CN105316358B - 使用ⅲ型nad激酶提高微藻脂肪酸和油脂含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用Ⅲ型NAD激酶来提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的方法。Ⅲ型NAD激酶基因转化微藻后可以促进细胞内NADPH的生成，进而大幅提高脂肪酸和油脂含量。本发明可应用于采用基因工程技术改造微藻以生产脂肪酸和生物柴油。

Description

使用Ⅲ型NAD激酶提高微藻脂肪酸和油脂含量的方法

技术领域

本发明涉及使用Ⅲ型NAD激酶来提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的方法。使用Ⅲ型NAD激酶基因转化微藻后可以促进细胞内NADPH的生成，进而大幅提高脂肪酸和油脂含量。本发明可应用于采用基因工程技术改造微藻以生产脂肪酸和生物柴油。

背景技术

微藻是一类介于微生物与高等植物细胞之间的单细胞生物，具有叶绿体等光合作用器官，能有效利用太阳能将水、CO₂和无机盐转化为有机物。微藻具有对光能的利用率高，生长速度快，对生长环境要求低，能源物质(油脂、烃)含量高等优点，被公认为最具发展潜力的第三代生物能源原料。此外，微藻的固碳效率是植物的10倍以上，可解决CO₂的点源排放问题，是国内外生物固碳之首选；微藻生长过程需要大量的N/P等营养，是净化富含N/P废水的有效途径；除能源物质外，微藻含有大量蛋白、多糖、色素、多不饱和脂肪酸等生物活性成分，其应用面广、价值高。微藻生长所需要的阳光取之不歇、所需碳源正是人类亟待大量固定的CO₂、所需营养正是造成我国水体大面积富营养化的N/P，而利用微藻为原料加工而成的能源、饲料和食品等产品的市场需求量极大。

野生型的微藻通常油脂含量并不高，通过调控培养工艺，使得藻类细胞在逆境中生长(例如缺氮、高光、高盐等条件下)，可以显著提高油脂含量，但是不可避免的牺牲藻细胞的生长。因此，人们尝试采用基因工程技术来调控藻细胞内油脂的合成与积累。微藻基因工程研究在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中取得了重要的进展，在三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、杜氏盐藻(Dunaliella salina)以及小球藻(Chlorella)等微藻上也有了不同程度的研究。然而，通过基因工程技术提高真核微藻细胞内油脂含量的研究相对较少。在美国ASP计划实行期间，曾有科学家将硅藻acc基因转入小环藻，尽管在转录水平检测到过量表达，但是总油脂含量并未提高。近年来，有学者转入DGAT基因，使得藻细胞内油脂含量提高。也有科学家转入植物的转录调控因子，例如大豆的Dof4和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的LEC1基因，但采用这些方法提高油脂或脂肪酸含量的幅度普遍不大。

NAD(H)和NADP(H)是一种关键性的辅酶，在所有生物中发挥重要的作用并且分工明确，NAD/NADP的平衡影响着代谢以及活性氧的体内平衡。细胞内很多氧化还原过程需要NAD(H)和NADP(H)的参与，例如脂肪酸的从头合成。调节胞内NAD(H)和NADP(H)之间的平衡是至关重要的。其中，起这种调节作用的一种关键酶是NAD(H)激酶，可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成NADP(H)。NADPH不仅被用于卡尔文循环，氮吸收，油脂和叶绿素代谢，还有维持氧化还原平衡的功能。

NAD激酶(EC 2.7.1.23；NADK)只能专一性的结合NAD+，使其磷酸化生成NADP+，这是NADP+生物合成途径的最后一步。根据磷酰基受体的不同，NAD激酶被分为poly(P)/ATP-NAD激酶和ATP-NAD激酶。不同于NAD激酶的专一性，NADH激酶(EC2.7.1.86；NADHK)不仅可以催化NAD+，还可以催化NADH发生磷酸化形成NADPH，但是优先利用NADH作为底物。在拟南芥中，已克隆到了由At3g21070、At1g21640和At1g78590分别编码的NADK1、NADK2和NADK3。其中，NADK1和NADK2只能专一性的磷酸化NAD，而NADK3却能编码NADH激酶，优先利用NADH，对NAD的亲和力却很低。

对这3种酶的功能以及亚细胞和组织定位的结果显示，NADK1位于胞质中，主要在根部细胞表达，NADK2定位于叶绿体基质，主要在叶子细胞表达。但关于NADK3却存在争议，Chai等的实验中显示NADK3定位在细胞质中，并认为NADK3提供了细胞质内绝大部分的NADPH；而另一组实验显示NADK3定位于过氧化物酶体，而过氧化物酶体需要大量的NADPH，所以NADK3很可能给过氧化物酶体提供还原力。过表达拟南芥的NADK2提高了NADP(H)浓度，其提高有助于促进植株的氮吸收，以及与卡尔文循环有关的代谢物积累，并伴随着Rubisco活力的提高。这些研究暗示了NADK作为转基因植物中的候选基因，在维持细胞内氧化还原平衡、促进初始代谢和抗逆性方面具有潜在应用价值。但目前尚未检索到利用NADK3基因(AtNADK3)转化藻类并提高脂肪酸和油脂含量的研究报道。

