CN115807026B - 一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 - Google Patents
一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115807026B CN115807026B CN202210918037.7A CN202210918037A CN115807026B CN 115807026 B CN115807026 B CN 115807026B CN 202210918037 A CN202210918037 A CN 202210918037A CN 115807026 B CN115807026 B CN 115807026B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- astaxanthin
- chlamydomonas reinhardtii
- astaxanthin synthesis
- yeast
- synthesis module
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000001168 astaxanthin Substances 0.000 title claims abstract description 210
- 229940022405 astaxanthin Drugs 0.000 title claims abstract description 210
- JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N Astaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C(=C/C=C/C1=C(C)C(=O)C(O)CC1(C)C)/C)C=CC=C(/C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)C(=O)C(O)CC2(C)C JEBFVOLFMLUKLF-IFPLVEIFSA-N 0.000 title claims abstract description 205
- 235000013793 astaxanthin Nutrition 0.000 title claims abstract description 205
- MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N astaxanthin Chemical compound C([C@H](O)C(=O)C=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C(=O)[C@@H](O)CC1(C)C MQZIGYBFDRPAKN-ZWAPEEGVSA-N 0.000 title claims abstract description 205
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 163
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 155
- 241000195597 Chlamydomonas reinhardtii Species 0.000 title claims abstract description 102
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 74
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 33
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 27
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 15
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 claims description 13
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 claims description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 101100301006 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) cbbL2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100061456 Streptomyces griseus crtB gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100114901 Streptomyces griseus crtI gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150004101 cbbL gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150081158 crtB gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150000046 crtE gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150011633 crtI gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150085103 crtY gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150075592 idi gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150075980 psbA gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101150074945 rbcL gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100286286 Dictyostelium discoideum ipi gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 7
- 101150014423 fni gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 101150023330 BKT gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010296 bead milling Methods 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 241000694540 Pluvialis Species 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 25
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 5
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 abstract description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 60
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N isopentenyl diphosphate Chemical compound CC(=C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FDSDTBUPSURDBL-LOFNIBRQSA-N canthaxanthin Chemical compound CC=1C(=O)CCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C(=O)CCC1(C)C FDSDTBUPSURDBL-LOFNIBRQSA-N 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 7
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 7
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 7
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 7
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 7
- 101100421134 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) sle1 gene Proteins 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 5
