CN105316357B - 利用转基因微藻生产虾青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及微藻表达载体，以及使用β‑胡萝卜素酮化酶(β‑carotene ketolase，BKT)和β‑胡萝卜素羟化酶(β‑carotene hydroxylase，CHYB)在转基因微藻中生产虾青素的方法。具体而言，本申请涉及构建微藻表达载体，包含β‑胡萝卜素酮化酶基因(BKT)和β‑胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)的微藻表达载体，包含所述微藻表达载体的微藻，使用BKT和CHYB在微藻中生产虾青素的方法，使用所述微藻表达载体制备生产虾青素的转基因微藻的方法，所述微藻表达载体在制备转基因微藻中的应用，以及所述微藻表达载体在生产虾青素中的应用。
Description
技术领域
本申请涉及微藻表达载体，以及使用β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CHYB)在转基因微藻中生产虾青素的方法。具体而言，本申请涉及构建微藻表达载体，包含β-胡萝卜素酮化酶基因(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)的微藻表达载体，包含所述微藻表达载体的微藻，使用BKT和CHYB在微藻中生产虾青素的方法，使用所述微藻表达载体制备生产虾青素的转基因微藻的方法，所述微藻表达载体在制备转基因微藻中的应用，以及所述微藻表达载体在生产虾青素中的应用。
背景技术
虾青素化学名称是3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素[1]，分子量式C40H52O4。是一种非维生素A原的类胡萝卜素，也是类胡萝素合成的最高级别产物[1]，是迄今为止自然界中发现的最强的抗氧化剂，具有强大的抗氧化活性[2]，其抗氧化性是类胡萝卜素的10倍、维生素E的550倍[3]，被誉为“超级抗氧化剂”。
虾青素具有重要的生理生化功能。它能向自由基提供电子而生成相应的阳离子基团或吸引自由基的未配对电子形成加合物，从而清除自由基，起到抗氧化作用[4]。过量的羟自由基会导致机体衰老，清除羟自由基可以调节DNA和重要生命物质的修复过程[5]，因此虾青素具有增强免疫力、抵抗癌症的作用[3,6]。虾青素对转谷胺酰胺酶具有特殊作用，能够在皮肤受光时消耗腐胺[7]，因此其可以防止皮肤衰老。又由于酯化的虾青素可以穿过血脑屏障，因此其对中枢神经系统健康具有重要的生理功能[8]。酯化态的虾青素易与蛋白质形成复合物，会产生不同的颜色[2]，因此被广泛的应用于饲料、食品添加剂中。绝大多数海产甲壳类动物和鱼类都含有虾青素，但都是通过食物链从海洋微藻、浮游植物和浮游动物中获得的[9]。这些海产动物通常都是人类的日常膳食，对人体安全[2]。因此虾青素在保健品、功能食品、医药、化妆品、饲料添加剂及食品添加剂等方面都有广阔的应用前景[10]。
但是，虾青素的来源有限，产量远远供不应求。虾青素主要分为人工合成和生物合成，生物合成又分为天然生物合成和转基因生物合成。虾青素最初是从河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼中发现的一种红色类胡萝卜素，但是河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼中的虾青素含量低、提取工艺复杂，此外河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼的来源受到季节的限制。人工合成的虾青素，由于合成工艺复杂，仅有25％为左旋结构，且都是游离形式的虾青素，目前人工合成的虾青素只能用于饲料添加剂，限制了人工合成虾青素的发展。
目前天然虾青素主要来源于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，而雨生红球藻具有生长周期长、易污染、细胞密度低等缺点导致虾青素的产率较低[11]，造成天然虾青素价格昂贵、供不应求。通过优化雨生红球藻的培养工艺或通过筛选突变体来解决虾青素产量低的问题至今尚未取得突破性进展。
小球藻含有丰富的营养价值，具有生长周期短、细胞密度高、可以进行异养、混养和光自养等营养方式进行快速生长等特点，因而在食品、医药、饲料以及能源等领域具有广泛的应用价值。申请人所在团队前期在国内外首次揭示了一株工业用蛋白核小球藻的全基因图谱，并已建立了蛋白核小球藻的电击转化方法，实现了其基因工程改造(参见闰从林《蛋白核小球藻外源基因表达系统的初步建立及其优化》，华东理工大学硕士毕业论文，2014)。
研究表明，雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)合成虾青素的过程中，β-胡萝卜素酮化酶(β-carotene ketolase，BKT)是限速酶[12]，能够以β-胡萝卜素(β-carotene)和玉米黄素(Zeaxanthin)为底物，形成角黄素(Canthanxanthin)和虾青素。β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase，CHYB)是一种非血红素双铁单加氧酶，催化β-胡萝卜素形成玉米黄素。因此，β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶在生成虾青素的过程中起重要的作用。
有文献报道通过基因工程改造，可以将雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的β-胡萝卜素酮化酶(HpBKT)和β-胡萝卜素羟化酶(HpCHYB)引入高等植物(例如烟草[13-15]、番茄[16]、拟南芥[12])中来生成虾青素。但是转基因植物种植周期长、含量低、提取工艺复杂、成本高等缺点都限制了其发展。
也有文献报道通过基因工程改造将雨生红球藻的β-胡萝卜素酮化酶(HpBKT)和β-胡萝卜素羟化酶(HpCHYB)引入微生物(例如油脂酵母、大肠杆菌[17])中来生成虾青素。但是转基因微生物不能生成酯化形式的虾青素。
