CN106047873B

CN106047873B - 一种三角褐指藻高表达启动子及其应用

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Publication number: CN106047873B
Application number: CN201610264773.XA
Authority: CN
Inventors: 李宏业; 陈嘉雯; 刘婉君; 杨维东; 刘洁生
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2019-01-29
Anticipated expiration: 2036-04-26
Also published as: CN106047873A

Abstract

本发明公开一种三角褐指藻高表达启动子PPtHsp20及其应用。本发明从三角褐指藻中克隆出Hsp20基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的启动子PPtHsp20能够启动下游基因在微藻细胞生长的生长周期高效表达，因此可将其应用于基因工程中，在基因工程中有良好的应用前景。

Description

一种三角褐指藻高表达启动子及其应用

技术领域：

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种三角褐指藻高表达启动子及其应用。

背景技术：

当前，世界性能源短缺和环境污染已经成为人类社会所面临的巨大挑战，因此，寻找一种替代化石能源的新型可再生清洁能源，已成为世界各国的共识。生物柴油(Biodiesel)，其性能跟石化柴油基本相当，且具有良好环保性和生物降解性，已成为国际上应用最广、发展最快的理想可再生能源。目前，生物柴油是指来自生物体的油脂(主要为甘油三酯)与醇类(甲醇或乙醇)经酯交换作用而形成单烷基脂肪酸酯。

微藻制生物柴油的原理是利用微藻光合作用，将化工生产过程中产生的二氧化碳转化为微藻自身的生物质，从而固定了碳元素，再通过诱导反应使微藻自身的碳物质转化为油脂，然后利用物理或化学方法把微藻细胞内的油脂转化到细胞外，再进行提炼加工，从而生产出生物柴油。微藻是光合自养型的低等水生植物，其种类繁多，分布极其广泛。其具有光合作用效率高，生长快速，生物量大等特点。而且油脂含量较客观，已成为制备生物柴油的优质天然原料，是未来生物柴油发展的研究热点。目前，微藻生物柴油的生产能耗和高昂成本是阻碍其产业化的关键问题。

海洋硅藻富含油脂，一般占细胞干重的40％-60％，且短链脂肪酸(C14与C16)占总脂肪酸的67％-70％左右。2008年，海洋硅藻三角褐指藻基因组已测完，是硅藻生物学研究的模式藻。其油脂含量一般在20％-30％左右，是制备生物柴油的优质原料。通过基因工程技术手段构建出高油脂含量的工程微藻有望提高生物柴油的产率。

目前，通过基因工程手段获得的高产油三角褐指藻，大多数都是过表达某个脂质相关的关键基因得到的。然而，这种方法获得的产油藻的产油效果是有限的。当前，在三角褐指藻产油的研究中，广泛应用的启动子只有一种，这大大阻碍了微藻基因工程的发展。

启动子是一段位于基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子一般由启动子核心元件和上游元件组成。位于转录起始位点上游-20～-30bp处的TATAbox为启动子核心元件，是富含有AT的保守序列区，与DNA(脱氧核糖核酸)双链的解链有关，并决定转录起始点的选择，是绝大多数植物启动子正确表达所必需的。TATAbox上游的保守序列称为启动子上游元件，包括上游-75bp处的CAAT box和-80--110bp附近的GC box等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件。大量文献表明启动子元件的种类、数量以及彼此间胡顺序与距离都可能影响基因的转录与否或转录程度，不同基因其启动子的长度各有不同，所含有胡元件也各有不同，因此，启动子的长度与其启动基因的转录有关。

目前，通过基因工程获得的高产油微藻一般都是使用三角褐指藻内源型启动子fcp(fucoxanthin，chlorophyll a/c-binding protein，墨角藻叶绿素a/c结合蛋白)基因簇，此启动子已实现多个报告基因与目的基因的稳定表达。然而，若想同时表达多个脂质关键基因，只有一个启动子是不够的，在动物中，同时过表达多个基因的技术已经相当成熟。只要有不同的启动子，就能同时过表达不同的基因。但是，在三角褐指藻中只有少数启动子被证实并广泛应用。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种三角褐指藻热休克蛋白基因Hsp20高表达启动子。