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N DL-mevalonic acid Natural products OCCC(O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000168517 Haematococcus lacustris Species 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OOUTWVMJGMVRQF-DOYZGLONSA-N Phoenicoxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)C(=O)C(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)C(=O)CCC2(C)C OOUTWVMJGMVRQF-DOYZGLONSA-N 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 235000012682 canthaxanthin Nutrition 0.000 description 4
- 239000001659 canthaxanthin Substances 0.000 description 4
- 229940008033 canthaxanthin Drugs 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M (R)-mevalonate Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC([O-])=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 3
- 241000588696 Pantoea ananatis Species 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 101150067314 aadA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N (3S)-3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VWFJDQUYCIWHTN-YFVJMOTDSA-N 2-trans,6-trans-farnesyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O VWFJDQUYCIWHTN-YFVJMOTDSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206486 Adonis Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VWFJDQUYCIWHTN-UHFFFAOYSA-N Farnesyl pyrophosphate Natural products CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O VWFJDQUYCIWHTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 2
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 102100023072 Neurolysin, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- -1 i.e. Chemical compound 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 2
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 2
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DMASLKHVQRHNES-UPOGUZCLSA-N (3R)-beta,beta-caroten-3-ol Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C DMASLKHVQRHNES-UPOGUZCLSA-N 0.000 description 1
- JKQXZKUSFCKOGQ-JLGXGRJMSA-N (3R,3'R)-beta,beta-carotene-3,3'-diol Chemical compound C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C[C@@H](O)CC1(C)C JKQXZKUSFCKOGQ-JLGXGRJMSA-N 0.000 description 1
- 229910003208 (NH4)6Mo7O24·4H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- XMWHRVNVKDKBRG-UHNVWZDZSA-N 2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate Natural products OC[C@@](O)(C)[C@H](O)COP(O)(O)=O XMWHRVNVKDKBRG-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- OINNEUNVOZHBOX-QIRCYJPOSA-K 2-trans,6-trans,10-trans-geranylgeranyl diphosphate(3-) Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O OINNEUNVOZHBOX-QIRCYJPOSA-K 0.000 description 1
- AJBZENLMTKDAEK-UHFFFAOYSA-N 3a,5a,5b,8,8,11a-hexamethyl-1-prop-1-en-2-yl-1,2,3,4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a,13b-hexadecahydrocyclopenta[a]chrysene-4,9-diol Chemical compound CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC(C1(C)CC3O)(C)C2CCC1C1C3(C)CCC1C(=C)C AJBZENLMTKDAEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000184350 Adonis aestivalis Species 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 229920006384 Airco Polymers 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000772993 Brevundimonas sp. SD212 Species 0.000 description 1
- 101150028535 CRTZ gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003880 Calendula Nutrition 0.000 description 1
- 101000703651 Chlamydomonas reinhardtii Arylsulfatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- OINNEUNVOZHBOX-XBQSVVNOSA-N Geranylgeranyl diphosphate Natural products [P@](=O)(OP(=O)(O)O)(OC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C)O OINNEUNVOZHBOX-XBQSVVNOSA-N 0.000 description 1
- JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N Lycophyll Natural products OC/C(=C/CC/C(=C\C=C\C(=C/C=C/C(=C\C=C\C=C(/C=C/C=C(\C=C\C=C(/CC/C=C(/CO)\C)\C)/C)\C)/C)\C)/C)/C JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100168661 Paracoccus sp. (strain N81106 / MBIC 01143) crtW gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- JKQXZKUSFCKOGQ-LQFQNGICSA-N Z-zeaxanthin Natural products C([C@H](O)CC=1C)C(C)(C)C=1C=CC(C)=CC=CC(C)=CC=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)C[C@@H](O)CC1(C)C JKQXZKUSFCKOGQ-LQFQNGICSA-N 0.000 description 1
- QOPRSMDTRDMBNK-RNUUUQFGSA-N Zeaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCC(O)C1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)CC(O)CC2(C)C QOPRSMDTRDMBNK-RNUUUQFGSA-N 0.000 description 1