但是现在还没有任何文献报道在微藻中，表达β-胡萝卜素酮化酶(HpBKT)和β-胡萝卜素羟化酶(HpCHYB)来生产虾青素的方法。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，本申请利用基因工程技术构建微藻表达载体，并且使用内源性启动子表达β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CHYB)在转基因微藻中生产虾青素。具体而言，本申请涉及构建微藻表达载体，包含β-胡萝卜素酮化酶基因(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)的微藻表达载体，包含所述微藻表达载体的微藻，使用BKT和CHYB在微藻中生产虾青素的方法，使用所述微藻表达载体制备生产虾青素的转基因微藻的方法，所述微藻表达载体在制备转基因微藻中的应用，以及所述微藻表达载体在生产虾青素中的应用。
本申请的技术方案使用蛋白核小球藻的内源性HSP70启动子表达β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CHYB)在蛋白核小球藻等藻株中生产虾青素。与现有技术中的虾青素生产方法相比，本申请的技术方案有如下优势：(1)与雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)和小球藻(Chlorella zofingiensis)相比，蛋白核小球藻已被联合国粮农组织(FAO)列为21世纪人类的绿色营养源健康食品；(2)与雨生红球藻相比，蛋白核小球藻生长周期短、细胞密度高、并且既可以进行自养又可以进行兼养和异养等多种培养方式；(3)与小球藻(Chlorella zofingiensis)相比，针对于蛋白核小球藻，本实验室创立了一项微藻培养领域崭新的平台技术——“异养—稀释—光诱导”技术(参见中国专利申请号200610025618.9，《高密度高品质培养小球藻的方法》，该专利通过引用全文并入本申请)，按照目前的培养工艺，蛋白核小球藻的平均生长速率不低于3g/L/h，即蛋白核小球藻的培养工艺更加成熟；(4)与红发夫酵母和海洋细菌Agrobacterium aurantiacum相比，蛋白核小球藻理论上可以生产所需要的反式结构酯化形式的虾青素；(5)与转基因番茄、烟草、拟南芥相比，蛋白核小球藻具有光合效率高、生长速度快、生长周期短、对不同的生态系统适应能力强、“不与人争粮，不与粮争地”等优势[18]，并且蛋白核小球藻富含蛋白、小球藻生长因子等其他高附加值产物可以用于水产养殖，从而避免了转基因食物的恐慌；(6)本申请使用蛋白核小球藻的内源性热激蛋白(HSP)70启动子，相对于外源性启动子(例如CaMV 35S启动子、SV40启动子或pCMV启动子)，内源性启动子的优点是不利于导致基因沉默，更加有利于外源基因的表达。
根据本申请的一个方面，本申请提供了微藻表达载体，所述微藻表达载体包含微藻的内源性启动子，所述内源性启动子可以用于在微藻中控制表达蛋白。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体选自pGreen、pGreen0000、pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambia1300、或pBlueScript SK/KS系列载体。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体为pGreen0029-HSP载体。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻的内源性启动子是内源性热激蛋白(HSP)启动子、泛素启动子、或NOS启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻的内源性启动子是内源性热激蛋白70启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻的内源性启动子是蛋白核小球藻的内源性启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻的内源性启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白70启动子。
根据本申请的一个方面，本申请提供了微藻表达载体，所述微藻表达载体包含β-胡萝卜素酮化酶基因(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)，并且所述微藻表达载体包含启动子、终止序列和抗生素抗性基因。
根据本申请的某些实施方式，所述BKT基因是克隆自雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的HpBKT基因。
根据本申请的某些实施方式，所述CHYB基因是克隆自雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的HpCHYB基因。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体选自pGreen、pGreen0000、pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambia1300、或pBlueScript SK/KS系列载体。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体为pGreen0029-HSP载体。
根据本申请的某些实施方式，所述启动子选自热激蛋白(HSP)启动子、泛素启动子、或NOS启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述启动子是热激蛋白启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述BKT基因和所述CHYB基因分别连接各自的启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体通过如下方法构建而得：将BKT基因插入到所述微藻表达载体中，得到包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)；用CHYB基因代替所述包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)中的BKT基因片段，从而得到包含CHYB基因的微藻表达载体(pCHYB)，再将所述载体上的启动子::CHYB::终止序列通过PCR扩增和酶切后，插入到包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)中，从而得到包含BKT基因和CHYB基因的微藻表达载体。
