CN1807649A - 一种莱茵衣藻外源基因表达系统及其构建生产phb转基因藻的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莱茵衣藻外源基因表达系统及其构建生产PHB的转基因藻的方法，由启动子、外源目的基因、筛选标记和莱茵衣藻受体藻株组成。利用该系统构建生产PHB的转基因的方法：A.受体藻株的选择与培养；B.PHB生物合成关键酶基因的克隆；C.PHB生物合成关键酶莱茵衣藻表达载体，D.通过珠磨法、基因枪法或电激法，从真养产碱杆菌分离出的PHB生物合成关键酶基因导入莱茵衣藻中，经过筛选和分子检测获得生产PHB的二价或转基因衣藻。利用光合作用产生的乙酰辅酶A为底物，在phbA、phbB和phbC基因编码的PHB合成关键酶的共同作用下，合成聚β－羟基丁酸。方法易操作、成本低廉、产物易分离、安全，解决了白色污染的问题。

Description

一种莱茵衣藻外源基因表达系统及其构建生产PHB转基因藻的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种莱茵衣藻外源基因表达系统，同时还涉及构建生产聚β-羟基丁酸(PHB)转基因藻的方法。

背景技术

随着社会的不断发展，塑料制品已经成为人类社会生活的必需品。由于化学合成塑料在自然环境中的光降解和生物降解速度都较慢，用¹⁴C同位素跟踪考察土壤中塑料的降解结果表明，塑料的分解速度随环境条件(如降雨量、透气性、温度等)不同而有所差异，但总体看来，分解速度非常缓慢，通常认为需要200-400年，其塑料废弃物造成的“白色污染”问题已经成为日益严重的环境问题。开发出生物可降解的塑料是目前该领域研究的热点。

聚β-羟基丁酸(polyhydroxybutyric acid，PHB)是发现最早且研究最透彻的一种生物可降解塑料。它不仅具有与化学合成塑料相似的理化性质，还具有一些特殊性能，如生物可降解性、生物相容性、光学活性、无毒性、无刺激性和无免疫原性等。它的这些特殊性能在医学、光电子化学、精细化工等高新技术行业具有极大的开发潜力。在医学上，可以用作药物释控微球、外科医用植入材料、药剂载体、细胞培养的理想支架材料、骨修复材料和外科治疗用品等；在光电子化学品方面可用作录音材料介质、液晶显示用材料、光学薄膜、光电摄影调色剂等；在精细化工方面，可用作精加工包装、照相、摄像机、家电、电脑的缓冲包装等。

Lemoigne等于1925年在细菌Bacillus megaterium中发现了聚β-羟基丁酸酯(PHB)。十九世纪二十年代至今已发现许多微生物包括光能和化能自养及异养菌等共65种均能产生PHB，如产碱杆菌属(Alcaligenes)，假单细胞菌属(Pseudomonas)，甲基营养菌属(Methylotrophs)，固氮菌属(Azotobacter)和红螺菌属(Rhodospirillum)等。PHB的熔点低、可塑性强且易于加工，其分子量因菌种及合成条件而异，约从6×10⁴至10⁶道尔顿不等，相应的聚合度n约700至12,000。PHB的合成途径如下：

在营养平衡条件下，微生物细胞中的乙酰辅酶A进入三羧酸循环，生成高浓度的游离辅酶，抑制了PHB合成的关键调控酶——乙酰辅酶A酰基转移酶，最终抑制了PHB的合成；当营养失衡且碳源过剩时，NADH氧化酶活性降低，NADH逐渐增多会抑制柠檬酸合成酶及异柠檬酸脱氢酶，阻断了三羧酸循环，没有被利用的乙酰辅酶A积累到一定程度，辅酶A对乙酰辅酶A酰基转移酶的抑制就被克服，乙酰辅酶A便缩合成乙酰乙酰辅酶A并启动了PHB的合成(Steinbuchel et al，Molecular Microbiology，1991，5(3)535-542)。PHB能为土壤及海水中存在的许多微生物所降解，一般在厌氧污水中降解最快，在海水中降解最慢(Luzier，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89：839-842)。

目前生产PHB较成熟的方法是用细菌发酵生产PHB。自然条件下产PHB的细菌中，PHB含量一般为1％～3％。在碳过量、氮限量的控制发酵条件下，PHB含量可达细胞干重的70％～80％。1975年英国帝国化学公司(ICI)开始采用真养产碱杆菌的一个突变体生产PHB。他们于1981年在限磷而其它盐过量且含葡萄糖和丙酸的培养基上培养利用葡萄糖的真养产碱杆菌突变体，使其产生P(3HB-3HV)，终产量可达菌体干重的70％～80％(Lee et al，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，1995，52：27-58)。1987年弗吉利亚James Madison大学的Dennis成功地从真氧产碱杆菌中克隆到合成PHB的基因，并转入大肠杆菌中。1989年ICI公司利用Dennis组建的工程菌生产的PHB占菌体干重80％以上。奥地利维也纳大学在组建工程大肠杆菌的同时引入热敏噬菌体溶解基因，可使细菌易裂解释放PHB，降低了提取成本。但用细菌合成PHB生产效率低，熔点和降解起始温差不大，结晶速度慢，加工困难，价格昂贵，实际应用受到限制。

