CN104131025A - 一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体及应用。包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌P1启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌ccdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega leader序列，所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游。本发明的重组载体比较小，适合转化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表达。通过过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因能够显著地提高微藻细胞内的脂质含量，为生物能源的研究奠定了基础。

Description

一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体及应用

技术领域：

本发明属于微藻基因工程领域，具体涉及一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体及应用。 

背景技术：

传统能源的不可再生性决定了其日益枯竭的趋势，且造成环境问题日益严重。能源危机和环境污染的日益严峻激起了人们的能源忧患意识及污染物零排放观念，加强了对废油脂及工业下脚料的回收处理及科学利用，推动清洁新型能源的开发利用。寻求一种安全可靠的、清洁的可再生能源已成为当今世界共同关注的焦点。生物能源是指利用生物可再生原料及太阳能生产的能源，包括生物质能生物液体燃料及利用生物质生产的能源如燃料酒精、生物柴油、生物质气化及液化燃料、生物制氢等(谭天伟，等，2003)。其中，生物柴油是采用来自动物或植物脂肪酸单酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯及脂肪酸丙酯等与甲醇(或乙醇)经酯交换反应而得到的长链脂肪酸甲(乙)酯，是一种可以替代普通石油柴油的可再生的清洁燃料，相较于其它种类的生物能源，生物柴油具有原料广泛、生产高效、环境友好、净化环境等突出特点(谭天伟，等，2002)。 

Chisti通过建立数学模型和工程计算指出微藻生物能源是唯一可以取代石化油的生物柴油(Chisti，et al.,2007；Chisti，et al.,2008)。因具有清洁、高效、环保、产油量大等优点，微藻生物能源被视为最具有发展潜力的生物柴油的资源(Metting，et al.,1996；Spolaore，et al.，2006；Weers，et al.，1977；Hu et al.,2008)。硅藻是海洋浮游生物最重要的组成成分，在提供海洋初级生产力方面发挥着重要的作用。它们是研究发现新颖的在其他经常研究的生物体中不存在的代谢路径的主要研究对象，因为在它们进化过程中形成一系列新颖的代谢路径(Armbrust,et al.,2004)。由于三角褐指藻具有生长周期短、生长快、脂质含量高等优点，成为最具潜力的产油微藻(Yang,et al.,2013；Niu,et al.,2012)。因此，通过遗传学改造提高三角褐指藻的脂质含量与生物量是提高工业化生产产量的重要途径。 

海洋硅藻三角褐指藻，一种广泛使用的饵料藻，其快速增长和高脂肪含量已成为有吸引力和有前途的，作为生物柴油的新来源，它的基因组在2008年已被测序(http://genome.jgi-psf.org/Phatr2/Phatr2.home.html)，使得它也成为研究功能基因组学一个模型微藻。 

载体元件是决定微藻表达系统中DNA表达稳定性的关键部件之一。随着基因组测序技术的快速进步，基因测通技术和序列信息注释已被开发用于传输序列功能性信息的渠道。通常，研究基因的功能可以使用各种的方法，如异位表达，基因沉默，蛋白质亚细胞定位，启动子活性分析，结构—功能分析，并在体内或体外用生物化学测定基因表达模式分析。然而，对基于限制性内切酶/连接酶克隆方法工程表达构建体的常规方法是非常费力和耗时的，并且经常受到限制性酶切位点的阻碍。在模型藻莱茵衣藻和三角褐指藻甚至大多数高等植物中载体构建是功能基因分析的主要障碍，因此，迫切需要创新和有效的技术手段克服以 上困难。最近的通路克隆系统用两步骤的位点特异性重组快速大规模克隆研究一个或者多个基因进入载体(G andJ,2004)。需连入载体的DNA片段，首先克隆到一个普通供体载体。然后，由两个位点特异性重组位点(attB1和attB2位)中的供体质粒侧翼的DNA片段可以被精确地转印到各种表达载体中，通过位点特异性重组反应。一旦DNA产物被靶向到供体载体中，无需传统的限制性内切酶和连接酶克隆的简单反应。将重组克隆系统，DNA的转移构建体整合到表达目的载体所介导Gateway技术，和许多开放阅读框条目(供体)的克隆的集合和表达质粒已被广泛用于功能基因组学中的许多生物创建(Aliverti et al.,2008)。然而，在这种方式中使用的酶的成本相对昂贵，特别是相关技术几乎没有在硅藻三角褐指藻中报道，并且转化效率不高，因此通过利用选择标记基因构造微藻的遗传转化的零背景的TA克隆载体。此外，该技术可灵活地适应用于PCR扩增的基因或片段开发专门的表达载体的单步装配(Chen et al.,2009)。通过限制性内切酶XcmI的高效酶切，该质粒可以形成两个3'的T突出端以便用于TA克隆，我们这次构建的T载体基于限制性内切酶XcmI的灵活运用(Chen et al.,2009)，T载体连接方式几乎适用于所有的基因克隆连接工作，使得未来都省时省力连接目的基因到在三角褐指藻表达的载体。 

用于遗传转化的关键步骤是有一个包含所有表达基因元件的载体，该载体包含选择标记(通常是抗生素抗性基因)的表达盒或者选择质粒在细菌或选择在宿主生物体中的基因转移，以及用于表达的宿主生物体中另一个靶基因表达盒的操作。然而，所生产的选择标记蛋白的获得转基因生物体后不想要的。构建生产转基因细胞异源蛋白质有时是有问题的，因为一些蛋白质可能会影响转基因细胞或细胞的生长，一个可行的选择是使用诱导型启动子来限制选择标记蛋白在转基因生物体的表达。诱导型启动子的发展也是必不可少的转化载体允许选择标记物的表达，以及是在细胞中表达感兴趣的基因的设计思路。 

某些广泛用于植物转化的异源启动子已被用于在微藻的基因转化中。如在甲藻Amphidinium中，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和p1'2'农杆菌启动子启动了报告基因GUS的表达(Leon and Fernandez,2007)。然而，由于这些微细藻类的独特的核特性，异源启动子表达量的影响，而不是如预期在高等植物中表达量高，在藻类中表现出相对低的表达水平，且通常为瞬时表达。与此相对，单细胞绿藻莱茵衣藻的RBCS2启动子比在转基因盐藻中使用35S启动子表现出更高的效率(Sun et al.,2005)。在羽状硅藻Cylindrotheca fusiformis和中心硅藻海链藻(Poulsen and2005)中用内源的岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白(fcp)启动子和硝酸还原酶(NR)启动子呈现相对较高的转化效率(Poulsen et al.,2006)。从硅藻Cylindrotheca fusiformis中克隆的启动子在硅藻三角褐指藻中呈现相对较高效率的表达(Miyagawa et al.,2009)。此外和羽状硅藻Cylindrotheca fusiformis和中心硅藻Thalassiosira pseudonana相比，三角褐指藻遗传转化方法的技术限制，其转换效率都比较低。因此，新型和有效的内源性启动子的功能研究是外源基因在三角褐指藻高效表达的重要因素。 

绿色荧光蛋白是真核细胞中基因表达的定量基因(Soboleski,2004)。含绿色荧光蛋白(GFP)标记基因 的质粒DNA可通过蛋白免疫印迹法和细胞荧光来检测该蛋白质的表达(Tolonen et al.,2006)。Scott等人已成功将绿色荧光蛋白报告基因在衣藻Chlamydomonas reinhardtii叶绿体中表达(Scott Franklin,2002)。Li等人在转基因盐藻成功表达硝酸还原酶诱导的绿色荧光蛋白表达(Li et al.,2007)。Niu等人在三角褐指藻中成功建立诱导表达绿色荧光蛋白表达系统(Niu et al.,2012)。 

目前微生物油脂的高额生产成本阻碍了其大规模产业化.提高产油微生物中的油脂含量是解决成本问题的一个关键。然而，无论是在微生物还是植物中，油脂含量的提高都是一个具有较大难度的工作。研究者曾采取各种各样的方法，包括基因修饰等方法来去除可能对油脂积累有阻碍作用的物质，但这些尝试都失败了，或者说油脂产量的提高不显著(10％～15％)(Rafledge et al.2010)。近年来研究证实，油脂积累期间6-磷酸葡萄糖脱氢酶活力的降低和油脂积累程度有直接的联系.因此研究6-磷酸葡萄糖脱氢酶在产油藻类中的调控作用，对于实现提高产油生物中的油脂含量具有重大意义。 

近年来6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)受到普遍关注，在动物、酵母、人类、植物中做了很多研究来探究G6PD的功能(Zhang,2008#93).(Lojudice,2001#102)(Legan,Rebrin et al.2008)(Wang,2012#90)。 