根据本申请的另一个方面，本申请提供了包含如申请所述的微藻表达载体的微藻。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)或栅藻(Scenedesmus spp.)。
根据本申请的另一个方面，本申请提供了使用β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CHYB)在微藻中生产虾青素的方法。
根据本申请的某些实施方式，所述方法包括构建包含BKT和CHYB的微藻表达载体，将所述微藻表达载体转化到微藻中表达，其中所述微藻表达载体包含启动子、终止序列和抗生素抗性基因。
根据本申请的某些实施方式，所述BKT包含经修饰的BKT，或者BKT的嵌合蛋白、截短蛋白或蛋白结构域，或者所述CHYB包含经修饰的CHYB，或者CHYB的嵌合蛋白、截短蛋白或蛋白结构域。
根据本申请的某些实施方式，所述BKT包含与BKT的相同性为至少约70％的序列，或者所述CHYB包含与CHYB的相同性为至少约70％的序列。
根据本申请的某些实施方式，所述BKT是来自雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的HpBKT。
根据本申请的某些实施方式，所述CHYB是来自雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的HpCHYB。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体选自pGreen、pGreen0000、pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambia1300、或pBlueScript SK/KS系列载体。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体为pGreen0029-HSP载体。
根据本申请的某些实施方式，所述启动子选自热激蛋白(HSP)启动子、泛素启动子、或NOS启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述启动子是热激蛋白启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述BKT基因和所述CHYB基因分别连接各自的启动子。
根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)或栅藻(Scenedesmus spp.)。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻表达载体通过如下方法构建而得：将BKT基因插入到所述微藻表达载体中，得到包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)；用CHYB基因代替所述包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)中的BKT基因片段，从而得到包含CHYB基因的微藻表达载体(pCHYB)，再将所述载体上的启动子::CHYB::终止序列通过PCR扩增和酶切后，插入到包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)中，从而得到包含BKT基因和CHYB基因的微藻表达载体。
根据本申请的另一个方面，本申请提供了使用本申请所述的微藻表达载体制备生产虾青素的转基因微藻的方法，所述方法包括构建如本申请所述的微藻表达载体，将所述微藻表达载体转化到微藻中，使得BKT和CHYB基因在转基因微藻中表达，并且催化所述微藻本身的类胡萝卜素生成虾青素。
根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)或栅藻(Scenedesmus spp.)。
根据本申请的另一个方面，本申请提供了本申请所述的微藻表达载体在制备转基因微藻中的应用，所述应用包括构建如本申请所述的微藻表达载体，将所述微藻表达载体转化到微藻中，使用抗生素选择性压力下获得生产虾青素的转基因藻株。
根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)或栅藻(Scenedesmus spp.)。
根据本申请的另一个方面，本申请提供了本申请所述的微藻表达载体在生产虾青素中的应用，所述应用包括构建如本申请所述的微藻表达载体，将所述微藻表达载体转化到微藻中，使得BKT和CHYB基因在转基因微藻中表达，并且催化所述微藻本身的类胡萝卜素生成虾青素。
根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)或栅藻(Scenedesmus spp.)。
根据本申请的另一个方面，本申请提供了根据本申请所述的微藻表达载体制备转基因微藻的方法所制备获得的产虾青素的转基因微藻。
根据本申请的另一个方面，本申请提供了根据本申请所述方法获取的转基因微藻作为提取虾青素的原材料的应用。
根据本申请的另一个方面，本申请提供了根据本申请所述方法获取的转基因微藻在制备动物养殖品、保健食品或化妆品中的应用。
附图说明
图1显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP的构建；
图2显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP-HpBKT的构建；
图3显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP-HpCHYB的构建；
图4显示了微藻表达载体pGreen0029-HSP-HpBKT-HpCHYB的构建；
图5显示了转基因小球藻异养生长曲线，WT表示野生型对照；
图6显示了转基因微藻虾青素HPLC图谱，其中箭头标出角黄素标品、虾青素标品、野生型藻株、以及BKT转基因的微藻株B7-7和BKT-CHYB转基因的微藻株BC9-1；和
图7显示了换算虾青素浓度的标准曲线。
具体实施方式
除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。