直到1992年Poirier等首次进行了植物生产PHB的尝试，将CaMV35s启动子控制的真氧产碱杆菌PHB合成途径中的phbB，phbC导入拟南芥菜中，并利用植物本身的酮硫裂解酶合成了一定量的PHB，颗粒大小形状与细菌中相似。虽然PHB合成量很少，约100μg/gfwt，转基因植株生长却严重受阻，PHB颗粒在胞质、液泡，甚至核内出现，但质体内不存在(Poirieret al，FEMS Microbiol.Rev.，1992，103：237-246)。1994年，Nawrath等改进了策略，将PHB定位于质体。他们分别在phb B，phbA和phb C基因上连入一段编码豌豆叶绿体Rubisco小亚基转运肽的DNA片段，将表达产物定位于质体，通过杂交手段将三个基因在同一株拟南芥菜中表达。结果PHB累积量高达干重的14％，而且转基因植株发育正常(Nawrath et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91：12760-12764)。第一代含PHB基因的转基因植物中，质体中没有PHB产物，表明PHB颗粒不能穿过质体双层膜。因此将PHB定位于质体的另一个优点就是不会造成PHB的泄漏而干扰植物的正常生理功能，也不会阻碍一些内源机制的运转。但是研究发现植株幼叶成长期PHB含量超过300～400μg/gfwt时，在后期(50～60天后)叶片有轻微的黄化现象。PHB颗粒积累太多可能对叶绿体的正常功能有不利的影响。

孟山都公司的研究小组选择油菜作为生产塑料(PHB)的植物，并期望在种子中表达相关目的基因，这是因为乙酰COA是PHB和脂肪酸生物合成的共用中间代谢产物，油菜种子又是油脂化合物有效合成积累的场所。孟山都公司的Houmiel等报道(Houmiel et al，Planta，209：547-550)，构建了一个包含4个目的基因(IlvA466、BktB/phbA、phb B和phbC)的植物表达载体，每个目的基因前融合有编码拟南芥叶绿体转送肽(ctp)和Lesguerella羧化酶启动子(P-Lh)，目的基因尾部融合有豌豆RbcsSE9基因的E 93’序列终止子，其中目的基因phb B使用的是豌豆Rubisco小亚基转送肽。这样构建的表达载体保证了多个目的基因在植物白色质体中正确表达。采用农杆菌介导法将该多基因表达载体导入油菜，转基因植株成熟种子中含有7.7％鲜重的PHB。通过进一步改变脂肪酸和氨基酸生物合成的中间产物流向，研究小组获得了能够合成积累PHBV共聚物(3-羟基丁酸酯与3-羟基戊酸酯的共聚物)的转基因油菜。研究还证明PHBV共聚物的积累并不影响油菜种子中油脂的合成和生产。

本发明人之一宋艳茹等(植物学报，phbB、phbC基因在大肠杆菌中的表达及对马铃薯植株的转化和检测，1998，40(7)：615-621)成功从真养产碱杆菌染色体DNA中扩增出phbA、phbB和phbC基因，构建原核表达载体导入大肠杆菌，并对细菌中积累的PHB进行物化性质的鉴定，证明克隆的phbB、phbC基因产物具有活性。并已经完成了单基因(嵌合phbA)，双基因(嵌合phbB、phbC)，三基因(嵌合phb A、phbB和phbC)植物表达载体的构建，转化5个马铃薯品种，并在转基因阳性株系中检测到PHB的累积。

尽管细菌发酵生产PHB的技术比较成熟，但由于细菌培养需要较昂贵的发酵底物和消耗能源使其价格难以下降，无法与现今价格低廉的化学合成塑料竞争。利用转基因植物生产PHB也存在生长周期长，占地空间大，转基因植株不可育性等问题，这给实现工业化生产PHB带来很大的困难。

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)属于绿藻门团藻目衣藻科，是一种单细胞真核鞭毛藻类，是研究多种生命活动(如光合作用、鞭毛组装、趋光性和生理节律等)的模式生物，与酵母细胞有许多共同的特征，素有“光合酵母”之称。莱茵衣藻的细胞呈卵形，有细胞壁、细胞质和细胞核；细胞质里有一个大型杯状叶绿体，占整个细胞体积的40-60％。细胞前部偏在一侧的地方有一个红色的眼点，眼点对光线的强弱很敏感。莱茵衣藻细胞的前端有两根鞭毛，能够摆动，因此可以在水中自由游动。莱茵衣藻的全身都能够吸收溶解在水中的二氧化碳和无机盐，并且能够依靠眼点的感光和鞭毛的摆动，游到光照和其他条件都适宜的地方，进行光合作用，维持自己的生活。它具有无性生殖、有性生殖两种方式，有光能自养、异养及光能异养3种不同的营养生长方式，其生长速度快且光合效率高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种莱茵衣藻外源基因表达系统，它包含强启动子、外源目的基因、终止子、筛选标记和受体藻株(莱茵衣藻，Chlamydomonas reinhardtii)，该系统具有表达效率高、成本低、产物易分离、生态安全等优点。

本发明的另一个目的是构建生产生物可降解塑料-聚β-羟基丁酸(polyhydroxybutyricacid，PHB)转基因衣藻的方法，该方法具有易操作、生产成本低廉等优点。