G6PD还参与脂肪酸的生物合成。G6PD催化磷酸戊糖途径的第一个反应并产生NADPH和磷酸戊糖。G6PD是该途径的限速酶，反应产物NADPH通过提供还原力促进脂肪酸的合成(Salati and Amir-Ahmady2001)。有研究表明，在此反应过程中，NADPH不断生成，能够提供肝脏中脂肪酸合成所必须的50-75％的还原力(R.Rognstad1979)。G6PD基因在受到外界刺激如激素、生长因子、营养条件以及氧化应激的调节时，会进行转录以及转录后水平的调节(Kletzien,1994#86)。有研究表明，在受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制时，脂肪合成酶包括G6PD同样受到调节，但是不同的脂肪合成酶受到的调节不同。G6PD是唯一一个可以在转录后水平调节的酶，所以能够有效地调节脂肪合成(Kohan,2009#50)。 

G6PD是众多参与脂肪生物合成的酶中唯一一个参与多个代谢路径的酶，目前许多关于该酶的研究表明G6PD与细胞生长、抵抗胰岛素、高脂血、心血管疾病、糖尿病以及动物体内的氧化应激等相关。(Batetta,Bonatesta et al.2002)(Park,Rho et al.2005)(Gupte2008,Legan,Rebrin et al.2008,Schneider,Rawat et al.2012)。G6PD在调控NADPH的生成及氧化还原平衡中起着重要的作用，还能够有效地调控细胞分化，细胞生长以及物质代谢。G6PD在G6PD缺陷的人纤维细胞中的异位表达能够有效地阻止缺陷细胞的生长迟缓以及细胞早衰。(Ho,2000#83)。G6PD基因的上调与黑腹果蝇的寿命延长以及肿瘤性转化包括胃癌(Wang,2012#103)肾细胞癌，(Langbein,2008#106)，纤维肉瘤(Frederiks,2006#105)等显著相关。同样，还有报道称在G6PD缺陷的外周血淋巴细胞及单核细胞中，G6PD的低表达能够抑制胆固醇代谢和细胞生长(Batetta,Bonatesta et al.2002)。这些研究能够充分说明G6PD对于细胞生长 的重要作用。另外还有研究表明胚外组织的G6PD活性的严重缺陷能够导致氧化还原平衡的混乱，导致细胞生长的调剂异常最终胚胎死亡(Longo,2002#80)。由以上研究可知G6PD对于机体的正常生长以及适应外界环境有重要的作用。 

研究表明提高G6PD的表达量，提高G6PD的酶活，可提高NADPH的合成，还有研究报道提高G6PD的表达能够促进大部分脂肪基因的表达。G6PD在脂质的生物合成路径中发挥显著的作用，在人类肝脏中过表达G6PD基因能够提高细胞内甘油三酯和游离脂肪酸的含量并能促进脂肪细胞中游离脂肪酸的释放，并能增加脂肪细胞因子的表达、刺激胰岛素抵抗。尽管脂质生物合成的增加与G6PD活性的增加紧密相关，但是具体的相互作用机制相当复杂至今还未能完全研究清楚(Schneider,Rawat et al.2012)。在动物中，G6PD的过表达同样能够刺激肥胖动物的脂肪生成，G6PD的过表达与脂肪酸代谢物包括游离脂肪酸(FFAs)和甘油三酯(TAG)的增加相关。与正常的脂肪细胞相比，过表达G6PD基因的3T3-L1细胞中的G6PD活性提高了1.4倍，使得过表达G6PD基因的细胞中脂肪滴变多变大(Park,Rho et al.2005)。通过基因改造可以啤酒酵母菌也能够产生高水平的G6PD活性以及G6PD基因的表达量。(Lojudice,2001#102)。有研究表明G6PD基因的过表达与血脂异常相关，在过表达G6PD的肥胖小鼠中，游离脂肪酸达到了相当高的水平。与正常的小鼠心脏相比，过表达G6PD的小鼠心脏G6PD基因的表达量增加了10倍，G6PD活性增加了2倍(Gupte2008)。在另外的研究中也表明在患有糖尿病的肥胖小鼠肝脏中G6PD也明显增加(Gupte,Floyd et al.2009)。相应的，敲除G6PD基因能够抑制肥胖小鼠的脂肪生成。G6PD缺陷的细胞中脂肪细胞的分化减弱，脂肪滴积累的数量变少，脂肪滴变小，细胞内游离脂肪酸以及甘油三酯的积累水平明显降低(Park,Rho et al.2005)。G6PD缺陷的个体同样表现出β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶a以及3—羟基—3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶活性相应的降低，从而导致胆固醇以及低密度脂肪酸合成减少(Meloni,Manca et al.2008).，(Batetta,Bonatesta et al.2002)。酵母水解产物的补充能够通过下调肥胖小鼠肝脏中G6PD的活性从而抑制脂肪酸的合成，使得小鼠脂肪积累减(Jung,2012#40)。通过小干扰RNA敲除G6PD基因会降低细胞内脂质积累、阻碍重要的脂肪基因的表达(Park,Rho et al.2005)。在G6PD缺陷病人中，血清蛋白的浓度以及脂质生成的速率都会降低(Dessi,Chiodino et al.1986,Dessi,Batetta et al.1992)。G6PD活性与代谢显著相关，尤其是紧密参与多不饱和脂肪酸的代谢。G6PD的活性会因饮食中糖类的刺激而增加，在食入的多不饱和脂肪酸刺激下降低(Salati,2001#52)。 

G6PD在人类及动物中有较多研究，以上这些结果表明提高G6PD的表达能够促进脂肪酸合成的可能性。但是迄今G6PD在植物及藻类中缺乏研究。此发明中，借鉴人类及动物研究中G6PD基因与脂肪和成紧密相关、G6PD活性增加能够促进脂肪合成，在藻类中通过过表达G6PD基因使得G6PD基因表达量提高，从而使得G6PD活性显著提高，使得藻的脂肪酸合成增加以及脂肪酸成分发生变化。 

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体。 

本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，是一个多功能的微藻转化载体。该重组载体包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌P1启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌ccdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega leader序列，所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游。 

所述的大肠杆菌P1启动子的序列如SEQ ID NO.1所示，大肠杆菌ccdB终止子的序列如SEQ ID NO.2所示，三角褐指藻fcpC基因启动子的序列如SEQ ID NO.3所示，6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO.4所示，三角褐指藻fcpA基因终止子的序列如SEQ ID NO.5所示，Omega leader序列如SEQ ID NO.6所示。 

所述的目的基因表达盒，优选在三角褐指藻fcpC基因启动子和三角褐指藻fcpA基因终止子之间通过不依赖于连接反应的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位点，所述的XcmI序列如SEQ ID NO.7所示。 

所述的目的基因表达盒，优选在三角褐指藻fcpA基因终止子前融合一个MYC标签序列，所述的MYC标签序列如SEQ ID NO.8所示。 

所述的抗性筛选基因，优选为氯霉素酰基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。 

所述的表达盒是指含有启动子、目的基因或目的基因克隆位点和终止子、且其中的基因能正常进行转录和翻译的序列。 

所述的融合为本领域技术人员所熟知的DNA片段连接技术。 

不依赖于连接反应的高效克隆方法(LIC)属于现有技术。 

本发明的第二个目的是提供所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用。 

所述的微藻，优选为三角褐指藻。 

本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体包括2个基因表达盒，一个为筛选标记基因表达盒，另一为目的基因表达盒。筛选标记基因表达盒集成了真核和原核的表达盒，采用氯霉素酰基转移酶基因作为抗性筛选基因，其上游融合了来自大肠杆菌的P1启动子和三角褐指藻fcpC基因启动子，下游融合了大肠杆菌ccdB终止子和三角褐指藻fcpA基因终止子。该融合表达盒使得氯霉素酰基转移酶基因既能在大肠杆菌中表达，又能在三角褐指藻中表达。该设计有效减小了表达载体的大小，便于载体的克隆操作以及高效的转化。本发明中采用了三角褐指藻的内源性的高效启动子fcpC，fcpC与三角褐指藻的光合作用相关，因此具有极高的启动效率，是理想的构建载体元件。 

目的基因表达盒，用于表达外源基因，采用三角褐指藻的高表达水平的fcpC基因的启动子及终fcpA基因的终止子。目的基因表达盒内通过特别设计的2个XcmI内切酶位点引入了TA克隆的连接方式。XcmI酶切线性化的载体即可直接一个步骤克隆Taq聚合酶PCR的产物。在三角褐指藻fcpC基因启动子的后面融合了一个Omega leader序列，曾有相关研究表明，把CaMV35S启动子-419～-90(E12)序列与omega序列相串联，GUS基因在转基因烟草中有最大的表达活性。用这种结构增强GUS基因表达，在转基因烟草中GUS活性比仅仅用CaMV35S启动子高20-70倍(Mitsuhara et al.,1996)。由此可以看出，omega序列具有提高启动子活性进而提高目的基因表达的作用。 