发明内容

本发明发现过表达拟南芥AtNADK3基因可以使微藻细胞内NADPH含量增多，进而使得脂肪酸和油脂含量显著提高。

与现有技术相比，本申请的技术方案有如下优势：(1)微藻生长快、光合固碳效率高，当前微藻生物技术已步入快速发展阶段，除了把微藻开发成传统意义上的新食品原料、功能食品外，随着新能源、碳减排和环保等方面的迫切需要，微藻在生物能源、生物固碳、富含N/P废水、动物饲料及食品等行业具有广阔的应用前景。尤其是在生物能源与固碳减排方面，微藻具有无可比拟的独特优势；(2)针对于蛋白核小球藻，本实验室创立了一项微藻培养领域崭新的平台技术——“异养—稀释—光诱导”技术(参见中国专利申请号200610025618.9，《高密度高品质培养小球藻的方法》，该专利通过引用全文并入本申请)，按照目前的培养工艺，蛋白核小球藻的平均生长速率不低于3g/L/h，即蛋白核小球藻的培养工艺更加成熟；(3)本申请使用蛋白核小球藻的内源性热激蛋白(HSP)70启动子，相对于外源性启动子(例如CaMV 35S启动子、SV40启动子或pCMV启动子)，内源性启动子的优点是不利于导致基因沉默，更加有利于外源基因的表达。

因此，鉴于脂肪酸和油脂合成需要细胞内提供足够的还原力NADPH，并且野生型微藻普遍存在油脂含量低等缺点，本发明的技术方案具有重要的应用前景。

本发明涉及使用Ⅲ型NAD激酶来提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的方法。Ⅲ型NAD激酶基因转化微藻后可以促进细胞内NADPH的生成，进而大幅提高脂肪酸和油脂含量。本发明可应用于采用基因工程技术改造微藻以生产脂肪酸和生物柴油。

根据本申请的一个方面，本申请提供了使用Ⅲ型NAD激酶提高微藻中油脂或脂肪酸含量的方法。

根据本申请的某些实施方式，所述方法构建包含Ⅲ型NAD激酶的表达载体，将所述表达载体转化到微藻细胞内表达。

根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶包含经修饰的Ⅲ型NAD激酶，或者Ⅲ型NAD激酶的嵌合蛋白、截短蛋白或蛋白结构域。

根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶包含与Ⅲ型NAD激酶的相同性为至少约70％的序列。

根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶是来自拟南芥的AtNADK3激酶。

根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶的基因包含如SEQ ID NO:1所示的序列。

根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶包含如SEQ ID NO:2所示的序列。

根据本申请的某些实施方式，所述转化Ⅲ型NAD激酶的微藻中油脂的含量提高了至少约45％。

根据本申请的某些实施方式，所述转化Ⅲ型NAD激酶的微藻中脂肪酸的含量提高了至少约2倍。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体选自表达载体pGreen、pBI121、pBIN19、pCambia1300、pGreen0000、或pBlueScript系列载体。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体为pGreen0029载体。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体为pGreen0029-HSP载体。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含启动子，所述启动子选自热激蛋白(HSP)启动子、泛素启动子、或NOS启动子。

根据本申请的某些实施方式，所述启动子是热激蛋白启动子。

根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70启动子。

根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内源性启动子。

根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性HSP70启动子。

根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含抗生素抗性基因。

根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。

根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)或栅藻(Scenedesmus spp.)。

根据本申请的某些实施方式，所述微藻是蛋白核小球藻FACHB-9。

根据本发明的另一个方面，本申请提供了Ⅲ型NAD激酶在提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的应用。

根据本发明的另一个方面，本申请提供了Ⅲ型NAD激酶在通过微藻细胞生产脂肪酸或生物柴油中的应用。

根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶包含经修饰的Ⅲ型NAD激酶，或者Ⅲ型NAD激酶的嵌合蛋白、截短蛋白或者蛋白结构域。

根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶包含与Ⅲ型NAD激酶的相同性为至少约70％的序列。

根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶基因是来自拟南芥的AtNADK3激酶。

根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶的基因包含如SEQ ID NO:1所示的序列。

根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶包含如SEQ ID NO:2所示的序列。

根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、或栅藻(Scenedesmus spp.)。

根据本申请的某些实施方式，所述微藻是蛋白核小球藻FACHB-9。

附图说明

图1显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP70的构建；

图2显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP70-AtNADK3-Nos的构建；

图3显示了转AtNADK3基因的小球藻的PCR鉴定，M表示标记物(Marker)，1是野生型对照，3是质粒阳性对照，2和4-11是转化AtNADK3基因的小球藻；

图4显示了转AtNADK3基因小球藻的光自养生长曲线，WT是野生型对照；

图5显示了转AtNADK3基因小球藻的异养生长曲线，WT是野生型对照；

图6显示了在异养、光照和热激的不同生长条件下，AtNADK3基因在小球藻细胞内的转录表达情况；

图7显示了在异养、光照和热激的不同生长条件下，转AtNADK3基因的小球藻细胞内NADPH含量，WT是野生型对照；

图8显示了在异养、光照和热激的不同生长条件下，转AtNADK3基因的小球藻细胞内的油脂含量，WT是野生型对照；以及

图9显示了在光照和热激的不同生长条件下，转AtNADK3基因的小球藻细胞内的脂肪酸组成变化，WT是野生型对照。

具体实施方式

除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。

本发明涉及使用Ⅲ型NAD激酶来提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的方法。Ⅲ型NAD激酶基因转化微藻后可以促进细胞内NADPH的生成，进而大幅提高脂肪酸和油脂含量。本发明可应用于采用基因工程技术改造微藻以生产脂肪酸和生物柴油。

