CN105802927B - 一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种6‑磷酸葡萄糖脱氢酶及其编码基因和应用。本发明的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示，其编码的G6PD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明首次从微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)CCAP849/10中克隆到G6PD基因，并且通过转化实验证明该基因能够影响植脂质代谢，促进脂肪酸的合成，提高脂质含量。因此，本发明提供的微拟球藻的G6PD基因为基因工程改良微藻产油进程，对提供一株性能优良的微藻藻株提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

Description

一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶及其编码基因和应用。
背景技术
6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)是磷酸戊糖途径中关键的限速酶，能够催化6磷酸葡萄糖脱氢，产生大量的NADPH，为细胞的各种合成反应提供还原剂(力)，比如参与脂肪酸和固醇类物质的合成。
近年来研究证实，油脂积累期间6-磷酸葡萄糖脱氢酶活力的降低和油脂积累程度有直接的联系。因此研究6-磷酸葡萄糖脱氢酶在产油藻类中的调控作用，对于实现提高产油生物中的油脂含量具有重大意义。
近年来6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)受到普遍关注，在动物、酵母、人类、植物中做了很多研究来探究G6PD的功能(Zhang,2008#93；Lojudice,2001#102；Legan,Rebrin etal.2008；Wang,2012#90)。
G6PD还参与脂肪酸的生物合成。G6PD催化磷酸戊糖途径的第一个反应并产生NADPH和磷酸戊糖。G6PD是该途径的限速酶，反应产物NADPH通过提供还原力促进脂肪酸的合成(Salati and Amir-Ahmady,2001)。有研究表明，在此反应过程中，NADPH不断生成，能够提供肝脏中脂肪酸合成所必须的50-75％的还原力(R.Rognstad 1979)。G6PD基因在受到外界刺激如激素、生长因子、营养条件以及氧化应激的调节时，会进行转录以及转录后水平的调节(Kletzien,1994#86)。有研究表明，在受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制时，脂肪合成酶包括G6PD同样受到调节，但是不同的脂肪合成酶受到的调节不同。G6PD是唯一一个可以在转录后水平调节的酶，所以能够有效地调节脂肪合成(Kohan,2009#50)。
G6PD是众多参与脂肪生物合成的酶中唯一一个参与多个代谢路径的酶，目前许多关于该酶的研究表明G6PD与细胞生长、抵抗胰岛素、高脂血、心血管疾病、糖尿病以及动物体内的氧化应激等相关。(Batetta,Bonatesta et al.2002；Park,Rho et al.2005；Gupte.2008；Legan,Rebrin et al.2008；Schneider,Rawat et al.2012)。G6PD在调控NADPH的生成及氧化还原平衡中起着重要的作用，还能够有效地调控细胞分化，细胞生长以及物质代谢。G6PD在G6PD缺陷的人纤维细胞中的异位表达能够有效地阻止缺陷细胞的生长迟缓以及细胞早衰。(Ho,2000#83)。G6PD基因的上调与黑腹果蝇的寿命延长以及肿瘤性转化包括胃癌(Wang,2012#103)，肾细胞癌(Langbein,2008#106)，纤维肉瘤(Frederiks,2006#105)等显著相关。同样，还有报道称在G6PD缺陷的外周血淋巴细胞及单核细胞中，G6PD的低表达能够抑制胆固醇代谢和细胞生长(Batetta,Bonatesta et al.2002)。这些研究能够充分说明G6PD对于细胞生长的重要作用。另外还有研究表明胚外组织的G6PD活性的严重缺陷能够导致氧化还原平衡的混乱，导致细胞生长的调剂异常最终胚胎死亡(Longo,2002#80)。由以上研究可知G6PD对于机体的正常生长以及适应外界环境有重要的作用。
研究表明提高G6PD的表达量，提高G6PD的酶活，可提高NADPH的合成，还有研究报道提高G6PD的表达能够促进大部分脂肪基因的表达。G6PD在脂质的生物合成路径中发挥显著的作用，在人类肝脏中过表达G6PD基因能够提高细胞内甘油三酯和游离脂肪酸的含量并能促进脂肪细胞中游离脂肪酸的释放，并能增加脂肪细胞因子的表达、刺激胰岛素抵抗。尽管脂质生物合成的增加与G6PD活性的增加紧密相关，但是具体的相互作用机制相当复杂至今还未能完全研究清楚(Schneider,Rawat et al.2012)。在动物中，G6PD的过表达同样能够刺激肥胖动物的脂肪生成，G6PD的过表达与脂肪酸代谢物包括游离脂肪酸(FFAs)和甘油三酯(TAG)的增加相关。与正常的脂肪细胞相比，过表达G6PD基因的3T3-L1细胞中的G6PD活性提高了1.4倍，使得过表达G6PD基因的细胞中脂肪滴变多变大(Park,Rho et al.2005)。