所述的三角褐指藻热休克蛋白基因Hsp20高表达启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的三角褐指藻热休克蛋白HSP20基因，在GenBank的基因组编号为PHATRDRAFT_35158，本发明克隆该基因的预测编码区的上游区域，命名为启动子PPtHsp20。其在微藻整个繁殖周期均可高效启动报告基因的转录表达。同时，在热激条件下，报告蛋白的表达提高了约5-25倍。本发明的三角褐指藻热休克蛋白基因Hsp20高表达启动子位于三角褐指藻7号染色体上，全长759bp，在染色体上位置是：187601-186843。

通过PLACE(ADatabase ofPlant Cis-acting Regulatory DNAElements)和PLANTCARE预测软件对该启动子(759bp)进行分析，发现该序列具有启动子的基本组成元件TATA-box、CAAT-box，且包含多个诱导元件，光诱导顺式作用元件：-10promoter element；光诱导转录元件：T-box、GT-1box；热诱导元件：CCAAT box；硫反应核心元件：SURE；质体PatpB基因启动子核心元件：Box II。

本专利把此启动子与报告基因GUS连接，构建到带有抗性基因(博来霉素)的质粒中，通过电击等方法，把重组质粒整合到三角褐指藻的基因组中，只需验证GUS的表达即能验证启动子的启动效率。

目前在转基因植物中广泛应用的GUS基因由大肠杆菌E.coli菌株K12中uidA(也称gusA)基因座编码。该基因编码的β-葡萄糖苷酸酶，系统命名为β-D-glucuronideglucuronosohydrolase(EC 3.2.1.31)。该酶是一种外切水解酶，能催化多种β-D-葡萄糖苷酸类物质水解为D-葡萄糖醛酸和糖苷配基。1987年Jefferson等克隆了GUS基因并进行了测序，由此发展出用GUS基因作为基因融合标记的系统。由于在绝大多数植物的细胞内不存在内源的GUS活性，而且GUS基因表达产物具有检测方法简单、灵敏度高、易于定量及定位分析、可以与其他蛋白质基因融合等优点，使得GUS基因成为近年来在植物基因工程研究中应用最为广泛的报道基因之一。

目前常用于GUS组织化学定位的酶作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide,简称X-Gluc)。这一底物能够在酶活性位点形成蓝色沉淀物。β-葡萄糖苷酸酶作用于X-Gluc的初始产物为无色的吲哚衍生物，经过氧化二聚化作用形成不溶解的5,5′-二溴-4,4′-二氯深色的靛蓝色物质，使得具有GUS活性的部位呈现蓝色。

本发明的启动子PPtHsp20是三角褐指藻内源启动子，启动热休克蛋白的表达，因此，本发明验证了在三角褐指藻一个生长繁殖周期的正常条件和热激后的启动子效率。分别利用GUS染色组织染色法和实时荧光PCR(Real-time qPCR)方法来检测该启动子的效率。

Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。设在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。对RT-PCR产生的结果，分析时采用2^-CT法，即按照如下公式进行计算：

1.ΔCt(目的基因Ct—内参Ct)的平均值±标准偏差；

2.ΔΔCt(待测样品中目的基因ΔCt—参照样品中目的基因ΔCt)的平均值±标准偏差；

3.相对表达量(2^-ΔΔCt)的平均值±标准偏差；

本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有上述三角褐指藻热休克蛋白基因Hsp20高表达启动子。

本发明的第三个目的是提供一种宿主细胞，其特征在于，含有上述表达载体。

所述的宿主细胞优选为三角褐指藻。

本发明的第四个目的是提供上述启动子PPtHsp20在启动下游基因在三角褐指藻的细胞生长周期高效表达的应用。

所述的微藻优选为三角褐指藻。

所述的下游基因优选为三角褐指藻热休克蛋白HSP20基因。

本研究发现的启动子序列没有任何文献报道过，在GenBank等公开数据库也没有任何注释是启动子及何种特征的启动子。本发明为首次发现并鉴定该启动子的功能、启动效率。本发明从三角褐指藻中克隆出Hsp20基因的启动子：三角褐指藻热休克蛋白基因Hsp20启动子，该启动子能够启动下游基因在三角褐指藻的细胞生长周期均能高效表达，因此可将其应用于基因工程中在基因工程中有良好的应用前景。