本申请涉及构建微藻表达载体，包含β-胡萝卜素酮化酶基因(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)的微藻表达载体，包含所述微藻表达载体的微藻，使用BKT和CHYB在微藻中生产虾青素的方法，使用所述微藻表达载体制备生产虾青素的转基因微藻的方法，所述微藻表达载体在制备转基因微藻中的应用，以及所述微藻表达载体在生产虾青素中的应用。
“修饰”是指对天然存在的核酸序列或其编码的蛋白序列进行一种或多种改变。所述修饰包括在蛋白的N末端或C末端加入多肽序列，在蛋白的N末端或C末端删除一段氨基酸序列，或者在不改变蛋白功能的情况下蛋白序列中的一种或多种氨基酸取代、插入、重复或缺失等，例如将甘氨酸取代为丙氨酸。
“突变”是指天然存在的核酸序列或其编码的蛋白序列发生改变，包括但不限于单个碱基改变所引起的点突变，或者多个碱基的缺失、重复和插入。“突变蛋白”又称为“突变体蛋白”或“蛋白突变体”是指序列中包含突变的蛋白。突变可以使用本领域已知的任何技术来生成，包括但不限于体外定点诱变、PCT介导的寡核苷酸定向突变、限制性内切核酸酶消化或者使用寡核苷酸接头等。
“嵌合蛋白”又称为“融合蛋白”，是指通过DNA重组技术获得的将两个或多个基因重组后表达的蛋白。“截短蛋白”又称为“截短体蛋白”或“蛋白截短体”，是指通过DNA重组技术，特异性表达蛋白中一个或多个片段的蛋白。“蛋白结构域”是蛋白分子中具有相对特定的结构和相对独立的功能的区域。嵌合蛋白、融合蛋白或蛋白结构域可以使用本领域已知的任何技术来生成，包括但不限于PCR扩增和重组、PCT介导的寡核苷酸定向突变、限制性内切核酸酶消化或者使用寡核苷酸接头等。
“相同性”是指两个或多个核酸或多肽序列按照本领域常用的计算方法(例如BLASTN或BLASTP或本领域已知的其他方法)进行比较或比对时，相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。“高度同源”是指与靶标核苷酸序列或氨基酸序列比较，相同性为至少约70％的核苷酸序列或氨基酸序列，例如相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。
本申请包括与本申请BKT高度同源的核苷酸序列和氨基酸序列。根据本申请的某些实施方式，所述BKT是雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpBKT。根据本申请的某些实施方式，所述HpBKT的基因序列包含NCBI数据库中注册号是D45881.1的序列。根据本申请的某些实施方式，所述HpBKT的氨基酸序列包含NCBI数据库中注册号是BAA08300.1的序列。根据本申请的某些实施方式，所述HpBKT的基因序列是NCBI数据库中注册号是D45881.1的序列。根据本申请的某些实施方式，所述HpBKT的氨基酸序列是NCBI数据库中注册号是BAA08300.1的序列。
根据本申请的某些实施方式，与本申请HpBKT高度同源的核苷酸序列是指与本申请HpBKT核苷酸序列的相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列。根据本申请的某些实施方式，与本申请HpBKT高度同源的氨基酸序列是指与本申请HpBKT氨基酸序列的相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的氨基酸序列。根据本申请的某些实施方式，所述BKT是BKT的突变蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述BKT是BKT的嵌合蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述BKT是具有BKT酶活性的截短蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述BKT是具有BKT酶活性的蛋白结构域。
本申请包括与本申请CHYB高度同源的核苷酸序列和氨基酸序列。根据本申请的某些实施方式，所述CHYB是雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpCHYB。根据本申请的某些实施方式，所述HpCHYB的基因序列包含NCBI数据库中注册号是AY187011.1的序列。根据本申请的某些实施方式，所述HpCHYB的氨基酸序列包含NCBI数据库中注册号是AAO53295.1的序列。根据本申请的某些实施方式，所述HpCHYB的基因序列是NCBI数据库中注册号是AY187011.1的序列。根据本申请的某些实施方式，所述HpCHYB的氨基酸序列是NCBI数据库中注册号是AAO53295.1的序列。
根据本申请的某些实施方式，与本申请HpCHYB高度同源的核苷酸序列是指与本申请HpCHYB核苷酸序列的相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的核苷酸序列。根据本申请的某些实施方式，与本申请HpCHYB高度同源的氨基酸序列是指与本申请HpBKT氨基酸序列的相同性为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的氨基酸序列。根据本申请的某些实施方式，所述CHYB是CHYB的突变蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述CHYB是CHYB的嵌合蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述CHYB是具有CHYB酶活性的截短蛋白。根据本申请的某些实施方式，所述CHYB是具有CHYB酶活性的蛋白结构域。
“聚合酶链反应”缩写为PCR，指通过酶促合成来扩增特异核酸序列的体外方法。“引物”指可以与靶标核酸序列杂交，从而生成在合适条件下DNA合成起始位点的寡核苷酸。这种引物可用于PCR扩增反应或DNA测序。“下游”指在核苷酸序列3’的核苷酸序列。“上游”指在核苷酸序列5’的核苷酸序列。术语“限制性内切核酸酶”或者“限制性酶”，指可以结合双链DNA，并且剪切特异DNA序列的酶。根据本申请的某些实施方式，本申请中的所述“限制性内切核酸酶”或“限制性酶”是Hind III和BamH I。根据本申请的某些实施方式，本申请中的所述“限制性内切核酸酶”或“限制性酶”是Spe I和Not I。根据本申请的某些实施方式，本申请中的所述“限制性内切核酸酶”或“限制性酶”是Sac I。