NAD激酶(NAD kinase，NADK)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体，可催化NAD(H)进行磷酸化反应，从而生成NADP(H)。并且NADK是目前生物体内发现的惟一可以催化NAD磷酸化生成NADP的酶，因此NAD激酶对于合成NADP(H)以及调节NAD(H)与NADP(H)的平衡都具有重要的作用。

“修饰”是指对天然存在的核酸序列或其编码的蛋白序列进行一种或多种改变。所述修饰包括在蛋白的N末端或C末端加入多肽序列，在蛋白的N末端或C末端删除一段氨基酸序列，或者在不改变蛋白功能的情况下蛋白序列中的一种或多种氨基酸取代、插入、重复或缺失等，例如将甘氨酸取代为丙氨酸。

“突变”是指天然存在的核酸序列或其编码的蛋白序列发生改变，包括但不限于单个碱基改变所引起的点突变，或者多个碱基的缺失、重复和插入。“突变蛋白”又称为“突变体蛋白”或“蛋白突变体”是指序列中包含突变的蛋白。突变可以使用本领域已知的任何技术来生成，包括但不限于体外定点诱变、PCT介导的寡核苷酸定向突变、限制性内切核酸酶消化或者使用寡核苷酸接头等。

“嵌合蛋白”又称为“融合蛋白”，是指通过DNA重组技术获得的将两个或多个基因重组后表达的蛋白。“截短蛋白”又称为“截短体蛋白”或“蛋白截短体”，是指通过DNA重组技术，特异性表达蛋白中一个或多个片段的蛋白。“蛋白结构域”是蛋白分子中具有相对特定的结构和相对独立的功能的区域。嵌合蛋白、融合蛋白或蛋白结构域可以使用本领域已知的任何技术来生成，包括但不限于PCR扩增和重组、PCT介导的寡核苷酸定向突变、限制性内切核酸酶消化或者使用寡核苷酸接头等。

“相同性”是指两个或多个核酸或多肽序列按照本领域常用的计算方法(例如BLASTN或BLASTP或本领域已知的其他方法)进行比较或比对时，相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。“高度同源”是指与靶标核苷酸序列或氨基酸序列比较，相同性为至少约70％的核苷酸序列或氨基酸序列，例如相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。

本申请包括与本申请Ⅲ型NAD激酶高度同源的核苷酸序列和氨基酸序列。根据本申请的某些实施方式，本申请Ⅲ型NAD激酶是来自拟南芥的AtNADK3激酶。根据本申请的某些实施方式，本申请Ⅲ型NAD激酶是来自其他生物的Ⅲ型NAD激酶。根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶的基因序列包含如SEQ ID NO:1所示的序列。根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:2所示的序列。所述AtNADK3激酶的基因序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。根据本申请的某些实施方式，所述AtNADK3激酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

根据本申请的某些实施方式，与本申请Ⅲ型NAD激酶高度同源的核苷酸序列是指与本申请SEQ ID NO:1的相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列。根据本申请的某些实施方式，与本申请Ⅲ型NAD激酶高度同源的氨基酸序列是指与本申请SEQ ID NO:2的相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的氨基酸序列。根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶是Ⅲ型NAD激酶的突变体。根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶是Ⅲ型NAD激酶的嵌合蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶是具有Ⅲ型NAD激酶酶活性的截短蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述Ⅲ型NAD激酶是具有Ⅲ型NAD激酶酶活性的蛋白结构域。

“聚合酶链反应”缩写为PCR，指通过酶促合成来扩增特异核酸序列的体外方法。“引物”指可以与靶标核酸序列杂交，从而生成在合适条件下DNA合成起始位点的寡核苷酸。这种引物可用于PCR扩增反应或DNA测序。“下游”指在核苷酸序列3’的核苷酸序列。“上游”指在核苷酸序列5’的核苷酸序列。术语“限制性内切核酸酶”或者“限制性酶”，指可以结合双链DNA，并且剪切特异DNA序列的酶。根据本申请的某些实施方式，本申请中的所述“限制性内切核酸酶”或“限制性酶”是Hind III和BamH I。根据本申请的某些实施方式，本申请中的所述“限制性内切核酸酶”或“限制性酶”是Spe I和Not I。

“宿主细胞”又称“受体细胞”，是使用分子生物方法转化核酸片段时，接受被转化核酸的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。根据本申请的某些实施方式，所述宿主细胞是藻类细胞，包括但不限于微藻。根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括但不限于小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)或栅藻(Scenedesmus spp.)。根据本申请的某些实施方式，所述微藻是蛋白核小球藻FACHB-9。

“载体”指在基因操作过程中，用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞的运载工具。术语“表达载体”指能表达所插入的核酸序列的载体或质粒。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体是藻类表达载体。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体选自表达载体pGreen、pBI121、pBIN19、pCambia1300、pGreen0000、或pBlueScript系列载体。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体为pGreen0029载体。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体为pGreen0029-HSP载体。

