積）％を意味すると解釈される。
[0031]ここで使用される場合、「配列同一性」という用語は、２つの核酸（ポリヌクレオチド）配列又は２つのアミノ酸（ポリペプチド）配列の間の配列同一性のパーセンテージのことを指す。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するためには、最適な比較のために配列がアラインされる（例えば、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアライメントのために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列の配列中にギャップが導入され得る）。対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドが次いで比較される。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列の間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の重なる位置の数／位置の総数、に１００％を掛けたもの）である。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することもできる。２つの配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの１つの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）のアルゴリズムであり、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）のように改変されたものである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。本開示の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、例えばスコア＝１００、語長＝１２に設定されたＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムのパラメータを用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することができる。本開示のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、例えばスコア＝５０、語長＝３に設定されたＸＢＬＡＳＴプログラムのパラメータを用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施することができる。比較のためにギャップ付きのアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。或いは、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を実施するために使用することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔのプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータ）を使用することができる（例えばＮＣＢＩウェブサイトを参照のこと）。配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ（１９８８）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合には、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーを使用することができる。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許可するか許可しないかにかかわらず、上記のものに類似する技術を使用して決定することができる。パーセント同一性の計算では、典型的には、正確な一致のみが数えられる。特定の実施形態では、核酸は、特定の微細藻類又はシアノバクテリアの種におけるコドン使用のために最適化される。特に、カンナビノイド生合成経路の酵素をコードする核酸配列には、ＧＣリッチな微細藻類、例えばコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ソロキニアナ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ）、クロレラ・プロトセコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、テトラセルミス・チュイ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉ）、ナノクロロプシス・オクラテ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔｅ）、セネデスムス・オブリクース（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）、アクトデスムス・ディモルフス（Ａｃｕｔｏｄｅｓｍｕｓ ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）、ドナリエラ・テルチオレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）及びヘマトコッカス・プルシアリス（Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｕｓ ｐｌｕｃｉａｌｉｓ）；珪藻、例えばフェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）及びタラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）；又はシアノバクテリア、例えばアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）及びアファニゾメノン・フロス・アクア（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ ｆｌｏｓ－ａｑｕａｅ）のためにコドン最適化されたコドンが組み込まれている。
[0032]本開示の配列は、本明細書に記載の配列に対して少なくとも８０％同一であってもよい；別の例では、配列は、核酸又はアミノ酸レベルで、本明細書に記載の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であってもよい。重要なことだが、バリアント配列によってコードされるタンパク質は、参照配列によってコードされるタンパク質の活性及び特異性を保持する。よって、本開示は、配列番号４９～５２から選択された配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する、カンナビノイド生合成経路の酵素をコードする核酸配列を含む核酸分子も提供する。さらに、配列番号１～１１から選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する、カンナビノイド生合成経路の酵素のアミノ酸配列も提供する。
[0033]本明細書に記載の核酸及びアミノ酸配列を表１に提示する。
Figure 2023500781000002
Figure 2023500781000003

Figure 2023500781000004
[0034]本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」という用語及びその派生語は、遺伝物質が、分子生物学的手法、例えば、これらに制限されないが、分子クローニング、組換えＤＮＡ法、形質転換及び遺伝子導入を使用して変えられた微生物のことを指す。遺伝子操作された微生物には、生きている改変微生物、遺伝子改変微生物又はトランスジェニック微生物が含まれる。遺伝子変化には、遺伝物質の付加、欠失、修飾及び／又は変異が含まれる。本開示における、本明細書に記載のそのような遺伝子工学は、対応する野生型の微生物と比べて、植物の各種天然生成物、例えばカンナビノイド類の生成を増加させる。「カンナビノイド」という用語には、カンナビノイド受容体に作用するあらゆる化合物が含まれると一般的に理解される。カンナビノイド類の例には、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）、カンナビクロマノン（ＣＢＣＮ）、カンナビエルソイン（ＣＢＥ）、カンナビフラン（ＣＢＦ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビノジオール（ＣＢＤＬ）、カンナビシクロル（ＣＢＬ）、カンナビトリオール（ＣＢＴ）、カンナビバリン（ＣＢＶ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビクロメバリン（ＣＢＣＶ）、カンナビゲロバリン（ＣＢＧＶ）、カンナビゲロールモノメチルエーテル（ＣＢＧＭ）、カンナビネロール酸、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビノジオール（ＣＢＮＤ）、カンナビノールプロピルバリアント（ｃａｎｎａｂｉｎｏｌ ｐｒｏｐｙｌ ｖａｒｉａｎｔ）（ＣＢＮＶ）、カンナビトリオール（ＣＢＯ）、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、テトラヒドロカンナビバリン酸（ＴＨＣＶＡ）、カンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）、カンナビジバリン酸（ＣＢＤＶＡ）、カンナビクロメバリン酸（ＣＢＣＶＡ）及びそれらの誘導体が含まれる。カンナビノイド類のさらなる例が、ＰＣＴ特許出願国際公開第２０１７／１９０２４９号及び米国特許出願公開第２０１４／０２７１９４０号において述べられている。
[0035]カンナビノイドは酸型又は非酸型であってもよく、酸型を脱炭酸することによって非酸型を生じさせることができるため、非酸型は脱炭酸型とも称される。特定のカンナビノイドを参照する本開示の文脈の範囲内では、カンナビノイドは酸型若しくは非酸型、又は酸型と非酸型の両方の混合物であってもよい。
[0036]カンナビノイド生合成経路の生成物は、カンナビノイド類の生成と関連する生成物である。カンナビノイド生合成経路の生成物の例としては、ヘキサノイル－ＣｏＡ、ブチリル－ＣｏＡ、トリオキソドデカノイル－ＣｏＡ、トリオキソデカノイル－ＣｏＡ、オリベトール酸、オリベトール、ジバリノール酸（ｄｉｖａｒｉｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）及びジバリノール（ｄｉｖａｒｉｎｏｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、カンナビノイド生合成経路の生成物は、ヘキサノイル－ＣｏＡ、ブチリル－ＣｏＡ、トリオキソドデカノイル－ＣｏＡ、トリオキソデカノイル－ＣｏＡ、オリベトール酸、オリベトール、ジバリノール酸及びジバリノールのうちの、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つである。
[0037]一実施形態では、遺伝子操作された微生物は、対応する野生型の微生物と比べて、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つのカンナビノイド生合成経路の生成物の生成を増加させた。別の実施形態では、カンナビノイド生合成経路の生成物は、ヘキサノイル－ＣｏＡ、ブチリル－ＣｏＡ、トリオキソドデカノイル－ＣｏＡ、トリオキソデカノイル－ＣｏＡ、オリベトール酸、オリベトール、ジバリノール酸及びジバリノールのうちの、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つである。例えば、遺伝子操作された微生物は、対応する野生型の微生物と比べて、オリベトール酸の生成、又はオリベトール酸とカンナビゲロール酸の生成を増加させた可能性がある。別の例では、遺伝子操作された微生物は、対応する野生型の微生物と比べて、オリベトールの生成、又はオリベトールとカンナビゲロールの生成を増加させた可能性がある。