“宿主细胞”又称“受体细胞”，是使用分子生物方法转化核酸片段时，接受被转化核酸的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。根据本申请的某些实施方式，所述宿主细胞是藻类细胞，包括但不限于微藻。根据本申请的某些实施方式，所述微藻包括小球藻(Chlorella spp.)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)、嗜热小球藻(Chlorella sorokiniana)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、微拟球藻(Nannochloropsis spp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)或栅藻(Scenedesmus spp.)。根据本申请的某些实施方式，所述微藻是蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，优选蛋白核小球藻FACHB-9。
“载体”指在基因操作过程中，用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞的运载工具。术语“表达载体”指能表达所插入的核酸序列的载体或质粒。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体是藻类表达载体。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体选自表达载体pGreen、pGreen0000、pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambia1300、或pBlueScriptSK/KS系列载体。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体为pGreen0029-HSP载体。
“启动子”是指能控制编码序列表达的一段DNA序列。通常，启动子序列在所述编码序列的5'。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子选自热激蛋白(HSP)启动子、泛素启动子、或NOS启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是热激蛋白启动子。根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70启动子。根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是热激蛋白70A启动子。
在多种生理压力下，热激蛋白70启动子会启动蛋白的表达。所述生理压力包括热激、接触重金属或非压力条件例如血清刺激。根据本申请的某些实施方式，所述生理压力是热激处理。根据本申请的某些实施方式，所述生理压力是光照刺激。
根据本申请的某些实施方式，所述BKT和所述CHYB分别连接各自的启动子。根据本申请的某些实施方式，所述BKT和所述CHYB连接同一个启动子。根据本申请的某些实施方式，所述BKT的启动子和所述CHYB的启动子是相同的启动子。根据本申请的某些实施方式，所述BKT的启动子和所述CHYB的启动子是不同的启动子。
“内源性”DNA是指宿主细胞自身的DNA。与之相对，“外源性”DNA是指宿主细胞从外界吸收的DNA。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内源性启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内源性热激蛋白70启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内源性热激蛋白70A启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的外源性启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白70启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白70A启动子。根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子包含如SEQ ID NO:1序列所示的序列。根据本申请的某些实施方式，所述热激蛋白启动子是SEQ ID NO:1序列所示的序列。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性泛素启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性NOS启动子。
“选择标记”指可以根据标记的基因来用于选择的鉴定因子。选择标记通常是抗生素或化学抗性基因。本领域已知并使用的选择标记基因的示例包括但不限于：青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、G418等基因。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含抗生素抗性基因。根据本申请的某些实施方式，所述抗生素抗性基因是G418抗性基因。
“转化”指将核酸片段转移到宿主生物中的分子生物学过程。经转化后包含核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物或“转化”的生物。载体可以通过本领域已知的转化方法转移到宿主生物中。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是微藻。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是蛋白核小球藻。根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。根据本申请的某些实施方式，所述转化方法是电穿孔法。
在本申请中当“约”用于修饰某个数值时，是指所述数值可以上下浮动±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。
除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。