在三角褐指藻fcpA基因终止子的前面，添加的另外一个序列MYC-tag，具有高效，可靠，稳定的特性属于被广泛应用的成熟的理想的蛋白标签。在1985年就有相关文献报道将MYC序列位于终止密码子之前，用于western blot检测目的基因的表达(Evan et al.,1985)。MYC-tag应用于本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，可以解决一些后续载体的应用问题。例如在载体携带三角褐指藻的内源性基因进行过表达研究时，因为无内源性基因表达的蛋白与藻细胞内自身表达的蛋白相同，无法使用特定的抗体进行检测，MYC标签可以方便可靠的检测出基因是否成功的导入了细胞中。另一方面，对于其他非三角褐指藻内源性的基因的携带导入实验中，也可以不必再针对不同的蛋白而使用不同的抗体，而可以统一使用MYC抗体进行检测，节约了成本。 

本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体比较小，适合转化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表达。 

本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体能够在微藻中进行过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因。G6PD催化磷酸戊糖途径的第一个反应并产生NADPH和磷酸戊糖。G6PD是该途径的限速酶，反应产物NADPH通过提供还原力促进脂肪酸的合成(Salati and Amir-Ahmady2001)。有研究表明，在此反应过程中，NADPH不断生成，能够提供肝脏中脂肪酸合成所必须的50-75％的还原力(R.Rognstad1979)。G6PD基因在受到外界刺激如激素、生长因子、营养条件以及氧化应激的调节时，会进行转录以及转录后水平的调节(Kletzien,1994#86)。有研究表明，在受到腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的抑制时，脂肪合成酶包括G6PD同样受到调节，但是不同的脂肪合成酶受到的调节不同。G6PD是唯一一个可以在转录后水平调节的酶，所以能够有效地调节脂肪合成(Kohan,2009#50)。通过过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因能够显著地提高微藻细胞内的脂质含量，为生物能源的研究奠定了基础。 

附图说明：

图1为目的基因表达盒构建图； 

图2为pHY18表达载体结构图，Pnr/Tnr：硝酸还原酶启动子/终止子；PfcpC：三角褐指藻fcpC启动子，TfcpA：三角褐指藻fcpA终止子；CAT：氯霉素乙酰转移酶基因；Ori：pUC19质粒复制起点； 

图3为CAT在大肠杆菌和三角褐指藻中的表达，A左为商业化载体pMD19-T转化大肠杆菌；A右为pHY18载体转化大肠杆菌(LB培养基含35mg L^-1氯霉素)；B左为转化载体pHY18-eGFP的三角褐指藻生长在250mg L^-1氯霉素f/2^-si培养基中，B右为野生型三角褐指藻； 

图4PCR验证和微藻蛋白质印迹分析，A为用引物P201和P202PCR扩增转化eGFP基因融合，其中，泳道1：转基因株系，泳道2：未转基因藻株，泳道M：100bp Marker，箭头表示0.7-kb的eGFP的条带；B为Western blot分析用抗Myc及抗GFP抗体检测绿色荧光蛋白，β-actin作为内部对照基因和探讨，泳道1：未转基因藻株，泳道2：转基因株系； 

图5共聚焦显微镜观察eGFP基因，A为转基因三角褐指藻株，B为未转化的三角褐指藻B； 

图6为G6PD基因的PCR扩增结果图，泳道M为1kb的ladder marker；泳道1为G6PD基因的扩增结果； 

图7为G6PD基因编码的蛋白序列的进化树； 

图8为PtG6PD-pHY18重组质粒的Sal Ⅰ酶切图，泳道M为1kb的ladder marker；泳道1为PtG6PD-pHY18重组质粒；泳道2为PtG6PD-pHY18重组质粒的Sal Ⅰ酶切结果； 

图9为PtG6PD-pHY18重组质粒的引物图谱； 

图10为抗生素筛选阳性三角褐指藻的培养结果照片，其中，A为200mg·L^-1氯霉素平板筛选阳性藻的照片，Wild type为未转化藻，Transgenic为转化藻；B为200mg·L^-1氯霉素浓度的f/2培养基培养转化藻和未转化藻，Wild type为未转化藻，Transgenic为转化藻； 

图11为转化藻的MYC蛋白的Western blot分析图，其中，control为未转化藻，G6PD1为转化藻株1；G6PD2为转化藻株2； 

图12为G6PD基因表达蛋白的蛋白定位的胶体金免疫电镜图，A为过表达G6PD基因的转基因三角褐指藻，B为野生型的三角褐指藻，标尺大小为500nm。 

图13为转化藻中的G6PD基因的qPCR分析图； 

图14为转化藻的G6PD的酶活检测结果； 

图15A为每ml藻液的转化藻和未转化藻的中性脂质含量；B为尼罗红染色测定每10⁶细胞的转化藻和未转化藻的中性脂质含量；C为转化藻和未转化藻的生长曲线；D为转化藻和未转化藻缺氮48小时和96小时后的中性脂质含量； 

图16为转化藻和未转化藻的激光扫描共聚焦显微镜检测图，A为未转化藻；B为转化藻。 

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。 

本发明所使用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、NEB高保真Pfu聚合酶(购自New England Biolabs,USA)；所有引物及核苷酸序列的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。大肠 杆菌DH5α感受态细胞购自广州鼎国生物有限公司。 

过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体构建过程中所使用的引物序列如表1所示。 

表1：载体设计中使用的引物 

实施例1： 

一、表达载体pHY18的构建 

1、表达载体相关元件的分析克隆与连接 

本发明的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体是通过改造商业化载体pMD19-T(Takara,Dalian,China)而来的，主要有两个表达盒，抗性筛选基因CAT表达盒以及目的基因表达盒。 

表达调控序列原件通过用NEB高保真Pfu聚合酶PCR和重叠PCR获得(具体PCR体系及程序参照Bryksin and Matsumura,2010)。表达调控序列原件的引物分别为：NR启动子(Pt13，Pt14)，NR终止子(Pt79，Pt80)。CAT表达盒用引物Pt83和Pt84从质粒pHY11克隆(具体参考Niu et al.,2012)。用引物Pt13和Pt82扩增PNR-PP3-SD片段。Pt83，Pt84和Pt84L引物中都含有SD序列，引物见表1，扩增获得片段PP3-SD-CAT-TBAC。用引物Pt85，Pt85L和Pt80扩增片段TBAC-TNR。然后，引物Pt83和Pt80与重叠引物Pt84L和Pt85L通过重叠PCR获得PP3-SD-CAT-TBAC-TNR。Pt13和Pt80与重叠引物Pt82和Pt83扩增获得PNR-PP3-SD-CAT-TBAC-TNR完整的CAT表达盒获得(具体步骤参考Niu et al.,2012)。 

对于TA表达盒(目的基因表达盒)，基因表达盒与fcpA启动子、fcpA终止子表达盒有一个特别设计的xcmI-xcmI酶切位点，通过酶切，可在启动子和终止子之间加入Myc标签序列可用于检测蛋白表达(Evan et al.,1985)，以及一个增强翻译的Omega leader序列(Gallie and Kado,1989)。引物Pt121Sph和Pt124Sac通过PCR获得PfcpA并且在PfcpA5'和3'的端部引入SphI和SacI酶切位点。然后用引物Pt89Sac和Pt125Sal通过PCR获得omega-xcmI-xcmI-Myc基因TfcpA，Myc标签用于外源蛋白表达的检测。然后将含有两种启动子或终止子的两个片段用SacI酶切后用T4DNA连接酶连接，最终得到的目的基因表达盒pfcpA-omega-TA连接点-MYC-TfcpA。 

通过TA克隆将CAT表达盒连接到载体的pMD19-T。将得到的质粒用SacI和BspHI酶切后以消除氨苄青霉素抗性基因，然后用绿豆核酸酶(购自New England Biolabs,USA)酶切后自我连接。将得到的质粒用SphI和SalI限制性内切酶酶切，获得pHY15。 

由于三角褐指藻fcpA基因启动子(PfcpA)序列太短，在后续试验中发现fcpA基因启动子的效率不够高，三角褐指藻fcpC基因启动子(PfcpC)的启动效率比三角褐指藻fcpA基因启动子(PfcpA)的效率高很多，所以随后用重叠引物Pt87L和Pt88L将PfcpA替换PfcpC，获得最终表达载体pHY18。 

(1)、三角褐指藻fcpA基因启动子(PfcpA)及fcpA基因终止子(TfcpA)的选择及引物设计 

三角褐指藻的全基因组测序已经完成，根据NCBI上的三角褐指藻全基因组序列进行分析筛选，从而确定了在本发明中所需要使用的几个重要元件，即PfcpA和TfcpA这一对启动子和终止子，在三角褐指藻内参与光合作用的调控，是高效的启动子和终止子，而且长度短，非常的适用于本发明的过表达6-磷酸葡 萄糖脱氢酶基因的重组载体。通过NCBI，获得了PfcpA和TfcpA的基因序列，设计引物对其进行扩增。且由于考虑到后续表达盒与载体的连接方式，在设计引物时选择性的添加了限制性内切酶位点。PfcpA的上游引物和下游引物分别为Pt121sph、Pt124Sac，TfcpA的上游引物和下游引物分别为Pt22、Pt23。 