本发明包括以下几方面的内容：

1.一种莱茵衣藻外源基因表达系统包括：

(1)转基因受体藻的筛选与培养

选择细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC-849作为受体藻，莱茵衣藻的培养采用Tris-acetate-phosphate(TAP)培养基，在光照～90μE/m².s的条件下，通气培养至对数生长后期，藻细胞浓度达到10⁸-10⁹cells/mL时，离心收集。藻细胞培养依生产规模采用不同规模的光合生物培养系统，大规模生产可采用跑道式藻类培养系统。

(2)含有筛选标记基因表达盒的外源基因莱茵衣藻表达载体的构建

A：建立莱茵衣藻核表达载体：含有RBCS2启动子或Hsp70A-RBCS2合成启动子、RBCS2终止子，通过“基因枪法”、珠磨法或电激法将外源基因导入莱茵衣藻核基因组中，再以ble基因为筛选标记，通过腐草霉素或Zeomycin筛选获得转基因衣藻。

B：建立菜茵衣藻叶绿体表达载体：含有rbcL启动子和rbcL终止子，以psbA基因外显子5和23S rRNA的3′端的序列为同源重组片段，通过“基因枪法”、珠磨法或电激法将外源基因定点整合到莱茵衣藻叶绿体的psbA基因外显子5和23S rRNA3′端基因序列之间，以突变的16S rRNA为筛选标记，通过壮观霉素筛选获得转基因衣藻。

2.构建生产PHB转基因衣藻的方法

(1)PHB生物合成关键酶基因的克隆

先从GenBank里获得phbA(GenBank登录号：J04987)、phbB(GenBank登录号：J04987)和phbC(GenBank登录号：J05003)的基因序列，再通过PCR法从真养产碱杆菌基因组中扩增出phbA、phbB和phbC基因，并克隆到合适的克隆载体上，分别获得pSKA-1质粒、pUB8质粒和pUC13质粒。

(2)PHB生物合成关键酶基因衣藻核表达载体的构建

将phbA基因(1.2Kb)插入pH105载体的PmaC I位点，获得pH105A，然后将phbA基因表达框架插入到pSP124的EcoR I位点，获得phbA基因衣藻表达载体pH105A124(见图1)；将phbB基因(780bp)连入pSP105的BamHI和PmaCI位点，获得p105B；再将phbB基因表达框架插入到pSP124的EcoRV位点，获得phbB基因衣藻表达载体p105B124(见图2)；将phbC基因(1.8Kb)插入pH105载体的PmaC I位点，获得pH105C，然后将phbC基因表达框架插入到pSP124的EcoR I位点，获得phbC基因衣藻表达载体pH105C124(见图3)。

(3)PHB生物合成关键酶基因叶绿体表达载体的构建

将phbB和phbC基因片段分别插入p53rGFPct质粒的NdeI与XbaI双酶切位点，获得p53rB和p53rC质粒。再将phbB基因表达框(rbcL5′-phbB-rbcL3′)插入p322的BamHI位点，获得p322-53rB。再将phbC基因的表达框架(rbcL5′-phbC-rbcL3′)连接到p322-53rB的EcoRV酶切位点，获得二价表达载体p322-53rBC(见图4)。

(4)PHB生物合成关键酶基因表达载体的遗传转化与筛选

A：通过“珠磨法”、基因枪法或电激法等遗传转化方法将PHB生物合成的关键酶基因phbA、phbB和phbC导入莱茵衣藻，通过抗性筛选平板培养基获得转基因衣藻。

B：通过共转化的方法，同时进行phbB和phbC基因遗传转化，在筛选平板上培养7-15天，就可以长出阳性藻落，得到生产聚β-羟基丁酸二价转基因衣藻，由于莱茵衣藻中含有β-酮硫裂解酶活性(phbA表达产物)，二价转基因衣藻也能生产聚β-羟基丁酸。。

C：通过共转化的方法，同时将phbA、phbB和phbC基因的表达载体混在一起，进行遗传转化，在筛选平板上培养7-15天，就可以长出阳性藻落，得到生产聚β-羟基丁酸的三价转基因衣藻。

(5)生产聚β-羟基丁酸的转基因衣藻的鉴定

A：将在筛选平板培养基上长出的阳性藻落，经过连续继代培养15-20代后，进行进一步的分子检测。

B：分子鉴定包括PCR-Southern blot检测、RT-PCR-Southern blot检测和PHB产物检测。获得二价或三价转基因衣藻后就可通过大规模培养转基因衣藻来实现快速、廉价生产生物可降解塑料-聚β-羟基丁酸。

本发明所述的利用莱茵衣藻外源基因表达系统及其构建生产PHB转基因藻的方法，该方法的优势主要表现在：(1)莱茵衣藻繁殖速度快，生长周期短，能象细菌等微生物一样进行集约化生产，同时它可以象高等植物那样通过光合作用合成生产PHB的所需底物，不需要添加昂贵的底物，大大降低PHB生产成本；(2)该系统采用没有细胞壁的突变株，表达产物容易分离提取；(3)莱茵衣藻遗传背景清晰，易进行外源基因定点整合；(4)生长繁殖在受控光生物反应系统(photo-bioreactor)中进行，易于控制，无需顾虑转基因生物的环境生态学问题。(5)本发明采用光诱导启动子(RBCS2启动子、rbcL启动子)和光诱导的热激启动子(Hsp70A-RBCS2合成启动子)，属于莱茵衣藻强启动子，易调控。Hsp70A-RBCS2合成启动子经热激后能使外源基因表达效率提高数十倍，这为通过诱导提高目的产物的产量提供调控基础。

附图说明

图1β-酮硫裂解酶基因衣藻表达载体pH105A124构建示意图，其构建过程如下：用SacI和HindIII双酶切pSKA-1，得到phbA基因(1.2Kb)，两端补平，插入pH105载体的PmaCI位点，获得pH105A。经EcoRI酶切pH105A，将分离的phbA基因表达框架插入到衣藻转化载体pSP124的EcoR I位点，获得phbA基因衣藻表达载体pH105A124.