附图说明：

图1是重组载体图谱；

图2是PCR验证结果，其中，TC是转化藻，WT是野生藻；

图3是转化藻GUS染色图，其中，1是对照藻，2是转化藻；

图4是三角褐指藻染色后细胞形态图，其中，A、B是野生藻，C、D是转化藻；

图5是三角褐指藻热激后GUS染色图；

图6是第一、四、八天野生藻和转化藻在正常及热激条件GUS染色效果，其中，第1、4、7为第一、四、八天野生藻，第2、5、8为第一、四、八天正常条件转化藻，第3、6、9为第一、四、八天热激条件转化藻；

图7是第一天正常条件及热激后RT-PCR分析结果；

图8是第四天正常条件及热激后RT-PCR分析结果；

图9是第八天正常条件及热激后RT-PCR分析结果。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、启动子和GUS基因的克隆

首先，提取三角褐指藻的基因组DNA，采用Magene公司的植物DNA提取试剂盒进行。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE方法纯化，使用时稀释到100μM。启动子PPtHsp20在三角褐指藻DNA中克隆，GUS基因于通用载体pCAMBIA1301(于上海捷兰生物技术有限公司购买)中克隆。其中克隆条件均采用PCR方法，使用KOD-plus-Neo酶(TOYOBO，JAPAN)PCR获得，启动子PPtHsp20及GUS基因的PCR引物如表1所示，PCR反应体系分别如表2和表3所示，三角褐指藻HSP20基因的启动子没有确认，本发明通过多个预测软件预测到PPtHsp20启动子的核心元件，并取其中759bp为启动子区域，在此区域设计引物。

表1.PCR引物

表2.PCR反应体系(20μl)

表3.GUS基因PCR反应体系(20μl)

反应条件为：预变性：94℃,2min.

通过PLACE(ADatabase ofPlant Cis-acting Regulatory DNAElements)和PLANTCARE预测软件对上述克隆的序列进行分析，发现该序列具有启动子的基本组成元件TATA-box、CAAT-box，且包含多个诱导元件，光诱导顺式作用元件：-10promoter element；光诱导转录元件：T-box、GT-1box；热诱导元件：CCAAT box；硫反应核心元件：SURE；质体PatpB基因启动子核心元件：Box II。该序列被命名为启动子PPtHsp20。

二、构建重组载体

把上述克隆出来的启动子PPtHsp20、GUS基因以及fcpA终止子(277bp，由上海生工生物有限公司合成)通过采用ClonExpress MultiS One Step Cloning试剂盒(VazymeBiotech Co.,Ltd，nanjing)同源重组的方法连接到含有博来霉素抗性表达盒的载体，含有博来霉素抗性表达盒的载体是由pPt-ApCAT载体(pPt-ApCAT载体的构建步骤参考Niu等，2011)把氯霉素抗性基因通过本领域技术人员熟知的常规基因工程手段替换成博来霉素基因获得，得到含有启动子PPtHsp20和GUS基因的重组表达载体(如图1所示)。采用的试剂盒是诺唯赞生物科技有限公司的one step cloning KIT。

三、三角褐指藻转化及转化藻的筛选

参考Niu等(2012)的电击方法把重组载体整合到三角褐指藻基因组中。通过4-5次博来霉素的筛选获得具有抗性的转化藻。

四、转化藻的验证

第一步，在分子水平上验证，把100ml转化藻和100ml野生型三角褐指藻3000g离心5min收集，用PBS溶液清洗3次后用Magene公司的植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA，用GUS-F引物(F:5’ATGTTACGTCCTGTAGAAA 3’)和GUS-R引物(；R:5’TGTTTGCCTCCCTGCTGCGGT3’)进行PCR，结果如图2所示，第3列是转化藻，第4列是野生型藻，转化藻在大概1.8kb处有条带，而野生型藻没有，可知转化藻中已含有GUS基因。