[0038]「核酸分子」という用語又はその派生語は、本明細書で使用される場合、修飾されていないＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡを含むものとする。例えば、本開示の核酸分子が、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混ざったＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域と二本鎖領域が混ざったＲＮＡから構成されていることが有用であり、ハイブリッド分子は、一本鎖、又はより典型的には二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡ、或いは一本鎖領域と二本鎖領域が混ざったＤＮＡ及びＲＮＡを含む。さらに、核酸分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成されていることが有用である。本開示の核酸分子はまた、安定性又は他の理由のために修飾された、１つ又は複数の修飾された塩基又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ骨格を含有してもよい。「修飾された」塩基には、例えば、トリチウム標識された塩基及び異常塩基、例えばイノシンが含まれる。種々の修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができ；それにより「核酸分子」は化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態を取り入れる。「ポリヌクレオチド」という用語は、対応する意味を有するものとする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物は、少なくとも１種の本明細書に記載の核酸分子を含む。
[0039]本明細書で使用される場合、「外来性の」という用語は、細胞に導入された要素のことを指す。外来性の要素には、タンパク質又は核酸が含まれ得る。外来性の核酸は、例えば形質転換の方法によって細胞に導入された核酸である。外来性の核酸は、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現をコードしていてもよい。外来性の核酸は、同じ種（相同の）、又は異なる種（異種の）から由来したものであってもよい。外来性の核酸は、自然界の細胞では通常見られない形態で細胞に導入されるように変えられた相同配列を含んでもよい。例えば、核酸の内在性のバージョンと比べて、相同である外来性の核酸は変異を含有してもよく、異なる制御領域に作動可能に連結されるか、又はゲノムの異なる領域に組み込まれてもよい。外来性の核酸は、１つ又は複数のコピーで形質転換された細胞の染色体に組み込まれ得るか、形質転換された細胞の色素体又はミトコンドリアのＤＮＡに組み込まれ得るか、又は形質転換された細胞のゲノムの外で独立した核酸として維持され得る。
[0040]本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオシド又はヌクレオチドのモノマーの配列のことを指し、ｃＤＮＡを含む。その用語は、天然に存在しないモノマー又はその一部を含めた、修飾又は置換配列も含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）又はリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含む天然に存在する塩基を含み得る。配列は、修飾塩基も含有してもよい。そのような修飾塩基の例としては、アザ及びデアザのアデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシル；並びにキサンチン及びヒポキサンチンが挙げられる。核酸は、二本鎖又は一本鎖のいずれかであり得、センス又はアンチセンス鎖に相当する。さらに、「核酸」という用語には、相補的な核酸配列が含まれる。
[0041]本明細書で提供される遺伝子操作された微生物によって生成されるカンナビノイド類は、カンナビノイド生合成経路に関連する１種又は複数の酵素の活性を増加させた結果である可能性がある。微生物内の酵素の活性の増加は、例えば、酵素をコードする核酸配列を含む核酸分子の導入を伴い得る。一実施形態では、酵素をコードする核酸配列を含む核酸分子の導入は、形質転換によって達成され得る。カンナビノイド生合成経路の酵素の例には、ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼ、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ（例えば、テトラケチドシンターゼ、Ｓｔｅｅｌｙ１及びＳｔｅｅｌｙ２）、オリベトール酸シクラーゼ、ゲラニルピロリン酸シンターゼ、芳香族プレニルトランスフェラーゼ（ＡＰＴ）、ゲラニルピロリン酸：オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ、カンナビクロメンシンターゼ、テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）及びカンナビジオール酸シンターゼ（ＣＢＤＡＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
[0042]図１は、大麻由来の酵素に基づく例示的なカンナビノイド生合成経路を示す：テトラケチドシンターゼ（ＴＫＳ）は、ヘキサノイル－ＣｏＡとマロニル－ＣｏＡを縮合させて中間体のトリオキソドデカノイル－ＣｏＡを形成する；オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）は、分子内アルドール縮合を触媒してオリベトール酸（ＯＡ）を産する；芳香族プレニルトランスフェラーゼはゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）をＯＡに転移させてカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を生成する；テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ又はカンナビジオール酸シンターゼは、それぞれ、ＣＢＧＡの酸化的環化を触媒してテトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）又はカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）にする。カルボキシル基を除くためのＴＨＣＡ又はＣＢＤＡの脱炭酸は、それぞれ、脱炭酸されたカンナビノイド類の、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）又はカンナビジオール（ＣＢＤ）を生成することになる。
[0043]図１に示される、大麻の例示的なカンナビノイド生合成経路に加えて、代替の生合成中間体を、遺伝子操作された微生物内のカンナビノイド生合成経路において使用することができる。例えば、オリベトールはオリベトール酸のカルボキシル基を欠く中間体である。カンナビノイド生合成経路において、オリベトール酸の代わりにオリベトールを使用することにより、カルボキシル基を同様に欠くカンナビノイド類、例えばカンナビゲロール（ＣＢＧ）、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）又はカンナビジオール（ＣＢＤ）が生成されることになる。別の例では、テトラケチドシンターゼ（ＴＫＳ）がブチリル－ＣｏＡとマロニル－ＣｏＡを縮合させて中間体のトリオキソデカノイル－ＣｏＡを形成し、オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）がトリオキソデカノイル－ＣｏＡの分子内アルドール縮合を触媒してジバリノール酸を産する。ジバリノール酸は、オリベトール酸で見られるｎ－ペンチル基の代わりにｎ－プロピル基を含有する中間体である。カンナビノイド生合成経路において、オリベトール酸の代わりにジバリノール酸を使用することにより、ｎ－プロピル基を同様に含有するカンナビノイド類、例えばカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）、テトラヒドロカンナビバリン酸（ＴＨＣＶＡ）、カンナビジバリン酸（ＣＢＤＶＡ）又はカンナビクロメバリン酸（ＣＢＣＶＡ）が生成されることになる。別の例では、ジバリノールはジバリノール酸のカルボキシル基を欠く中間体であり、オリベトールで見られるｎ－ペンチル基の代わりにｎ－プロピル基を含有する。カンナビノイド生合成経路において、ジバリノール酸の代わりにジバリノールを使用することにより、ｎ－プロピル基を同様に含有し、カルボキシル基を同様に欠くカンナビノイド類、例えばカンナビゲロバリン（ＣＢＧＶ）、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）、カンナビジバリン酸（ＣＢＤＶ）又はカンナビクロメバリン酸（ＣＢＣＶ）が生成されることになる。
[0044]図１に示される大麻の例示的なカンナビノイド生合成経路に加えて、代替の酵素を、遺子操作された微生物内のカンナビノイド生合成経路において使用することができる。例えば、大麻中に見出される酵素に加えて、カンナビノイド生合成経路の代替の酵素が、他の植物（例えば、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ））、細菌（例えば、ストレプトマイセス属）又は原生生物（例えば、キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ））中に見出され得る。構造は異なるが同じ機能を果たす酵素を、遺伝子操作された微生物内のカンナビノイド生合成経路において、互いに交換可能に使用することができる。例えば、大麻由来の芳香族プレニルトランスフェラーゼＣｓＰＴ１（配列番号３）及びＣｓＰＴ４（配列番号１０）、ホップ由来のＨｌＰＴ１（配列番号１１）及びストレプトマイセス属の種の株Ｃｌ１９０由来のＯｒｆ２（配列番号９）は、すべて、ＧＰＰ及びＯＡからのＣＢＧＡの合成を触媒する芳香族プレニルトランスフェラーゼである。さらなる実施例では、キイロタマホコリカビ由来のＳｔｅｅｌｙ１（配列番号７）若しくはＳｔｅｅｌｙ２（配列番号８）ポリケチドシンターゼ又はそのバリアントが、マロニル－ＣｏＡをオリベトールに縮合させるのに使用することができ、ＯＡＣの非存在下でオリベトールを生成するためにＴＫＳの代わりに使用してもよい。
[0045]本明細書で述べられる生物中に見出される野生型の酵素に加えて、これらの酵素の改変されたバリアントを、遺伝子操作された微生物内のカンナビノイド生合成経路において使用することができる。カンナビノイド生合成経路における使用のための酵素のバリアントは、例えば、ドメインの活性を増加／減少させるように、ドメインを追加／除去するように、シグナル伝達配列を追加／除去するように、又は酵素の活性若しくは特異性を別様に変えるように、前記酵素をコードする核酸配列を変えることによって生じさせることができる。例えば、非メチル化カンナビノイド類を生成するために、Ｓｔｅｅｌｙ１の配列を改変してメチルトランスフェラーゼドメインの活性を低下させることができる。参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／１４８８４９号に開示されているように、例として、これは、配列番号７に対してアミノ酸をＧ１５１６Ｄ＋Ｇ１５１８Ａ又はＧ１５１６Ｒに変異させることによって行うことができる。さらなる例では、テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ又はカンナビジオール酸シンターゼの配列を改変してＮ末端の分泌ペプチドを除去することができる。参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／２００８８８号に開示されているように、例として、これは、配列番号５又は６のアミノ酸１～２８を除去して短縮型酵素を生成することによって行うことができる。
[0046]アシル－ＣｏＡシンテターゼは、ＣｏＡと、２～６個の炭素原子を含有する直鎖アルカン酸又はアルカノエートを連結してアルカノイル－ＣｏＡを生成するアシル活性化酵素であり、アルカノイル－ＣｏＡは、２～６個の炭素原子のアルカノイル基を含有する、コエンザイムＡのチオエステルである。一実施形態では、アシル－ＣｏＡシンテターゼはヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼであり、これは、ＣｏＡと、ヘキサン酸又はヘキサノエートを連結してヘキサノイル－ＣｏＡを生成する。ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼは、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。別の実施形態では、アシル－ＣｏＡシンテターゼは、ＣｏＡと、酪酸又はブチレートを連結してブチリル－ＣｏＡを生成する。