通过基因改造可以啤酒酵母菌也能够产生高水平的G6PD活性以及G6PD基因的表达量。(Lojudice,2001#102)。有研究表明G6PD基因的过表达与血脂异常相关，在过表达G6PD的肥胖小鼠中，游离脂肪酸达到了相当高的水平。与正常的小鼠心脏相比，过表达G6PD的小鼠心脏G6PD基因的表达量增加了10倍，G6PD活性增加了2倍(Gupte 2008)。在另外的研究中也表明在患有糖尿病的肥胖小鼠肝脏中G6PD也明显增加(Gupte,Floyd et al.2009)。相应的，敲除G6PD基因能够抑制肥胖小鼠的脂肪生成。G6PD缺陷的细胞中脂肪细胞的分化减弱，脂肪滴积累的数量变少，脂肪滴变小，细胞内游离脂肪酸以及甘油三酯的积累水平明显降低(Park,Rho et al.2005)。G6PD缺陷的个体同样表现出β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a以及3—羟基—3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶活性相应的降低，从而导致胆固醇以及低密度脂肪酸合成减少(Meloni,Manca et al.2008).，(Batetta,Bonatesta et al.2002)。酵母水解产物的补充能够通过下调肥胖小鼠肝脏中G6PD的活性从而抑制脂肪酸的合成，使得小鼠脂肪积累减少(Jung,2012#40)。通过小干扰RNA敲除G6PD基因会降低细胞内脂质积累、阻碍重要的脂肪基因的表达(Park,Rho et al.2005)。在G6PD缺陷病人中，血清蛋白的浓度以及脂质生成的速率都会降低(Dessi,Chiodino et al.1986；Dessi,Batetta et al.1992)。G6PD活性与代谢显著相关，尤其是紧密参与多不饱和脂肪酸的代谢。G6PD的活性会因饮食中糖类的刺激而增加，在食入的多不饱和脂肪酸刺激下降低(Salati,2001#52)。
G6PD在人类及动物中有较多研究，以上这些结果表明提高G6PD的表达能够促进脂肪酸合成的可能性。但是迄今G6PD在植物及藻类中缺乏研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种来自于藻类的6-磷酸葡萄糖脱氢酶及其编码基因和应用。
本发明的第一个目的是提供一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示或为其变体、同系物、片段或衍生物。
优选，所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的同一性至少为80％。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因。
优选，所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种含有所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组表达载体。所述的重组表达载体，优选pHY21载体。
本发明还提供一种含有所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组宿主细胞。所述的重组宿主细胞，优选蛋白核小球藻。
本发明的第三个目的是提供所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶在增加中性脂的生物合成中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶在增加不饱和脂肪酸的生物合成中的应用。
本发明以微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)CCAP 849/10(formerlyCCMP1779)购自NCMA(National Center for Marine Algae and Microbiota,USA)为材料，提取其总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA第一链，以该cDNA第一链模板，根据另一株微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)的G6PD基因设计引物，利用RT-PCR的方法扩增拼接获得全长cDNA序列，该cDNA序列长度为1593bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，其开放阅读框为自5’端第1位至第1593位碱基，共1593bp，将此开放阅读框命名为G6PD基因，其编码的蛋白的氨基酸序列具有530个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示，将该蛋白命名为G6PD蛋白。
将微拟球藻的G6PD基因编码的蛋白质序列用ClustalW2分析其同源性，采用MEGA5对微拟球藻的G6PD基因编码的氨基酸(G6PD蛋白)序列进行系统进化分析。结果显示G6PD蛋白具有G6PD类蛋白的两个保守区即G6PD-N以及G6PD-C保守区。G6PD-N保守区由N端的第83位至第261位氨基酸组成，G6PD-C保守区由第265位至429位氨基酸组成。微拟球藻的G6PD蛋白与卡氏棘阿米巴的同源性最高，并与大麦和小麦聚在一枝。