- XMWHRVNVKDKBRG-CRCLSJGQSA-N [(2s,3r)-2,3,4-trihydroxy-3-methylbutyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC[C@](O)(C)[C@@H](O)COP(O)(O)=O XMWHRVNVKDKBRG-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- JKQXZKUSFCKOGQ-LOFNIBRQSA-N all-trans-Zeaxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)CC(O)CC2(C)C JKQXZKUSFCKOGQ-LOFNIBRQSA-N 0.000 description 1
- NBZANZVJRKXVBH-ITUXNECMSA-N all-trans-alpha-cryptoxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CCCC2(C)C)C NBZANZVJRKXVBH-ITUXNECMSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- MQZIGYBFDRPAKN-UWFIBFSHSA-N astaxanthin Chemical compound C([C@H](O)C(=O)C=1C)C(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)C(=O)[C@@H](O)CC1(C)C MQZIGYBFDRPAKN-UWFIBFSHSA-N 0.000 description 1
- 108010091656 beta-carotene hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010080924 beta-carotene ketolase Proteins 0.000 description 1
- 235000002360 beta-cryptoxanthin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011774 beta-cryptoxanthin Substances 0.000 description 1
- DMASLKHVQRHNES-ITUXNECMSA-N beta-cryptoxanthin Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=C(C)CCCC2(C)C DMASLKHVQRHNES-ITUXNECMSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001746 carotenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000005473 carotenes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- VOAXAOULFRTTAM-UHFFFAOYSA-N chloroform phenol Chemical compound C1(=CC=CC=C1)O.C(Cl)(Cl)Cl.C1(=CC=CC=C1)O.C1(=CC=CC=C1)O VOAXAOULFRTTAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 235000012661 lycopene Nutrition 0.000 description 1
- 239000001751 lycopene Substances 0.000 description 1
- OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N lycopene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CCC=C(C)C OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N 0.000 description 1
- 229960004999 lycopene Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- DGEYTDCFMQMLTH-UHFFFAOYSA-N methanol;propan-2-ol Chemical compound OC.CC(C)O DGEYTDCFMQMLTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N prenyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N trans-isorenieratene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/c1c(C)ccc(C)c1C)C=CC=C(/C)C=Cc2c(C)ccc(C)c2C ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N 0.000 description 1
- KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N trans-lutein Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CC(O)CC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=CC(O)CC2(C)C)C KBPHJBAIARWVSC-XQIHNALSSA-N 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N vitamin A aldehyde Natural products O=CC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 235000010930 zeaxanthin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001775 zeaxanthin Substances 0.000 description 1
- 229940043269 zeaxanthin Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用。所述构建方法包括虾青素合成模块的设计、组装以及在莱茵衣藻中的功能验证。本发明选用7个虾青素合成相关的基因，设计虾青素表达模块框架，并分成4个片段进行人工合成；之后将4个片段以及酵母‑大肠穿梭质粒骨架共转化酵母，获得含有虾青素合成模块的酵母；再将含有虾青素合成模块的酵母与含有叶绿体基因组的酵母进行杂交，将虾青素合成模块插入到莱茵衣藻叶绿体基因组中，再将重组质粒导入莱茵衣藻叶绿体中，最终获得含有虾青素合成模块的阳性莱茵衣藻转化子，即为虾青素合成工程藻株。最终，可通过大规模培养转基因的虾青素合成工程藻株，实现快速、廉价生产虾青素。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术以及合成生物学领域，涉及一种转基因表达系统的构建方法及应用，尤其涉及一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用。
背景技术
虾青素(astaxanthin)具有极强的生物活性，被认为是“超级维生素E”。虾青素在在功能食品和医药方面有广泛的应用前景，具有巨大的市场潜力。虾青素合成途径的第一阶段是合成β-胡萝卜素；第二阶段是β胡萝卜素经氧化(酮基化)和羟基化形成虾青素(如图1所示)。类胡萝卜素的天然合成途径大致可以分为上下游，目前普遍认为有两种上游生物合成途径：甲羟戊酸(mevalonate,MVA)途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methy1-D-erythrito1-4-phosphate,MEP)途径。第一种MVA途径合成异戊烯焦磷酸，即以乙酰CoA为起始物，首先合成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)，然后经还原作用形成3-甲基-3,5-二羟基戊酸，再进一步形成异戊烯焦磷酸(IPP)。第二种合成途径是MEP途径，在该途径IPP可以由甘油醛-3-磷酸和丙酮酸两种前体物质合成，即以丙酮酸为起始物，经过与3-磷酸甘油醛(GAP)反应而合成异戊烯焦磷酸(IPP)。其中3-磷酸甘油醛可能来自光合磷酸化和氧化磷酸化。从异戊烯焦磷酸(IPP)到β-胡萝卜素的合成步骤是通过逐步添加异戊烯焦磷酸而延长分子链，经二甲(基)烯丙(基)焦磷酸(DMAPP)、牛儿焦磷酸(GPP)、法尼焦磷酸(FPP)和牛儿牛儿焦磷酸(GGPP)形成八氢蕃茄红素和蕃茄红素，再经环化反应形成β-胡萝卜素。第二阶段由β-胡萝卜素合成虾青素的过程中，合成路线也分为两条：第一条路线是从β-胡萝卜素氧化(酮基化)开始，经过海胆酮、鸡油菌黄质、4,4’-二酮基-3-羟基-β-胡萝卜素三种中间物质合成虾青素。第二条路线是β-胡萝卜素首先羟基化形成β-隐黄质，然后经玉米黄质和3,3’-二羟基-4-酮基-β-萝卜素最终合成虾青素。