图2乙酰乙酰辅酶A还原酶基因衣藻表达载体p105B124构建示意图，其构建过程如下：通过EcoRI酶切pUB8，Klenow片段补平，再加入BamHI酶切1小时，分离的phbB基因插入pSP105的BamHI和PmaCI位点，获得中间质粒p105B。再用EcoRI酶切p105B后用Klenow片段补平，将phbB基因表达框架插入到pSP124的EcoRV酶切位点，获得phbB基因衣藻表达载体p105B124.

图3PHB合成酶基因衣藻表达载体pH105C124构建示意图，其构建过程如下：用EcoRI和BamHI酶切pUC13，两端补平，获得约1.18Kb的phbC基因；插入pH105的PmaCI位点，获得pH105C。EcoRI酶切pH105C得到phbC基因的表达框架(大小约为2.8kb)；将phbC基因表达框架插入转化载体pSP124的EcoRI位点，获得phbC基因衣藻表达载体pH105C124.

图4衣藻叶绿体二价(phbB和phbC)表达载体p322-53rBC构建示意图，其构建过程如下：通过NdeI和XbaI双酶切质粒T-phbB，将phbB基因片段插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位点，获得p53rB质粒。再用BamHI酶切p53rB质粒，获得phbB基因的表达框(rbcL5′-phbB-rbcL3′)，插入p322的BamHI位点，构建成一价表达载体p322-53rB。再通过NdeI和XbaI双酶切质粒T-phbC，获得phbC基因，插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位点，获得p53rC质粒。通过BamHI酶切p53rC质粒，Klenow片段补平后获得phbC基因的表达框架(rbcL5′-phbC-rbcL3′)，连接到p322-53rB的EcoRV酶切位点，获得二价表达载体p322-53rBC。

图5-6：转phbB基因衣藻PCR-Southern杂交分析结果。图5共有6条泳道，其中1为入DNA/HindI marker，2为阳性对照pUB8，3-5为转基因衣藻基因组DNA中phbB的扩增产物，6为阴性对照(未转基因衣藻基因组DNA的扩增产物)。图6共有6条泳道，其中1为入DNA/HindIII marker，2为阳性对照pUB8，3-5为转phbB基因衣藻PCR产物与phbB基因探针杂交，6为阴性对照(未转化衣藻基因组DNA扩增产物与探针杂)。只有阳性对照和转基因藻出现杂交印迹，说明phbB基因已经整合到莱茵衣藻的基因组中。

图7-8：转phbB基因衣藻RT-PCR-Southern杂交分析结果。图7为转phbB基因衣藻的RT-PCR分析，共有8条泳道，其中1为入DNA/HindIII marker，2为阳性对照阳性对照(pUB8/BamHI+EcoRI)，3为阴性对照(未转化衣藻总RNA RT-PCR结果)，4-8为转基因衣藻总RNA的RT-PCR产物；图8为转phbB基因衣藻RT-PCR-DNA杂交分析结果，共有8条泳道，其中1为入DNA/HindIII+EcoRI，2为阳性对照(pUB8/BamHI+EcoRI)，3为阴性对照，未转化衣藻总RNA RT-PCR产物与探针杂交结果，4-8为转基因衣藻RT-PCR产物与phbB探针杂交结果。只有阳性对照和转基因藻出现杂交印迹，说明整合到基因组的phbB基因能在莱茵衣藻细胞中转录。

具体实施方式

实施例1：转基因受体藻的选择与培养

本发明选用的转基因受体为莱茵衣藻CC-849(Chlamydomonas reinhardtii cc-849)(购自美国Duke大学衣藻遗传中心，Durham，NC 27708USA)作为转基因操作的受体，该藻株为细胞壁缺陷型的莱茵衣藻品系。

莱茵衣藻培养时使用的培养基为TAP培养基，1L培养基的组份如下：Tris 2.42g，4倍Beijerinck salts(每升含16g NH₄Cl，2g CaCl₂·2H₂O，4gMgSO₄·7H₂O)25mL，1M磷酸钾缓冲液1mL，微量元素混合液(每升含11.4g H₃BO₃，22g ZnSO₄·7H₂O，5.06g MnCl₂·4H₂O，4.99g FeSO₄·7H₂O，1.61g CoCl₂·6H₂O 1.57g CuSO₄·5H₂O 1.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，50gNa₂EDTA)1mL，冰醋酸1mL，H₂O 975mL，pH7.0。

莱茵衣藻培养条件如下：温度22-25℃，光照90μE/m²/s的条件下连续光照培养，通气量可调整(0.5L/分钟)，藻细胞浓度达到10⁸-10⁹细胞/mL时离心收集。