本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。
本申请描述了优选的实施方式和实施例，本领域技术人员在阅读本申请的基础上，可以对本申请所述的实施方式和实施例进行适当的改变。因此，本申请包括法律允许范围内对本申请权利要求书中主题的所有等同的修改和变化。
实施例
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是，下述实施例是为了举例说明的目的，不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
实施例1：包含蛋白核小球藻内源性启动子的微藻表达载体的构建
本实施例构建包含蛋白核小球藻内源性启动子的微藻表达载体。在本实施例中，所示蛋白核小球藻内源性启动子是蛋白核小球藻内源性HSP70A启动子，所述微藻表达载体pGreen0029系列表达载体。
1.1pEASY-Blunt-Hsp70A质粒构建
(1)取50mL蛋白核小球藻藻液，冷冻离心去上清后，液氮研磨提取其RNA存于-80℃冰箱冻成块状的藻泥，转移到事先倒好液氮预冷的研钵中，迅速研磨，整个过程中不断加入适量的液氮，防止RNA降解。于不含RNA酶(RNase-free)的Ep管中事先加入1ml Trizol裂解液(购自Invitrogen公司)，向其中加入50-100mg研磨好的藻粉，漩涡振荡混匀，室温放置10min使其充分裂解，12000rpm，4℃离心10min。将上清转移至另一RNase-free Ep管中，加入200μL预冷的氯仿，上下颠倒混匀15s，室温放置3min，12000rpm 4℃离心15min。将上清转移至另一RNase-free Ep管中，注意不要吸到中间层的DNA，加入500μL异丙醇，手动振荡15s，室温放置10min后12000rpm，4℃离心10min。弃上清，向沉淀中加入1ml 75％乙醇，吹打悬浮温和振荡，在7500rpm，4℃离心5min，用移液器小心吸弃上清。在超净台上风干RNA，加入20-40μL RNase-free H2O，轻弹管壁以充分溶解，留5μL左右测定浓度，剩下的-80℃保存。
通过Nano drop测定RNA浓度(OD260)以及纯度(OD260/280)。同时设定250V电压，1.5％琼脂糖凝胶电泳验证提取的RNA质量。
(2)RNA反转录成cDNA用于基因克隆
向200μL的RNase-free PCR管中加入5μL溶解的RNA，在PCR仪上进行反转录。第一步的条件是65℃5min，4℃冷却待用。再在冰上依次加入表1中的试剂(购自Toyobo公司的gDNA去除型ReverTra Ace qPCR RT Master Mix，产品号：FSQ-301)：
表1cDNA合成体系
小心混匀，37℃，5min。再按照以下步骤在PCR仪上进行反转录：37℃15min，50℃，5min，98℃5min，反应结束后获得cDNA，置于-20℃保存备用。
蛋白核小球藻热激蛋白(HSP)70A启动子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1。用含Hind III位点的上游引物HsphinF和含BamH I位点的下游引物HspbamR从上述获得的蛋白核小球藻cDNA中克隆出Hsp70A启动子基因片段。回收纯化后连接到pEASY-Blunt(北京全式金生物技术有限公司，产品号：CB101-02)克隆载体，使用测序引物M13F和M13R进行PCR测序，验证序列正确后提取质粒。
用于克隆的上游引物HsphinF和下游引物HspbamR，以及用于PCR测序的M13F和M13R引物的序列如表2所示。
表2pEASY-Blunt-Hsp70A质粒构建引物
1.2Hind III和BamH I双酶切连接获得pGreen II 0029-Hsp70A-NosT质粒
如图1所示，使用Hind III和BamH I双酶切pEASY-Blunt-Hsp70A质粒和pGreen II0029-Npt II质粒(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品号3574117)。回收pEASY-Blunt-Hsp70A质粒酶切后的小片段和pGreen II 0029-Npt II质粒酶切后的大片段，然后使用T4DNA连接酶连接，转化获得pGreen II 0029-Hsp70A-NosT载体。
pGreen II 0029-Hsp70A-NosT载体在本申请中也称为pGreen II 0029-Hsp-NosT载体、pGreen0029-HSP70A载体、pGreen0029-HSP70载体、pGreen0029-HSP载体或pGreen29-HSP载体。
实施例2：包含BKT基因的微藻表达载体的构建
本实施例构建包含BKT基因的微藻表达载体。在本实施例中，所述BKT基因是来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpBKT基因，所述表达载体是实施例1获得的含有蛋白核小球藻的内源性HSP70启动子的pGreen II 0029-Hsp-NosT载体。
雨生红球藻由嘉兴泽元生物制品有限责任公司提供。雨生红球藻用雨生培养液/培养基来培养。用Trizol提取液(购自Invitrogen公司)提取大约108个雨生红球藻细胞的总RNA，方法参考说明书步骤。采用TransScript One-Step gDNA Removal和cDNASynthesis SuperMix(购自Transgen公司)试剂盒，在15分钟合成cDNA。
所述HpBKT的基因序列在NCBI数据库中的注册号是D45881.1，所述HpBKT的氨基酸序列在NCBI数据库中的注册号是BAA08300.1。如图2所示，以雨生红球藻cDNA为模版，用含Spe I位点的上游引物BKT F和含Not I位点的下游引物BKT R引物进行PCR扩增得到HpBKT基因。用Spe I和Not I双酶切所得的HpBKT基因片段以及实施例1获得的pGreen 0029-HSP载体。将酶切后的HpBKT基因连接到pGreen 0029-HSP载体相应的酶切位点上，得到产物pGreen0029-HSP-HpBKT载体。使用测序引物HspCxF和0000R进行PCR测序，验证序列正确后提取质粒。用于克隆的上游引物BKT F和下游引物BKT R，以及用于PCR测序的HspCxF和0000R引物的序列如表3所示。