然而，目前进行虾青素的生产的技术存在以下问题和不足：(1)、研究具有盲目性，很少或没有将控制条件的优化与细胞的生理代谢特性及虾青素合成的调控特点结合起来；(2)、生产成本高，无法实现商业化生产。为了提高虾青素产量，不顾微生物细胞的生长需求和生产成本，盲目地大量提高碳源和氮源尤其是价格很高的有机氮源(酵母膏和蛋白胨等)的添加量，这些营养物质不能被微生物细胞有效利用而造成浪费；(3)、化学合成法存在局限性，化学合成法合成虾青素的质量、安全性都存在问题，并且功效远不如天然来源的虾青素。因此，随着生物合成虾青素的兴起，各国对化学合成的虾青素管理愈来愈严，例如美国食品与药物管理局(FDA)禁止化学合成的虾青素进入食品、保健品市场。目前，虾青素已经在许多的植物中被成功合成。少数的金盏花物种是唯一能产生虾青素的陆地植物，金盏花(Adonis)属中的Adonis aestivalis和Adonis annua的花瓣中由于虾青素的积累呈现明亮的血红色。它是高级植物中虾青素合成途径的良好载体。然而，由于金盏花花朵较小，使得其在虾青素的工业化生产中受到限制。在番茄中共表达莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhartii)的β-胡萝卜素酮醇酶和雨生红球藻的β-胡萝卜素羟化酶，使得番茄中大多数原有的类胡萝卜素基因上调，有效地将碳通量引导到类胡萝卜素中，大量游离虾青素在叶片中大量积累。在烟草中表达Brevundimonas sp.SD212的编码crtW和crtZ的基因，在烟叶中产生了0.5％DCW的虾青素(占总胡萝卜素的70％以上)。但是在植物中合成的虾青素产量较少，生产成本大，难以实现工业化规模。
因此，现有技术还有待改进，急需寻找一种能够获得高效且低成本合成虾青素的途径，以解决现有技术中虾青素产量低、成本高的问题。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用，旨在通过叶绿体基因工程技术改造莱茵衣藻，构建合成虾青素的工程藻株，获得高效且低成本合成虾青素的途径。
本发明的技术方案如下：
一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，所述构建方法包括虾青素合成模块的设计、组装以及在莱茵衣藻中的功能验证；其中，设计的所述虾青素合成模块包括7个虾青素合成途径相关酶基因、psbA启动子、rbcL终止子以及I-SceI位点。
所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，所述虾青素合成途径相关酶基因为crtE、crtB、crtI、idi、crtY、BKT2和CrtR-b1。
所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，所述crtE、crtB和crtI基因来自于Pantoea ananatis，所述idi基因来自于Escherichia coli，所述crtY基因来自于Pantoea agglomerans，所述BKT2和CrtR-b1基因来自于Haematococcus pluvialis。
所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，所述虾青素合成模块全长为11632bp。
所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，将所述虾青素合成模块分成4个初级片段进行全化学合成，每个片段两端加入BamHI限制性内切酶，两两片段之间依次有80bp的同源臂。
所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，所述虾青素合成模块的组装包括如下步骤：
6.1将所述虾青素合成模块分成4个初级片段进行全化学合成；
6.2将合成的4个初级片段以及酵母-细菌穿梭质粒骨架共转化酵母，并初步筛选阳性克隆；
6.3利用PCR验证初步筛选的阳性克隆，鉴定出酵母阳性转化子，即得到含有虾青素合成模块的酵母菌株。
所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，所述酵母-细菌穿梭质粒骨架是以pRS406载体为模板，通过PCR扩增的方法获得，PCR的引物序列如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示。
所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，所述虾青素合成模块在莱茵衣藻中的功能验证包括如下步骤：
8.1利用酵母同源重组的方法将所述虾青素合成模块导入叶绿体基因组中，得到虾青素-叶绿体基因组；
8.2将所述虾青素-叶绿体基因组转化进入莱茵衣藻细胞中；
8.3经转化后的莱茵衣藻细胞在含壮观霉素的培养平板筛选，挑取绿色单克隆；
8.4利用PCR对所述绿色单克隆进行检测，选取叶绿体基因组被替换为所述虾青素-叶绿体基因组的阳性转化子；
8.5检测所述阳性转化子的虾青素产物的含量。
所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其中，将所述虾青素-叶绿体基因组转化进入莱茵衣藻细胞中的方法包括珠磨法、基因枪法或电激法。
一种虾青素合成路径的构建方法的应用，其中，将如上任一所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法应用于虾青素合成工程藻株的构建。
有益效果：本发明提供了一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用。所述构建方法包括虾青素合成模块的设计、组装以及在莱茵衣藻中的功能验证；设计的所述虾青素合成模块包括7个虾青素合成途径相关酶基因(crtE、crtB、crtI、idi、crtY、BKT2和CrtR-b1)、psbA启动子、rbcL终止子以及I-SceI位点。本发明根据相关文献获得7个虾青素合成相关的基因，设计虾青素表达模块框架，并分成4个片段进行人工合成并进行密码子优化；之后利用酵母具有同源重组的特点将4个片段以及酵母-大肠穿梭质粒骨架共转化酵母，最终获得含有虾青素合成模块的酵母。再将含有虾青素合成模块的酵母与含有叶绿体基因组的酵母进行杂交，利用缺陷型培养基筛选出导入成功的含有虾青素-叶绿体基因组的酵母菌株。本发明将组装成功的虾青素合成模块插入到莱茵衣藻叶绿体基因组中，再通过“珠磨法”、基因枪法、电激法等遗传转化方法将重组质粒导入莱茵衣藻叶绿体中，待长出转化子后，提取藻DNA，进行PCR验证，最终获得含有虾青素合成模块的阳性莱茵衣藻转化子，即为虾青素合成工程藻株。最终，虾青素合成工程藻株利用莱茵衣藻自身光合作用产生的乙酰CoA为底物，在虾青素合成通路相关酶的催化作用下，在藻细胞内合成虾青素。与其他生产虾青素途径相比较，本发明在莱茵衣藻中合成虾青素具有如下几方面的优势：(1)莱茵衣藻可以利用光能来合成生产虾青素的底物，不需要添加昂贵的底物，大大降低虾青素生产成本；(2)莱茵衣藻叶绿体可实现多基因的同时表达，多个外源基因可以以多顺反子的形式同时在叶绿体中转录和表达，叶绿体基因组多顺反子的表达具有安全、高效等特点，更利于实现多基因共转化；(3)莱茵衣藻叶绿体基因组具有分子量小，结构简单、不结合组蛋白等特点，有利于实现分子操作；(4)本发明所用的莱茵衣藻菌株为细胞壁缺陷型菌株，有利于获积累高水平目标产物的工程株，并且该菌株中转基因表达效率并不严格依赖于密码子的使用。最终，可通过大规模培养转基因的虾青素合成工程藻株，实现快速、廉价生产虾青素。
附图说明
图1为虾青素合成代谢途径示意图。
图2为本发明实施例提供的虾青素合成模块设计示意图。
图3为本发明实施例提供的pRS406-ura3-虾青素合成模块载体示意图。
图4为本发明实施例提供的酵母载体pRS406片段的扩增结果图。
图5为本发明实施例提供的初筛阳性酵母转化子连接处鉴定结果图。
图6为本发明实施例提供的转基因衣藻aadA DNA-PCR鉴定结果图。
图7为本发明实施例提供的转基因衣藻阳性藻株HPLC结果图。
图8为本发明实施例提供的转基因衣藻阳性藻株虾青素峰图。
具体实施方式
本发明提供一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，所述构建方法包括虾青素合成模块的设计、组装以及在莱茵衣藻中的功能验证、
在莱茵衣藻中构建虾青素合成路径，利用莱茵衣藻叶绿体基因工程的方式生产虾青素是一种有效且极具发展前景的技术。利用合成生物学手段获得高产藻株生产虾青素与传统的生产方式相比，在时间、效率和成本等方面都具有明显的优势：(1)莱茵衣藻可利用TAP无机培养基和空气中的CO2合成碳源等有机物，其光合效率高、生长周期短。与培养大肠杆菌和酵母相比，虾青素培养条件简单、成本低；(2)莱茵衣藻作为单细胞真核生物，其叶绿体、细胞核和线粒体三大遗传操作的表达系统已建立，且它们的全基因组信息均测序完成，遗传背景较清晰，是一种常用的模式生物，具有完整的翻译后加工的复杂系统，可以表达外泌重组蛋白，且可以进行翻译后加工，分离提纯蛋白成本低，不需要通过化学半合成的方式形成最终的活性产物，极大降低了生产成本；(3)莱茵衣藻属于安全级的单细胞微生物，适合工厂发酵罐或者流道式培养，不需要占据耕地，也不像植物细胞工程那样发生生物扩散或者基因漂移现象。目前，莱茵衣藻的工业化生产已经可以达到50万升的规模，转基因产物推广可行性高，经济价值高。近年来，已有多种有应用前景和表达意义的外源基因在莱茵衣藻叶绿体成功表达有融合抗原类、单克隆抗体类、疫苗类、细胞因子类等基因。
在一些实施方式中，设计的所述虾青素合成模块包括7个虾青素合成途径相关酶基因、psbA启动子、rbcL终止子以及I-SceI位点。
在一些实施方式中，所述虾青素合成途径相关酶基因为crtE、crtB、crtI、idi、crtY、BKT2和CrtR-b1。