实施例2：PHB生物合成关键酶基因的分离及表达载体的构建

(1)PHB生物合成关键酶基因的克隆：提取真养产碱杆菌H16的染色体DNA(方法见：叶梁，李枞等，科学通报，3-酮硫裂解酶基因phbA的克隆、序列分析及功能检测，1999，44(4)：398-402)，作为PCR扩增的模板。

根据已发表的phbA基因序列(GenBank登录号：J04987)设计引物，PrA1：5-CACCATGACTTACGTTGTC-3′；PrA2：5 GAAGAGCTCTTCCTTATTT-3′。PCR程序：95℃变性1分钟，53℃复性1分钟，74℃延伸90秒，35个循环。实验结果扩增出1.2kb的特异性片段，经SacI和EcoRV双酶切后连入pBluescript SK+的SacI和EcoRV位点，得到pSKA-1质粒。

根据phbB基因序列(GenBank登录号：J04987)设计引物，PrB1：5-TGACCATGACTCAGCGCATTG-3′；PrB2：5-AGGCAAGCTTGTCAGCCCATATG-3′。PCR程序：94℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环。实验结果显示得到780bp的特异性片段，经T4聚合酶处理，再连接到pUC18载体(Takara生物(大连)有限公司)的SmaI位点，得到pUB8质粒。

根据phbC基因序列(GenBank登录号：J05003)设计引物，PrC1：5-ACCATGGCGACGCGGCAAAGGCG-3′；PrC2：5-GTCATGCCTTGGCTTTGACGTATCG-3′。PCR程序：94℃变性2分钟，62℃复性90秒，72.5℃延伸4分钟，30个循环。实验结果显示得到1.78kb的特异性片段，经T4聚合酶处理，再连接到pUC18载体的SmaI位点，得到pUC13质粒。

(2)PHB生物合成关键酶基因衣藻核表达载体的构建

载体pSP105(Stevens，D.R.et al.The bacterial phleomycin resistance gene ble as adominant selectable marker in Chlamydomonas.1996，Mol.Gen.Genet.251，23-30.)上克隆有RBCS2的5′启动子序列和它的3′终止子序列，中间携带有PmaCI、BamHI、XbaI和SalI等限制性内切酶位点，可以插入外源基因并在衣藻核基因组中表达外源基因。载体pCB740(Schroda M.et al.Sequence elements within an HSP70 promoter counteract transcriptionaltransgene silencing in Chlamydomona.Plant J，2002，31(4)：445-455)上克隆有Hsp70A-RBCS2合成启动子。载体pSP124(Victoria Lumbreras et al.Efficient foreign gene expression inChlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron.Plant J，1998，14(4)：441-447)上含有ble基因的表达盒(RBCS2启动子-b1e-RBCS2终止子)，编码13.5KD的腐草霉素结合蛋白，它产生的抗体使衣藻具有腐草霉素和Zeomycin抗性，作为衣藻转化时的筛选标记。

构建pH105载体：以pCB740为模板，设计两条引物，扩增出HSP70A-RBCS2合成启动子序列，并引入酶切位点：

上游引物：PrHp1(5′CGC AAGCTTCAG GAATTCGCTGAGGCTTGACAT  3′)

                       HindIII  EcoR I

下游引物：PrHp2(5′CGACTGCAGCGT CACGTGGCTAGCTCTCTTGTAAA  3′)

                                PmaC I

通过PCR(程序是94℃变性3min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min)从质粒pCB740上扩增出HSP70A-RBCS₂启动子片段(约498bp)，经琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒(Fermentas公司)回收DNA片段，将其克隆到不带酶切位点的pUMD 18-T载体(TaKaRa公司)上，得到HRT，通过PmaC I和HindIII从重组质粒HRT上分离出HSP70A-RBCS2启动子片段(约498bp)，然后定向克隆于pSP105的PmaC I和HindIII位点上，获得pH105载体。载体pH105上克隆有Hsp70A-RBCS2启动子和RBCS2的3′终止子序列，中间携带有PmaCI、NheI、XbaI和SalI等限制性内切酶位点，可以插入外源基因并在衣藻核基因组中高效表达外源基因。。

用SacI和HindIII双酶切pSKA-1，得到phbA基因(1.2Kb)，两端补平，插入pH105载体的PmaC I位点，获得pH105A。经EcoRI酶切pH105A，将分离的phbA基因表达框架插入到衣藻转化载体pSP124的EcoR I位点，获得phbA基因衣藻表达载体pH105A124(见图1)；

通过EcoRI酶切pUB8，Klenow片段补平，再加入BamHI酶切1小时，分离的phbB基因插入pSP105的BamHI和PmaCI位点，获得中间质粒p105B。再用EcoRI酶切p105B后用Klenow片段补平，将phbB基因表达框架插入到pSP124的EcoRV酶切位点，获得phbB基因衣藻表达载体p105B124(见图2)；

用EcoRI和BamHI酶切pUC13，两端补平，获得约1.18Kb的phbC基因；插入pH105的PmaCI位点，获得pH105C。EcoRI酶切pH105C得到phbC基因的表达框架(大小约为2.8kb)；将phbC基因表达框架插入到转化载体pSP124的EcoRI位点，获得phbC基因衣藻表达载体pH105C124(见图3)。

在转化实验中，通过phbA、phbB和phbC基因衣藻表达载体的共转化，可分别获得二价(phbB和phbC基因)转基因衣藻或三价(phbA、phbB和phbC基因)转基因衣藻。