本发明人将上述G6PD基因与微藻表达载体pHY21连接，通过电击转化方法，将含有G6PD基因的重组藻类表达载体转化到蛋白核小球藻中，经筛选培养获得含有G6PD基因的转基因蛋白核小球藻。通过实验发现，该转基因蛋白核小球藻与野生型蛋白核小球藻相比，转基因蛋白核小球藻脂质含量显著提高，2个转化株的脂质含量分别为野生型的2.72、3.03倍。由此表明，外源微拟球藻G6PD基因具有提高脂肪酸合成的功能，其在宿主蛋白核小球藻中实现了超量表达，显著提高了蛋白核小球藻脂质的产量。
从上述结果分析可以表明，本发明的G6PD基因是一个参与脂质代谢的基因，该基因能显著提高脂质合成从而提高脂质产量。因此可以将本发明的G6PD基因应用到提高微藻脂质产量以及新型能源生物柴油的开发利用中。本发明首次从微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)CCAP 849/10中克隆到糖酵解限速酶G6PD基因，并且通过实验证明该基因能够产生大量的NADPH，为细胞代谢提供足够的还原力，显著提高了脂质合成，改变了脂肪酸成分。因此，本发明提供的微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)CCAP 849/10的G6PD基因为基因工程改良绿藻的脂质代谢，对微藻的脂质积累进行调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。
本发明的G6PD蛋白催化磷酸戊糖途径的第一个反应并产生NADPH和磷酸戊糖。G6PD蛋白是该途径的限速酶，反应产物NADPH通过提供还原力促进脂肪酸的合成(Salatiand Amir-Ahmady 2001)。有研究表明，在此反应过程中，NADPH不断生成，能够提供肝脏中脂肪酸合成所必须的50-75％的还原力(R.Rognstad 1979)。G6PD基因在受到外界刺激如激素、生长因子、营养条件以及氧化应激的调节时，会进行转录以及转录后水平的调节(Kletzien,1994#86)。有研究表明，在受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制时，脂肪合成酶包括G6PD同样受到调节，但是不同的脂肪合成酶受到的调节不同。G6PD是唯一一个可以在转录后水平调节的酶，所以能够有效地调节脂肪合成(Kohan,2009#50)。通过过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因能够显著地提高微藻细胞内的脂质含量，为生物能源的研究奠定了基础。
附图说明
图1为G6PD基因的PCR扩增结果图，泳道M为100bp的ladder marker，泳道1、2为G6PD基因的扩增结果；
图2为G6PD基因编码的G6PD蛋白的保守区；
图3为G6PD基因编码的G6PD蛋白序列的进化树；
图4为G6PD蛋白序列与动植物以及其他微藻和菌类的G6PD蛋白序列的比较，Dme代表Drosophila melanogaster(黑腹果蝇)，Mci代表Mucor circinelloides(卷枝毛，霉菌)，Tae代表Triticum aestivum(小麦)，Noc代表本发明的微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)CCAP 849/10，Nga代表Nannochloropsis gaditana(另一株微拟球藻)；
图5为抗生素筛选阳性蛋白核小球藻的培养结果，其中，A为含10mg·L-1博来霉素平板培养的未转化藻，B为含10mg·L-1博来霉素平板筛选阳性转化藻；
图6为PCR验证转化藻株的结果图，泳道M为100bp的ladder marker；泳道1-4为不同转化藻株G6PD基因的扩增结果；泳道5为野生型微拟球藻G6PD基因的扩增结果。
图7为转化藻的Flag蛋白的Western blot分析图；
图8为转化藻中的G6PD基因的qPCR分析图；
图9为转化藻的G6PD蛋白的酶活检测结果；
图10为转化藻的脂质积累、生长和缺氮处理结果，A为每ml藻液的转化藻和未转化藻的中性脂质含量，B为尼罗红染色测定每106细胞的转化藻和未转化藻的中性脂质含量，C为转化藻和未转化藻的生长曲线，D为转化藻和未转化藻缺氮24～96小时后的中性脂质含量，Control、G6PD1和G6PD2为未进行缺氮处理组，Control-N、G6PD1-N和G6PD2-N为分别对Control、G6PD1和G6PD2株进行缺氮处理组；
图11为转化藻的光合作用效率；
图12为转化藻和未转化藻的激光扫描共聚焦显微镜检测图，A为未转化藻，B为转化藻株1；C为未转化藻株2。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明所使用的限制性内切酶、infusion DNA连接酶、NEB高保真Pfu聚合酶购自New England Biolabs(USA)；所有引物及核苷酸序列的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自广州鼎国生物有限公司。
实施例1
一、微拟球藻G6PD基因的克隆及其同源性分析。