并提取了于平台期收获的三角褐指藻CCMP2561(来自暨南大学藻种库)的DNA(提取所用试剂盒为TAKARA公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒)，具体DNA提取步骤详见说明书。随后以高保真的pfu酶进行PCR扩增，从而获得了目的基因表达盒的启动子PfcpA和终止子TfcpA。 

扩增PfcpA及TfcpA的PCR加样体系参考NEB高保真Pfu聚合酶的说明书，20μl的体系，Pfu酶Mix：10μl，DMSO：0.6μl，100μM的上下游引物分别0.3μl，模板：三角褐指藻的DNA250ng，用双蒸水补足20μl。扩增PfcpA及TfcpA的PCR反应程序：98℃：1min，98℃：15s，55℃：30s；72℃：1min，循环数为30。 

以此得到PfcpA及TfcpA的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化，通过切去目的条带纯化的方式，使用TAKARA凝胶纯化试剂盒，获得纯化后的PfcpA及TfcpA的DNA片段，留待后续试验中进行处理。 

(2)、MYC标签序列(MYC tag)及Omega leader序列(Ωleader)的分析与选择 

在本发明中，在启动子PfcpA及终止子TfcpA之间依次添加了2个特殊的结构，即Omega leader序列，及MYC标签序列。Omega leader序列在前人的试验中曾多次被证实能够确实的提高启动子的启动效率，经过在NCBI多次的对比，本发明选定的Omega leader序列具体碱基序列为：TATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACAAT 

而添加的另外一个短小的序列MYC标签序列,则属于成熟的蛋白标签被广泛的应用。早在1985年就有相关文献报道将MYC序列位于终止密码子之前，用于western blot检测转化基因的表达(evan,et al,1985)。目前MYC的抗体已经形成了商业化，被广泛应用于蛋白筛选的成熟的筛选标记，其相对应的抗体具有产品成熟，稳定性好，且该标记自身长度小，是理想的蛋白标签，因此选择它作为这次试验中，用以添加到终止子TfcpA和Omega leader序列之间的又一序列，并在MYC标签序列后设计转录的终止子，从而达到在后续的蛋白检测表达中，能够通过检测MYC标签序列的存在与否，得知蛋白的表达情况的目的。例如在载体携带三角褐指藻的内源性基因进行过表达研究时，因为内源性基因表达的蛋白与藻细胞内自身表达的蛋白相同，无法使用特定的抗体进行检测，MYC标签序列可以方便可靠的检测出基因是否成功的导入了藻细胞中。另一方面，对于其他非三角褐指藻内源性的基因的携带导入实验中，也可以不必再针对不同的蛋白而使用不同的抗体，而可以统一使用MYC抗体进行检测，节约了成本，也节省了人力物力。 

在本发明中经过改良的MYC标签序列如下：GGATCCCACCACACACCTGGAACAAAAACTCATTAGTGAAGAAGATCTTTAA 

(3)、目的基因表达盒中各个片段的连接 

通过以上2个步骤获得了PfcpA和TfcpA的片段，以及通过相关生物信息学分析，获得了Omega leader序列和MYC标签序列的相关序列，采用重叠PCR及限制性内切酶酶切，两种普遍使用的DNA片段连接方式，进行这4个片段的连接工作。目的基因表达盒的构建流程如图1所示。 

首先获得的是以引物对Pt121sph-Pt124Sac扩增得到的启动子PfcpA片段，引物对Pt22-Pt23扩增得到的终止子TfcpA片段。随后，使用Pt91和Pt23进一步扩增终止子TfcpA片段，PCR加样体系参考NEB高保真Pfu聚合酶的说明书，20μl的体系：Pfu酶Mix：10μl，DMSO：0.6μl，100μM的上下游引物分别0.3μl，模板：三角褐指藻的DNA250ng，用双蒸水补足20μl。PCR反应条件：98℃：1min，98℃：15s，53℃：30s，72℃：1min。循环数为30。 

随后进一步设计终止子TfcpA与MYC标签序列重叠的引物P91L：CAGTGAAGAAGATCTTTAAAAATTTAATTTTCATTAG 

进一步延长终止子TfcpA，重叠引物P91L与引物Pt22的PCR加样体系参考NEB高保真Pfu聚合酶的说明书，20μl的体系：Pfu酶Mix：10μl，DMSO：0.6μl，100μM的上下游引物分别0.3μl，模板：终止子TfcpA纯化片段250ng，用双蒸水补足20μl。PCR反应程序如下：98℃：1min，98℃：15s，55℃：30s，72℃：1min，循环数为30。 

至此可以得到包含了一部分MYC标签序列在内的终止子TfcpA片段，命名为MTC-TfcpA。 

利用引物对Pt89Sac和Pt90，PCR反应体系按NEB高保真Pfu聚合酶说明书，如前面所述，获得片段Omega leader序列-MYC标签序列重叠片段，PCR反应程序：98℃：1min，98℃：15s，55℃：30s，72℃：30s，循环数为30。 

获得omega-MYC-TfcpA的PCR反应所用引物为：P89tSac、Pt125Sal、P91L、Pt90。通过重叠PCR，将Omega leader序列-MYC标签序列重叠片段与MYC-TfcpA两个片段进行重叠PCR，从而获得omega-MYC-TfcpA。反应体系为：pfu Mix：10μL，DMSO：0.6μL，MYC-TfcpA片段：0.1μL，Omega leader-MYC片段：0.3μL，双蒸水补足20μL。PCR反应程序为：98℃：1min，98℃：15s，52℃：30s，72℃：30s，循环数为20。至此得到了片段omega-MYC-TfcpA。 

分别用限制性内切酶SacI处理片段omega-MYC-TfcpA及启动子PfcpA6个小时，酶切总体系为30μL：SacI：3μL，片段：20μL，Buffer:3μL，ddH2O：4μL。37℃反应3小时。反应后的产物经70℃水浴20分钟对酶进行灭活处理后，经TAKARA的PCR产物纯化试剂盒进行片段的纯化。并通过T4DNA连接酶进行两个片段的连接，连接总体系30μL：PfcpA：10μL，Omega-MYC-TfcpA：10μL，Ligase：3μL，Buffer：3μL，ddH2O：4μL。37℃连接过夜。反应后产物经70℃水浴20分钟对酶进行灭活处理，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收片段，获得完整的TA表达盒片段(目的基因表达盒)。 

凝胶回收使用TAKARA凝胶回收试剂盒(Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0)具体方法参照说明书进行。 

2、表达载体pHY15的构建 

在设计引物的时候，已经在目的基因表达盒的两端引入了两个限制性内切酶位点，即，在启动子PfcpA前面引入了SphI,在终止子TfcpA后面引入了SalI。而在pHY11载体(该载体的构建参考Niu et al.,2012)上，也含有这两个酶切位点。通过双酶切的方式，分别处理载体和目的基因表达盒片段。双酶切总体系30μL：SphI:3μL，SalI:3μL，pHY11载体/TA表达盒各：20μL，Buffer:3μL，ddH₂0:1μL。37℃反应过夜，70℃水浴20分钟灭活，后经1％琼脂糖凝胶电泳分离，TAKARA凝胶纯化回收试剂盒纯化备用。 

纯化后的片段经T4DNA连接酶进行连接反应，连接总体系5μL：连接酶：0.3μL，Buffer：0.5μL，目的基因表达盒：2μL，pHY11载体：1μL，ddH₂O：1.2μL。16℃反应过夜。得到目的基因表达盒与pHY11载体的连接产物。 

3、表达载体在大肠杆菌中的转化筛选 

取pHY11载体与目的基因表达盒的连接产物，用与DH5α感受态细胞进行转化，转化方法参照说明书进行。 

在获得菌落的平板上，挑取单克隆，置于LB液体培养基(含35mg/L氯霉素)中进行37℃恒温震荡培养过夜。通过离心收集5mL震荡培养的单克隆菌，通过TKKARA MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0试剂盒进行质粒的提取，提取方法参照说明书进行。 

通过1％琼脂糖凝胶电泳检测是否获得了质粒。取得到的质粒，通过双酶切验证目的基因表达盒是否已经正确的连接进了pHY11载体，双酶切总体系10μL：SphI:0.5μL，SalI:0.5μL，pHY11载体/目的基因表达盒各：5μL，Buffer：1μL，ddH₂0：3μL。37℃反应2小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测是否获得酶切条带。将获得正确酶切验证条带的质粒送交上海生工公司进行测序，以进一步确定所构建的载体的正确性。并将经测序验证正确的表达载体命名为pHY15，载体的目的基因表达盒图谱如图1所示。 