[0047]ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼは、チオエステルが連結した出発分子へのアセチル単位の縮合反応を触媒することによってポリケチドを生成する酵素である。ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼは、配列番号１、７若しくは８のアミノ酸配列又は配列番号１、７若しくは８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。一実施形態では、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼは、多段階反応において、アルカノイル－ＣｏＡを３つのマロニル－ＣｏＡと縮合させて３，５，７－トリオキソアルカノイル－ＣｏＡを形成し、３，５，７－トリオキソアルカノイル－ＣｏＡは８～１２個の炭素原子を含有する。別の実施形態では、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼは、当分野ではオリベトールシンターゼ及び３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡシンターゼとしても知られる大麻由来のテトラケチドシンターゼである。一実施形態では、テトラケチドシンターゼは、多段階反応において、ヘキサノイル－ＣｏＡを３つのマロニル－ＣｏＡと縮合させて３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡを形成する。別の実施形態では、テトラケチドシンターゼは、多段階反応において、ブチリル－ＣｏＡを３つのマロニル－ＣｏＡと縮合させて３，５，７－トリオキソデカノイル－ＣｏＡを形成する。別の実施形態では、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼは、キイロタマホコリカビ由来の、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ活性を有するドメインを含むＳｔｅｅｌｙ１若しくはＳｔｅｅｌｙ２、又はそのバリアント（例えば、国際公開第２０１８／１４８８４９号に開示されているＳｔｅｅｌｙ１（Ｇ１５１６Ｄ＋Ｇ１５１８Ａ）又はＳｔｅｅｌｙ１（Ｇ１５１６Ｒ））である。Ｓｔｅｅｌｙ１は当分野ではＤｉＰＫＳ又はＤｉＰＫＳ１としても知られ、Ｓｔｅｅｌｙ２は当分野ではＤｉＰＫＳ３７としても知られる。
[0048]オリベトール酸シクラーゼは、本明細書で使用される場合、３，５，７－トリオキソアルカノイル－ＣｏＡの分子内アルドール縮合を触媒して２，４－ジヒドロキシ－６－アルキル安息香酸を形成する酵素のことを指し、安息香酸のアルキル基は１～５個の炭素を含有する。一実施形態では、オリベトール酸シクラーゼは、３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡからのオリベトール酸の形成を触媒する。別の実施形態では、オリベトール酸シクラーゼは、３，５，７－トリオキソデカノイル－ＣｏＡからのジバリノール酸の形成を触媒する。オリベトール酸シクラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。大麻由来のオリベトール酸シクラーゼは、当分野では、オリベトール酸シンターゼ及び３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡ ＣｏＡ－リアーゼとしても知られる。
[0049]芳香族プレニルトランスフェラーゼは、本明細書で使用される場合、ゲラニル二リン酸を５－アルキルベンゼン－１，３－ジオールに転移させて２－ゲラニル－５－アルキルベンゼン－１，３－ジオールを合成することが可能な酵素のことを指し、生成物のアルキル基は１～５個の炭素を含有する。一実施形態では、芳香族プレニルトランスフェラーゼは、ゲラニル二リン酸をオリベトールに転移させてカンナビゲロール（ＣＢＧ）を合成する。別の実施形態では、芳香族プレニルトランスフェラーゼは、ゲラニル二リン酸をオリベトール酸（ＯＡ）に転移させてカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）を合成する。別の実施形態では、芳香族プレニルトランスフェラーゼは、ゲラニル二リン酸をジバリノール酸に転移させてカンナビゲロバリン（ＣＢＧＶ）を合成する。別の実施形態では、芳香族プレニルトランスフェラーゼは、ゲラニル二リン酸をジバリノール酸に転移させてカンナビゲロバリン酸（ＣＢＧＶＡ）を合成する。芳香族プレニルトランスフェラーゼの例は、当分野ではＣｓＰＴ１としても知られる大麻由来の芳香族プレニルトランスフェラーゼ、プレニルトランスフェラーゼ１、ゲラニルピロリン酸－オリベトール酸ゲラニルトランスフェラーゼ及びゲラニル二リン酸：オリベトレートゲラニルトランスフェラーゼである。芳香族プレニルトランスフェラーゼのさらなる例としは、ホップ由来のＨＩＰＴ１、大麻由来のＣｓＰＴ４及びストレプトマイセス属の種の株Ｃｌ１９０由来のＯｒｆ２（ＮｐｈＢ）が挙げられる。芳香族プレニルトランスフェラーゼは、配列番号３、９、１０若しくは１１のアミノ酸配列又は配列番号３、９、１０若しくは１１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。
[0050]テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼは、当分野ではΔ９－テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼとしても知られ、カンナビゲロール酸のモノテルペン部分の環化を触媒することによってΔ９－テトラヒドロカンナビノール酸を合成する。テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼは、配列番号５のアミノ酸配列又は配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。
[0051]カンナビジオール酸シンターゼは、カンナビゲロール酸のモノテルペン部分の立体選択的な酸化的環化を触媒することによってカンナビジオール酸を合成する。カンナビジオール酸シンターゼは、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。
[0052]一実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変微生物は、ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼ、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ（例えば、テトラケチドシンターゼ、Ｓｔｅｅｌｙ１及びＳｔｅｅｌｙ２）並びにオリベトール酸シクラーゼのうちの１つ、２つ又は３つ以下をコードするか；又はＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ（例えば、テトラケチドシンターゼ、Ｓｔｅｅｌｙ１及びＳｔｅｅｌｙ２）並びにオリベトール酸シクラーゼのうちの１つ又は２つ以下をコードする外来性の核酸分子を含み、芳香族プレニルトランスフェラーゼをコードする外来性の核酸分子を含まず、任意選択でテトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ又はカンナビジオール酸シンターゼをコードする外来性の核酸分子を含まない。
[0053]一実施形態では、少なくとも１つのヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸配列を含む核酸分子は、配列番号４に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼは配列番号１、７又は８に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、オリベトール酸シクラーゼは配列番号２に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、核酸分子は、ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸配列を含まない。別の実施形態では、核酸分子は遺伝子操作された微生物中に含まれる。
[0054]一実施形態では、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼをコードする核酸配列を含む核酸分子は、配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、オリベトール酸シクラーゼは配列番号２に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
[0055]一実施形態では、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼをコードする核酸配列を含む核酸分子は、配列番号７又は８に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
[0056]本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「核酸ベクター」という用語は、制御エレメント及びトランスジェニックＤＮＡを導入するための部位を含む核酸分子、例えばプラスミドを意味し、前記トランスジェニックＤＮＡを微生物に導入するために使用される。トランスジェニックＤＮＡは異種タンパク質をコードすることができ、異種タンパク質を微生物中で発現させ、微生物から単離することができる。トランスジェニックＤＮＡは、相同又は非相同組換えによって、核、ミトコンドリア又は葉緑体のゲノム中に組み込むことができる。トランスジェニックＤＮＡは、核、ミトコンドリア又は葉緑体のゲノムに組み込まれることなく、染色体外ベクターにおいて自己複製することもできる。ベクターは、プロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、トランスジェニックＤＮＡのための挿入部位、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）及びターミネーター配列を含む単一の、作動可能に連結された一式の制御エレメントを含有することができる。本方法において有用なベクターは、当分野では周知である。一実施形態では、核酸分子はエピソーム性ベクターである。
[0057]本明細書で使用される場合、「エピソーム性ベクター」という用語は、形質転換された細胞のゲノムに組み込まれることなく形質転換された細胞中で発現することができる、細菌のエピソームに基づくＤＮＡベクターのことを指す。エピソーム性ベクターは、細菌（例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））から別の標的微生物（例えば微細藻類）に接合を介して移すことができる。
[0058]別の実施形態では、ベクターは市販のベクターである。本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、プロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、トランスジェニックＤＮＡのための挿入部位、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）及びターミネーター配列を含む単一の、作動可能に連結された一式の制御エレメントを意味する。一実施形態では、少なくとも１種の核酸分子がエピソーム性ベクターである。
[0059]「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上の成分の配置のことを指し、そこではそのように記載される成分は、それらが協調的に機能することを可能にする関係にある。例えば、転写制御配列又はプロモーターがコード配列の転写の局面を促進する場合、転写制御配列又はプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。当業者は、開始、伸長、減衰及び終結を含むがこれらに限定されない転写プロセスの局面を容易に認識することができる。一般的に、作動可能に連結された転写制御配列はコード配列とｃｉｓでつながっているが、必ずしもコード配列に直接隣接しているとは限らない。