表3BKT基因克隆引物
实施例3：包含CHYB基因的微藻表达载体的构建
本实施例构建包含CHYB基因的微藻表达载体。在本实施例中，所述CHYB基因是来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpCHYB基因，所述表达载体是实施例1获得的含有蛋白核小球藻的内源性HSP70启动子的pGreen II 0029-Hsp-NosT载体。
所述HpCHYB的基因序列在NCBI数据库中的注册号是AY187011.1，所述HpCHYB的氨基酸序列在NCBI数据库中的注册号是AAO53295.1。如图3所示，用含Spe I位点的上游引物CHYB F和含Not I位点的下游引物CHYB R从实施例2中获得的雨生红球藻的cDNA中克隆出CHYB基因片段。用Spe I和Not I双酶切所得的HpCHYB基因片段和实施例1获得的pGreen0029-HSP载体。将酶切后的HpCHYB基因连接到pGreen 0029-HSP载体相应的酶切位点上，得到产物pGreen0029-HSP-HpCHYB载体。使用测序引物HspCxF和0000R进行PCR测序，验证序列正确后提取质粒。。
用于克隆的上游引物CHYB F和下游引物CHYB R，以及用于PCR测序的HspCxF和0000R引物的序列如表4所示。
表4CHYB基因克隆引物
实施例4：包含BKT和CHYB基因的微藻表达载体的构建
本实施例构建包含BKT和CHYB基因的微藻表达载体。在本实施例中，所述BKT基因是来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpBKT基因，所述CHYB基因是来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpCHYB基因，所述表达载体是实施例1获得的含有蛋白核小球藻的内源性HSP70启动子的pGreen II 0029-Hsp-NosT载体。
以实施例3获得的pGreen0029-HSP-HpCHYB为模版，用包含SacI酶切位点的无缝连接引物WL2-NOS-HSP-F和WL2-NOS-NOS-R进行PCR扩增得到HSP70A::HpCHYB::nos序列。如图4所示，用Sac I单酶切所得的HSP70A::HpCHYB::nos片段和实施例2获得的pGreen0029-HSP-HpBKT载体。将酶切后的HSP70A::HpCHYB::nos片段无缝连接到酶切后的pGreen0029-HSP-HpBKT载体相应的酶切位点上，得到产物pGreen0029-HSP-HpBKT-HpCHYB载体。使用测序引物HspCxF和0000R进行PCR测序，验证序列正确后提取质粒。
用于克隆的上游引物WL2-NOS-HSP-F和下游引物WL2-NOS-NOS-R，以及用于PCR测序的HspCxF和0000R引物的序列如表5所示。
表5HSP-HpCHYB-NOS基因克隆引物
实施例5：转基因微藻的构建
本实施例获得包含转BKT和CHYB的微藻。在本实施例中，所述BKT是来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpBKT，所述CHYB是来自雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的HpCHYB，所述表达载体是实施例2获得的pGreen0029-HSP-HpBKT和实施例4获得的pGreen0029-HSP-HpBKT-HpCHYB载体，所述微藻是蛋白核小球藻，优选的是蛋白核小球藻FACHB-9(购自中科院水生生物学研究所)。
(1)大量制备微藻表达载体：
分别将10μL实施例2获得的pGreen0029-HSP-HpBKT和实施例4获得的pGreen0029-HSP-HpBKT-HpCHYB与50μL感受态大肠杆菌(E.coli)细胞(Trans1-T1)中，轻弹混匀，冰浴30min。42℃热激90s，立即置于冰上2min。加入250μL LB培养基，在200rpm 37℃下培养1h。全部涂于含卡那霉素(Kanamycin)(60μg/mL)的LB平板上，将平板在28℃倒置培养12小时。从平板上挑取单菌落。经PCR测序鉴定正确后，液体扩大培养并且大量提取质粒。
(2)转基因微藻的制备：
蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)由嘉兴泽元生物制品有限责任公司提供。在Endo培养基中接种10％的蛋白核小球藻，在30℃、150rpm弱光条件下混养。取1mL处于对数生长期的藻液，在4℃下8,000rpm离心3min收集藻细胞。小心吸出上清液，加入1mL的高渗液，用枪头轻轻吹打至混匀，冰浴40min。在4℃下8,000rpm离心3min收集藻细胞，小心吸出上清液，加入1mL电击液用枪头轻轻吹打至混匀，用血球板计数法统计细胞密度。用电击液调节细胞密度至5×107个/mL，加入pGreen0029-HSP-HpBKT和pGreen0029-HSP-HpBKT-HpCHYB质粒、辅助质粒pSoup及鲑鱼精DNA，其中辅助质粒pSoup可以帮助pGreen II 0029质粒进行复制，加入鲑鱼精DNA可以竞争性的结合藻细胞内的核酸酶，从而对质粒加以保护，提高转化效率。混匀后取100μL加入2mm电击杯，静置冰浴5min。在电压660V、电击时间3.5ms、2mm电击杯条件下进行电击，完成后，冰上静置10min，加入200μL含1g/mL葡萄糖的BBM培养基，30℃静置1h。全部取出，涂布在含G418的SE固体培养基(含1.5％琼脂)上，先30℃避光过夜，然后在2k lx、16h/8h光暗周期培养，约一周后可见有单藻落长出。
(3)转基因微藻的鉴定：
使用上述HpBKT和HpCHYB的测序引物，经PCR方法对转基因微藻的藻落进行鉴定，选择包含HpBKT和HpCHYB基因的转基因微藻。
(4)转化藻株的生长情况分析：
包含pGreen0029-HSP-HpBKT转基因微藻命名为B7-7，pGreen0029-HSP-HpBKT-HpCHYB转基因微藻命名为BC9-1。使用野生型微藻作为对照，与B7-7和BC9-1在30℃、150rpm、避光培养条件下进行异养培养，培养结果示于图4。
由图5可知，转基因藻B7-7和BC9-1，与野生型藻在异养培养时，4天可以达到稳定期，经过短暂的平台期(5天)后，进入衰亡期。这一结果说明转基因藻和野生型藻具有相同的生长趋势。