1、以微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)CCAP 849/10(formerly CCMP1779)(购自美国海洋藻类和微生物中心)以及蛋白核小球藻(由中国科学院淡水藻种库提供)为试验材料。微拟球藻用液体f/2培养基进行培养，f/2培养基需预先用0.22μm的滤膜(购自Millipore,Billerica,MA,USA)进行过滤，所用的锥形培养瓶经1.034×105Pa(121℃)高压蒸汽灭菌30min；微拟球藻放置在智能生物人工气候培养箱中培养，温度为25±1℃，光照强度为200μmol光子·m–2·s–1，光暗比为15h/9h。蛋白核小球藻用BG11淡水培养基培养，同样在智能生物人工气候培养箱中培养，温度为25℃，光照强度为200μmol光子·m–2·s–1，光暗比为15h/9h。
2、RNA提取：用Trizol reagent(购自Invitrogen公司)进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程严格按照Trizol试剂的RNA提取流程说明。
3、采用PrimeScriptTM RT-PCR Kit反转录试剂盒(购自TaKaRa公司)逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明书进行。
4、基因的克隆：以逆转录的微拟球藻的cDNA第一链为模板，参考另一株微拟球藻(N annochloropsis gaditana)的G6PD基因设计引物，利用引物G6PD-F：ATGGCCAGCCACGGGCAGAATA和G6PD-R：GATACCGCAAGTGGTAGCTCAGA进行PCR扩增，采用KOD高保真酶(TOYOBO)进行PCR扩增，加样体系参照酶的说明书，其PCR反应程序为：98℃变性3min，随后进行35个循环反应(98℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 1min)，68℃延伸10min。将得到的PCR产物用凝胶电泳检测，结果如图1所示，得到约1600bp长度PCR产物。回收PCR产物，测序，获得1593bp的G6PD基因的全长cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。该序列的开放阅读框为SEQ ID NO.1的自5’端第1位至第1593位碱基，共1593bp，将该开放阅读框命名为G6PD基因，该基因编码由530个氨基酸残基组成的多肽，其序列如SEQ ID NO.2所示，命名为G6PD蛋白。
采用在线软件BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)及MEGA5对微拟球藻的G6PD基因编码的氨基酸(G6PD蛋白)序列进行系统进化分析。在Genbank中下载大量同源性高的蛋白序列，然后用Clustal X 2.10进行比对，用MEGA5将比对结果采用N-J法构建系统进化树(Tamura et al.,2007)，结果(图2)显示G6PD蛋白具有G6PD类蛋白的两个保守区即G6PD-N以及G6PD-C保守区。G6PD-N保守区由N端的第83位至第261位氨基酸组成，G6PD-C保守区由第265位至429位氨基酸组成。由图3可知微拟球藻的G6PD蛋白与卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)的同源性最高，并与大麦和小麦聚在一枝。将得到的微拟球藻的基因编码的蛋白序列与已知的动物Drosophila melanogaster(黑腹果蝇)、植物Triticum aestivum(小麦)、菌类Mucor circinelloides(卷枝毛，霉菌)、藻类Nannochloropsis gaditana(另一株微拟球藻)的G6PD蛋白序列进行比对，结果(图4)发现保守区相似性很高，由此确认我们获得的基因就是G6PD基因。
二、G6PD基因与重组载体pHY21的连接和转化
1、G6PD基因与pHY21载体的连接
(1)用Xcm Ⅰ(购自NEB公司)酶切处理pHY21载体5个小时，酶切体系参照说明书，在37℃下反应5个小时，得到酶切后的pHY21载体。
(2)将酶切后的pHY21载体凝胶电泳跑胶，切下相应的胶块后进行胶回收(纯化回收试剂盒为Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，购自大连宝生物公司)，测得浓度为0.201μg/μl。
(3)采用infusion连接酶(购自NEB公司)将纯化回收的特异的1593bp的G6PD基因片段和回收的pHY21载体进行连接，具体操作参照说明书，在37℃下反应30分钟，得到过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PD基因)的重组载体，命名为NoG6PD-pHY21。
2、重组载体NoG6PD-pHY21的转化筛选及提取
(1)将重组载体NoG6PD-pHY21转化至E.coli DH5α感受态细胞中(转化按照说明书进行)。
(2)挑平板并扩大培养，收集质粒。挑取多个菌落，置于LB液体培养基(含100mg/L氨苄)中进行37℃恒温震荡培养过夜。离心收集5mL震荡培养的单克隆菌，通过TaKaRaMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0试剂盒进行质粒的提取，提取方法按照说明书进行。