[0060]従って、カンナビノイド生合成経路の酵素をコードする核酸ベクターは、微生物中での酵素の適切な発現に適したエレメントを含有する。特に、各発現ベクターは微生物中での転写を促進するプロモーターを含有する。「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが作動可能に連結された遺伝子すなわちコーディング配列の転写を誘導するヌクレオチド配列のことを指す。適したプロモーターには、ｐＥＦ－１α、ｐ４０ＳＲＰＳ８、ｐＨ４－１Ｂ、ｐγ－Ｔｕｂｕｌｉｎ、ｐＲＢＣＭＴ、ｐＦｃｐＡ、ｐＦｃｐＢ、ｐＦｃｐＣ、ｐＦｃｐＤ、ＨＳＰ７０Ａ－ＲｂｃＳ２（配列番号２１～２８、５３及び５５として表１に示される；Ｓｌａｔｔｅｒｙら、２０１８を参照のこと）及びＲｂｃＳ２が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、化学的に誘導可能なプロモーター、アルコール誘導性プロモーター及びエストロゲン誘導性プロモーターを含む誘導性プロモーターも使用することができることを容易に理解することができる。予測プロモーター、例えばゲノムデータベースマイニング（ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｍｉｎｉｎｇ）から見出され得るものも使用してもよい。さらに、核酸分子又はベクターは、目的の遺伝子の強力な発現を駆動するために、クローニング部位の前又は遺伝子配列内部に、１つ又は複数のイントロンを含有してもよい。１つ又は複数のイントロンには、ＦＢＡＣ２－１ ＴＵＦＡ－１、ＥＩＦ６－１、ＲＰＳ４－１、ＲｂｃＳ２－１、ＲｂｃＳ２－２のイントロン（配列番号１５～２０として表１に示される）が含まれる。核酸分子は、１つを超えるイントロン又は１つを超える同じイントロンのコピーを含有してもよい。核酸分子又はベクターは、適したターミネーター、例えばｔＥＦ－１α、ｔ４０ＳＲＰＳ８、ｔＨ４－１Ｂ、ｔγ－Ｔｕｂｕｌｉｎ、ｔＲＢＣＭＴ、ｔＦｃｐＢ、ｔＦｃｐＣ、ｔＦｃｐＤ、ｔＦｃｐＡ、ｔＲｂｃＳ２（配列番号２９～３６、５４及び５６として表１に示される）も含有する。選択可能なマーカー遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子又はｎｐｔＩＩとしても知られる）、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、バスタ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子又はその他の遺伝子もベクターに連結することができる。本明細書で使用される場合、「タグ」という用語は、抗体によって認識されるアミノ酸配列のことを指す。タグのアミノ酸配列は、例えば、酵素の配列に連結しており、それによって、タグとタグ特異的抗体間の結合による酵素の検出又は単離が可能となる。例えば、当分野で知られる一般的なタグには、６Ｈｉｓ、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＨＡ及びＨＳＶが含まれる。これらタグは、Ｎ又はＣ末端に配置された場合に有用である。
[0061]一実施形態では、核酸分子はルビスコ小サブユニットをコードする配列を含む。ルビスコ小サブユニットは、それが結合するポリペプチドを、内部色素体標的化シグナルを介して葉緑体に輸送されるように標的化することを可能にし得る（Ｈｉｒａｋａｗａ及びＩｓｈｉｄａ ２０１０）。理論に拘束されるものではないが、葉緑体中ではアセチル－ＣｏＡ及びマロニル－ＣｏＡを含む基質が利用できるため、カンナビノイド生合成酵素を葉緑体コンパートメントに輸送することによって、微細藻類中の外来性のカンナビノイド生合成経路が亢進される可能性があると予想される。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の核酸分子が、配列番号１２に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するルビスコ小サブユニットをコードする配列を含む。
[0062]本明細書で使用される場合、「レポーター」という用語は、該レポーターが結合若しくは関連する別の分子の検出、又は該レポーターを含む生物の検出を可能にする分子のことを指す。レポーターは、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む蛍光分子を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の核酸分子が、配列番号１３～１４に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するレポーターをコードする１つ又は複数のレポーター配列を含む。
[0063]一実施形態では、少なくとも１種のカンナビノイド生合成経路の酵素をコードする核酸分子又はベクターが、配列番号２１～２８、５３及び５５から選択されるプロモーター核酸配列を含む。別の実施形態では、核酸分子は、配列番号１５～２０から選択される少なくとも１つのイントロン配列を含む。別の実施形態では、核酸分子は、配列番号２９～３６、５４及び５６から選択されるターミネーター核酸配列を含む。別の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、配列番号３７～４２から選択されるアミノ酸配列を有するタグをコードする少なくとも１つの配列を含む核酸分子を含む。
[0064]核酸分子は、カンナビノイド生合成経路と関連する１つ、２つの又は３つ以下の酵素を発現するように構築することができる。一実施形態では、核酸分子は２つ以上のポリヌクレオチド配列を含み、そのそれぞれが１つのカンナビノイド生合成経路の酵素をコードし、同じプロモーターに作動可能に連結される。コンストラクト中に２つ又は３つの酵素がコードされる場合は、コンストラクトは自己切断型のペプチドリンカー、例えばＦＭＤＶ２ａ、ｅｘｔＦＭＤＶ２ａ又はＴ２Ａをコードするヌクレオチド配列を含有し、それによって独立したタンパク質として生成される酵素がもたらされ得るか；又はコンストラクトは融合タンパク質として酵素を連結するペプチドリンカー配列、例えば３（ＧＧＧＧＳ）及びＦＰＬ１ペプチドリンカーを含有し、１つの酵素の中間代謝産物を溶液中に遊離することなく直接別の酵素又は活性部位に渡す基質チャネリングを可能にし得るか；又はコンストラクトは自己切断型及び非自己切断型の配列の組み合わせを含有し得る。一実施形態では、核酸分子は、少なくとも２つのポリヌクレオチド配列の間に少なくとも１つのリンカー配列を含む。別の実施形態では、リンカー配列は、自己切断型のペプチドリンカー、任意選択で配列番号４３～４５に示されるアミノ酸配列を有する自己切断型のペプチドリンカーをコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の核酸分子が、配列番号４３～４８に示される配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドリンカーをコードする１つ又は複数のリンカー配列を含む。
[0065]別の実施形態では、ベクターは本明細書に記載の核酸配列を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の核酸配列を含むベクター又は核酸分子で形質転換される。別の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の任意の微生物である。
[0066]本明細書に記載の核酸配列は、様々な配置又は組み合わせのベクターで提供することができる。カンナビノイド生合成経路の酵素をコードする個別の各配列は、独立したベクターで提供することができる。或いは、複数の配列を同じベクターで一緒に提供することができる。例えば、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ及びオベリトール酸シクラーゼをコードする核酸配列を第１のベクターで一緒に提供することができ、ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸配列を第２のベクターで提供することができる。或いは、すべての酵素をコードする配列を、同じベクターで一緒に提供することができる。酵素をコードする１つを超える配列が同じベクターで提供される場合、配列は、独立した発現カセットか、又は同じ発現カセットで一緒に提供することができる。２つ以上の配列が同じ発現カセットにある場合、それらを同じオープンリーディングフレームで提供して融合タンパク質を生成することができる。融合タンパク質をコードする２つ以上の配列は、制限酵素認識部位又は自己切断型のペプチドリンカーをコードするリンカー配列によって分離することができる。よって、カンナビノイド類の生成のための遺伝子改変微生物は、それぞれがカンナビノイド生合成経路の１種又は複数の酵素をコードする核酸配列を含む複数のベクターを用いた段階的なトランスフェクション、又はすべての酵素をコードする核酸配列を含む単一のベクターを用いた段階的なトランスフェクションによって操作することができる。
[0067]本明細書で使用される場合、「微細藻類」という用語及びその派生語には、真核生物である光合成微生物及び非光合成微生物が含まれる。本明細書で使用される場合、「シアノバクテリア」という用語及びその派生語には、原核生物である光合成微生物が含まれる。一実施形態では、微細藻類はＧＣリッチな微細藻類である。本明細書で使用される場合、「ＧＣリッチな微細藻類」とは、核ゲノム及び／又は色素体ゲノムのＤＮＡが少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％又は少なくとも７５％のＧＣ含有量を含む微細藻類のことを指す。一実施形態では、微細藻類は油性微細藻類である。本明細書で使用される場合、「油性」とは、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％又は少なくとも５０重量％の脂質含有量を含む微細藻類のことを指す。一実施形態では、微細藻類は低温適応微細藻類である。本明細書で使用される場合、「低温適応」とは、自然界における温帯、亜寒帯若しくは極地で増殖する微細藻類、又は温帯、亜寒帯又は極地で確認される温度で増殖させる人工の増殖条件に適応した微細藻類のことを指す。いくつかの実施形態では、低温適応微細藻類は、２４℃未満、２０℃未満、１６℃未満又は１２℃未満の温度で増殖する。一実施形態では、微細藻類は、２４℃未満、２０℃未満、１６℃未満又は１２℃未満の温度で増殖させた場合に脂質含有量の増加を示す低温適応型微細藻類である。