具体的，所述crtE、crtB和crtI基因来自于Pantoea ananatis，所述idi基因来自于Escherichia coli，所述crtY基因来自于Pantoea agglomerans，所述BKT2和CrtR-b1基因来自于Haematococcus pluvialis。
在一些实施方式中，所述虾青素合成模块全长为11632bp。
本发明实施例设计的虾青素合成模块表达框架，将虾青素合成途径相关的7个酶基因、psbA启动子、rbcL终止子、I-SceI位点，以及叶绿体基因组I-SceI位点两端约80bp的片段整合，获得全长为11632bp的虾青素合成模块，具体设计图如图2所示。
在一些实施方式中，将所述虾青素合成模块分成4个初级片段进行全化学合成，每个片段两端加入BamHI限制性内切酶，两两片段之间依次有80bp的同源臂。
将全长为11632bp的虾青素合成模块切割成4段3kb左右的片段(seg1、seg2、seg3、seg4)，每个片段两端加入BamHI限制性内切酶，两两片段之间依次有80bp的同源臂。委托商业公司合成seg1、seg2、seg3和seg4片段，并连接在pUC-57载体上，之后通过BamHI限制性内切酶切即可获得seg1、seg2、seg3和seg4片段。
在一些实施方式中，所述虾青素合成模块的组装包括如下步骤：
S10、将所述虾青素合成模块分成4个初级片段进行全化学合成；
S20、将合成的4个初级片段以及酵母-细菌穿梭质粒骨架共转化酵母，并初步筛选阳性克隆；
S30、利用PCR验证初步筛选的阳性克隆，鉴定出酵母阳性转化子，即得到含有虾青素合成模块的酵母菌株。
在一些具体的实施方式中，所述酵母-细菌穿梭质粒骨架是以pRS406载体为模板，通过PCR扩增的方法获得。其中，PCR的引物序列如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示：
SEQ.ID NO.1
pRS406-F：ttggaacattatatggataagggatccctattgggcgctcttccgcttcct
SEQ.ID NO.2
pRS406-R：cggtagcaggtttacatacagggatccccgcaaaccgcctctccccgcgcg
具体的，通过PCR扩增获得pRS406载体片段，即酵母-细菌穿梭质粒骨架；之后将seg1、seg2、seg3和seg4片段，以及酵母-细菌穿梭质粒骨架通过原生质体法共转化酵母BY4741，经SC-URA平板筛选阳性克隆。这些片段包括7个虾青素合成必须基因，1个酵母-细菌穿梭质粒骨架，其中pRS40作为节选片段质粒的载体，URA3基因提供营养缺陷型筛选标记。
具体的，利用PCR验证初步筛选的阳性克隆，鉴定出酵母阳性转化子。步骤S20初步筛选得到的阳性克隆，随机挑选单克隆进行酵母菌落PCR初筛，之后提取菌落PCR初筛阳性的酵母质粒，进行基因组复筛，最终经全部引物验证的即为包含全部片段的阳性转化子。其中，验证所用的PCR引物序列如下：
SEQ.ID NO.3
psbA-F:ccatgataacattttagcttcacga
SEQ.ID NO.4
psbA-R:ttggagcgaacgacctacac
SEQ.ID NO.5
rbcL-F:cagtcgggaaacctgtcgtg
SEQ.ID NO.6
rbcL-R:cgtgaaggtggcgacgtaat
通过对启动子psbA连接处以及终止子rbcL连接处鉴定，得到的酵母阳性转化子，即为含有虾青素合成模块的酵母菌株，所述菌株含有完整的pRS406-ura3-虾青素合成模块载体，全长16236bp，如图3所示。
在一些实施方式中，所述虾青素合成模块在莱茵衣藻中的功能验证包括如下步骤：
S100、利用酵母同源重组的方法将所述虾青素合成模块导入叶绿体基因组中，得到虾青素-叶绿体基因组；
S200、将所述虾青素-叶绿体基因组转化进入莱茵衣藻细胞中；
S300、经转化后的莱茵衣藻细胞在含壮观霉素的培养平板筛选，挑取绿色单克隆；
S400、利用PCR对所述绿色单克隆进行检测，选取叶绿体基因组被替换为所述虾青素-叶绿体基因组的阳性转化子；
S500、检测所述阳性转化子的虾青素产物的含量。
在一些具体的实施方式中，步骤S100中，利用酵母同源重组的方法将虾青素合成模块导入叶绿体基因组。将含有叶绿体基因组的酵母菌株(已进行生物保藏，保藏信息如下：保藏单位名称：CCTCC-中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2022-07-05；保藏编号：CCTCC NO:M 20221032；分类命名：Saccharomycescerevisiae SZUsyncre1.0)和虾青素合成模块的酵母菌株进行杂交，利用SC-LEU、SC-MET平板筛选获得同时含叶绿体基因组和虾青素合成模块的酵母菌株。将ZLP012质粒(已进行生物保藏，保藏信息如下：保藏单位名称：CCTCC-中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2022-07-05；保藏编号：CCTCCNO:M 20221031；分类命名：Escherichia coli SZUZLP012)转化到上一步得到的酵母中，用SC-URA-HIS平板筛选得到同时含有叶绿体基因组、虾青素合成模块和ZLP012质粒的酵母菌株，利用半乳糖诱导I-SceI的表达，叶绿体基因组和虾青素合成模块因I-SceI位点切割而线性化，在酵母中完成组装。之后，通过PCR筛选出虾青素合成模块整合进莱茵衣藻叶绿体基因组的酵母菌株，即得到含有虾青素-叶绿体基因组的酵母菌株。
在一些具体的实施方式中，步骤S200中，将所述虾青素-叶绿体基因组转化进入莱茵衣藻细胞中的方法包括“珠磨法”、基因枪法或电激法。
在一些具体的实施方式中，步骤S300中，经转化后的莱茵衣藻细胞在含壮观霉素的培养平板筛选。转基因衣藻由于导入aadA基因而具有壮观霉素抗性，使转基因衣藻可在含壮观霉素的平板上生长。挑取绿色单克隆，经过连续性5-20代的继代培养，并在抗性平板上进行保持培养(含150μg/mL的壮观霉素)。
在一些具体的实施方式中，步骤S500中，将阳性莱茵衣藻转化子进行高光诱导，冷冻干燥后获得藻粉，经异丙醇处理后进行高效液相色谱分析。利用高效液相色谱分析所述阳性转化子的虾青素产物，包括虾青素、类胡萝卜素、虾青素合成的中间产物角黄素等等。
本发明实施例还提供一种虾青素合成路径的构建方法的应用，将如上任一所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法应用于虾青素合成工程藻株的构建。最终，可通过大规模培养转基因的虾青素合成工程藻株，实现快速、廉价生产虾青素。
与其他生产虾青素途径相比较，本发明提供的虾青素生产方法具有如下几方面的优势：(1)莱茵衣藻可以利用光能来合成生产虾青素的底物，不需要添加昂贵的底物，大大降低虾青素生产成本；(2)莱茵衣藻叶绿体可实现多基因的同时表达，多个外源基因可以以多顺反子的形式同时在叶绿体中转录和表达，叶绿体基因组多顺反子的表达具有安全、高效等特点,更利于实现多基因共转化；(3)莱茵衣藻叶绿体基因组具有分子量小，结构简单、不结合组蛋白等特点，有利于实现分子操作；(4)本发明所用的莱茵衣藻菌株为细胞壁缺陷型菌株，有利于获积累高水平目标产物的工程株，并且该菌株中转基因表达效率并不严格依赖于密码子的使用。
下面通过具体实施例对本发明一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用做进一步的解释说明：
若无特别说明，本发明实施例所用到的材料、试剂等均可以通过商业途径购买；若无特别说明，本发明实施例所采用的方法、流程等均为本领域常规技术或本领域技术人员可以根据公知常识或常规技术进行合理设置。
实施例1转基因受体藻的选择与培养
本发明实施例选用的受体藻为莱茵衣藻的藻株Chlamydomonas reinhardtii JUV和Chlamydomonas reinhardtii CC849，作为转基因操作的受体，该藻株为细胞壁缺陷型的莱茵衣藻品系。
莱茵衣藻培养时使用的培养基为TAP培养基，1L培养基的组份如下：Tris 2.42g，4×Beijerinck salts(每升含16g NH4Cl，2g CaCl2·2H2O，4gMgSO4·7H2O)25mL，1M磷酸钾缓冲液1mL，微量元素混合液(每升含11.4g H3BO3，22g ZnSO4·7H2O，5.06g MnCl2·4H2O，4.99g FeSO4·7H2O，1.61g CoCl2·6H2O，1.57g CuSO4·5H2O，1.1g(NH4)6Mo7O24·4H2O，50gNa2EDTA)1mL，冰醋酸1mL，H2O 975mL，pH＝7.0。
莱茵衣藻培养条件如下：温度22-25℃，光照90μE/m2/s的条件下连续光照培养，通气量可调整(0.5L/min左右)，藻细胞浓度达到108-109细胞/mL时离心收集。
实施例2虾青素合成模块的组装
(1)基因来源：crtE、crtB和crtI三个基因来自于Pantoea ananatis，idi基因来自大肠杆菌Escherichia coli，crtY基因来自Pantoea agglomerans，BKT2和CrtR-b1两个基因来自于Haematococcus pluvialis(基因序号：D45881.1和MW147623.1)。
(2)虾青素合成模块表达框架的设计：将虾青素合成途径相关的7个酶基因、psbA启动子、rbcL终止子、I-SceI位点以及叶绿体基因组I-SceI位点两端约80bp的片段组装，获得全长为11632bp的虾青素合成模块，具体设计图如图2所示。
(3)虾青素合成模块的组装：
1)将全长为11632bp的虾青素合成模块切割成4段3kb左右的片段(seg1，seg2，seg3，seg4)，每个片段两端加入BamHI限制性内切酶，两两片段之间依次有80bp的同源臂。委托商业公司合成seg1、seg2、seg3和seg4片段，并连接在pUC-57载体上，通过BamHI限制性内切酶切获得seg1、seg2、seg3和seg4片段；