(3)PHB生物合成关键酶基因叶绿体表达载体的构建

质粒p53rGFPct(Franklin，S.E.et al.Development of a GFP reporter gene for Chlamydomonasreinhardtii chloroplast.Plant J 2002，30：733-744)上携带有衣藻叶绿体的rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列，通过NdeI和XbaI可以切下GFPct基因，并插入外源目的基因，在rbcL5′启动子和rbcL3′终止子序列的作用下，可以在衣藻叶绿体中表达插入的外源基因。载体p322(美国Duke大学衣藻遗传中心，Durham，NC 27708 USA)上携带有衣藻叶绿体psbA基因外显子5和23S rRNA的3′端的序列，方便外源基因表达盒插入叶绿体DNA的psbA基因外显子5和23S rRNA之间的位置；p228质粒(美国Duke大学衣藻遗传中心，Durham，NC 27708 USA)上携带有突变的衣藻叶绿体16S rRNA和23S rRNA5′端序列，它的导入可使藻细胞具有壮观霉素抗性，成为莱茵衣藻叶绿体遗传转化的筛选标记。

设计引物为phbB基因和phbC基因引入NdeI和XbaI位点，并克隆到pUMD 18-T载体上。

扩增phbB基因的引物为：5′-GCA CATATGTGACCATGACTCAGCGCATTG-3′：

                             NdeI

5′-AGGCAAGCTTGTCAGCCCATATG TCTAGATAC-3′，

                             XbaI

PCR程序：94℃变性1分钟，58℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，扩增产物克隆到pUMD 18-T载体上，获得T-phbB质粒。

扩增phbC基因的引物为：5′-GTC CATATGACCATGGCGACGCGGCAAAGGCG-3′；

                             NdeI

5′-GTCATGCCTTGGCTTTGACGTATCG TCTAGACTG-3′，

                             XbaI

PCR程序：94℃变性2分钟，62℃复性90秒，72.5℃延伸4分钟，30个循环，产物克隆到pUMD 18-T载体上，获得T-phbC质粒。

通过NdeI和XbaI双酶切质粒T-phbB，将phbB基因片段插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位点，获得p53rB质粒。再用BamHI酶切p53rB质粒，获得phbB基因的表达框(rbcL5′-phbB-rbcL3′)，插入p322的BamHI位点，构建成一价表达载体p322-53rB。再通过NdeI和XbaI双酶切质粒T-phbC，获得phbC基因，插入p53rGFPct的NdeI和XbaI位点，获得p53rC质粒。通过BamHI酶切p53rC质粒，Klenow片段补平后获得phbC基因的表达框架(rbcL5′-phbC-rbcL3′)，连接到p322-53rB的EcoRV酶切位点，获得二价表达载体p322-53rBC(见图4)。

在转化实验中，通过p322-53rBC质粒和p228质粒的共转化，可获得二价(phbB和phbC基因)转基因衣藻。

实施例3：莱茵衣藻的遗传转化

(1)通过“珠磨法”转化莱茵衣藻

莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×10⁶细胞/mL，室温(20-25℃)离心收集，用TAP溶液重悬，调整细胞浓度至2×10⁸细胞/mL。吸取300μL悬浮液到5mL的试管里(内含已灭菌的石英砂)，含外源基因的质粒经酶切成线状(包括pH105A124，p105B124和pH105C124)，取1μg-2μg加入试管，CC-849/石英砂/外源DNA混合物快速振荡15秒。把混合液转移到25mL的带螺旋帽的离心管中，加入10mL灭菌TAP培养液，在60转/分钟全温振荡摇床25℃光照过夜培奍(光照条件为90μE/m²/s)。室温(20-25℃)离心收集细胞，去上清，用0.5mL TAP重悬，加入3.5mL 0.5％TAP培养基，混匀后倒在含抗生素的筛选平板上，22℃光照培养箱里培养7-15天(光照条件为90μE/m²/s)，平板上长出绿色的单克隆藻落。

(2)通过“基因枪法”转化莱茵衣藻

莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×10⁶细胞/mL，室温(20-25℃)离心收集，用TAP液体培养基重悬，调整细胞浓度至2×10⁸细胞/mL。吸取300μL悬浮液涂布于TAP固体平板培养基，22℃光照培养箱(光照条件为90μE/m²/s)中培养1-2天以形成细胞层。在无菌条件下用基因枪(Bio-Rad)轰击。具体步骤如下：取50μL金粉悬浮液(60μg/mL)，加入6μg含有外源基因的环状质粒(p322-53rBC)和50μL 2M CaCl₂和20μL 0.1M亚精胺，通过涡轮振荡器振荡1-3分钟以混合，8,000rpm离心10秒，弃上清，用无水乙醇清洗，振荡，再8,000rpm离心10秒，弃上清，共5次，最后用60μL无水乙醇重悬沉淀。每次轰击取10μL，轰击参数如下：真空度25inches·Hg，轰击距离9cm，每皿轰击3次，22℃光照培养箱恢复培养12小时，然后转移到筛选平板上继续培养(22℃，90μE/m²/s)1-2周，至绿色单克隆长出。