4、表达载体pHY18的构建 

(1)、启动子的替换 

由于三角褐指藻fcpA基因启动子(PfcpA)序列太短，fcpA基因启动子的效率不够高，三角褐指藻fcpC基因启动子(PfcpC)的启动效率比三角褐指藻fcpA基因启动子(PfcpA)的效率高很多，所以用重叠引物Pt87L和Pt88L将PfcpA替换成PfcpC，获得最终表达载体pHY18。 

首先用重叠引物Pt87L和Pt88L PCR获得添加重叠序列的启动子PfcpC，PCR体系参照pfu酶的说明书：pfu Mix：10μL，DMSO：0.6μL，模板pHY15：10ng，重叠引物Pt87L和Pt88L分别0.3μL，双蒸水补足20μL。PCR反应程序为：98℃：1min，98℃：15s，55℃：30s， 72℃：30s，循环数为30。获得启动子PfcpC片段后用TAKARA凝胶纯化回收试剂盒纯化备用。 

然后将纯化的启动子PfcpC片段和载体pHY15做重叠PCR，将启动子PfcpA替换为高效的启动子PfcpC。重叠PCR体系为：pfu Mix：10μL，DMSO：0.6μL，载体pHY15(80ng/μL)：0.1μL，启动子fcpC(97.4ng/μL)：0.3μL，双蒸水补足20μL。PCR反应程序为：98℃：1min，98℃：15s，52℃：30s，72℃：30s，循环数为20。 

重叠PCR后用Dpn I酶切以消除模板，酶切总体系为30μl：Dpn I酶：0.5μl，10×NEBuffer：0.3μl，重叠PCR产物：20μl，ddH₂O：9.2μl。37度反应6小时，然后转化入DH5α感受态细胞中，方法如前面所述。转化14小时后挑取单克隆菌在含有氯霉素的LB液体培养基中培养12小时，用Plasmid Purification Kit Ver.3.0试剂盒进行质粒的提取，方法如前面所述，送上海生工生物科技有限公司测序。测序获得成功替换启动子的质粒命名为pHY18，图谱如图2所示。 

(2)、报告基因绿色荧光蛋白的连接 

报告基因绿色荧光蛋白扩增用引物P201和P202从pHY11载体获得(参照Niu et al.,2012)，并连接到Xcm Ⅰ线性化pHY18载体生成pHY18-eGFP。 

1)、用Xcm Ⅰ酶切处理pHY18载体5个小时，酶切体系如下： 

在37℃下反应5个小时，得到酶切后的pHY18载体。 

2)、将酶切后的pHY18载体跑胶，切下相应的胶块后进行胶回收(纯化回收试剂盒为Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，购自大连宝生物公司)，测得浓度为0.107μg/μl。 

3)、用T4Ligase(购自NEB公司)将纯化回收的特异的绿色荧光蛋白基因片段和回收的pHY18载体进行连接，按照载体和片段的摩尔比为1：3进行连接，连接体系如下： 

在16℃下反应16个小时，得到过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体pHY18-eGFP。 

转化入DH5α感受态细胞中，方法如前面所述。转化14小时后挑取单克隆菌在含有氯霉素的LB液体培养基中培养12小时，用Plasmid Purification Kit Ver.3.0试剂盒进行质粒的提取，方法如前面所述，送上海生工生物科技有限公司测序。测序获得成功连接报告基因绿色荧光蛋白的质粒命名为pHY18-eGFP。 

二、将表达载体pHY18-eGFP的转化及鉴定 

1、通过电穿孔法将pHY18-eGFP转化到三角褐指藻(Niu et al.,2012)。将转化后的三角褐指藻涂于含200mgL^-1氯霉素藻平板，置于温度在21±1℃，光照强度为50μm photonosm^-2s^-1，光暗比为12h：12h的智能生物人工气候培养箱中培养2-3周。挑取单藻落于新鲜f/2-si培养基中，扩大培养。pHY18-eGFP转化的三角褐指藻在补充有250毫克的L^-1氯霉素新鲜f/2-si培养基中(图3B，左烧瓶)生长，同时未转化的对照在150毫克的L^-1氯霉素新鲜f/2-si培养基中培养7天无法生存，(图3B，右烧瓶)。结果表明，外源CAT基因在大肠杆菌和三角褐指藻中已成功表达。转化效率估计为每1×10⁵个细胞一个菌落，比已报道的其他三角褐指藻转化体系高(Apt et al.,1996；Miyagawa et al.,2009；Niu et al.,2012)。 

在平台期收集细胞，使用eGFP基因的特异性引物P201和P202分子鉴定提取微藻的基因组DNA。分别以提取的转化和未转化的三角褐指藻DNA为模板，P201和P202引物PCR结果表明：转化的三角褐指藻有预期的0.7kb CAT条带出现(图4A，泳道2)，未转化的三角褐指藻则没有相应的条带(图4A，泳道1)，说明挑取的单藻落为阳性藻株。 

2、为了鉴定eGFP报告基因的表达，从1×10⁸个细胞中使用蛋白提取试剂盒提取野生型三角褐指藻细胞中的总蛋白(KeyGEN,Nanjing,China)。通过BCA方法测定(二喹啉甲酸测定法)蛋白浓度。在12％SDS-PAGE的每个孔道上样20μg蛋白。凝胶体免疫印迹电转移至PVDF膜。将膜置于5％BSA的PBST(137mM NaCl,10mM Na2HPO4,2.7mM KCl,1.8mM KH2PO4,0.5％Tween20,pH7.6)中室温下放置2小时。在PBST中洗涤三次后，将膜与抗Myc抗体(Invitrogen，USA)或抗GFP抗体(Epitomics,USA)，用PBST以1:5000稀释在5％BSA于室温2小时。按1:5000稀释的β-actin(Invitrogen，USA)作为内参。然后用PBST将膜洗涤三次，其后1:5000稀释在PBST中用HRP偶联的二抗(Kangwei,China)在室温下孵育1小时，用TMB试剂(Beyotime,China)洗涤印迹三次。 

用免疫印迹证明绿色荧光蛋白在转化微藻中的表达(图4B)。即抗eGFP(图4B，上图)和抗Myc(图4B，下图)抗体检测的转化细胞蛋白质印迹显示出预测的绿色荧光蛋白分子质量的28kDa的，未转化的细胞(图4B，泳道1)无条带。这一结果证实了eGFP基因已整合入微藻基因组并成功表达，也展现了通过检测在转化微藻蛋白质印迹分析Myc标签靶基因的蛋白表达的可行性。 

3、检测eGFP的表达 

使用Zeiss LSM510Meta激光共聚焦显微镜(Zeiss,Jena,Germany)(参考Li et al.,2008)检测分析平台期细胞eGFP的表达。设定480nm和530nm激发波长和发射波长测量eGFP荧光,在平台期细胞中观察转 化和野生型细胞。根据共聚焦照片显示，含有pHY18-eGFP的转基因藻株可在该激发波和检测波下显示出较为明亮的绿色荧光(如图5A所示)，而未转化的普通三角褐指藻则不显示荧光(如图5B所示)。由此可以确定，eGFP可以在三角褐指藻内表达。由此可以推断，pHY18载体可以顺利的携带外源基因，并在三角褐指藻内进行表达。 

三、三角褐指藻6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PD基因)的克隆及其同源性分析 

1、三角褐指藻G6PD基因的克隆 

(1)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，由暨南大学藻种库保存。三角褐指藻用液体f/2培养基进行培养，f/2培养基需预先用0.22μm的滤膜(购自Millipore,Billerica,MA,USA)进行过滤，所用的锥形培养瓶经1.034×105Pa(121℃)高压蒸汽灭菌30min。三角褐指藻放置在智能生物人工气候培养箱中培养，温度为21±1℃，光照强度为200μmol光子·m^–2·s^–1，光暗比为15h/9h。 

(2)、RNA提取以及反转录：采用植物RNA提取试剂盒(购自Takara公司)提取三角褐指藻的总RNA，然后通过采用PrimeScript II1st Strand cDNA Synthesis Kit(购自Takara公司)进行mRNA反转录合成cDNA。进行RT-PCR反应，反应体系25ul如下：10×PCR Buffer，2.5ul；25mM Mg²⁺，1.5ul；dNTP Mixture，0.5μl；Sense primer，1μl；Anti-sense primer，1μl；Taq，0.2μl；cDNA，1.5μl；dH2O，16.8μl。PCR反应程序如下：Cycle1：(1×)94℃，3-4min；Cycle2：(30×)94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；Cycle3：(1×)72℃，10min；16℃，∞。整个操作过程严格按照试剂盒的流程说明。 

(3)、G6PD基因的扩增：以三角褐指藻基因组cDNA为模板，上游引物P33(5’ACCATGATAATTTGCAGTCTCACTTTTTGC-3’)和下游P37(5’AAGTGCAGACGGAGGAGGTGA-3’)扩增得到1434-bp的特异性片段，DNA凝胶电泳结果如图6所示，凝胶电泳分离并纯化回收目的片段G6PD基因(纯化回收试剂盒为Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，购自大连宝生物公司)。 