[0068]一実施形態では、微細藻類は緑藻類である。一実施形態では、微細藻類は緑藻植物門由来である。一実施形態では、微細藻類は、アンキストロデスムス属（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス属（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、オーキセノクロレラ属（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、バシクラミス属（Ｂａｓｉｃｈｌａｍｙｓ）、ボツリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ボトリオコリネ属（Ｂｏｔｒｙｏｋｏｒｙｎｅ）、ボロディネラ属（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、ブラキオモナス属（Ｂｒａｃｈｉｏｍｏｎａｓ）、カテナ属（Ｃａｔｅｎａ）、カルテリア属（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、カエトフォラ属（Ｃｈａｅｔｏｐｈｏｒａ）、カラシオクロリス属（Ｃｈａｒａｃｉｏｃｈｌｏｒｉｓ）、カラシオシフォン属（Ｃｈａｒａｃｉｏｓｉｐｈｏｎ）、クライノモナス属（Ｃｈｌａｉｎｏｍｏｎａｓ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロロキトリウム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、クロロコッカム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム属（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロロモナス属（Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ）、クロステリオプシス属（Ｃｌｏｓｔｅｒｉｏｐｓｉｓ）、ジクチオクロロプシス属（Ｄｉｃｔｙｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ドナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エリプソイドン属（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エレモスファエラ属（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、ユードリナ属（Ｅｕｄｏｒｉｎａ）、フロイディエラ属（Ｆｌｏｙｄｉｅｌｌａ）、フリエドマニア属（Ｆｒｉｅｄｍａｎｉａ）、ヘマトコッカス属（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハフニオモナス属（Ｈａｆｎｉｏｍｏｎａｓ）、ヘテロクロレラ属（Ｈｅｔｅｒｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ゴニウム属（Ｇｏｎｉｕｍ）、ハロサルシノクラミス属（Ｈａｌｏｓａｒｃｉｎｏｃｈｌａｍｙｓ）、コリエラ属（Ｋｏｌｉｅｌｌａ）、ロボカラシウム属（Ｌｏｂｏｃｈａｒａｃｉｕｍ）、ロボクラミス属（Ｌｏｂｏｃｈｌａｍｙｓ）、ロボモナス属（Ｌｏｂｏｍｏｎａｓ）、ロボスファエラ属（Ｌｏｂｏｓｐｈａｅｒａ）、ロボスファエロプシス属（Ｌｏｂｏｓｐｈａｅｒｏｐｓｉｓ）、マルバニア属（Ｍａｒｖａｎｉａ）、モノラフィジウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ミルメシア属（Ｍｙｒｍｅｃｉａ）、ナンノクロリス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オオキスティス属（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オーガモクラミス属（Ｏｏｇａｍｏｃｈｌａｍｙｓ）、パビア属（Ｐａｂｉａ）、パンドリナ属（Ｐａｎｄｏｒｉｎａ）、パリエトクロリス属（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ファコタス属（Ｐｈａｃｏｔｕｓ）、プラチドリナ属（Ｐｌａｔｙｄｏｒｉｎａ）、プラチモナス属（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレオドリナ属（Ｐｌｅｏｄｏｒｉｎａ）、ポルリクロリス属（Ｐｏｌｕｌｉｃｈｌｏｒｉｓ）、ポリトーマ属（Ｐｏｌｙｔｏｍａ）、ポリトメラ属（Ｐｏｌｙｔｏｍｅｌｌａ）、プラシオラ属（Ｐｒａｓｉｏｌａ）、プラシオロプシス属（Ｐｒａｓｉｏｌｏｐｓｉｓ）、プラシノコッカス属（Ｐｒａｓｉｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ属（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードカルテリア属（Ｐｓｅｕｄｏｃａｒｔｅｒｉａ）、シュードトレボウクシア属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｅｂｏｕｘｉａ）、プテロモナス属（Ｐｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ピロボトリス属（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、ロゼンビンギエラ属（Ｒｏｓｅｎｖｉｎｇｉｅｌｌａ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、アオミドロ属（Ｓｐｉｒｏｇｙｒａ）、ステファノスファエラ属（Ｓｔｅｐｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）、テトラバエナ属（Ｔｅｔｒａｂａｅｎａ）、テトラエドロン属（Ｔｅｔｒａｅｄｒｏｎ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、トレボウキシア属（Ｔｒｅｂｏｕｘｉａ）、トロキスシオプシス属（Ｔｒｏｃｈｉｓｃｉｏｐｓｉｓ）、ビリジエラ属（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、ビトレオクラミス属（Ｖｉｔｒｅｏｃｈｌａｍｙｓ）、ボルボックス属（Ｖｏｌｖｏｘ）、ボルブリナ属（Ｖｏｌｖｕｌｉｎａ）、バルカノクロリス属（Ｖｕｌｃａｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ワタナベア属（Ｗａｔａｎａｂｅａ）、ヤマギシエラ属（Ｙａｍａｇｉｓｈｉｅｌｌａ）、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）由来である。一実施形態では、微細藻類はコナミドリムシ、クロレラ・ブルガリス、クロレラ・ソロキニアナ、クロレラ・プロトセコイデス、テトラセルミス・チュイ、ナノクロロプシス・オクラテ、セネデスムス・オブリクース、アクトデスムス・ディモルフス、ドナリエラ・テルチオレクタ又はヘマトコカス・プルシアリスである。別の実施形態では、微細藻類は珪藻、任意選択でフェオダクチラム・トリコルヌタム又はタラシオシラ・シュードナナである。
[0069]別の実施形態では、シアノバクテリアはスピルリナ科（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａｃｅａｅ）、フォルミジウム科（Ｐｈｏｒｍｉｄｉａｃｅａｅ）、シネココッカス科（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）又はネンジュモ科（Ｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）由来である。一実施形態では、シアノバクテリアはアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ、シネココッカス・エロンガタス又はアファニゾメノン・フロス・アクアである。
[0070]本開示は、カンナビノイド類の生成のための、本明細書に記載の遺伝子操作された微生物、及び遺伝子操作された微生物を培養するための培地を含む、細胞培養物も提供する。一実施形態では、培地は実質的に糖を含まない、すなわち糖の濃度は２重量％未満、１．５重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満又は０．１重量％未満である。別の実施形態では、培地は微量以下の糖を含有し、微量とはわずかな量又は検出限界に近い量のことを指すと、当分野では通常理解される。光合成ができない微生物を培養するために必要であることが知られている糖には、モノサッカライド（例えばグルコース、フルクトース、リボース、キシロース、マンノース及びガラクトース）並びにジサッカライド（例えばスクロース、ラクトース、マルトース、ラクツロース、トレハロース及びセロビオース）が含まれるが、これらに限定されない。
[0071]別の実施形態では、培地は実質的に固定炭素源を含まない、すなわち固定炭素源の濃度は２重量％未満、１．５重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満又は０．１重量％未満である。別の実施形態では、培地は微量以下の固定炭素源を含有する。「固定炭素源」という用語は、本明細書で使用される場合、増殖、生合成及び／又は代謝のための炭素の供給源を与える、常温及び常圧で液体又は固体である有機炭素分子のことを指す。固定炭素源の例には、糖（例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、スクロース、ラクトース）、アミノ酸又はアミノ酸誘導体（例えばグリシン、Ｎ－アセチルグルコサミン、グリセロール、フロリドシド、グルクロン酸、トウモロコシデンプン、解重合したセルロース材料、植物材料（例えばサトウキビ、サトウダイコン））、及びカルボン酸（例えばヘキサン酸、酪酸及びそれらの個別の塩）が含まれるが、これらに限定されない。固定炭素の供給源は国際公開第２０１５／１６８４５８号において開示されており、その内容を参照により本明細書に組み込む。
[0072]微生物は、それらの増殖に許容的な条件において培養することができる。光合成微生物は、（固定炭素源ではない）二酸化炭素を、光源からのエネルギーを使用して有機分子、例えば糖に固定する炭素固定が可能であることが知られている。光源からのエネルギーを使用する二酸化炭素の固定が光合成である。光合成におけるエネルギーの供給に適した光源には、太陽光及び人工光が含まれる。光合成微生物は、固定炭素源を用いずに増殖及び／又は代謝することが可能である。微細藻類は、大気中の二酸化炭素、工業的に排出された二酸化炭素（例えば煙道ガス及びフレアリングガス）を含む種々の供給源並びに可溶性炭酸（例えばＮａＨＣＯ３及びＮａ２ＣＯ３）から二酸化炭素を固定することができる（その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｉｎｇｈら ２０１４を参照のこと）。非固定炭素源、例えば二酸化炭素は、二酸化炭素ガス混合物を培養培地に注入又は通気することによって、微細藻類の培養物に添加することができる。光合成増殖は独立栄養増殖の１種であり、そこでは微生物は、外部のエネルギー供給源、例えば光を使用して有機分子を自ら生成することができる。これは、従属栄養増殖と対照的であり、そこでは微生物は、増殖及び／又は代謝のために有機分子を消費しなければならない。従属栄養生物は、従って、増殖及び／又は代謝のために固定炭素源を必要とする。一部の光合成生物は混合栄養増殖が可能であり、そこでは微生物は、固定炭素源も消費しながら、光合成によって炭素を固定する。混合栄養増殖では、独立栄養代謝は、培養培地中で利用可能な還元炭素供給源を酸化する従属栄養代謝と統合される。光合成微細藻類は、本明細書に記載の固定炭素源を培養培地に添加することによる混合栄養条件において、通常は培養される。使用される固定炭素の一般的な供給源には、グルコース、エタノール又は産業からの廃棄物、例えばアセテート若しくはグリセロールが含まれる（その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｃｃｈｉｎら ２０１８を参照のこと）。微生物、例えば微細藻類及びシアノバクテリアは、当分野で知られる方法及び条件を使用して培養することができる（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｏｆｕｅｌｓ ｆｒｏｍ Ａｌｇａｅ編、Ｐａｎｄｅｙら、２０１４、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＩＳＢＮ ９７８－０－４４４－５９５５８－４を参照のこと）。一部の微生物は化学独立栄養増殖が可能である。光合成微生物と同様に化学独立栄養生物は二酸化炭素固定が可能であるが、光の代わりに化学的供給源（例えば硫化水素、第一鉄、分子状水素、アンモニア）に由来するエネルギーを使用する。
[0073]微細藻類は、有機的に生産された製品に対する基準に違反する化学物質又は添加剤を使用せずに、有機条件で増殖させることができる。微細藻類は、例えば、管轄の基準、例えば米国よって定められた基準（ＵＳ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ａｃｔ；ＵＳＤＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＵＳＤＡ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）、欧州連合によって定められた基準（２０２１年１月１日より前の規制Ｎｏ ８３４／２００７；２０２１年１月１日からの規制２０１８／８４８）及びカナダよって定められた基準（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｆｏｏｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）に従う条件において増殖させることによって、有機的に増殖させることができる。有機条件で微細藻類を増殖させることによって、微細藻類中での有機植物天然生成物の生成が可能となる。