(3)通过“电激法”转化莱茵衣藻

莱茵衣藻CC-849在TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×10⁶细胞/mL，室温(20-25℃)离心收集，用电激缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl₂，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇)重悬，调整细胞浓度至2×10⁸细胞/mL。加入终浓度为10μg/mL的含外源基因的质粒(包括pH105A124，p105B124，pH105C124或p322-53rBC)及25μg/mL的鲑精DNA，混匀后置冰上，吸取0.4mL于电转杯中待用。电转仪(Eppendorf)电激时电压为1KV/cm，持续时间2秒，然后冰上放置10分钟，补充10mL TAP液体培养基22℃光照培养箱恢复培养12-18小时，然后转移到筛选平板上继续培养(22℃，90μE/m²/s)1-2周，至绿色单克隆长出。

实施例4：转基因莱茵衣藻的筛选与鉴定

转基因衣藻由于导入ble基因而具有Zeomycin抗性或是导入突变的衣藻叶绿体16S rRNA而具有壮观霉素抗性，使转基因衣藻可在含Zeomycin或壮观霉素的筛选平板上生长，得到的转化子经过连续性5-20代的继代培养，并在抗性平板上进行保持培养(含10μg/mL的Zeomycin或100μg/mL的壮观霉素)。

转基因藻的分子检测包括PCR-southern杂交、RT-PCR-southern杂交和聚β-羟基丁酸产物分析。具体步骤如下：

(1)转基因衣藻总DNA的提取

莱茵衣藻总DNA提取参照文献的方法(科学通报，phbB基因在莱茵衣藻中的表达与分子检测，2004，49(15)：1519-1522)：取10mL处于对数生长后期的莱茵衣藻培养液，4℃离心收集，加350mL细胞裂解液(0.1mol/L NaCl，50mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)重悬沉淀，加入25μL Proteinase K(10mg/mL)、25μL 20％SDS，混匀、55℃水浴2h；试管放在冰上降温，加入200μL 5mol/L KAc、冰上静置后离心，上清加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，再用等体积的氯仿抽提1次，水相加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-70℃放置15分钟；离心收集沉淀，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于30μL TE缓冲液中。

(2)转基因藻PCR-southern杂交分析

以转基因衣藻总DNA为模板，根据各目的基因片段设计特异性引物分别扩增phbA、phbB和phbC片段，然后各取10μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，采用“向上毛细管转移法”转膜，分别与由地高辛标记标记的完整的phbA、phbB和phbC基因(通过双酶切分别从pSKA-1，pUB8和pUC13上获得)探针杂交，杂交时采用高效地高辛DNA标记和检测试剂盒(Roche生物公司)，结果显示扩增片段可与探针杂交，转基因衣藻出现和阳性对照一致的杂交印迹反应，而对照组没有印迹(见图5，图6)。这表明phbA、phbB和phbC基因已经整合到莱茵衣藻的基因组中。

(3)转基因衣藻总RNA的提取

用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取转基因衣藻的总RNA，具体操作说明见产品说明书。

(4)转基因藻RT-PCR-southern杂交分析

用Invitrogen生物公司的TRIzol试剂盒提取转基因衣藻的总RNA。取1μg作为模板，采用Takara生物(大连)有限公司的RNA反转录试剂盒(AMV)进行反转录，以各基因片段的特异性引物进行RT-PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后转膜，再分别与地高辛标记的完整的phbA、phbB和phbC基因探针杂交，结果显示扩增片段可与探针杂交，转基因衣藻出现和阳性对照一致的杂交印迹反应，而对照组没有印迹(见图7，图8)。这表明导入莱茵衣藻基因组的phbA、phbB和phbC基因均具有转录活性。

(5)转基因藻产物分析-气相色谱-质谱(GC-MS)

光照条件下将二价或三价转基因衣藻培养至对数中后期，离心收集藻细胞，冷冻干燥后获得藻粉。先通过甲醇65℃温育5小时去除杂质，收集残余的藻细胞，热氯法萃取PHB，再加入甲醇(含3％浓硫酸)93℃4小时酯化，待溶液温度降到23℃后加入0.1％的NaCl溶液萃取，分离得到的有机相进行气相色谱-质谱分析。

这个气相色谱-质谱(GC-MS)系统主要由GC-17A气相色谱仪和QP-5000质谱仪组成。通过氦气携带分离物，气压设定为100kPa，酯化的PHB首先通过DB-5MS毛细管(规格是：30m×0.25mm)分离，气相色谱的升温程序是：50℃保持2分钟，以20℃/分钟速率升温至225℃，保持5分钟。质谱采用电子轰击(EI)模式，离子阱能量是70eV。结果显示在二价或三价的转基因衣藻中可以检测到PHB，得到与PHB标准品(Sigma生物公司)相同的图谱，而未转基因衣藻中检测不到。结果表明所得到的转基因衣藻在光照培养条件下可以合成PHB。

Claims (9)

1、一种莱茵衣藻外源基因表达系统，它包括强启动子、外源目的基因、终止子、筛选标记和莱茵衣藻受体藻株，首先是转基因受体藻的筛选与培养，选择莱茵衣藻作为受体藻，采用Tris-acetate-phosphate培养基，在光照～90μE/m².s的条件下，通气培养至对数生长后期，藻细胞浓度达到10⁸-10⁹cells/mL时，离心收集；其次是含有筛选标记基因表达盒的外源基因表达载体构建：