将提取的质粒用XcmⅠ酶切验证，酶切产物电泳结果如图6所示，酶切片段大小与G6PD基因大小相同，验证得到了阳性克隆。
将提取的阳性克隆质粒委托华大基因公司进行测序，测序验证获得了G6PD基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)成功连接在高效表达载体pHY21上的重组载体，由此确认成功构建了过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体NoG6PD-pHY21。
三、蛋白核小球藻的电穿孔转化及抗生素筛选阳性转化藻株
采用电穿孔法(所用电穿孔仪为Bio-Rad GenePulser Xcell)将上述过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体NoG6PD-pHY21导入蛋白核小球藻细胞中(具体方法参照朱聪聪等，2011)。
将重组载体NoG6PD-pHY21导入蛋白核小球藻细胞后，然后在含10mg·L-1博莱霉素的淡水BG11平板上培养2-3星期后观察转化细胞的生长状况，并查看得到分离的藻落。图5A为未转化重组载体NoG6PD-pHY21的蛋白核小球藻作为对照组，其平板由绿色变成白色，这是因为未转化的蛋白核小球藻细胞对博莱霉素敏感。实验组的平板得到分离的单藻落(如图5B所示)。挑取阳性藻落，接种于新鲜的淡水BG11培养基中培养，培养基含有10mg·L-1的博莱霉素，同时在相同条件下培养未转化的蛋白核小球藻，zeocin基因在转化了重组载体NoG6PD-pHY21的藻细胞中成功表达，因此该藻细胞对博莱霉素具有抗性；而未转化的蛋白核小球藻由于对博莱霉素敏感而凋亡。筛选的阳性藻株在博莱霉素浓度为10mg·L-1的淡水BG11培养基中培养5个周期后进行后续实验。
在本实施例的后续内容中为了描述简便，将未转化重组载体NoG6PD-pHY21的野生型蛋白核小球藻简述为未转化藻，筛选的阳性转化重组载体NoG6PD-pHY21的蛋白核小球藻简述为转化藻。
四、转化藻的蛋白提取和Western blot分析
由于重组载体NoG6PD-pHY21中含有Flag标签序列，可以通过对Flag标签序列的检测来检验目的G6PD基因的表达。为了检测G6PD基因的表达，采用植物蛋白提取试剂盒(购自凯基公司)提取转化藻和未转化藻的全蛋白，实验操作步骤完全按照试剂盒的说明书。然后采用BCA蛋白定量试剂盒(购自凯基公司)对提取的蛋白进行浓度测定(蛋白浓度为42ug·ml-1)。根据蛋白浓度确定SDS-PAGE的上样体积，最终上样量均为20μg。同时配置两块聚丙烯氨酰胺胶，进行SDS-PAGE实验，上样量及实验条件相同，实验条件为：胶浓度12﹪，电压100V，电泳时间100min。电泳结束后，取出一块胶进行考马斯亮蓝G-250染色分析，另一块胶进行电转移，蛋白转移到PVDF膜上。转移结束后，小心取出PVDF膜，将膜置于5﹪的脱脂奶粉封闭液中，4℃过夜。封闭结束后，往封闭液中加入1:5000的抗-Flag的小鼠抗体(购自Invitrogen公司)，室温孵育2h。然后用PBST溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，0.5％Tween 20，pH 7.6)洗涤3次，每次10min。回收一抗溶液，将膜置于1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(购自康为公司)，室温孵育2h。回收二抗溶液，用PBST溶液洗涤3次，每次10min，采用TMB试剂(购自碧云天公司)进行显色。采用蛋白核小球藻的β-Actin作为内参。
印记免疫实验结果(如图7所示)表明G6PD基因在转化藻(转化藻株1即G6PD1、转化藻株2即G6PD2，下同)中成功表达，抗-Flag的抗体探针特异结合目的蛋白，分子大小约58Kda。而未转化藻(对照/Control，下同)未出现任何条带，表明Western blot实验未出现抗体的交叉反应。与内参蛋白β-Actin的表达量相比较，转化藻成功表达了G6PD基因编码的蛋白。
五、蛋白的亚细胞定位预测，
蛋白重要的属性之一就是蛋白的亚细胞定位，它对于研究蛋白的功能有着重要的作用。蛋白的亚细胞定位信息对于理解被错综复杂的路径调控的细胞水平的生物进程是不可或缺的。因此，预测蛋白的亚细胞定位对于系统生物学的研究也有着重要的作用。首先在NCBI上获取了G6PD基因编码的蛋白序列，然后采用几个常用的蛋白亚细胞定位预测软件Target P ver1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)，Psort II Prediction(http://psort.hgc.jp/fo rm2.html)和Euk-mPLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)预测G6PD基因编码的蛋白在细胞中的特定位置。根据Target P的预测结果，蛋白核小球藻的G6PD基因编码信号肽不属于分泌蛋白(SP为：0.060)，G6PD基因编码的蛋白定位在线粒体(mTP)的可能性分别为0.275，而定位在其他位置的可能性为0.751。根据PSORT II预测的结果，蛋白核小球藻的G6PD基因有相当大的可能是编码细胞质蛋白(56.5％)，G6PD基因也可能存在于细胞外，存在于细胞核以及细胞骨架的可能性分别为：17.4％，13.0％。而编码过氧化物酶体蛋白和线粒体蛋白的可能性分别为8.7％和4.3％。Euk-mPLoc 2.0是用来预测定位于多个位点的真核生物的亚细胞定位，根据此软件的预测结果，蛋白核小球藻的G6PD基因定位于叶绿体。