[0074]本開示は、１種、２種の又は３種以下のカンナビノイド生合成経路の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子も提供する。一実施形態では、核酸分子は、ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼ、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ（例えば、テトラケチドシンターゼ、Ｓｔｅｅｌｙ１及びＳｔｅｅｌｙ２）並びにオリベトール酸シクラーゼのうちの１つ、２つ又は３つ以下をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、核酸分子は、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼ（例えば、テトラケチドシンターゼ、Ｓｔｅｅｌｙ１及びＳｔｅｅｌｙ２）、オリベトール酸シクラーゼ、又はその両方をコードし、ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼをコードしない核酸配列を含む。
[0075]「微生物に核酸分子を導入する」という句には、遺伝子操作された微生物を調製するための、微生物のゲノムへの核酸分子の安定な組込み並びに微生物への核酸の一過性の組込みの両方が含まれる。細胞への核酸の導入は、当分野では形質転換としても知られている。核酸ベクターは、ガラスビーズを用いた撹拌、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム属を介した形質転換、加速粒子送達法、すなわち微粒子銃、細胞融合法を含むがこれらに限定されない当分野で知られる技術を使用して、又は核酸ベクターを微生物に送達するための任意の他の方法によって、微生物に導入することができる。
[0076]本開示の特定の実施形態には、以下が含まれるが、これらに限定されない：
１．カンナビノイドを生成することが可能な遺伝子操作された微生物であって、光合成微細藻類又はシアノバクテリアであり、芳香族プレニルトランスフェラーゼをコードする外来性の核酸分子を含まない、遺伝子操作された微生物。
２．テトラヒドロカンナビノール酸又はテトラヒドロカンナビノールを生成することが可能であり、テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼをコードする外来性の核酸分子を含まない、実施形態１に記載の遺伝子操作された微生物。
３．カンナビジオール酸又はカンナビジオールを生成することが可能であり、カンナビジオール酸シンターゼをコードする外来性の核酸分子を含まない、実施形態１又は２に記載の遺伝子操作された微生物。
４．テトラケチドシンターゼ及びオリベトール酸シクラーゼをコードする少なくとも１種の外来性の核酸分子を含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
５．テトラケチドシンターゼが配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、オリベトール酸シクラーゼが配列番号２に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４に記載の遺伝子操作された微生物。
６．少なくとも１種の外来性の核酸分子が、テトラケチドシンターゼをコードする第１のポリヌクレオチド配列及びオリベトール酸シクラーゼをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態４又は５に記載の遺伝子操作された微生物。
７．第１のポリヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド配列に対して５’にある、実施形態６に記載の遺伝子操作された微生物。
８．少なくとも１種の外来性の核酸分子が、第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列の間に少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む、実施形態６又は７に記載の遺伝子操作された微生物。
９．リンカー配列が、自己切断型のリンカー配列（例えば、アミノ酸配列配列番号４３～４５）又は融合リンカー配列（例えば、アミノ酸配列配列番号４６～４８）をコードする、実施形態８に記載の遺伝子操作された微生物。
１０．第１のポリヌクレオチド配列が、少なくとも１つのイントロン配列（例えば、配列番号１５～２０）を含む、実施形態６～９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
１１．少なくとも１種の外来性の核酸分子が、テトラケチドシンターゼをコードする第１の核酸分子及びオリベトール酸シクラーゼをコードする第２の核酸分子を含む、実施形態４又は５に記載の遺伝子操作された微生物。
１２．少なくとも１種の外来性の核酸分子が、プロモーター核酸配列（例えば、配列番号２１～２８、５３及び５５）、タグをコードする配列（例えば、アミノ酸配列配列番号３７～４２）、レポーターをコードする配列（例えば、アミノ酸配列配列番号１３～１４）、ルビスコ小サブユニットをコードする配列（例えば、アミノ酸配列配列番号１２）及びターミネーター核酸配列（例えば、配列番号２９～３６、５４及び５６）のうちの１つ又は複数をさらに含む、実施形態４～１１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
１３．少なくとも１種の外来性の核酸分子がエピソーム性ベクターである、実施形態４～１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
１４．少なくとも１種の外来性の核酸分子からなる、実施形態４～１３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
１５．Ｓｔｅｅｌｙ１、Ｓｔｅｅｌｙ２又はそのバリアントをコードする少なくとも１種の外来性の核酸分子を含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
１６．Ｓｔｅｅｌｙ１又はＳｔｅｅｌｙ２のバリアントが、それぞれ、配列番号７又は配列番号８に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１５に記載の遺伝子操作された微生物。
１７．少なくとも１種の外来性の核酸分子が、少なくとも１つのイントロン配列（例えば、配列番号１５～２０）を含む、実施形態１５又は１６に記載の遺伝子操作された微生物。
１８．少なくとも１種の外来性の核酸分子が、プロモーター核酸配列（例えば、配列番号２１～２８、５３及び５５）、タグをコードする配列（例えば、アミノ酸配列配列番号３７～４２）、レポーターをコードする配列（例えば、アミノ酸配列配列番号１３～１４）、ルビスコ小サブユニットをコードする配列（例えば、アミノ酸配列配列番号１２）及びターミネーター核酸配列（例えば、配列番号２９～３６、５４及び５６）のうちの１つ又は複数をさらに含む、実施形態１５～１７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
１９．少なくとも１種の外来性の核酸分子がエピソーム性ベクターである、実施形態１５～１８のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
２０．少なくとも１種の外来性の核酸分子からなる、実施形態１５～１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
２１．ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼをコードする外来性の核酸分子を含まない、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
２２．微細藻類が珪藻又は緑藻植物である、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
２３．微細藻類がフェオダクチラム・トリコルヌタム又はタラシオシラ・シュードナナである、実施形態２２に記載の遺伝子操作された微生物。
２４．微細藻類が、フェオダクチラム・トリコルヌタムである、実施形態２３に記載の遺伝子操作された微生物。
２５．微細藻類がコナミドリムシ又はクロレラ・ブルガリスである、実施形態２２に記載の遺伝子操作された微生物。
２６．微細藻類がコナミドリムシである、実施形態２５に記載の遺伝子操作された微生物。
２７．シアノバクテリアが、スピルリナ科、フォルミジウム科、シネココッカス科又はネンジュモ科、任意選択でアルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ・マキシマ、シネココッカス・エロンガタス又はアファニゾメノン・フロス・アクアである、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
２８．実施形態１～２７のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物及び実質的に糖を含まない培地を含む、細胞培養物。
２９．糖が２重量％未満の濃度で培地中に存在する、実施形態２８に記載の細胞培養物。
３０．糖が１重量％未満の濃度で培地中に存在する、実施形態２９に記載の細胞培養物。
３１．糖が０．５重量％未満の濃度で培地中に存在する、実施形態３０に記載の細胞培養物。
３２．糖が０．１重量％未満の濃度で培地中に存在する、実施形態３１に記載の細胞培養物。
３３．糖が微量以下で培地中に存在する、実施形態３２に記載の細胞培養物。
３４．糖がモノサッカライドである、実施形態２８～３３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
３５．モノサッカライドが、グルコース、フルクトース、リボース、キシロース、マンノース及びガラクトースのうちの少なくとも１つである、実施形態３４に記載の細胞培養物。
３６．糖がジサッカライドである、実施形態２８～３３のいずれか一項に記載の細胞培養物。
３７．ジサッカライドが、スクロース、ラクトース、マルトース、ラクツロース、トレハロース及びセロビオースのうちの少なくとも１つである、実施形態３６に記載の細胞培養物。
３８．培地が実質的に固定炭素源を含まない、実施形態２８～３７のいずれか一項に記載の細胞培養物。
３９．固定炭素源がカルボン酸及びグリセロールのうちの少なくとも１つである、実施形態３８に記載の細胞培養物。
４０．カルボン酸がヘキサン酸である、実施形態３９に記載の細胞培養物。
４１．独立栄養増殖を起こす、実施形態２８～４０のいずれか一項に記載の細胞培養物。
４２．独立栄養増殖が光合成増殖である、実施形態４１に記載の細胞培養物。
４３．光合成増殖が太陽光源の存在下で起こる、実施形態４２に記載の細胞培養物。
４４．光合成増殖が人工の光源の存在下で起こる、実施形態４２に記載の細胞培養物。
４５．有機条件での増殖を起こす、実施形態２８～４４のいずれか一項に記載の細胞培養物。
４６．遺伝子操作された微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物にテトラケチドシンターゼ及びオリベトール酸シクラーゼをコードする少なくとも１種の核酸分子を導入するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法。
４７．遺伝子操作された微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物にＳｔｅｅｌｙ１、Ｓｔｅｅｌｙ２又はそのバリアントをコードする少なくとも１種の核酸分子を導入するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法。
４８．野生型の微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物を２，４－ジヒドロキシ－６－アルキル安息香酸又は２，４－ジヒドロキシ－６－アルキル安息香酸エステルを含む培地中で培養するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法。
[0077]以下の非限定的な実施例は本開示の実例である：
実施例１
[0078]エピソーム性ベクターの構築及び珪藻フェオダクチラム・トリコルヌタム細胞の形質転換
実施例１．１ 遺伝子配列