“启动子”是指能控制编码序列表达的一段DNA序列。通常，启动子序列在所述编码序列的5'。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含启动子，所述启动子选自热激蛋白(HSP)启动子、泛素启动子、或NOS启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是热激蛋白启动子。根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70启动子。根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70A启动子。

在多种生理压力下，热激蛋白70启动子会启动蛋白的表达。所述生理压力包括热激、接触重金属或非压力条件例如血清刺激。根据本申请的某些实施方式，所述生理压力是热激处理。根据本申请的某些实施方式，所述生理压力是光照刺激。

“内源性”DNA是指宿主细胞自身的DNA。与之相对，“外源性”DNA是指宿主细胞从外界吸收的DNA。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内源性启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内源性热激蛋白70启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内源性热激蛋白70A启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的外源性启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白70启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白70A启动子。根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子包含如SEQ ID NO:3序列所示的序列。根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是SEQ ID NO:3序列所示的序列。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性泛素启动子。

“选择标记”指可以根据标记的基因来用于选择的鉴定因子。选择标记通常是抗生素或化学抗性基因。本领域已知并使用的选择标记基因的示例包括但不限于：青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、G418等基因。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含抗生素抗性基因。根据本申请的某些实施方式，所述抗生素抗性基因是G418抗性基因。

“转化”指将核酸片段转移到宿主生物中的分子生物学过程。经转化后包含核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物或“转化”的生物。载体可以通过本领域已知的转化方法转移到宿主生物中。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是微藻。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是蛋白核小球藻。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是蛋白核小球藻FACHB-9。根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。根据本申请的某些实施方式，所述转化方法是电穿孔法。

“油脂”是油和脂肪的统称，一般在室温下是液体形态的称为油，是固体或半固体形态的称为脂。油和脂都是高级脂肪酸甘油酯，其中油是不饱和高级脂肪酸甘油酯，脂肪是饱和高级脂肪酸甘油酯。从化学成分上来讲，油脂的主要成分通常是三分子高级脂肪酸与一分子甘油脱水形成的酯。油脂为混合物，没有固定的熔点和沸点。

“脂肪酸”是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链。脂肪酸通常以酯的形式存在，天然存在的游离形式的脂肪酸非常少见。通常用简单的代号来表示不饱和脂肪酸的碳原子数目及双键的数目和位置，如18:2，18表示有18个碳原子，2表示有两个双键。高等动植物中最丰富的脂肪酸是含16或18个碳原子的脂肪酸，例如棕榈酸(软脂酸)、油酸、亚油酸和硬脂酸。根据本申请的某些实施方式，本申请涉及使用Ⅲ型NAD激酶在提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的应用。

“生物柴油”是指由动植物油脂(脂肪酸甘油三酯)与醇(甲醇或乙醇)经酯交换反应得到的脂肪酸单烷基酯，最典型的成分是脂肪酸甲酯。生物柴油是生物质能的一种，其物理性质与石化柴油比较接近。生物柴油的主要特点包括稳定性好、含硫量低环保特性好、芳香族烷烃含量低、十六烷值高、安全性能好、润滑性好并且可部分添加到石化柴油中等。生产生物柴油的方法包括化学法、生物酶合成法等。根据本申请的某些实施方式，本申请涉及使用Ⅲ型NAD激酶在生产脂肪酸或生物柴油中的应用

本申请中使用“提高”、“促进”、“增加”、“增多”、“超过”、“改善”以及其他类似含义的术语是指转化Ⅲ型NAD激酶的微藻中NADPH含量、油脂或脂肪酸的含量多于未转化Ⅲ型NAD激酶的野生型对照藻株。例如所述转化Ⅲ型NAD激酶的微藻中NADPH含量提高了至少约39％，例如包括但不限于提高约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍、约15倍、约20倍。例如所述转化Ⅲ型NAD激酶的微藻中油脂的含量提高了至少约45％，例如包括但不限于提高约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约1倍、约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍、约15倍、约20倍。所述转化Ⅲ型NAD激酶的微藻中脂肪酸的含量提高了至少约2倍，例如包括但不限于提高约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍、约2.8倍、约2.9倍、约3.0倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍、约5倍、约5.5倍、约6倍、约6.5倍、约7倍、约7.5倍、约8倍、约8.5倍、约9倍、约9.5倍、约10倍、约15倍、约20倍。

在本申请中当“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。

除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。

本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。

本申请描述了优选的实施方式和实施例，本领域技术人员在阅读本申请的基础上，可以对本申请所述的实施方式和实施例进行适当的改变。因此，本申请包括法律允许范围内对本申请权利要求书中主题的所有等同的修改和变化。

实施例

下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是为了举例说明的目的，不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。

实施例1：包含蛋白核小球藻内源性启动子的微藻表达载体的构建

本实施例构建包含蛋白核小球藻内源性启动子的微藻表达载体。在本实施例中，所述蛋白核小球藻内源性启动子是蛋白核小球藻的内源性HSP70A启动子，所述微藻表达载体是pGreen0029系列表达载体。