2、三角褐指藻G6PD基因的同源性分析 

采用在线软件BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)及MEGA5对三角褐指藻的G6PD基因表达的蛋白序列进行系统进化分析。在Genbank中下载大量同源性高的蛋白序列，然后用Clustal X2.10进行比对，用MEGA5将比对结果采用N-J法构建系统进化树(Tamura et al.,2007)，结果如图7所示，表明三角褐指藻的G6PD基因与其他物种的G6PD基因有很高的同源性，与硅藻中的假微型海链藻，新萨托菌属的一种真菌费希新萨托菌以及常见腐生真菌黄曲霉聚在一支。 

四、G6PD基因与重组载体pHY18的连接和转化 

1、G6PD基因与pHY18载体的连接 

(1)、用Xcm Ⅰ(购自NEB公司)酶切处理pHY18载体5个小时，酶切体系如下： 

在37℃下反应5个小时，得到酶切后的pHY18载体。 

(2)、将酶切后的pHY18载体跑胶，切下相应的胶块后进行胶回收(纯化回收试剂盒为Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，购自大连宝生物公司)，测得浓度为0.107μg/μl。 

(3)、用T4Ligase(购自NEB公司)将纯化回收的特异的1.68kb的目的基因片段和回收的pHY18载体进行连接，按照载体和片段的摩尔比为1：3进行连接，连接体系如下： 

在16℃下反应16个小时，得到过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，命名为PtG6PD-pHY18。 

2、过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体PtG6PD-pHY18的转化筛选及提取 

A、将重组载体PtG6PD-pHY18转化至E.coliDH5α感受态细胞中(转化按照说明书进行)。 

B、挑平板并扩大培养，收集质粒 

挑取多个菌落，置于LB液体培养基(含35mg/L氯霉素)中进行37℃恒温震荡培养过夜。离心收集5mL震荡培养的单克隆菌，通过TKKARA MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0试剂盒进行质粒的提取，提取方法按照说明书进行。 

用Sal Ⅰ酶切质粒，载体内部有一个Sal Ⅰ切点，G6PD基因内部有一个Sal Ⅰ切点，所以成功连接G6PD基因的转化子会切出两条带，根据切点的位置以及连接方式可知三条带的大小分别为5.06kb和0.53kb。而未成功连接G6PD基因的载体pHY18只切出一条带。结果如图8所示，重组质粒切出与预期大小相符的两条带，说明成功连接了G6PD基因。 

委托华大基因公司进行测序，测序结果显示G6PD基因成功的连接在了高效表达载体pHY18上了，成功构建了过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体PtG6PD-pHY18。过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体PtG6PD-pHY18中目的基因表达盒的图谱如图9所示。 

五、三角褐指藻的电穿孔转化及抗生素筛选阳性藻株 

采用电穿孔法(所用电穿孔仪为Bio-Rad GenePulser Xcell)将上述过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的 重组载体PtG6PD-pHY18导入三角褐指藻细胞中(具体方法参照朱聪聪等，2011)。 

将重组载体PtG6PD-pHY18导入三角褐指藻细胞12天后观察转化细胞的生长状况，并查看得到分离的藻落。对照组为未转化重组载体PtG6PD-pHY18的三角褐指藻，对照组平板由褐色变成白色，这是因为未转化的三角褐指藻细胞对氯霉素敏感。实验组的平板的褐色越来越深，并看得到分离的藻落(如图10A所示)。挑取阳性藻落，接种于新鲜的不加si的f/2培养基中培养，培养基含有200mg·L^-1的氯霉素，同时相同条件下培养未转化的三角褐指藻，CAT基因在转化了重组载体PtG6PD-pHY18的藻细胞中成功表达，转化藻对氯霉素具有抗性，而未转化的三角褐指藻由于对氯霉素敏感而凋亡(如图10B所示)。筛选的阳性藻株在氯霉素浓度为200mg·L^-1的不加si的f/2培养基中培养5个周期后进行后续实验。 

六、转化藻的蛋白提取和Western blot分析 

由于重组载体PtG6PD-pHY18中含有MYC标签序列，可以通过对MYC标签序列的检测来检验目的G6PD基因的表达。为了检测G6PD基因的表达，采用植物蛋白提取试剂盒(购自凯基公司)提取转化藻和未转化藻的全蛋白，实验操作步骤完全按照试剂盒的说明书。然后采用BCA蛋白定量试剂盒(购自凯基公司)对提取的蛋白进行浓度测定(蛋白浓度为33ug·ml^-1)。根据蛋白浓度确定SDS-PAGE的上样体积，最终上样量均为20μg。同时配置两块聚丙烯氨酰胺胶，进行SDS-PAGE实验，上样量及实验条件相同，实验条件为：胶浓度12﹪，电压100V，电泳时间100min。电泳结束后，取出一块胶进行考马斯亮蓝G-250染色分析，另一块胶进行电转移，蛋白转移到PVDF膜上。转移结束后，小心取出PVDF膜，将膜置于5﹪的脱脂奶粉封闭液中，4℃过夜。封闭结束后，往封闭液中加入1:5000的抗-Myc的小鼠抗体(购自Invitrogen公司)，室温孵育2h。然后用PBST溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，0.5％Tween20，pH7.6)洗涤3次，每次10min。回收一抗溶液，将膜置于1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(购自康为公司)，室温孵育2h。回收二抗溶液，用PBST溶液洗涤3次，每次10min，采用TMB试剂(购自碧云天公司)进行显色。采用HRP标记的GAPDH优质内参。 

印记免疫实验结果(如图13所示)表明G6PD基因在转化藻中成功表达，抗-Myc的抗体探针特异结合目的蛋白，分子大小约54Kda。而未转化的藻未出现任何条带，表明Western blot实验未出现抗体的交叉反应。与内参蛋白GAPDH的表达量相比较，转化藻成功表达了G6PD基因编码的蛋白，且表达量较高，表明用抗Myc便可以快速有效地检测插入载体表达盒中任意目的基因的表达，经济实惠。 

七、蛋白的亚细胞定位预测以及免疫电镜 

蛋白重要的属性之一就是蛋白的亚细胞定位，它对于研究蛋白的功能有着重要的作用。蛋白的亚细胞定位信息对于理解被错综复杂的路径调控的细胞水平的生物进程是不可或缺的。因此，预测蛋白的亚细胞定位对于系统生物学的研究也有着重要的作用。首先在NCBI上获取了G6PD编码的蛋白序列，然后采用几个常用的蛋白亚细胞定位预测软件Target P ver1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)，Psort II  Prediction(http://psort.hgc.jp/form2.html)和Euk-mPLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)预测G6PD基因编码的蛋白在细胞中的特定位置。 

根据Target P的预测结果，三角褐指藻的G6PD基因编码信号肽属于分泌蛋白(SP为：0.663)，G6PD基因定位在线粒体及叶绿体(mTP及cTP)的可能性分别为0.016和0.088，而定位在其他位置的可能性为0.518。然而根据PSORT II预测的结果，三角褐指藻的G6PD基因有相当大的可能是编码细胞质蛋白(43.5％)，G6PD基因也可能存在于细胞外，存在于细胞壁以及细胞核的可能性分别为：17.4％，13.0％。而编码线粒体蛋白和内质网蛋白的可能性相同(8.7％)，G6PD还可能存在于液泡以及分泌系统的囊泡(4.3％)。Euk-mPLoc2.0是用来预测定位于多个位点的真核生物的亚细胞定位，根据此软件的预测结果，三角褐指藻的G6PD基因定位于细胞质及叶绿体。 

综上所述，三角褐指藻的G6PD基因最可能定位于细胞质和叶绿体，还有可能定位于内质网及线粒体。研究表明G6PD基因在不同的生物体中亚细胞定位不同，如胞液、叶绿体及线粒体。 

为了更清楚地确定三角褐指藻的G6PD基因在细胞中的定位，本发明应用了免疫胶体金与电镜结合的方式。 

实验操作如下： 

(1)、前固定：2％的戊二醛和2％的甲醇固定液固定细胞团2h；(2)、漂洗：0.01mol/L PBS浸洗5min后，3000r/min离心5min；(3)、1％锇酸固定20min；(4)、30％、50％、70％、80％、90％、95％的酒精各1次，每次5min；100％丙酮2次，每次10min；(5)、渗透：1/3树脂+2/3丙酮浸泡1h；2/3树脂+1/3丙酮浸泡1h；纯树脂2次，每次1h，第三次过夜；(6)、包埋：用环氧树脂以倒扣包埋法进行包埋；(7)、聚合：在烤箱中70℃聚合24h；(8)、常规修块，超薄切片机切片；(9)、超薄切片厚50～70nm左右，载于200～300网孔的镍网上；(10)、置与1％H2O2内10min至1h；(11)、双蒸水洗3次，每次10min；(12)、用滤纸在网缘将水吸干，浮于封闭液上，室温30min；(13)、滤纸吸干，滴加稀释的购自sigma的抗体MYC(1：100)，先室温预孵1h，再置于4℃24h；(14)、PBS漂洗3min，3次，用滤纸在网缘将水吸干；(15)、滴加二抗：滴加胶体金标记的羊抗小鼠IgG混合液，淡红色为适宜稀释液，室温孵育1h；(16)、双蒸水洗3min，3次；(17)、5％醋酸铀(双蒸水配制)染5min，然后用双蒸水洗；(18)、枸橼酸铅染色5min，双蒸水洗净。(19)、透射电镜观察。 