2)通过PCR扩增获得pRS406载体片段，作为酵母-细菌穿梭质粒骨架，验证结果如图4所示。其中，PCR的引物序列如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示：
SEQ.ID NO.1
pRS406-F：ttggaacattatatggataagggatccctattgggcgctcttccgcttcct
SEQ.ID NO.2
pRS406-R：cggtagcaggtttacatacagggatccccgcaaaccgcctctccccgcgcg
3)将seg1、seg2、seg3和seg4片段，以及酵母-细菌穿梭质粒骨架通过原生质体法共转化酵母BY4741(商业化菌株，购于辉诺生物医药科技有限公司，货号：A226)。
具体方法如下：从平板上挑取酵母单菌落，于20mL YPD液体培养基过夜培养。将菌液转接至40mL YPD液体培养基中，使菌体浓度OD600为0.4-0.8，之后3000rpm离心5min收集菌体，并用ddH2O离心洗涤，3000rpm离心5min。将洗涤后的菌体转移至1.5mL离心管中，用1mL的0.1mol/L LiAc离心洗涤，3000rpm离心1min。重悬细胞于400μL的0.1mol/L LiAc中混匀，取50μL，13000rpm离心15sec后，依次加入240μL50％PEG6000、36μL1mol/L LiAc、5μL单链鱼精DNA、64μL无菌ddH2O和6μL DNA片段混匀。30℃孵育30min后，加入50μl的DMSO，42℃水浴中热激25min。3000rpm离心5min，去上清。加入1mL 5mM CaCl2，3000rpm离心2min去上清，重悬细胞于800μL无菌ddH2O中，3000rpm离心2min除去上清液，重悬细胞于500μL无菌ddH2O中，取100μL涂布至SC-URA平板筛选阳性克隆，30℃恒温培养3-4天，挑选转化子并验证。
4)酵母转化子鉴定
首先随机挑选单克隆进行酵母菌落PCR初筛。酵母菌落PCR具体方法如下：
取单克隆到10μL ddH2O，置于PCR反应仪中进行如下反应：98℃，3min；4℃，2min；5个循环。反应结束后将菌液混匀作为酵母菌落PCR的模板。反应体系：10×Taq PCR Buffer，1μL；2.5mM dNTP MIX，0.8μL；10μM上游引物，0.2μL；10μM下游引物，0.2μL；酵母菌液，7.7μL；GenStar DNA Polymerase，0.1μL。反应程序：94℃，5min；94℃，30s；Tm℃，30s；72℃，1kb/min；72℃，5min；16℃保存。
提取初筛阳性的酵母质粒，具体方法如下：将过夜培养的，OD600＝1.5的酵母1860×g常温离心5min；50mL ddH20重悬，1860×g常温离心5min，40mL SPE溶液重悬；加入250μlZYm·20T和40μlβ-巯基乙醇，37℃放置1h，中间间歇轻柔混匀；1294×g，4℃离心5min，收集细胞，加1mL(1M)山梨醇溶液；加入20mL Lysis溶液，上下颠倒10次左右，37℃放置30min；加入20mL氯仿·苯酚，上下颠倒20次左右，4194rpm常温离心20min，收集上清至新的50mL离心管；加入2mL NaAc(3M)和20mL异丙醇沉淀DNA,上下颠倒6-8次，4194×g 4℃离心30min；加入10mL75％乙醇漂洗DNA，4194×g 4℃离心5min，取上清，晾干后加入50-80μL的ddH2O。进行PCR验证。
PCR验证的引物序列如下：
SEQ.ID NO.3
psbA-F:ccatgataacattttagcttcacga
SEQ.ID NO.4
psbA-R:ttggagcgaacgacctacac
SEQ.ID NO.5
rbcL-F:cagtcgggaaacctgtcgtg
SEQ.ID NO.6
rbcL-R:cgtgaaggtggcgacgtaat
PCR验证结果如图5所示，其中，(A)启动子psbA连接处鉴定；N：阴性对照，P1-20：阳性酵母转化子，M：DL5000 Marker(B)终止子rbcL连接处鉴定；N：阴性对照，P1-20：阳性酵母转化子，M：DL5000 Marker。通过验证，得到含有完整虾青素合成模块的酵母菌株，所述菌株含有完整的pRS406-ura3-虾青素合成模块载体，全长16236bp。
实施例3虾青素合成模块导入叶绿体基因组
利用酵母同源重组的方法将虾青素合成模块导入叶绿体基因组。将含有叶绿体基因组的酵母菌株(保藏号：CCTCC M 20221032)和实施例2得到的含有完整pRS406-ura3-虾青素合成模块载体的酵母菌株进行杂交，利用SC-LEU、SC-MET平板筛选获得同时含叶绿体基因组和虾青素合成模块的酵母菌株。将ZLP012质粒(保藏号：CCTCC M 20221031)转化到上一步得到的酵母中，用SC-URA-HIS平板筛选得到同时含有叶绿体基因组、虾青素合成模块和ZLP012质粒的酵母菌株。I-SceI是来源于酿酒酵母线粒体内含子编码的一种核酸内切酶，能够特异性识别约18bp的序列，并在识别位点产生一个双链断裂缺口进而激活酵母细胞的同源重组修复机制。利用半乳糖诱导I-SceI的表达，叶绿体基因组和虾青素合成模块因I-SceI位点切割而线性化，在酵母中完成完整叶绿体基因组的组装。
之后，通过PCR筛选出虾青素合成模块整合进莱茵衣藻叶绿体基因组的酵母菌株，即得到含有虾青素-叶绿体基因组的酵母菌株。
实施例4莱茵衣藻的遗传转化
上述实施例3中验证正确的虾青素-叶绿体基因组，转入大肠杆菌，利用大肠杆菌扩繁该基因组，之后提质粒，得到能用于叶绿体转化的高浓度的质粒，通过“基因枪法”或“电激法”转化莱茵衣藻。
“基因枪法”转化莱茵衣藻，具体步骤如下：
莱茵衣藻JUV在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106cells/mL，室温离心收集，用TAP液体培养基重悬，调整细胞浓度至2×108cells/mL。吸取300μL悬浮液涂布于TAP固体平板培养基，22℃光照培养箱(光照条件为90μE/m2/s)中培养1-2天以形成细胞层。在无菌条件下用基因枪(Bio-Rad)轰击。具体步骤如下：取50μL金粉悬浮液(60μg/mL)，加入6μg含有外源基因的质粒和50μL 2M CaCl2和20μL 0.1M亚精胺，通过涡轮振荡器振荡1-3min以混合，8000rpm离心10秒，弃上清，用无水乙醇清洗，振荡，再8000rpm离心10秒，弃上清，共5次，最后用60μL无水乙醇重悬沉淀。每次轰击取10μL，轰击参数如下：真空度25inches·Hg，轰击距离9cm，每皿轰击3次，22℃光照培养箱恢复培养12小时，然后转移到筛选平板(含150μg/mL的壮观霉素)上继续培养(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至绿色单克隆长出。
通过“电激法”转化莱茵衣藻，具体步骤如下：
莱茵衣藻JUV在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×106cells/mL，室温离心收集，用电激缓冲液(10mM Tris-HCl，pH＝7.5，10mM CaCl2，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重悬，调整细胞浓度至2×108cells/mL。加入终浓度为10μg/mL的含外源基因的质粒及25μg/mL的鲑精DNA，混匀后置冰上，吸取0.4mL于电转杯中待用。电转仪(Eppendorf)电激时电压为1KV/cm，持续时间2秒，然后冰上放置10min，补充10mL TAP液体培养基22℃光照培养箱恢复培养12-18小时，然后转移到筛选平板(含100μg/mL的壮观霉素)上继续培养(22℃，90μE/m2/s)1-2周，至绿色单克隆长出。
上述筛选平板培养基中含有150μg/mL的壮观霉素，如果藻细胞能在筛选平板上长出单克隆藻落，说明虾青素-叶绿体基因组已经转入叶绿体中。
实施例5转基因莱茵衣藻的筛选、鉴定以及功能验证
要确定实施例4得到的藻落为转入目的基因的衣藻，首先通过连续继代培养5-20代后，再进行分子检测以及功能验证。转基因衣藻由于导入aadA基因而具有壮观霉素抗性，使转基因衣藻可在含壮观霉素的平板上生长，得到的转化子经过连续性5-20代的继代培养，并在抗性平板上进行保持培养(含150μg/mL的壮观霉素)。
1、转基因衣藻的筛选与鉴定
(1)转基因衣藻总DNA的提取
莱茵衣藻总DNA提取方法：取10mL处于对数生长后期的莱茵衣藻培养液，4℃离心收集，加350mL NET(0.1mol/L NaCl，50mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0)重悬沉淀，加入25μL Proteinase K(10mg/mL)、25μL 20％SDS，混匀，55℃水浴2h；冰上冷却，加入200μL 5mol/L KAc，冰上静置后离心，上清加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，水相加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-70℃放置15min；离心收集沉淀，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于30μL ddH2O中。
(2)转基因藻DNA-PCR分析
以转基因衣藻总DNA为模板，根据各目的基因片段设计特异性引物分别扩增片段，然后各取10μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，其中N：阴性对照，P：阳性对照，P7-28：阳性藻株转化子，M：DL2000 Marker。
PCR引物序列如下：
SEQ.ID NO.7