1.1pEASY-Blunt-Hsp70A质粒构建

(1)取50mL蛋白核小球藻藻液，冷冻离心去上清后，液氮研磨提取其RNA存于-80℃冰箱冻成块状的藻泥，转移到事先倒好液氮预冷的研钵中，迅速研磨，整个过程中不断加入适量的液氮，防止RNA降解。于不含RNA酶(RNase-free)的Ep管中事先加入1ml Trizol裂解液(购自Invitrogen公司)，向其中加入50-100mg研磨好的藻粉，漩涡振荡混匀，室温放置10min使其充分裂解，12000rpm，4℃离心10min。将上清转移至另一RNase-free Ep管中，加入200μL预冷的氯仿，上下颠倒混匀15s，室温放置3min，12000rpm 4℃离心15min。将上清转移至另一RNase-free Ep管中，注意不要吸到中间层的DNA，加入500μL异丙醇，手动振荡15s，室温放置10min后12000rpm，4℃离心10min。弃上清，向沉淀中加入1ml 75％乙醇，吹打悬浮温和振荡，在7500rpm，4℃离心5min，用移液器小心吸弃上清。在超净台上风干RNA，加入20-40μL RNase-free H₂O，轻弹管壁以充分溶解，留5μL左右测定浓度，剩下的-80℃保存。

通过Nano drop测定RNA浓度(OD260)以及纯度(OD260/280)。同时设定250V电压，1.5％琼脂糖凝胶电泳验证提取的RNA质量。

(2)RNA反转录成cDNA用于基因克隆

向200μL的RNase-free PCR管中加入5μL溶解的RNA，在PCR仪上进行反转录。第一步的条件是65℃5min，4℃冷却待用。再在冰上依次加入表1中的试剂(购自Toyobo公司的gDNA去除型ReverTra Ace qPCR RT Master Mix，产品号：FSQ-301)：

表1 cDNA合成体系

小心混匀，37℃，5min。再按照以下步骤在PCR仪上进行反转录：37℃15min，50℃，5min，98℃5min，反应结束后获得cDNA，置于-20℃保存备用。

蛋白核小球藻热激蛋白70A启动子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:3。用含Hind III位点的上游引物Hsp_hinF和含BamH I位点的下游引物Hsp_bamR从上述获得的蛋白核小球藻cDNA中克隆出Hsp70A启动子基因片段。回收纯化后连接到pEASY-Blunt(北京全式金生物技术有限公司，产品号：CB101-02)克隆载体，使用测序引物M13F和M13R进行PCR测序，验证序列正确后提取质粒。

用于克隆的上游引物Hsp_hinF和下游引物Hsp_bamR，以及用于PCR测序的M13F和M13R引物的序列如表2所示。

表2 pEASY-Blunt-Hsp70A质粒构建引物

1.2Hind III和BamH I双酶切连接获得pGreen II 0029-Hsp70A-NosT质粒

如图1所示，使用Hind III和BamH I双酶切pEASY-Blunt-Hsp70A质粒和pGreen II0029-Npt II质粒(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品号3574117)。回收pEASY-Blunt-Hsp70A质粒酶切后的小片段和pGreen II 0029-Npt II质粒酶切后的大片段，然后使用T4DNA连接酶连接，转化获得pGreen II 0029-Hsp70A-NosT载体。

pGreen II 0029-Hsp70A-NosT载体在本申请中也称为pGreen II 0029-Hsp-NosT载体、pGreen0029-HSP70A载体、pGreen0029-HSP70载体、pGreen0029-HSP载体或pGreen29-HSP载体。

实施例2：包含Ⅲ型NAD激酶基因的表达载体的构建

本实施例构建包含Ⅲ型NAD激酶基因的表达载体。在本实施例中，所述Ⅲ型NAD激酶基因是来自拟南芥的AtNADK3激酶基因，所述表达载体是实施例1获得的含有蛋白核小球藻内源性热激蛋白(HSP)70启动子的pGreen II 0029-Hsp-NosT载体。

用Invitrogen公司的Trizol试剂提取拟南芥叶片的RNA，经Toyobo公司逆转录试剂盒合成cDNA。根据NCBI公布的AtNADK3编码区序列(AtNADK3的核苷酸序列的注册号为NM_106506.2，示于SEQ ID NO:1；其所编码的蛋白序列的注册号为NP_177980.2，示于SEQ IDNO:2)，克隆AtNADK3基因的引物如下：

上游引物：ACTAGTATGGCGATTAGGAAGCTTTTGCT(下划线表示Spe I位点)

下游引物：GCGGCCGCCTAGTACCTTGATCTGATCTGAG(下划线表示Not I位点)

如图2所示，用分别含Spe I和Not I酶切位点的上下游引物和高保真酶Pfu聚合酶(全式金公司)克隆AtNADK3基因的全长CDS片段(长度为954bp)。使用1.0％的琼脂糖凝胶分离目的基因的PCR片段，电泳结束后用凝胶成像仪在312nm紫外光下切割目的片段，DNA片段用薄型琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收。

使用pEASY-Blunt平末端克隆载体来连接纯化的PCR产物。取3-4μL目的DNA的PCR产物，再加入0.5-1μL的pEASY-Blunt克隆载体，轻弹混匀25℃反应10-15min，即可用于转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞。