根据电镜结果(如图12所示)可知，相比野生型的藻，转化藻的细胞形态以及细胞器形态均未发生变化，转化藻的叶绿体中可见标记的金颗粒，其他细胞器未见金颗粒，所以可以确定G6PD基因表达的蛋白主要定位在叶绿体中。 

八、转化藻的荧光定量PCR分析 

为了检测目的基因在转化藻中的转录水平，本发明进行了荧光定量PCR实验。采用Primer Premier5.0 设计荧光定量PCR引物，对G6PD基因进行荧光定量PCR分析。β-actin基因作为管家基因，经常被作为内参分析数据，该发明以三角褐指藻的肌动蛋白1(ACT1，Phatrdraft_51157)作为分析数据的β-actin内参。用引物G6PDf(5’-AGCATCACCCTCAAGGAACC-3’)和引物G6PDr(5’-CCAAGACAAGACGGACGAAA-3’)分析G6PD基因的表达；用引物Act1f(5’-AGGCAAAGCGTGGTGTTCTTA-3’)和Act1r(5’-TCTGGGGAGCCTCAGTCAATA-3’)分析内参β-actin基因。首先，采用植物RNA提取试剂盒(购自Takara公司)提取转化藻和未转化藻的总RNA，然后通过采用PrimeScript II1st Strand cDNA Synthesis Kit(购自Takara公司)进行mRNA反转录合成cDNA。进行RT-PCR反应，反应体系25ul如下：10×PCR Buffer，2.5ul；25mM Mg²⁺，1.5ul；dNTP Mixture，0.5μl；Sense primer，1μl；Anti-sense primer，1μl；Taq，0.2μl；cDNA，1.5μl；dH2O，16.8μl。PCR反应程序如下：Cycle1：(1×)94℃，3-4min；Cycle2：(30×)94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；Cycle3：(1×)72℃，10min；16℃，∞。 

进行荧光定量PCR反应，反应体系的配制及反应参数等均按TaKaRaPremix Ex Taq^TM II(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行，荧光定量PCR的扩增曲线和融解曲线应用Bio-Rad CFX96Real-Time PCR System的操作方法进行。最后运用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6数据分析软件进行分析，且采用2^-ΔΔCt法来计算。 

转化藻株的G6PD基因的qPCR分析结果(如图13)表明G6PD基因在转化藻中的转录水平显著提高，转化藻株1的G6PD基因的转录水平是对照转录水平的2.23倍，转化藻株2的G6PD基因的转录水平是对照转录水平的4.42倍。由此可得出G6PD基因在转化藻中成功进行过表达。 

九、6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活测定 

6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化磷酸戊糖途径的第一个反应并产生NADPH和磷酸戊糖，G6PD是该途径的限速酶，反应产物NADPH提供机体所需的还原力。6-磷酸葡萄糖脱氢酶广泛存在于动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高，是糖酵解的关键酶。6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。 

由于G6PD的酶活在一定的反应时间内与反应产物NADPH浓度的变化呈线性相关，所以G6PD的活性可通过检测NADPH的产率来测定，NADPH浓度升高越多则G6PD活力越大。微藻的G6PD酶活通过G6PD酶活试剂盒(购自科铭，苏州，中国)来测定，具体实验操作严格按照说明书。取一定数量的藻细胞充分超声破碎，破碎完全后在4℃，8,000g离心10min，然后收集上层检测酶活。所有的实验操作都在30℃进行，用紫外分光度计在340nm处测定酶活。三角褐指藻的G6PD酶活按照细胞浓度计算。 

单位的定义：每10⁶个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol/L的NADPH定义为一个酶活力单位。 

$\begin{array}{c}G6\mathrm{PD}(U/{10}^6\mathrm{cells})=\frac{[(A_2-A_1)/6.22]\×(1/t.l)\×(V_1/V_2)}{C}\\ =857\×(A2-A1)\÷C({10}^6/\mathrm{mL})\end{array}$

(A：初始吸光度；A₂：反应后的吸光度；6.22：每mM NADPH的吸光度；t：反应时间(5min)；l：比色皿光径(1cm)V₁：总反应体积(750μL)；V₂：G6PD的粗酶体积C：三角褐指藻的细胞密度。) 

该研究中测定的是三角褐指藻对数中期的G6PD酶活，G6PD酶活在野生型的三角褐指藻中为2.75U/10⁶细胞，而过表达G6PD基因的转化藻的G6PD酶活分别为12.47，14.06U/10⁶细胞，比野生型的酶活分别提高了4.53倍，5.11倍。该结果(图14)表明G6PD基因的过表达确实能够显著地提高G6PD酶活。 

十、分析三角褐指藻细胞的中性脂含量 

1、尼罗红荧光染色法分析中性脂的积累 

尼罗红荧光染色法(Yang et al.2013)分析转化了PtG6PD-pHY18后三角褐指藻细胞中脂质含量的变化。染色前，采用血球板计数法对转化PtG6PD-pHY18和未转化的三角褐指藻的藻液进行浓度的测定，采用荧光分光光度计(Hitachi F4600,日本)扫描确定尼罗红和三角褐指藻的中性脂结合后的最大发射波为592nm。故本实验应用尼罗红染色分析三角褐指藻的中性脂时设定Ex＝530nm，Em＝592nm。先用20％的DMSO处理藻液10min，DMSO能使膜系统破裂，能更加准确地测定中性脂含量，然后将溶于丙酮的0.1mg·ml^-1的尼罗红染液(购自Sigma-Aldrich,美国)以1：100的体积比加入处理后的藻液中，使尼罗红的终浓度为1ug·ml^-1。室温避光染色20min。染色结束后，采用酶标仪(购自SpectraMax Plus³⁸⁴，美国)比较分析三角褐指藻细胞的中性脂的含量。将转化藻株与对照以相同的浓度转接，然后测定一个生长周期的生长速率与中性脂含量。转化藻的脂质积累速率比野生型三角褐指藻的脂质积累速率显著提高。转化藻株PtG6PD-1和PtG6PD-2在转接四天后，脂质开始持续积累，而野生型的三角藻在转接4天后脂质开始积累，在转接后的第十二天脂质积累基本达到平台期，转接后的第十三天的脂质含量比十二天的脂质含量略有提高达到最大值。(如图15A和15B所示)。每个细胞中性脂的含量在转接后的前四天略微下降。因为藻在平台期积累了大量的脂质，随后这些藻作为母液接种到新的培养基中，这些脂质会在细胞生长的过程中消耗。过表达G6PD基因的转化藻株的脂质积累比野生型的脂质积累有显著增加。转化藻株PtG6PD-1和PtG6PD-2在平台期的脂质积累分别是野生型的2.83倍和2.63倍。随后转化藻株中脂质含量高的一株用于进一步地分析验证。按照体积计算脂质含量综合考虑了细胞生长速率和脂质积累两个重要因素，能够直观地反映出微藻工业化生产的产量。刚转接的前四天单位体积藻液的脂质含量增长特别缓慢，随后脂质开始迅速积累，从第十天开始积累速度减缓，直到转接后的第十二天单位体积的脂质含量进入平台期，脂质积累缓慢，转接后第十三天脂质含量达到最大值。转化藻株每ml的中性脂含量最终比野生型的中性脂含量显著提高，转化藻株PtG6PD-1和PtG6PD-2分别提高2.4倍和2.66倍(如图15A所示)。转化藻每 10⁶个细胞中性脂的含量提高了2.83倍(如图15A所示)，每ml藻液的中性脂含量是野生型的2.66倍(如图15B所示)。转化藻株PtG6PD-1单位体积的中性脂质含量增加的幅度比单位数量的中性脂质含量增加的幅度稍大，主要是因为转化藻株PtG6PD-2的生长速率比野生型的生长速率稍慢。 

转化藻株G6PD-2的生长曲线与野生型的生长曲线几乎一致，而转化藻株PtG6PD-1的生长速率与野生型的生长速率略有差别(如图15C所示)，转化藻株PtG6PD-1在转接后的第7天进入平台期而野生型的藻在转接后第十天数量达到最大数值。在平台期时，转化藻株PtG6PD-2的藻细胞数量与野生型的藻细胞数量一致，而转化藻株PtG6PD-1的藻细胞数量略低于野生型的藻细胞数量。 