实施例6：转基因微藻虾青素含量的检测
本实施例检测包含转BKT和CHYB的微藻中的虾青素含量。在本实施例中，所述BKT是来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpBKT，所述CHYB是来自雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的HpCHYB，所述微藻是蛋白核小球藻。
使用野生型微藻的藻液作为对照组，HpBKT转基因的微藻命名为B7-7，HpBKT-HpCHYB转基因的微藻命名为BC9-1。取2mL野生型微藻和实施例5获得的转基因微藻的藻液，离心后收集到2mL离心管中；取约1.5mL DMSO到离心管中，然后将管在44℃下的水浴中水浴15分钟。从水浴中取出试管并在10000rpm离心1分钟，使微藻细胞沉淀。使用吸管将上清转移到一个10mL棕色容量瓶中，加入约1mL丙酮到离心管中，剧烈混合,将离心管在10000rpm离心1分钟，使固体物质沉淀，将上清转移至容量瓶中；重复加入丙酮提取并离心的步骤，直至上清液成为无色的。通常是使用丙酮提取3次。再加入约1.5mL的DMSO，44℃下的水浴中水浴15分钟，将所有上清液收集到容量瓶中，让溶液平衡至室温(20℃)，然后用丙酮定容至10mL刻度并摇匀。取3mL上述样品，加入50μL用于指示出峰时间的Trans-β-apo-8’-carotental内参溶液(购自西格玛(Sigma)公司，产品号：10810)，混匀。样品中加入2mLTris缓冲液，加入600μL配好的胆固醇酯酶酶液(2单位)(购自西格玛公司，产品号：C9281-100UN)，混匀。36℃水解45min，过程中经常摇匀两次。加入0.5g无水硫酸钠，加入2mL石油醚，4000转离心30sec。转移出最上面的绿色层至一个干燥的试管中，这一过程中注意不要转移出水相。加入2mL石油醚，混匀，离心，转移至上述同一个干燥试管。重复上述步骤，直至颜色变浅，通常这一个过程大约需要重复3次。将收集到的液体在氮气流中吹干，确保无水后，从氮气流中取出试管。加入3mL的色谱流动相，溶解绿色物质。
使用下列条件，通过HPLC检测转基因微藻中虾青素的含量：检测波长：474nm，458nm；层析柱：Luna 3u Silica(2)100A，150×4.6mm；温度：20—25℃；流速：1.2mL/min；进样量：20μL(注射40μL)；流动相：正己烷：丙酮＝82:18。在使用HPLC检测前，柱子使用流动相置换30min；使用后柱子使用纯甲醇清洗40min以上。
使用HPLC分析HpBKT转基因微藻B7-7和HpBKT-HpCHYB转基因微藻BC9-1及野生型微藻对照的结果示于图6。由图6可见，野生型微藻对照与转基因微藻的锋形不同。HpBKT-HpCHYB转基因微藻BC9-1在3.40分钟处有峰出现，表示生成了角黄素；在10.50分钟处有峰出现，表示生成了虾青素。
使用每L蛋白核小球藻虾青素产量与干重的比值来计算虾青素含量。根据提取液干重、通过HPLC目的峰峰面积用图7所示的标准曲线换算得到虾青素的浓度。野生型对照以及转基因微藻的虾青素浓度和含量示于表6。
表6转基因和野生型对照蛋白核小球藻中虾青素浓度和含量
| 编号 | 虾青素浓度(mg/L) | 虾青素含量(‰) |
| 野生型对照 | 0 | 0 |
| B7-7 | 1.18 | 0.56 |
| BC9-1 | 15.11 | 7.23 |
表6的结果表明HpBKT-HpCHYB转基因的微藻BC9-1中，虾青素的含量远高于野生型对照和HpBKT转基因的微藻B7-7。因此，使用BKT和CHYB转基因可以在微藻中大量生产虾青素。
以上结合附图示例性地说明了本申请的各实施例。本领域技术人员根据本说明书公开的内容可以很容易地想到，可以根据实际需要对各实施例进行适当调整和重新组合，而不会脱离本申请的精神。本申请的保护范围以本申请的权利要求书为准。
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Claims (8)
1.一种用于生产虾青素的包含微藻表达载体的微藻，其中，微藻为蛋白核小球藻，所述的微藻表达载体为包含β-胡萝卜素酮化酶基因(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)的载体pGreen0029；所述微藻表达载体包含启动子、终止序列和抗生素抗性基因；所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白70启动子；所述BKT基因和所述CHYB基因分别连接各自的启动子。
2.如权利要求1所述的微藻，其中，所述BKT基因是克隆自雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的HpBKT基因。
3.如权利要求1所述的微藻，其中，所述CHYB基因是克隆自雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的HpCHYB基因。
4.如权利要求1所述的微藻，其特征在于，所述微藻表达载体通过如下方法构建而得：将BKT基因插入到所述微藻表达载体中，得到包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)；用CHYB基因代替所述包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)中的BKT基因片段，从而得到包含CHYB基因的微藻表达载体(pCHYB)，再将所述载体上的启动子::CHYB::终止序列通过PCR扩增和酶切后，插入到包含BKT基因的微藻表达载体(pBKT)中，从而得到包含BKT基因和CHYB基因的微藻表达载体。
5.如权利要求1所述的微藻，其特征在于，所述微藻制得方法包括构建如所述的微藻表达载体，将所述微藻表达载体转化到微藻中，使得BKT和CHYB基因在转基因微藻中表达，并且催化所述微藻本身的类胡萝卜素生成虾青素。
6.如权利要求5所述的微藻，其特征在于，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。
7.如权利要求1-6中任一项所述的微藻作为提取虾青素的原材料的应用。
8.如权利要求1-6中任一项所述的微藻在制备动物养殖品、保健食品或化妆品中的应用。
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