按表3的体系配制Spe I和Not I双酶切系统，轻弹混匀后于37℃水浴中分别酶切pGreen II 0029-Hsp-NosT质粒和纯化的PCR产物3-5h。本领域技术人员应理解可根据酶切的实际效果来延长或缩短酶切时间。

表3 双酶切体系

分离纯化酶切后的目的片段，并使用T4DNA连接酶连接体系过夜连接，得到pGreenII 0029-Hsp-AtNADK3-NosT(下文简称0029HspNK3)重组质粒。

将-80℃冻存的大肠杆菌Trans-T1感受态细胞置于冰上，在其刚刚解冻时加入连接产物(不超过10％体积)，轻弹混匀，冰浴30分钟。42℃热激45秒，立即置于冰上冰浴2分钟。加入200μL的LB液体培养基，在37℃、180rpm下孵育60分钟，使细胞恢复生长并表达抗性。取上述菌液均匀涂布于含60μL/mL抗生素(卡那霉素(Kanamycin))的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。挑选部分单菌落，设置空白对照和阴性对照，用PCR克隆序列的引物做PCR，初步筛选重组转化质粒，并小提质粒送样测序。

在微藻电击转化过程中需要大量纯度高和已知浓度的质粒，因此使用PEG8000沉淀法大量提取和纯化质粒。在超净工作台上，将甘油管保种的质粒菌自然解冻后接种到含100mL液体LB(含60μL/mL卡那霉素)培养基的三角瓶中。置于恒温摇床中，在37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。用50mL离心管在12,000rpm条件下离心菌液2分钟，弃上清液。加入5mL预冷的STE溶液(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))，涡旋振荡重悬菌泥，在12,000rpm条件下离心2分钟，弃上清液。

菌泥重悬于1.8mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0))，加入200μL新配的溶菌酶(10mg/mL)，枪头吹打并涡旋震荡混匀，室温放置15-20min，中间晃动2-3次。加入4mL现配的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，盖紧管盖后轻柔颠倒数次混匀至溶液呈透明粘稠状。加入2mL预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)，盖紧管盖后颠倒数次混匀至白色絮状沉淀呈均匀分散状。在2,000rpm离心10分钟，用尼龙滤膜过滤将上清液转移至新的50mL离心管中。加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀后室温放置30分钟。在12,000rpm离心分钟，弃上清液，加入5mL 70％乙醇洗涤沉淀，在12,000rpm离心2分钟。弃乙醇，晾干后加400μL TE(pH 8.0)溶解核酸，转入1.5mL离心管中，再加200μL TE洗管，合并后共600μL于4℃保存。

在上述保存的每管中加600μL(等体积)预冷的5M LiCl，充分混匀后冰浴10分钟，12,000rpm离心10分钟。取上清液，加入等体积的异丙醇，充分混匀后放置20分钟，12,000rpm离心10分钟，弃上清液。加入1mL 70％乙醇洗涤，12,000rpm离心2分钟，弃上清液，晾干后加700μL TE溶解，加10μL RNaseA(10mg/mL)，37℃消化30分钟。加入0.5体积的含30mMMgCl₂的40％PEG8000，倒置混匀数次可观察到蛋清色絮状沉淀，12,000rpm离心10分钟，弃上清液。加入1mL 70％乙醇洗涤，12000rpm离心2分钟，弃上清液，晾干后加700μL TE溶解。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)混匀5分钟，12,000rpm离心10分钟。取上清液，再次用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)混匀5分钟，12,000rpm离心10分钟。取上清液，加入约1/10体积NaAc(3M，pH 5.2)，加2倍体积得无水乙醇，混合均匀，室温放置20分钟。12,000rpm离心10分钟，弃上清液。用70％乙醇清洗一遍，弃乙醇。晾干后加200μL TE，在-20℃保存备用。使用Nano drop核酸定量仪测定DNA浓度，OD260为1.0时的DNA浓度为50μg/mL。

实施例3：获得包含转Ⅲ型NAD激酶基因的微藻

本实施例获得包含转Ⅲ型NAD激酶的微藻。在本实施例中，所述Ⅲ型NAD激酶是来自拟南芥的AtNADK3基因，所述表达载体是实施例2获得的含有蛋白核小球藻的内源性HSP70启动子的pGreen0029-HSP-AtNADK3-Nos载体，所述微藻是蛋白核小球藻FACHB-9(保存于中国科学院野生生物种质库——淡水藻种库，保藏号FACHB-9)。

(1)电穿孔法转化蛋白核小球藻FACHB-9

将蛋白核小球藻FACHB-9提前一天转接到Endo培养基中，并在30℃，摇床转速为150rpm的条件下弱光培养。使用如参考文献(Ying Chen等，Highly efficient expressionof rabbit neutrophil peptide-1 gene in Chlorella ellipsoidea cells.Currentgenetics,2001,39,365-370，所述文献通过引用全文并入本申请)所描述的电穿孔法，将实施例1中获得的0029HspNK3质粒转化进入蛋白核小球藻FACHB-9。电击后的蛋白核小球藻FACHB-9细胞涂于含40mg/L G418的SE固体培养基中培养，约一周后平板上开始陆续长出单藻落。

(2)纯化抗性藻株

固体筛选：从生长好的平板上挑取抗性单藻落，在SE液体培养基中分散混匀，再均匀涂布于SE固体培养基板，在30℃下2klx、16h/8h光暗周期培养约4天，重复该过程7-8次，期间不断提高抗生素浓度至80mg/L，连续抗性筛选获得纯合单藻落，4℃保存备用。