A、外源基因莱茵衣藻细胞核表达载体的构建，该载体含有RBCS2启动子或Hsp70A-RBCS2合成启动子、RBCS2终止子和ble基因筛选标记表达盒，通过基因枪法、珠磨法或电激法将外源基因导入莱茵衣藻核基因组中，通过腐草霉素或Zeomycin筛选获得转基因衣藻；

B、莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建，该系统含有rbcL启动子和rbcL终止子，以psbA基因外显子5和23S rRNA的3′端的序列为同源重组片段，通过基因枪法、珠磨法或电激法将外源基因定点整合到莱茵衣藻叶绿体的psbA基因外显子5和23S rRNA3′端基因序列之间，以16S rRNA为筛选标记，获得转基因衣藻。

2、一种用于实现权利要求1所述的一种构建生产PHB转基因莱茵衣藻的方法，包括下列步骤：

A、转基因受体藻的筛选与培养：选用细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC-849作为转基因受体藻，在Tris-acetate-phosphate培养基，在光照～90μE/m².s的条件下通气培养；

B、PHB生物合成关键酶基因的克隆：先从GenBank里获得phbA、phbB和phbC的基因序列，再通过PCR法从真养产碱杆菌基因组中扩增出phbA、phbB和phbC基因，并克隆到克隆载体上，分别获得pSKA-1质粒、pUB8质粒和pUC13质粒；

C、PHB生物合成关键酶基因衣藻核表达载体的构建：将phbA基因1.2Kb插入pH105载体的PmaC I位点，获得pH105A，然后将phbA基因表达框架插入到pSP124的EcoR I位点，获得phbA基因衣藻表达载体pH105A124；将phbB基因780bp连入pSP105的BamHI和PmaCI位点，获得p105B，再将phbB基因表达框架插入到pSP124的EcoRV位点，获得phbB基因衣藻表达载体p105B124；将phbC基因1.8Kb插入pH105载体的PmaC I位点，获得pH105C，然后将phbC基因表达框架插入到pSP124的EcoR I位点，获得phbC基因衣藻表达载体pH105C124；

D、PHB生物合成关键酶基因叶绿体表达载体的构建：将phbB和phbC基因片段分别插入p53rGFPct质粒的NdeI与XbaI双酶切位点，获得p53rB和p53rC质粒，再将phbB基因表达框rbcL5′-phbB-rbcL3′插入p322的BamHI位点，获得p322-53rB，再将phbC基因的表达框架rbcL5′-phbC-rbcL3′连接到p322-53rB的EcoRV酶切位点，获得二价表达载体p322-53rBC；

E、PHB生物合成关键酶基因表达载体的遗传转化与转基因莱茵衣藻的筛选：通过共转化的方法，同时将phbB和phbC基因或同时将phbA、phbB和phbC基因的表达载体混在一起，利用珠磨法、基因枪法或电激法进行遗传转化，在筛选平板上培养7-15天，长出阳性藻落，进行分子检测和产物分析确定生产聚β-羟基丁酸的二价或三价转基因衣藻。

3、按照权利要求2所述的一种构建生产PHB转基因莱茵衣藻的方法，其特征是将外源基因/phbA、phbB和phbC导入莱茵衣藻的方法为珠磨法或者基因枪法或者电激法。

4、根据权利要求3所述的一种构建生产PHB转基因莱茵衣藻的方法，其特征是珠磨法选用细胞壁缺陷的受体莱茵衣藻，培养至对数期，用TAP培养液悬浮细胞浓度至2×10⁸cells/mL，吸取300μL悬浮液到5mL的两个试管里，将目的DNA酶切成线状，取1μg-2μg加入试管，受体藻/石英砂/DNA混合物振荡时间为15秒。

5、根据权利要求3所述的一种构建生产PHB转基因莱茵衣藻的方法，其特征是基因枪法轰击参数如下：真空度25inches·Hg，轰击距离9cm，每皿轰击3次，22℃光照培养箱恢复培养12小时。

6、根据权利要求3所述的一种构建生产PHB转基因莱茵衣藻的方法，其特征是电激法采用的电激缓冲液是：10mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM CaCl₂，0.4M甘露醇，0.4M山梨醇，调整受体细胞浓度至2×10⁸细胞/mL，电转仪电激时电压为1KV/cm，持续时间2秒，然后冰上放置10分钟，补充10mL TAP液体培养基22℃光照培养箱恢复培养12-18小时。

7、根据权利要求2所述的一种构建生产PHB转基因莱茵衣藻的方法，其特征在于：所述的外源目的基因/phbA、phbB和phbC导入莱茵衣藻的整合位置为细胞核基因组或者叶绿体基因组中。

8、根据权利要求2所述的一种构建生产PHB转基因莱茵衣藻的方法，其特征在于：(1)、phbB和phbC两个基因同时导入莱茵得到的是二价转基因藻；(2)、将PHB生物合成关键酶phbA、phbB和phbC基因同时导入莱茵衣藻得到的是三价转基因藻，利用二价或三价的转基因藻株均可生产聚β-羟基丁酸。

9、根据权利要求2所述的一种构建生产PHB转基因莱茵衣藻的方法，其特征在于：所述的转基因藻筛选与鉴定包括(1)用含有筛选抗生素平板的筛选单克隆藻落，通过连续继代培养15-20代后，进行分子检测；(2)分子鉴定包括PCR-Southern blot检测、RT-PCR-Southern blot检测和PHB产物检测。

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