[0079]ＣＢ生合成経路の初期に、ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼが、ヘキサン酸をヘキサノイル－ＣｏＡに変換することが示唆されている（図１；Ｇａｇｎｅ ら ２０１２から改変）。ＣＢ生合成経路における別の初期の代謝物中間体は、カンナビノイド類のポリケチド骨格を形成するオリベトール酸（ＯＡ）である。理論に縛られることを望むものではないが、ＯＡは以下の通りに生成される（図２）：最初に、ＩＩＩ型テトラ／ポリケチドシンターゼ（ＴＫＳ）酵素が、多段階反応において、ヘキサノイル－ＣｏＡを３つのマロニル－ＣｏＡと縮合させてトリオキソドデカノイル－ＣｏＡを形成する。次いで、オリベトール酸シクラーゼ（ＯＡＣ）が分子内アルドール縮合を触媒してＯＡを産する。次のステップで、ＣＢの多様化が、ＯＡ骨格への「装飾」酵素の連続した作用によって生じ、それがカンナビノイド類のΔ９－テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）をもたらし、そのそれぞれが脱炭酸して、それぞれΔ９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）を産する（図１）。
[0080]ＴＫＳ及びＯＡＣの遺伝子配列が同定され、インビトロで特徴づけられた（Ｌｕｓｓｉｅｒ ２０１２；Ｇａｇｎｅら ２０１２；Ｍａｒｋｓら ２００９；Ｓｔｏｕｔら ２０１２；Ｔａｕｒａら ２００９）。最適化されていないＴＫＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ１６４３７５．１）及びＯＡＣ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＮ６７９２２４．１）の完全なコード配列を、公共のデータベースから得た。ＴＫＳのオープンリーディングフレーム（１１５８ｂｐ）は、４２ｋＤａの計算ＭＷを有する３８５アミノ酸のタンパク質をコードする（Ｔａｕｒａら ２００９；Ｆｌｏｒｅｓ－Ｓａｎｃｈｅｚら ２０１０）。一方でＯＡＣは、１２ｋＤａのＭＷの、１０１アミノ酸の小型のタンパク質をコードする、比較的短い配列（４８５ｂｐ）である（Ｍａｒｋｓら ２００９）。理論に縛られることを望むものではないが、特定のアミノ酸（すなわちコドン）の核酸コーディングを宿主生物中でより良く発現すると言われている別のコドンで置き換えることによって宿主生物中でのタンパク質発現を改善させるために、コドン最適化が提案されている。この効果は、異なる生物が異なるコドンの嗜好性を示すために生じ得る。特に、微細藻類及びシアノバクテリアは、植物及び動物とは異なるコドンを好む可能性がある。コドン嗜好性に基づいたより良い発現を実現するために核酸の配列を変えるプロセスを、コドン最適化と呼ぶ。統計学的手法が種々の生物におけるコドン使用のバイアスを分析するために生み出され、コドン最適化された遺伝子配列のデザインにおいてこれらの統計学的解析を実行するために、多くのコンピューターアルゴリズムが開発されている（Ｌｉｔｈｗｉｃｋ及びＭａｒｇａｌｉｔ ２００３）。コドンバイアスに依存しない、タンパク質発現を増加させるための、コドン使用における他の改変も記載されてきた（Ｗｅｌｃｈら ２００９）。遺伝子及び他のエレメント（例えば、レポーター、タグ、ペプチドリンカー）を含むコンストラクトのオープンリーディングフレームをコドン最適化し（例えば、配列番号４９～５２）、合成し、形質転換ベクターに挿入した。
実施例１．２ 操作された珪藻
[0081]微細藻類は、価値の高い化学物質のバイオプロダクションのための、有望だが困難を伴うプラットフォームを提供する。モデル生物、例えば大腸菌及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と比較すると、藻類の複雑な生物学及び生化学の特徴づけ並びに株の改良は、非効率的な分子ツールによって妨げられてきた。現在まで、多くの微細藻類が形質転換可能であるものの、導入されたＤＮＡは非相同組換えが関与するメカニズムによって無作為に核ゲノムに組み込まれ、遺伝子発現抑制に直面する確率が高い。それゆえに、これらの難題を回避するための分子ツールが効率的な遺伝子操作を促進するために必要である。最近、珪藻に対するエピソーム性ベクターシステムが開発され、非常に安定であることが示された（Ｋａｒａｓら ２０１５）。エピソームは遺伝子発現抑制メカニズムによって影響されないはずであるため、珪藻株をＴＫＳ及びＯＡＣ導入遺伝子を含むコンストラクトで操作した。フェオダクチラム・トリコルヌタムのコドン使用に対して最適化されたコンストラクトを、配列番号４９～５２に示す。これらの最適化された配列は、他の珪藻、例えばタラシオシラ・シュードナナにも使用することができる。
実施例１．３ ＨＰＬＣ分析のための抽出
[0082]本明細書に記載の例示的な方法によって作製した細胞抽出液に対し、ＨＰＬＣ分析を行った。約１００ｍｇの藻の培養物を遠心分離し、上清を捨てた。５ｍＬの１００％エタノールを沈殿物に添加し、一晩－２０℃で置いた。沈殿物を４℃で１０分間４０００ｇで遠心分離した。１ｍｌの上清を１．７ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、Ｓｐｅｅｄｖａｃ中で、最大真空レベルにおいて加熱せずにエタノールを蒸発させた。２５０μｌの移動相溶液（５９．９％、０．１％及び４０％における、水：ギ酸：アセトニトリル）を、沈殿物を再懸濁するために使用した。各チューブを２分間高速でボルテックスすることによって懸濁液をホモジナイズし、次いで４℃で１０間最大速度で遠心分離した。２００μｌの上清をＨＰＬＣバイアル中に回収した。
実施例１．４ ＨＰＬＣ分析
[0083]機器：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ－ｉ ＬＣ－２０３０ Ｃ ３Ｄ；検出器：ＵＶ－ＤＡＤ／／ＰＤＡ；カラム：Ｐ／Ｎｏ：００Ｆ－４６３３－ＥＶＯ、モデル Ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ ＥＶＯ Ｃ１８ １００Å、ＬＣカラム １５０×４．６ｍｍ、シリアルナンバー：Ｈ１５０１０６９２、Ｂ／Ｎｏ：５７２０－０５０；乾燥器温度：３０℃；流速：０．５ｍＬ／分；移動相：Ａ＝１％のギ酸を含む水、Ｂ＝アセトニトリル１００％；勾配相：Ｔ０：４０％Ｂ、Ｔ１６：９０％Ｂ、Ｔ１８：９０％Ｂ、Ｔ２０：９９％Ｂ、Ｔ２３：９９％Ｂ、Ｔ２５：４０％Ｂ。時間に対する移動相の濃度を図３に示す。
[0084]分析する波長は、Ｃａｒｙ ６０ ＵＶ－Ｖｉｓ精密分光光度計における野生型藻類マトリックス中での各標準物質の最大ピークに基づいて選択した：ＴＨＣ：２８０ｎｍ、中性型か酸型かに依存して１７．８～１８．４分（ＴＨＣＡがさらに出現する）；ＣＢＤ：２７５ｎｍ、１５．０９～１５．４分；ＣＢＮ：２８５ｎｍ、１７～１７．５分。
[0085]試料のバックグラウンドを超えるＴＨＣ、ＣＢＤ又はＣＢＮのピークを決定するために、野生型Ｐ．トリコルヌタム抽出液からマトリックスとして作製した溶媒中で、各標準物質を０、５、１０、２５、５０、７５及び１００ｐｐｍの濃度に希釈した。試料におけるピークは、標準曲線及びブランクを用いた正規化後に同定した。ＴＨＣ、ＣＢＤ及びＣＢＮに対する標準曲線を図４に示す。
実施例２
実施例２．１ （ＡＣ＿１／Ｐｔｒｅｆ１）
[0086]ＴＫＳ及びＯＡＣの酵素をコードする配列を含むコンストラクトを、Ｐ．トリコルヌタムに形質転換した。
[0087]５’から３’までを含むコンストラクト（Ｐｔｒｅｆ１、配列番号４９）：ＴＫＳをコードする配列（位置１～１１５５）；Ｔ２Ａ自己切断型のペプチドリンカー配列（位置１１５６～１２１８）；及びＯＡＣをコードする配列（位置１２１９～１５２１）を、藻類に対するゼオシン耐性遺伝子及び大腸菌に対するクロラムフェニコール耐性遺伝子及び酵母におけるＨｉｓ選択を含有する改変ｐＰｔＧＥ３０プラスミド（Ｓｌａｔｔｅｒｙら ２０１８）に挿入した。
[0088]コンストラクトを、４０ＳＲＰＳ８プロモーター（配列番号２２）及びＦｃｐＡターミネーター（配列番号５４）に作動可能に連結させた。
[0089]ＰｔＧＥ３０エピソーム性ベクターを、大腸菌からＰ．トリコルヌタムに接合移行させた。
[0090]ＰＣＲ及び全エピソームシーケンシングによってＰ．トリコルヌタムのゼオシン耐性クローンを確認し、ＨＰＬＣによる分析のために選択した。
実施例２．２ （ＡＣ＿２／Ｐｔｒｅｆ２）
[0091]ＴＫＳ及びＯＡＣの酵素をコードする配列を含むコンストラクトを、Ｐ．トリコルヌタムに形質転換した。
[0092]５’から３’までを含むコンストラクト（Ｐｔｒｅｆ２、配列番号５０）：ＴＫＳをコードする配列（位置１～１１５５）；３（ＧＧＧＧＳ）ペプチドリンカー配列（位置１１５６～１２００）；及びＯＡＣをコードする配列（位置１２０１～１５０３）を、藻類に対するゼオシン耐性遺伝子及び大腸菌に対するクロラムフェニコール耐性遺伝子及び酵母におけるＨｉｓ選択を含有する改変ｐＰｔＧＥ３０プラスミド（Ｓｌａｔｔｅｒｙら ２０１８）に挿入した。
[0093]コンストラクトを、４０ＳＲＰＳ８プロモーター（配列番号２２）及びＦｃｐＡターミネーター（配列番号５４）に作動可能に連結させた。
[0094]ＰｔＧＥ３０エピソーム性ベクターを、大腸菌からＰ．トリコルヌタムに接合移行させた。
[0095]ＰＣＲ及び全エピソームシーケンシングによってＰ．トリコルヌタムのゼオシン耐性クローンを確認し、ＨＰＬＣによる分析のために選択した。
実施例２．３ （ＡＣ＿３／Ｐｔｒｅｆ３）
[0096]ＴＫＳ及びＯＡＣの酵素をコードする配列を含むコンストラクトを、Ｐ．トリコルヌタムに形質転換した。
[0097]５’から３’までを含むコンストラクト（Ｐｔｒｅｆ３、配列番号５１）：ＴＫＳをコードする配列（位置１～１１５５）；６Ｈｉｓタグ（位置１１５６～１１７３）；Ｔ２Ａ自己切断型のペプチドリンカー配列（位置１１７４～１２３６）；ＯＡＣをコードする配列（位置１２３７～１５３９）；及びＭｙｃタグ配列（位置１５４０～１５６９）を、藻類に対するゼオシン耐性遺伝子及び大腸菌に対するクロラムフェニコール耐性遺伝子及び酵母におけるＨｉｓ選択を含有する改変ｐＰｔＧＥ３０プラスミド（Ｓｌａｔｔｅｒｙら ２０１８）に挿入した。
[0098]コンストラクトを、４０ＳＲＰＳ８プロモーター（配列番号２２）及びＦｃｐＡターミネーター（配列番号５４）に作動可能に連結させた。
[0099]ＰｔＧＥ３０エピソーム性ベクターを、大腸菌からＰ．トリコルヌタムに接合移行させた。
[00100]ＰＣＲ及び全エピソームシーケンシングによってＰ．トリコルヌタムのゼオシン耐性クローンを確認し、ＨＰＬＣによる分析のために選択した。
実施例２．４ （ＡＣ＿７／Ｐｔｒｅｆ７）
[00101]ＴＫＳ及びＯＡＣの酵素をコードする配列を含むコンストラクトを、Ｐ．トリコルヌタムに形質転換した。
[00102]５’から３’までを含むコンストラクト（Ｐｔｒｅｆ７、配列番号５２）：ＹＦＰレポーター配列（位置１～７５３）；グリシンコドン（位置７５４～７５６）；ＴＫＳをコードする配列（位置７５７～１９１１）；３（ＧＧＧＧＳ）ペプチドリンカー配列（位置１９１２～１９５６）；ＯＡＣをコードする配列（位置１９５７～２２５９）；及びＭｙｃタグ配列（位置２２６０～２２８９）を、藻類に対するゼオシン耐性遺伝子及び大腸菌に対するクロラムフェニコール耐性遺伝子及び酵母におけるＨｉｓ選択を含有する改変ｐＰｔＧＥ３０プラスミド（Ｓｌａｔｔｅｒｙら ２０１８）に挿入した。
[00103]コンストラクトを、４０ＳＲＰＳ８プロモーター（配列番号２２）及びＦｃｐＡターミネーター（配列番号５４）に作動可能に連結させた。
[00104]ＰｔＧＥ３０エピソーム性ベクターを、大腸菌からＰ．トリコルヌタムに接合移行させた。
[00105]ＰＣＲ及び全エピソームシーケンシングによってＰ．トリコルヌタムのゼオシン耐性クローンを確認し、ＨＰＬＣによる分析のために選択した。
実施例２．５
[00106]ＨＰＬＣ曲線により、ＴＫＳ及びＯＡＣの導入遺伝子を含むコンストラクトＰｔｒｅｆ１（図５Ａ）、Ｐｔｒｅｆ２（図５Ｂ）、Ｐｔｒｅｆ３（図５Ｃ）及びＰｔｒｅｆ７（図５Ｄ）で形質転換したＰ．トリコルヌタムのクローン中に、野生型の対照（図５Ｅ）と比較して、ＣＢＤ、ＴＨＣ及び他のカンナビノイド類の存在が示された。カンナビノイド生合成経路を完成させるためには、ＡＰＴ及びＣＢＤＡＳ／ＴＨＣＡＳを含む追加の外来性の酵素を微生物に形質転換することが必要であると考えられていたため、本結果は予想外であった。
[00107]各試料におけるＣＢＤの量を、ＨＰＬＣによって検出されたＣＢＤに対する標準曲線（図４Ｂ）に基づいて計算し、表２に示す。
[00108]