综上所述，蛋白核小球藻的G6PD基因最可能定位于叶绿体。研究表明G6PD基因在不同的生物体中亚细胞定位不同，如叶绿体、胞液及线粒体。
六、转化藻的荧光定量PCR分析
为了检测目的基因在转化藻中的转录水平，本发明进行了荧光定量PCR实验。采用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR引物，对G6PD基因进行荧光定量PCR分析。β-actin基因作为管家基因，经常被作为内参分析数据，该发明以蛋白核小球藻的肌动蛋白(ACT，XM_ 011403467.1)作为分析数据的β-actin内参。用引物Gf(5’-ACGTGCCCAGCTTAAACCAT-3’)和引物Gr(5’-TCATTGTACTCACCCGACCG-3’)分析G6PD基因的表达；用引物ActF(5’-TGACTGAGGCTCCCCAGAAT-3’)和ActR(5’-GACGGCCTGGATATTGACGT-3’)分析内参β-actin基因。首先，采用植物RNA提取试剂盒(购自Takara公司)提取转化藻和未转化藻的总RNA，然后通过采用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(购自Takara公司)进行mRNA反转录合成cDNA。进行RT-PCR反应，反应体系25ul如下：10×PCR Buffer，2.5ul；25mM Mg2+，1.5ul；dNTP Mixture，0.5μl；Sense primer，1μl；Anti-sense primer，1μl；Taq，0.2μl；cDNA，1.5μl；dH2O，16.8μl。PCR反应程序如下：Cycle 1：(1×)94℃，3-4min；Cycle 2：(30×)94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；Cycle 3：(1×)72℃，10min；16℃，∞。
进行荧光定量PCR反应，反应体系的配制及反应参数等均按TaKaRaPremixEx TaqTMII(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行，荧光定量PCR的扩增曲线和融解曲线应用Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System的操作方法进行。最后运用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6数据分析软件进行分析，且采用2^-ΔΔCt法来计算。
转化藻的G6PD基因的qPCR分析结果(如图8)表明G6PD基因在转化藻中的转录水平显著提高，转化藻株1的G6PD基因的转录水平是未转化藻转录水平的2.84倍，转化藻株2的G6PD基因的转录水平是未转化藻转录水平的3.26倍。由此可得出G6PD基因在转化藻中成功进行过表达。
七、6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活测定
6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化磷酸戊糖途径的第一个反应并产生NADPH和磷酸戊糖，G6PD是该途径的限速酶，反应产物NADPH提供机体所需的还原力。6-磷酸葡萄糖脱氢酶广泛存在于动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高，是糖酵解的关键酶。6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。
由于G6PD的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADPH浓度的变化呈线性相关，所以G6PD的活性可通过检测NADPH的产率来测定，NADPH浓度升高越多则G6PD活力越大。微拟球藻的G6PD酶活通过G6PD酶活试剂盒(购自科铭，苏州，中国)来测定，具体实验操作严格按照说明书。取一定数量的未转化藻或转化藻细胞充分超声破碎，破碎完全后在4℃，8,000g离心10min，然后收集上层检测酶活。所有的实验操作都在30℃进行，用紫外分光度计在340nm处测定酶活。蛋白核小球藻的G6PD酶活按照细胞浓度计算。
单位的定义：每106个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol/L的NADPH定义为一个酶活力单位。
(A1：初始吸光度；A2：反应后的吸光度；6.22：每mM NADPH的吸光度；t：反应时间(5min)；l：比色皿光径(1cm)；V1：总反应体积(750μL)；V2：G6PD的粗酶体积；C：蛋白核小球藻的细胞密度。)