液体筛选：将获得的单藻落从平板上挑取到含有G418抗生素的6孔板或12孔板中，待其长到一定浓度(约10⁵/mL)后，再按照1-2％的接种量转接到含有G418抗生素的50ml锥形瓶中，装液量为20ml，在30℃、2klx、150rpm条件下培养3天后，扩培到含G418抗生素的250ml锥形瓶中，继续传代培养7-8次，期间不断提高抗生素浓度至80mg/L，获得高表达的纯化单藻落，保种备用。

(3)转化藻株的PCR鉴定

首先采用藻落PCR法鉴定AtNADK3基因，再对筛选得到的单克隆藻株液体扩培，传代培养7-8次后，选择抗性较高且稳定表达的藻株，采用基因组DNA提取的方法进一步鉴定目的基因，同时考察稳定性。

1)单克隆-PCR法鉴定：从电击转化后的平板上随机挑取几株长势较好的单藻株，在含50mg/L的G418固体平板上传代2-3次后挑取单藻株，融于装有TE溶液的EP管中，漩涡振荡，煮沸5分钟，离心后取上清液，-20℃保持。

以离心后的上清液为模板，同时设置阴性对照野生藻DNA以及空白对照，使用下述29HSPNK3-JD引物来鉴定AtNADK3基因，产物长度501bp。

29HSPNK3-JD 上游引物：CAGCAACGACGGCAACTACT

下游引物：CACGAATGGGATGCGATAAG

反应结束后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2)基因组DNA提取与鉴定：将液体筛选得到的纯化单藻落，培养至2-3天时收集藻细胞，液氮速冻后置于-80℃备用。先取约100mg藻细胞于洁净无菌的研钵里，加入液氮充分研磨成粉末状，再用天根生化科技(北京)有限公司的新型植物基因组提取试剂盒(产品号：DP320)提取基因组DNA，具体步骤参照试剂盒内说明书。

以提取的转基因藻DNA为模板，同时分别使用0029HspNK3质粒和野生藻的DNA为阳性和阴性对照，并设置不加模板的空白对照，用29HSPNK3-JD引物通过PCR来鉴定NADK3基因。反应结束后，电泳检测PCR产物，结果见图3。由图3可以看出，1号泳道中的阴性对照没有条带，3号阳性对照组中可见单一明亮条带，并且目标条带的位置在500bp左右，2号和4-11号泳道中的转化藻株，泳道4-9(6株)的转化株成功整合了AtNADK3基因，且条带位置符合预期的位置(500bp左右)，其他的藻株可能是在培养过程中发生了基因丢失。

(4)转化藻株的生长情况分析

将鉴定获得的转化藻株和野生型藻株(阴性对照)，分别进行异养和光自养培养鉴定。

异养培养操作如下：在Endo培养基中避光培养，摇瓶为500ml，装液量100ml，培养条件是30℃、150rpm，结果见图4。

光自养培养操作如下：在BBM培养基中培养，1L柱式反应器，通入2％CO₂，通气量为1vvm，光照强度10klux，温度30度，结果见图5。

对每天的藻细胞干重使用SPSS软件进行显著性分析，结果表明无论是异养还是光自养，转基因藻株和野生型对照的生物量都没有显著性差异(p>0.05)(学生t检验)，表明转化藻株和野生型藻株的生长曲线基本一样，具有相似的生长趋势。

(5)转化藻株的qRT-PCR鉴定

将Endo培养基中异养黑暗培养到72小时的藻细胞，分别切换到强光(50klux)和热激(42℃)处理24小时，将各个时间点的藻株样品提取总RNA，并反转成cDNA。使用SYBR染料法，以肌动蛋白(Actin)作为参照基因，每组设置3个平行，具体方法参照TOYOBO公司的SYBRGreen Realtime PCR Master Mix–Plus试剂盒使用说明书。AtNADK3基因的qRT-PCR上下游引物如下，产物长度为239bp。

Q-NADK3 上游引物：ATCGCATCCCATTCGTGAT

下游引物：TGCCAAACAAAATGTCATCCA

qRT-PCR由图6所示，热激处理对AtNADK3基因的转录在4小时有显著的促进作用。到24小时时，光照的刺激对AtNADK3基因的转录诱导比较明显，AtNADK3基因仍然持续高表达。

实施例4：包含转Ⅲ型NAD激酶基因的微藻中油脂和脂肪酸含量的检测

本实施例检测包含转Ⅲ型NAD激酶基因的微藻中油脂和脂肪酸含量。在本实施例中，所述Ⅲ型NAD激酶是来自拟南芥的AtNADK3基因，所述微藻是蛋白核小球藻FACHB-9。