2、干重法分析中性脂的含量 

藻株的中性脂含量还用干重法进行测定(Ben-Amotz et al.1985)。20mg的冻干藻粉与2ml的甲醇、2ml的氯仿、1.5ml的5％NaCl漩涡震荡2min。然后8000g离心4min，收集氯仿层。重复萃取三次，将收集的所有氯仿层混合，N₂吹干。然后在60℃烘箱中烘干，称重，计算干重。计算得出对照的中性脂干重含量为23.53％，过量表达G6PD基因的转化藻株的中性脂干重含量分别为55.71％和56.64％，是对照中性脂干重含量的2.37倍和2.41倍。此结果说明提高G6PD基因在三角褐指藻中的表达确实能够显著提高中性脂的含量。 

3、缺氮处理 

之前的研究表明缺氮能够增加油体的数量和总体积从而增加中性脂的积累，使得缺氮处理的中性脂含量增加大约2倍(Yang,et al.2013)。此发明中将导入G6PD基因的转化藻缺氮处理，研究缺氮能否使过表达G6PD的转化藻的脂质含量继续提高。将所有的实验组及对照藻细胞浓度调整一致，培养九天后4400rpm，4℃离心10min，弃掉上清培养基，藻淀用不加NaNO^3-的f/2^-Si培养基清洗3次，确保完全去除藻淀中的N，然后将藻淀重新转接到相同体积的不加NaNO^3-的f/2^-Si培养基中，继续在缺N的培养基中培养。尼罗红染色法测定缺氮后48小时以及96小时的中性脂含量以测定中性脂积累的潜力(如图15D所示)。在平台期缺氮处理48小时以及96小时后，野生型的脂质含量增加到56％是未处理的2.1倍。转基因藻株PtG6PD-1和PtG6PD-2在48小时缺氮处理后脂质含量分别增加了40.8％and29％，在处理96小时后脂质含量增加了42.6％和43.6％。研究结果表明缺氮处理能够提高细胞内脂质含量，促进微藻的脂质积累，同样也促进转基因藻株的的脂质积累。转基因藻株PtG6PD-1和PtG6PD-2最大的中性脂含量可以达到细胞干重的79.4％和81.3％。 

十一、光合作用的测定 

叶绿素荧光参数能够灵敏地反映硅藻的瞬时光合状态以及他们对目前环境条件的适应。Fv/Fm(可变荧光量/最大荧光)表示PSII反应中心最大光化学量子产量，反映了光合作用光能转换效率。因此，它被广泛用于表征光合性能以及生长状态(Campbell,et al.,1998)。Fo是当PSII反应中心是完全开放时的最 小荧光产量。损坏或PSII反应中心的活性不可逆的降低将导致Fo数值减少。Fm为PSII反应中心是完全封闭时的最大荧光产量，因此它反映了PSII的电子传递能力。Fv为可变荧光(Fv＝Fm-Fo)，反映PSII原初电子受体QA的减少，因此能够反映PSII反应中心的光反应活性。为了测量这些参数，三角褐指藻培养物保持在黑暗中20分钟，然后暴露于饱和脉冲光(3000摩尔·M^-2·S^-1)1秒，然后，采用便携叶绿素荧光计(购自Hansatech Instruments有限公司)按照操作说明测定叶绿素荧光强度。 

根据测得的结果(如表2所示)可知，转化藻所有的参数都比对照稍低一点，对照藻的Fv/Fm为0.476而转化藻株的Fv/Fm分别为0.437和0.442，对照藻的Fs为389.33，而转化藻株的Fs分别为352.33和342.33。由此可知对照藻的光合作用光能转化效率比转化藻株的高，此结果与对照藻和转化藻株的生长曲线一致。 

表2.转化三角褐指藻的光合作用 

十一、光扫描共聚焦荧光显微镜分析转化藻的脂质 

分别取20μl的处于平台期的转化藻和未转化的藻液，尼罗红染色20min后制备样品玻片，置于激光扫描共聚焦荧光显微镜(购自Zeiss LSM510Meta，德国)下观察，Ex＝488nm，Em＝505-550nm。图片采用LSM510软件(购自Zeiss LSM510Meta，德国)处理。 

采用激光扫描共聚焦荧光显微镜对处于稳定期的转化藻细胞和未转化的藻细胞进行观察，结果如图16A和图16B所示。相比对照藻细胞，转化藻的油体数量变多、大小显著增大，说明提高G6PD在三角褐指藻中的表达确实能够显著地促进脂质积累；且转化后的藻细胞形态也发生了改变，和对照组的长梭形相比，细胞长度变短了，但宽度变大细胞变得更大了。 

十三、C-MS分析脂肪酸成分 

1、提取脂肪酸 

(1)、对照藻和转化藻各取200ml，6600rpm4℃离心10min，收集藻沉淀；(2)、加入5mLKOH-CH₃OH溶液，冰浴条件下超声破碎30min；(3)、往样品充N₂1min，盖好管口，振荡混匀，75℃水浴10min；(4)、待冷却分层后，移出上清液至一新离心管中；(5)、加入15mL2MHCl-CH₃OH溶液，充分混匀后于75℃水浴10min；(6)、室温静置分层，转移上清液至一新离心管中；(7)、加入4mL正己烷，静置分层，将上层萃取液转移至一新离心管；(8)、以N₂吹干，再加入2mL正己烷重新溶解，用于脂肪酸的上机测定。 

2、脂肪酸成分分析 

提取出的脂肪酸样品送往广东省微生物研究所测定组分及含量。 

采用气相色谱质谱联用进行脂肪酸成分的分析。实验中使用的气相色谱质谱联用仪为美国热电Therom Finngan Trance DSQ，色谱柱为DB-5石英毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm。实验的GC条件为：柱温60-250℃，60-160℃以10℃min^-1的速度升温，160-250℃以2.5℃min^-1升温，进样口温度280℃，不分流进样，进样量1μl。质谱传输线温度：200℃脂肪酸的鉴定参照谱库进行，定量分析采用各组分峰面积积分，用归一化法计算出脂肪酸组分的百分含量，以占脂肪酸含量的百分比表示。三角褐指藻细胞脂肪酸成分的鉴定过程各组分的色谱峰清晰可辨，表明分离效果较好。三角褐指藻细胞脂肪酸的组分结果(如表3所示)表明转化了重组载体PtG6PD-pHY18的三角褐指藻细胞脂肪酸的组分组成发生了变化，脂肪酸组分比率也发生了显著的变化。转化藻的C16:0含量比对照增加了16.36％而转化藻其它的饱和脂肪酸的含量都比对照降低，C20:0，C22：0，C24：0都降低50％左右，而C14：0，C18：0稍有降低。但是由于三角褐指藻中饱和脂肪酸主要是C16：0，所以转化藻总的饱和脂肪酸的含量还比对照藻的总的饱和脂肪酸提高了3.54％。转化藻总的单不饱和脂肪酸含量显著增加，比对照增加58.46％，其中单不饱和脂肪酸C16:1增加51.47％，C18:1增加83.93％。而转化藻的总的多不饱和脂肪酸含量明显降低，比对照的多不饱和脂肪酸含量降低22.69％，C18:2，C20:5(EPA)，C20：6分别降低：24.71％，29.15％，56.76％，但是C16:3却增加了17.89％。转化藻的组分组成也发生了变化，在转化藻中未能检测到C20:2，可能是因为G6PD基因的过表达影响了C20:2的含量，导致该组分含量过低检测不到。以上的结果表明G6PD基因不仅在三角褐指藻的脂肪酸合成中起重要作用，而且能够影响脂肪酸的组分含量以及脂肪酸的成分组成。 

表3.三角褐指藻细胞脂肪酸的组分结果 

Claims (6)

1.一种过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌P1启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌ccdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega leader序列，所述的Omegaleader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游；

所述的大肠杆菌P1启动子的序列如SEQ ID NO.1所示，大肠杆菌ccdB终止子的序列如SEQ ID NO.2所示，三角褐指藻fcpC基因启动子的序列如SEQ ID NO.3所示，6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO.4所示，三角褐指藻fcpA基因终止子的序列如SEQ ID NO.5所示，Omega leader序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，所述的目的基因表达盒，其中在三角褐指藻fcpC基因启动子和三角褐指藻fcpA基因终止子之间通过不依赖于连接反应的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位点，所述的XcmI序列如SEQID NO.7所示。

3.根据权利要求1所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，所述的目的基因表达盒，在三角褐指藻fcpA基因终止子前融合一个MYC标签序列，所述的MYC标签序列如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求1所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，其特征在于，所述的抗性筛选基因为氯霉素酰基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

5.权利要求1所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用。

6.根据权利要求5所述的过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用，其特征在于，所述的微藻为三角褐指藻。