该研究中测定的是蛋白核小球藻对数中期的G6PD酶活，G6PD酶活在未转化藻中为3.08U/106细胞，而转化藻的G6PD酶活分别为11.14U/106细胞、12.4U/106细胞，比未转化藻的酶活分别提高了3.61倍，4.05倍。该结果(图9)表明G6PD基因的过表达确实能够显著地提高G6PD酶活。
八、分析蛋白核小球藻细胞的中性脂含量
1、尼罗红荧光染色法分析中性脂的积累
尼罗红荧光染色法(Yang et al.2013)分析转化了NoG6PD-pHY21后蛋白核小球藻细胞中脂质含量的变化。染色前，采用血球板计数法对转化NoG6PD-pHY21和未转化的蛋白核小球藻的藻液进行浓度的测定，采用荧光分光光度计(Hitachi F4600,日本)扫描确定尼罗红和蛋白核小球藻的中性脂结合后的最大发射波为592nm。故本实验应用尼罗红染色分析蛋白核小球藻的中性脂时设定Ex＝530nm，Em＝592nm。先用20％的DMSO处理未转化藻或转化藻藻液10min，DMSO能使膜系统破裂，能更加准确地测定中性脂含量，然后将溶于丙酮的0.1mg·ml-1的尼罗红染液(购自Sigma-Aldrich,美国)以1：100的体积比加入处理后的藻液中，使尼罗红的终浓度为1ug·ml-1。室温避光染色20min。染色结束后，采用酶标仪(购自SpectraMax Plus384，美国)比较分析未转化藻或转化藻细胞的中性脂的含量。将转化藻株与未转化藻以相同的浓度转接BG11培养基，然后测定一个生长周期的生长速率与中性脂含量。转化藻的脂质积累速率比未转化藻的脂质积累速率显著提高。转化藻株在转接四天后，脂质开始缓慢积累，从第九天开始脂质积累速度加快，在转接后的第十三天脂质积累基本达到平台期。而未转化藻在转接后第四天开始缓慢积累并在第十三天进入平台期(如图10A和10B所示)。单个细胞中性脂的含量在转接后的前四天略微下降。因为藻在平台期积累了大量的脂质，随后这些藻作为母液接种到新的培养基中，这些脂质会在细胞生长的过程中随着细胞分裂而分散。转化藻株的脂质积累比未转化藻的脂质积累有显著增加，尼罗红染色测定按每106细胞数计算，两株转化藻株在平台期的脂质积累分别是未转化藻的2.68，3.09倍(如图10B所示)。按照体积计算脂质含量综合考虑了细胞生长速率和脂质积累两个重要因素，能够直观地反映出微藻工业化生产的产量。刚转接的前四天单位体积藻液的脂质含量增长特别缓慢，随后脂质积累加快，从第八天开始积累迅速增加，直到转接后的第十二天单位体积的脂质含量进入平台期，脂质积累缓慢。转化藻株每ml的中性脂含量最终比未转化藻的中性脂含量显著提高，两株转化藻株分别提高2.72、3.03倍(如图10A所示)。
过表达G6PD基因并没有影响藻的生长(如图10C)，转接后蛋白核小球藻有了充足的营养开始迅速分裂，第5天进入指数生长期，生长速率达到最高，转接后第10天开始生长速率减慢，随后藻细胞生长进入平台期，第12天藻密度达到最高值。之后少量的藻细胞开始衰亡导致藻细胞数量略微有所降低。
2、干重法分析中性脂的含量
藻株的中性脂含量还用干重法进行测定(Ben-Amotz et al.1985)。20mg的冻干藻粉与2ml的甲醇、2ml的氯仿、1.5ml的5％NaCl漩涡震荡2min。然后8000g离心4min，收集氯仿层。重复萃取三次，将收集的所有氯仿层混合，N2吹干。然后在60℃烘箱中烘干，称重，计算干重。计算得出未转化藻的中性脂干重含量为14.6％，转化藻株的中性脂干重含量为39.42％至45.63％，是未转化藻中性脂干重含量的2.70至3.13倍。此结果说明提高G6PD基因在蛋白核小球藻中的表达确实能够显著提高中性脂的含量。
3、缺氮处理
之前的研究表明缺氮能够增加油体的数量和总体积从而增加中性脂的积累，使得缺氮处理的中性脂含量增加大约2倍(Yang,et al.2013)。此发明中将转化藻缺氮处理，研究缺氮能否使转化藻的脂质含量继续提高。将所有的转化藻及未转化藻细胞浓度调整一致，转接培养11天后4400rpm，4℃离心10min，弃掉上清培养基，藻淀用不加NaNO3的BG11培养基清洗3次，确保完全去除藻淀中的N，然后将藻淀重新转接到相同体积的不加NaNO3 -的BG11培养基中，继续在缺N的BG11培养基中培养。尼罗红染色法测定缺氮后24小时、48小时、72小时以及96小时的中性脂含量以测定中性脂积累的潜力(如图10D所示)。在平台期缺氮处理48小时以及96小时后，未转化藻的脂质含量增加，是未缺氮处理的1.44倍以及1.74倍。转化藻株1和2在48小时缺氮处理后脂质含量分别增加了39.1％和42.9％，在处理96小时后脂质含量增加了53.1％和47.0％。研究结果表明缺氮处理能够提高细胞内脂质含量，促进微拟球藻的脂质积累，同样也促进转基因微拟球藻的的脂质积累。转化藻株1和2最大的中性脂含量可以达到细胞干重的60.3％和67.1％。
九、光合作用的测定
叶绿素荧光参数能够灵敏地反映硅藻的瞬时光合状态以及他们对目前环境条件的适应。Fv/Fm(可变荧光量/最大荧光)表示PSII反应中心最大光化学量子产量，反映了光合作用光能转换效率。因此，它被广泛用于表征光合性能以及生长状态(Campbell,et al.,1998)。Fo是当PSII反应中心是完全开放时的最小荧光产量。损坏或PSII反应中心的活性不可逆的降低将导致Fo数值减少。Fm为PSII反应中心是完全封闭时的最大荧光产量，因此它反映了PSII的电子传递能力。Fv为可变荧光(Fv＝Fm-Fo)，反映PSII原初电子受体QA的减少，因此能够反映PSII反应中心的光反应活性。为了测量这些参数，未转化藻或转化藻培养物保持在黑暗中20分钟，然后暴露于饱和脉冲光(3000摩尔·M-2·S-1)1秒，然后，采用便携叶绿素荧光计(购自Hansatech Instruments有限公司)按照操作说明测定叶绿素荧光强度。