Figure 2023500781000005
[00109]ＵＰＬＣによる分析により、コンストラクトＰｔｒｅｆ１（図７Ａ）及びＰｔｒｅｆ２（図７Ｂ）で形質転換したＰ．トリコルヌタムのクローン中に、野生型の対照（図７Ｃ）と比較して、ＣＢＤ及びＴＨＣの存在がさらに示された。
[00110]これらの結果により、微細藻類は、ＴＫＳ及びＯＡＣの酵素をコードする遺伝子のみで形質転換した場合にカンナビノイド類を生成できることが示され、これにより、微細藻類は、基質としてオリベトール酸（ＯＡ）及び／又は誘導体を利用する酵素並びにＣＢＤ及び他のカンナビノイド類を合成できる酵素を有する可能性があることが示される。
実施例３
[00111]ベクターの構築及び緑藻植物コナミドリムシの形質転換。
実施例３．１ プラスミドの増殖及び大腸菌からの抽出
[00112]コナミドリムシへの形質転換のための合成コンストラクトを、まずデフォルトベクター（ＫａｎＲ、高コピー）に挿入し、エレクトロポレーションによって大腸菌に形質転換した。形質転換した大腸菌を増殖させてコンストラクトを含有するプラスミドを増やした。コロニーＰＣＲによって陽性大腸菌を確認した。次いでプラスミドを抽出し、ｐＣｈｌａｍｙ３へのギブソン・アセンブリのために調製した。ｐＣｈｌａｍｙ３は、強力なハイブリッドプロモーターのＨＳＰ７０－ＲｂｃＳ２及びＲｂｃＳ２のイントロン１を、クローニング部位の前に含有している。
実施例３．２ ギブソン・アセンブリ及び大腸菌における形質転換
[00113]アセンブルされたｐＣｈｌａｍｙ３ベクターを、熱ショックによる大腸菌の形質転換のために使用した。陽性コロニーをアンピシリンプレート上で増殖させ、コロニーＰＣＲによって確認した。次いで、形質転換した大腸菌を液体培地ＬＢ－ａｍｐ１００中で増殖させて、抽出及び精製の前にベクターを増やした（Ｂｉｏｂａｓｉｃ社、ミニプレップキット）。３時間の直線化（ＳｃａＩでの消化）後、直線化したベクターをアガロースゲル１％上で確認し、精製した（Ｂｉｏｂａｓｉｃ社、ＰＣＲクリーンアップキット）。精製したベクターを、コナミドリムシ細胞の形質転換のために使用した。
実施例３．３ エレクトロポレーションによるコナミドリムシの形質転換
[00114]細胞は、５０μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１の強度の適度かつ連続的な白色蛍光下で、５０％の相対湿度（Ｒｈ）を有する振とうフラスコ内又は寒天プレート上のトリス－アセテートホスフェート（ＴＡＰ）培地中で、混合栄養的に２５℃で培養した。
[00115]エレクトロポレーションを、以前に記載された通りに（Ｓｈｉｍｏｇａｗａｒａら １９９８；Ｗｉｔｔｋｏｐｐ ２０１８；Ｗａｎｇら ２０１９）、わずかな改変を加えて、形質転換のために実施した。コナミドリムシ細胞を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社のジーンパルサーエクセル（Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ）（商標）エレクトロポレーション装置及び４ｍｍのキュベットを使用して、以下のパラメータ：電圧 ０．５ｋＶ；電気容量 ５０μＦ；抵抗 ８００Ωの下で、形質転換した。
[00116]簡潔に言えば、液体状態の細胞を、１２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内の３０ｍＬのＴＡＰ培養培地中で、最初のＯＤ７５０ｎｍは０．１（１×１０５細胞／ｍＬ）で、穏やかに振とう（１００ｒｐｍ）させながら、最終的なＯＤ７５０ｎｍが０．７（７×１０６細胞／ｍＬ）になるまで増殖させた。細胞を、７０００×ｇでの５分間の遠心分離によって回収し、次いで、沈殿物を、５ｍＬの藻類用のマックスエフィシエンシー（Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（商標）形質転換試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号＃Ａ２４２２９）中に再懸濁することによって３回洗浄し、回収ステップと同じ条件で遠心分離した。試料を氷上で１０分間インキュベートした後、エレクトロポレーションを、２５０μＬのコナミドリムシ細胞及び５００ｎｇの直鎖化した精製プラスミドを使用して、電気パルスを加えることによって実施した。トランスジェニック株を、５ｍＬの、４０ｍＭのスクロースを補ったＴＡＰ液体培地（ＴＡＰ／スクロース）中に再懸濁し、次いで、２５℃で穏やかに振とう（１００ｒｐｍ）させながら、連続光下で２２時間インキュベートした。インキュベーション後、形質転換した細胞を、７０００×ｇでの５分間の遠心分離により回収し、２５０μｌのマックスエフィシエンシー中に再懸濁した。次いで、ハイグロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を補ったＴＡＰ寒天培地上に広げ、グロースチャンバー内でおよそ５～７日間インキュベートした。
[00117]単一のクローンが寒天ペトリ皿上に出現したら、各プレート上の形質転換体の総数をＯｐｅｎＣＦＵソフトウェアを使用して数えて、形質転換効率を決定した。
実施例３．３ トランスジェックコンストラクト及びＨＰＬＣ分析
[00118]ＴＫＳ及びＯＡＣの酵素をコードする配列を含むコンストラクトを、コナミドリムシに形質転換した。５’から３’までを含むコンストラクト（Ｇ１Ｃ１、配列番号５７）：ＴＫＳをコードする配列（位置１～１１５５）；ＦＭＤＶ２Ａ自己切断型のペプチドリンカー配列（位置１１５６～１２２７）；及びＯＡＣをコードする配列（位置１２２８～１５３０）をｐＣｈｌａｍｙ３プラスミドに挿入した。コンストラクトを、ＨＳＰ７０Ａ－ＲｂｃＳ２ハイブリッドプロモーター（配列番号５５）及びＲｂｃＳ２ターミネーター（配列番号５６）に作動可能に連結させた。ベクターを、エレクトロポレーションによって、コナミドリムシ株Ｃ－１３７にトランスフェクトした。
[00119]陽性の形質転換体をハイグロマイシン耐性及びＰＣＲによって選択し、ＴＡＰ培地中で増殖させた後、ＵＰＬＣによる分析のために回収及び抽出した。２２０ｎｍでのＵＰＬＣ分析により、カンナビノイド標準物質を含む対照試料の２５．４０６分でのカンナビノール（ＣＢＮ）（図６Ｂ）に相当する、２５．０２３分でのピークの存在が明らかになった（図６Ａ）。カンナビノイド標準物質を含む対照試料（図６Ｂ）は、６８．２４０においてＴＨＣＡのピーク、３１．５８７分においてＴＨＣのピーク、２５．４０６分においてＣＢＮのピーク、２０．１３０分においてＣＢＧＡのピーク、１６．２９２分においてＣＢＤＡのピーク、及び１４．６２８分においてＣＢＤのピークを示す。
[00120]本開示を、好ましい実施例であると現時点で考えられるものに関して記載してきたが、本開示は開示される実施例に限定されるものではないと理解すべきである。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる種々の改変及び等価な配置に及ぶものとする。
[00121]すべての公表文献、特許及び特許出願は、個々の公表文献、特許又は特許出願が参照によりその全体が組み込まれていると具体的且つ個別に示される場合と同程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
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〔関連出願の相互参照〕
[0001]本出願は、２０１９年１０月２９日出願の米国仮特許出願第６２／９２７，３２１号の利益及びそれからの優先権を主張する。

Claims (20)

  1. カンナビノイドを生成することが可能な遺伝子操作された微生物であって、光合成微細藻類又はシアノバクテリアであり、芳香族プレニルトランスフェラーゼをコードする外来性の核酸分子を含まない、遺伝子操作された微生物。
  2. テトラヒドロカンナビノール酸又はテトラヒドロカンナビノールを生成することが可能であり、テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼをコードする外来性の核酸分子を含まない、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
  3. カンナビジオール酸又はカンナビジオールを生成することが可能であり、カンナビジオール酸シンターゼをコードする外来性の核酸分子を含まない、請求項１又は２に記載の遺伝子操作された微生物。
  4. テトラケチドシンターゼ及びオリベトール酸シクラーゼをコードする少なくとも１種の外来性の核酸分子を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
  5. テトラケチドシンターゼが配列番号１に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、オリベトール酸シクラーゼが配列番号２に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の遺伝子操作された微生物。
  6. 少なくとも１種の外来性の核酸分子が、テトラケチドシンターゼをコードする第１のポリヌクレオチド配列及びオリベトール酸シクラーゼをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む、請求項４又は５に記載の遺伝子操作された微生物。
  7. 第１のポリヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチド配列に対して５’にある、請求項６に記載の遺伝子操作された微生物。
  8. 少なくとも１種の外来性の核酸分子が、第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列の間に少なくとも１つのリンカー配列をさらに含む、請求項６又は７に記載の遺伝子操作された微生物。
  9. 少なくとも１種の外来性の核酸分子が、テトラケチドシンターゼをコードする第１の核酸分子及びオリベトール酸シクラーゼをコードする第２の核酸分子を含む、請求項４又は５に記載の遺伝子操作された微生物。
  10. Ｓｔｅｅｌｙ１、Ｓｔｅｅｌｙ２又はそのバリアントをコードする少なくとも１種の外来性の核酸分子を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
  11. Ｓｔｅｅｌｙ１又はＳｔｅｅｌｙ２のバリアントが、それぞれ、配列番号７又は配列番号８に示される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子操作された微生物。
  12. 少なくとも１種の外来性の核酸分子がエピソーム性ベクターである、請求項４～１１のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
  13. 少なくとも１種の外来性の核酸分子からなる、請求項４～１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
  14. ヘキサノイル－ＣｏＡシンテターゼをコードする外来性の核酸分子を含まない、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
  15. 微細藻類が珪藻又は緑藻植物である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物。
  16. 微細藻類が、フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）又はコナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）である、請求項１５に記載の遺伝子操作された微生物。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の遺伝子操作された微生物及び実質的に糖を含まない培地を含む、細胞培養物。
  18. 培地が実質的に固定炭素源を含まない、請求項１７に記載の細胞培養物。
  19. 独立栄養増殖を起こす、請求項１７又は１８に記載の細胞培養物。
  20. 遺伝子操作された微生物中でカンナビノイドを生成するための方法であって、微生物にテトラケチドシンターゼ及びオリベトール酸シクラーゼをコードする少なくとも１種の核酸分子を導入するステップを含み、微生物が微細藻類又はシアノバクテリアである、方法。
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