aadA-F：actgcggagcagcttgttat
SEQ.ID NO.8
aadA-R：cacaacacgaggtacgggaa
2、转基因衣藻的功能验证
上一步筛选得到的阳性转化子，即为含有虾青素表达模块的转基因衣藻。光照条件下将转基因衣藻于20mL TAP液体培养基进行培养，测转基因藻液OD750的值，按照5×105cells/mL的接种量将藻液稀释到50mL的TAP液体培养基中。在正常光照下恢复24小时后，将藻液放在500HZ高光下培养7天，离心收集藻细胞，冷冻干燥后获得藻粉。取10mg的藻粉于5mL离心管，加入3mL甲醇后在涡旋仪涡旋10s，10min后涡旋一次，共涡旋三次。取1mL上清过0.22μm的滤膜，从其中吸取80μl于内插管的样品瓶，进行高效液相色谱分析。
高效液相色谱：Agilent Technologies,Agilent,USA
色谱柱：5μL,150×3.0mm,Phenomenex Inc.,Aschaffenburg,Germany
流动相A：ddH2O
流动相B：甲醇:异丙醇(8:2)
流速：0.6mL/min
分析时间：18min
梯度洗脱：
0min：15％A，85％B
0-10min：100％A，0％B
10-12min：100％A，0％B
12-18min：15％A,85％B
采用紫外检测器在最大吸收值280nm、400nm、440nm、450nm、475nm处测吸收峰面积，再根据标准曲线计算产量。
结果如图7、图8所示，其中，图7A为阳性转化子的类胡萝卜素含量与野生型对比；图7B为阳性转化子的角黄质含量与野生型对比。图8为阳性转化子虾青素峰图。上述结果表明：在光照条件下，导入虾青素合成模块的转基因衣藻的类胡萝卜素含量得到大幅提高，达到37.63μg/mg干重，较未导入虾青素合成模块的衣藻提高65％，虾青素合成的中间产物角黄素达到0.435μg/mg干重。通过高效液相色谱，可以从转基因藻中检测到虾青素，而未导入虾青素合成模块的衣藻则检测不到虾青素。
综上所述，本发明提供了一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用。所述构建方法包括虾青素合成模块的设计、组装以及在莱茵衣藻中的功能验证；设计的所述虾青素合成模块包括7个虾青素合成途径相关酶基因(crtE、crtB、crtI、idi、crtY、BKT2和CrtR-b1)、psbA启动子、rbcL终止子以及I-SceI位点。本发明根据相关文献获得7个虾青素合成相关的基因，设计虾青素表达模块框架，并分成4个片段进行人工合成并进行密码子优化；之后利用酵母具有同源重组的特点将4个片段以及酵母-大肠穿梭质粒骨架共转化酵母，最终获得含有虾青素合成模块的酵母。再将含有虾青素合成模块的酵母与含有叶绿体基因组的酵母进行杂交，利用缺陷型培养基筛选出导入成功的含有虾青素-叶绿体基因组的酵母菌株。本发明将组装成功的虾青素合成模块插入到莱茵衣藻叶绿体基因组中，再通过“珠磨法”、基因枪法、电激法等遗传转化方法将重组质粒导入莱茵衣藻叶绿体中，待长出转化子后，提取藻DNA，进行PCR验证，最终获得含有虾青素合成模块的阳性莱茵衣藻转化子，即为虾青素合成工程藻株。最终，虾青素合成工程藻株利用莱茵衣藻自身光合作用产生的乙酰CoA为底物，在虾青素合成通路相关酶的催化作用下，在藻细胞内合成虾青素。与其他生产虾青素途径相比较，本发明在莱茵衣藻中合成虾青素具有如下几方面的优势：(1)莱茵衣藻可以利用光能来合成生产虾青素的底物，不需要添加昂贵的底物，大大降低虾青素生产成本；(2)莱茵衣藻叶绿体可实现多基因的同时表达，多个外源基因可以以多顺反子的形式同时在叶绿体中转录和表达，叶绿体基因组多顺反子的表达具有安全、高效等特点，更利于实现多基因共转化；(3)莱茵衣藻叶绿体基因组具有分子量小，结构简单、不结合组蛋白等特点，有利于实现分子操作；(4)本发明所用的莱茵衣藻菌株为细胞壁缺陷型菌株，有利于获积累高水平目标产物的工程株，并且该菌株中转基因表达效率并不严格依赖于密码子的使用。最终，可通过大规模培养转基因的虾青素合成工程藻株，实现快速、廉价生产虾青素。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括虾青素合成模块的设计、组装以及在莱茵衣藻中的功能验证；其中，设计的所述虾青素合成模块包括7个虾青素合成途径相关酶基因、psbA启动子、rbcL终止子以及I-SceI位点，所述虾青素合成途径相关酶基因为crtE、crtB、crtI、idi、crtY、BKT2和CrtR-b1；
虾青素合成模块的组装以及功能验证包括：将含有叶绿体基因组的酵母菌株和含虾青素合成模块的酵母菌株杂交，筛选获得同时含有叶绿体基因组和虾青素合成模块的酵母菌株，其中，含有叶绿体基因组的酵母菌株的保藏编号为CCTCC NO:M20221032，含虾青素合成模块的酵母菌株以pRS406载体为酵母-细菌穿梭质粒骨架，且含有pRS406-ura3-虾青素合成模块载体；将ZLP012质粒转化到所述同时含有叶绿体基因组和虾青素合成模块的酵母菌株中，筛选获得同时含有叶绿体基因组、虾青素合成模块和ZLP012质粒的酵母菌株，其中，所述ZLP012质粒的保藏编号为CCTCC NO:M20221031；还包括莱茵衣藻的遗传转化和功能验证步骤。
2.根据权利要求1所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其特征在于，所述crtE、crtB和crtI基因来自于Pantoea ananatis，所述idi基因来自于Escherichia coli，所述crtY基因来自于Pantoea agglomerans，所述BKT2和CrtR-b1基因来自于Haematococcus pluvialis。
3.根据权利要求1所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其特征在于，所述虾青素合成模块全长为11632bp。
4.根据权利要求1所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其特征在于，将所述虾青素合成模块分成4个初级片段进行全化学合成，每个片段两端加入BamHI限制性内切酶，两两片段之间依次有80bp的同源臂。
5.根据权利要求1所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其特征在于，所述虾青素合成模块的组装包括如下步骤：
将所述虾青素合成模块分成4个初级片段进行全化学合成；
将合成的4个初级片段以及酵母-细菌穿梭质粒骨架共转化酵母，并初步筛选阳性克隆；
利用PCR验证初步筛选的阳性克隆，鉴定出酵母阳性转化子，即得到含有虾青素合成模块的酵母菌株。
6.根据权利要求5所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其特征在于，所述酵母-细菌穿梭质粒骨架是以pRS406载体为模板，通过PCR扩增的方法获得，PCR的引物序列如SEQ. ID NO. 1和SEQ. ID NO. 2所示。
7.根据权利要求1所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其特征在于，所述虾青素合成模块在莱茵衣藻中的功能验证包括如下步骤：
利用酵母同源重组的方法将所述虾青素合成模块导入叶绿体基因组中，得到虾青素-叶绿体基因组；
将所述虾青素-叶绿体基因组转化进入莱茵衣藻细胞中；
经转化后的莱茵衣藻细胞在含壮观霉素的培养平板筛选，挑取绿色单克隆；
利用PCR对所述绿色单克隆进行检测，选取叶绿体基因组被替换为所述虾青素-叶绿体基因组的阳性转化子；
检测所述阳性转化子的虾青素产物的含量。
8.根据权利要求7所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法，其特征在于，将所述虾青素-叶绿体基因组转化进入莱茵衣藻细胞中的方法选自珠磨法、基因枪法或电激法中的任一种。
9.一种虾青素合成路径的构建方法的应用，其特征在于，将如权利要求1-8任一所述的莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法应用于虾青素合成工程藻株的构建。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210918037.7A CN115807026B (zh) | 2022-08-01 | 2022-08-01 | 一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 |
| PCT/CN2022/116578 WO2024026963A1 (zh) | 2022-08-01 | 2022-09-01 | 一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 |
| ZA2023/08004A ZA202308004B (en) | 2022-08-01 | 2023-08-17 | Construction method of astaxanthin synthesis pathway in chlamydomonas reinhardtii and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210918037.7A CN115807026B (zh) | 2022-08-01 | 2022-08-01 | 一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115807026A CN115807026A (zh) | 2023-03-17 |
| CN115807026B true CN115807026B (zh) | 2023-09-01 |
Family