第二步，在表观上验证，把100ml转化藻和100ml野生型三角褐指藻3000g离心5min收集，藻沉淀用GUS染色试剂盒37℃染色过夜，然后5000g离心弃上清，加入1ml固定液(乙醇：乙酸＝3:1)洗脱30min，结果如图3所示，1为对照藻，染色后无颜色变化，2为转化藻，染色后形成蓝色沉淀物，由此可知，转化藻均能表达GUS基因。

第三步，从细胞形态上观察。转化藻通过GUS染色后，取10μl的藻液置于倒置显微镜观察细胞形态，如图4所示。A、B为野生型的藻细胞没有染上蓝色，C、D为转化藻细胞整个细胞均染成蓝色。

五、确定三角褐指藻的热激温度

据文献报道莱茵衣藻热激条件是40℃热激30分钟后正常条件复苏2小时。取50ml的转化后的三角褐指藻，在30℃、35℃、40℃水浴30分钟后正常培养2小时，然后3000g离心5分钟，藻沉淀用GUS染色试剂盒染色过夜，然后5000g离心弃上清，加入1ml固定液(乙醇：乙酸＝3:1)洗脱30分钟。如图5所示，热激30℃、35℃、40℃后采用GUS染色试剂盒染色均能染成蓝色，然而35℃时转基因藻染成蓝色的程度最深，其他两个温度均是浅蓝色，因此可以证明35℃为最适温度。

六、GUS染色验证启动子效率

对转化藻的报告基因GUS进行表观验证。将野生型藻和转化藻分别放置在新的培养基中且藻密度控制在1x10⁶个/ml，分别取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的数量控制在2.2x10⁸个。藻沉淀用GUS染色试剂盒37℃染色过夜，然后5000g离心弃上清，加入1ml固定液(乙醇：乙酸＝3:1)洗脱30min后拍照。结果如图6所示，由图五可知，第一天转化藻GUS染色显示最接近蓝色，第四，第八天GUS染色为蓝绿色，推测原因是，在三角褐指藻生长周期初期启动表达的GUS基因效率最高，对数期和稳定期启动效率降低。除此以外，通过热激后，转化藻GUS染色均比没热激的颜色都要接近蓝色。

七、RT-PCR检测启动子效率

本发明对转化藻的报告基因GUS进行荧光实时定量分析。野生型藻和转化藻放置新的培养基中且藻密度控制在1x10⁶个/ml，分别取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的数量控制在3x10⁸个。3000g离心5min，于-80°保存。采用Omega公司的植物RNA提取试剂盒获得三角褐指藻的RNA，TAKARA公司的反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。针对GUS基因的特异引物F:5’GCCAAAAGCCAGACAGAGTG3’；R:5’TGACGACCAAAGCCAGTAAAG3’，用于实时定量扩增。所用荧光探针SYBR qPCRMix购自TAKARA公司，实验所用的检测设备为美国Bio-Rad公司的CFX96Touch^TM荧光定量PCR检测系统。结果如图7-9所示。由此可见，该启动子在三角褐指藻生长繁殖周期都能高效启动目的基因表达，并且均能显著性提高目的基因表达。第一天GUS基因相对表达量最高，热激效果比正常情况高6.7倍；第四天转化藻热激效果比不热激的高24倍；第八天转化藻热激效果是不热激的4.7倍。因此，通过热激，可以提高目的基因的表达，最高达到24倍。实时定量PCR结果可知，PPtHsp20启动子在三角褐指藻生长周期均能高效启动基因的表达。

Claims

1.一种三角褐指藻热休克蛋白基因Hsp20高表达启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的三角褐指藻热休克蛋白基因Hsp20高表达启动子。

3.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。

4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为三角褐指藻。

5.权利要求1所述的启动子在启动下游基因在微藻的细胞生长周期高效表达的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的微藻为三角褐指藻。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的下游基因为三角褐指藻热休克蛋白HSP20基因。