根据测得的结果(如图11所示)可知，转化藻的光合作用效率与未转化藻的光合作用效率几乎一致。未转化藻的Fv/Fm为0.623而转化藻株1和2的Fv/Fm分别为0.643和0.613。由此可见转基因藻株的生长并没有受到影响，此结果与未转化藻和转化藻株的生长曲线一致。
十、光扫描共聚焦荧光显微镜分析转化藻的脂质
分别取20μl的处于平台期的转化藻和未转化藻的藻液，尼罗红染色20min后制备样品玻片，置于激光扫描共聚焦荧光显微镜(购自Zeiss LSM510Meta，德国)下观察，Ex＝488nm，Em＝505-550nm。图片采用LSM510软件(购自Zeiss LSM510Meta，德国)处理。
采用激光扫描共聚焦荧光显微镜对处于稳定期的转化藻细胞和未转化藻细胞进行观察，结果如图12A(未转化藻)和图12B(转化藻株1)、12C(转化藻株2)所示。相比未转化藻细胞，转化藻的油体数量变多、大小显著增大，说明提高G6PD在蛋白核小球藻中的表达确实能够显著地促进脂质积累。
十一、C-MS分析脂肪酸成分
1、提取脂肪酸
(1)未转化藻或转化藻各取200ml，6600rpm 4℃离心10min，收集藻沉淀；(2)加入5mL KOH-CH3OH溶液，冰浴条件下超声破碎30min；(3)往样品充N2 1min，盖好管口，振荡混匀，75℃水浴10min；(4)待冷却分层后，移出上清液至一新离心管中；(5)加入15mL 2M HCl-CH3OH溶液，充分混匀后于75℃水浴10min；(6)室温静置分层，转移上清液至一新离心管中；(7)加入4mL正己烷，静置分层，将上层萃取液转移至一新离心管；(8)以N2吹干，再加入2mL正己烷重新溶解，用于脂肪酸的上机测定。
2、脂肪酸成分分析
提取出的脂肪酸样品送往广东省微生物研究所测定组分及含量。
采用气相色谱质谱联用进行脂肪酸成分的分析。实验中使用的气相色谱质谱联用仪为美国热电Thermo Finngan Trance DSQ，色谱柱为DB-5石英毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm。实验的GC条件为：柱温60-250℃，60-160℃以10℃min-1的速度升温，160-250℃以2.5℃min-1升温，进样口温度280℃，不分流进样，进样量1μl。质谱传输线温度：200℃脂肪酸的鉴定参照谱库进行，定量分析采用各组分峰面积积分，用归一化法计算出脂肪酸组分的百分含量，以占脂肪酸含量的百分比表示。蛋白核小球藻细胞脂肪酸成分的鉴定过程各组分的色谱峰清晰可辨，表明分离效果较好。蛋白核小球藻细胞脂肪酸的组分结果(如表1所示)表明转化了重组载体NoG6PD-pHY21的蛋白核小球藻细胞脂肪酸的组分组成发生了变化，脂肪酸组分比率也发生了显著的变化。转化藻的饱和脂肪酸含量降低，不饱和脂肪酸含量增加。2株转化藻总的饱和脂肪酸分别比未转化藻降低了46.92％和30.31％。其中变化最显著的就是C18：0，在转化藻中几乎检测不到，但在未转化藻中的含量却达到8.36％。C16:0的含量在转化藻株1中降低26.57％，而在转化藻株2中的变化却不是很明显。在未转化藻中检测到了少量的C15：0，C17：0，在转化藻株中并没有检测到，说明转化藻株中的脂肪酸不仅含量发生了改变，成份也发生了改变。转化藻株1的总的单多不饱和脂肪酸增加1.4倍，转化藻株2的总的单不饱和脂肪酸增加2.89倍，其中C16:1显著增加，转化藻株1增加3.10倍，转化藻株2增加6.95倍。转化藻株1的C18:1含量增加11.86％，转化藻株2的C18:1的含量增加44.07％。两株转化藻的总的多不饱和脂肪酸分别增加1.69倍以及1.46倍。16碳的多不饱和脂肪酸增加显著，C16：2含量增加2.91倍，C16：3含量增加2.24倍。18碳的多不饱和脂肪酸也有所增加，C18:2的含量增加66.80％，C18:3的含量增加34.71％。以上的结果表明G6PD基因不仅在蛋白核小球藻的脂肪酸合成中起重要作用，而且能够影响脂肪酸的组分含量以及脂肪酸的成份组成。
表1蛋白核小球藻细胞脂肪酸的组分结果

Claims (9)

1.一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因。
3.根据权利要求2所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
4.一种含有权利要求2所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体的原始表达载体为pHY21载体。
6.一种含有权利要求2所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞的原始宿主细胞为蛋白核小球藻。
8.权利要求1所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶在增加中性脂的生物合成中的应用。
9.权利要求1所述的6-磷酸葡萄糖脱氢酶在增加不饱和脂肪酸的生物合成中的应用。
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