(1)NADPH含量的测定

由于NADPH可以通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒，所以检测570nm下的吸光值，可以测定NADPH含量。选取三株包含转AtNADK3基因的微藻(NADK3-1、NADK3-2和NADK3-3)，将Endo培养基中异养黑暗培养到72小时的藻细胞，分别切换到强光(50klux)和热激(42℃)处理24小时，将新鲜藻细胞液氮研磨，然后采用苏州科铭生物技术有限公司的NADP(H)含量测试盒，利用酶标法测定吸光值，具体操作步骤参考试剂盒内说明书。测定结果示于图7。图7中可以看出，相比野生型藻株，无论是热激还是光照处理，三株不同的转化株细胞内NADPH含量提高了39.3％-79.9％，并且这种提高具有统计学显著性(学生t检验，p<0.05)。这些结果表明AtNADK3基因在微藻细胞中过量表达并正确行使了催化酶的功能。

(2)油脂含量的测定

采用氯仿甲醇法测定藻细胞中的油脂含量。准确称量经冷冻干燥并研磨后的藻粉约0.3g(藻粉重量为W)，加入50mL离心管中，加入氯仿：甲醇(v/v＝2:1)混合液40mL，超声破碎30分钟，然后4000rpm离心10分钟。将上清液转移至已经精确称量的旋转蒸发瓶(蒸发瓶重量为G₁)中，重复上述操作直至离心管上清至无色。最后将旋转蒸发瓶中的液体蒸发干，将旋转蒸发瓶置于烘箱中烘干，精确称量旋转蒸发瓶的重量(此时蒸发瓶重量为G₂)，使用如下公式来计算藻类中的油脂含量。

油脂含量(％)＝(G₂-G₁)/W×100％

油脂含量的测定结果示于图8。由图8可以看出，相比野生型藻株，无论是热激还是光照处理，三株不同转化株的油脂含量提高了45.3％-110.4％，并且这种提高具有统计学显著性(学生t检验，p<0.05)。

(3)脂肪酸组成的分析

随机选取上述方法获得的转化株NADK3-2的油脂，加入3mL 0.5N的KOH-CH₃OH溶剂和1mL 0.2mg/mL的C10:0(十烷酸，购自Sigma公司，溶剂是正己烷)作为内标物，于75℃水浴20分钟。冷却后再加入3mL 14％的BF3(三氟化硼)，75℃条件水浴20分钟。待冷却后，加入1mL的饱和食盐水和1mL的正己烷进行萃取，随后4000rpm离心10分钟后，取上层含有脂肪酸甲酯的液体(500μL)，采用Agilent公司的6890N/5975气相色谱-质谱(GC-MS)检测系统。使用的色谱柱为HP-5MS弹性毛细孔柱(含5％的苯甲基硅油)，柱体积为30m×0.25mm×0.25μm，使用氮气作为保护气，流量为2.0mL/min。升温程序如下：120℃维持2分钟，再以15℃/分钟的速度从120℃升温至180℃，随后以1℃/分钟的速度从180℃升温至205℃，检测口温度为280℃。脂肪酸含量的测定结果示于图9。

由图9可以看出，脂肪酸组成的结果显示，转化株NADK-2在不同诱导条件下对脂肪酸不同碳链和饱和度的影响很小。相比野生型藻株，无论是热激还是光照处理，所有系列的脂肪酸均有不同程度的提高，比野生型藻株提高至少2倍，并且这种提高均具有统计学显著性(学生t检验，p<0.05)。这些结果表明转AtNADK3基因对于提高藻细胞内脂肪酸含量有明显的促进作用。

微藻油脂向生物柴油的高效转化技术目前国内外研究较多，技术已经相对成熟。通常，培养获得微藻细胞后，进行采收。提取出细胞中的粗油脂后，采用转酯化技术(化学法或者酶法)进行生物柴油的加工，获得脂肪酸甲酯生物柴油，然后可以直接和石化柴油混合添加使用。

以上结合附图示例性地说明了本申请的各实施例。本领域技术人员根据本说明书公开的内容可以很容易地想到，可以根据实际需要对各实施例进行适当调整和重新组合，而不会脱离本申请的精神。本申请的保护范围以本申请的权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种使用Ⅲ型NAD激酶提高微藻中油脂或脂肪酸含量的方法；

所述方法包括构建包含Ⅲ型NAD激酶的表达载体，将所述表达载体转化到微藻中表达；

所述Ⅲ型NAD激酶是来自拟南芥的AtNADK3激酶；

所述微藻是蛋白核小球藻FACHB-9；

所述表达载体选自表达载体pGreen0029系列载体；

所述表达载体包含启动子，所述启动子选自蛋白核小球藻的内源性HSP70A启动子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AtNADK3激酶的基因序列为如SEQ IDNO:1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AtNADK3激酶的氨基酸序列为如SEQID NO:2所示的序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化Ⅲ型NAD激酶的微藻中油脂含量提高了至少45％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化Ⅲ型NAD激酶的微藻中脂肪酸含量提高了至少2倍。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体包含抗生素抗性基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。

8.Ⅲ型NAD激酶在提高微藻细胞中脂肪酸和油脂含量的应用；所述Ⅲ型NAD激酶是来自拟南芥的AtNADK3激酶；所述微藻是包含Ⅲ型NAD激酶的表达载体的蛋白核小球藻FACHB-9；所述表达载体选自表达载体pGreen0029系列载体；所述表达载体包含启动子，所述启动子选自蛋白核小球藻的内源性HSP70A启动子。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述AtNADK3激酶的基因序列为如SEQ IDNO:1所示的序列。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述AtNADK3激酶的氨基酸序列为如SEQID NO:2所示的序列。