ID=85482524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210918037.7A Active CN115807026B (zh) | 2022-08-01 | 2022-08-01 | 一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115807026B (zh) |
| WO (1) | WO2024026963A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA202308004B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115807026B (zh) * | 2022-08-01 | 2023-09-01 | 深圳大学 | 一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1827769A (zh) * | 2006-01-26 | 2006-09-06 | 深圳大学 | 一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法 |
| CN103805623A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-05-21 | 河北大学 | 一种虾青素合成基因重组质粒及其制备方法和用途 |
| CN103865818A (zh) * | 2012-12-07 | 2014-06-18 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种产虾青素基因工程菌的构建方法 |
| CN105861538A (zh) * | 2016-05-25 | 2016-08-17 | 天津大学 | 一种重组质粒及重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
| CN107129995A (zh) * | 2014-09-03 | 2017-09-05 | 武汉生物技术研究院 | 一种产虾青素基因工程菌的构建方法 |
| CN112852694A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-05-28 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 虾青素合成菌株构建及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7064196B2 (en) * | 2003-05-20 | 2006-06-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Genes encoding carotenoid compounds |
| AU2004260061A1 (en) * | 2003-07-17 | 2005-02-03 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Genes encoding carotenoid compounds |
| CN105316357B (zh) * | 2015-10-14 | 2019-05-28 | 华东理工大学 | 利用转基因微藻生产虾青素的方法 |
| CN115807026B (zh) * | 2022-08-01 | 2023-09-01 | 深圳大学 | 一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 |
-
2022
- 2022-08-01 CN CN202210918037.7A patent/CN115807026B/zh active Active
- 2022-09-01 WO PCT/CN2022/116578 patent/WO2024026963A1/zh unknown
-
2023
- 2023-08-17 ZA ZA2023/08004A patent/ZA202308004B/en unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1827769A (zh) * | 2006-01-26 | 2006-09-06 | 深圳大学 | 一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法 |
| CN103865818A (zh) * | 2012-12-07 | 2014-06-18 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种产虾青素基因工程菌的构建方法 |
| CN103805623A (zh) * | 2014-01-17 | 2014-05-21 | 河北大学 | 一种虾青素合成基因重组质粒及其制备方法和用途 |
| CN107129995A (zh) * | 2014-09-03 | 2017-09-05 | 武汉生物技术研究院 | 一种产虾青素基因工程菌的构建方法 |
| CN105861538A (zh) * | 2016-05-25 | 2016-08-17 | 天津大学 | 一种重组质粒及重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
| CN112852694A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-05-28 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 虾青素合成菌株构建及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA202308004B (en) | 2023-09-27 |
| CN115807026A (zh) | 2023-03-17 |
| WO2024026963A1 (zh) | 2024-02-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110423732B (zh) | 一种在酿酒酵母中表达的酶及高产α-和γ-生育三烯酚的基因工程菌及其构建方法 | |
| CN113652440B (zh) | 3-酮脂酰辅酶a硫解酶基因rkacaa1-2及其应用 | |
| CN115029257B (zh) | 产β-胡萝卜素的重组解脂耶氏酵母及其构建方法和应用 | |
| CN105861538B (zh) | 一种重组质粒及重组酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| CN113621630B (zh) | 3-酮脂酰-CoA硫解酶基因RkACAA1-1及其应用 | |
| CN115807026B (zh) | 一种莱茵衣藻中虾青素合成路径的构建方法及应用 | |
| CN113621631A (zh) | 一种甲羟戊酸激酶基因rkmk及其应用 | |
| CN105316357A (zh) | 利用转基因微藻生产虾青素的方法 | |
| CN113265344A (zh) | 一种选择性生产视黄醇的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN111235044B (zh) | 合成δ-生育三烯酚重组酿酒酵母菌株及构建方法及用途 | |
| CN113604374A (zh) | 一种高效生产类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN112608936B (zh) | 调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用 | |
| CN114214218A (zh) | 一种产虾青素的工程菌及其制备方法和应用 | |
| CN109913508A (zh) | 一种利用蓝藻合成根皮素的方法 | |
| CN117229934A (zh) | 一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN110669787B (zh) | 一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用 | |
| CN114107079B (zh) | 一种耐油酿酒酵母基因工程菌及其构建方法 | |
| CN106893726B (zh) | 一种启动子以及重组酵母菌株 | |
| WO2018233531A1 (zh) | 微生物及其用途 | |
| CN114525215A (zh) | 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用 | |
| CN105441458B (zh) | 盐芥耐低磷基因ThPHT1-1及重组载体及应用 | |
| CN109825441A (zh) | 一种用于提高微藻固碳效率的方法及转基因衣藻和应用 | |
| WO2016106988A1 (zh) | 一种产紫杉二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备紫杉二烯的方法 | |
| CN114806911B (zh) | 一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α-红没药烯的方法 | |
| CN115786386B (zh) | 一种简化莱茵衣藻叶绿体基因组设计与合成组装的方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |