CN108485982A - 一种利用三种混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中除菌的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟混合抗菌剂进行衣藻除菌的方法，方法：在TAP固体培养基平板上接种已被混合污染的衣藻，培养；配制混合除菌剂平板，该平板为添加醚菌酯，氨苄青霉素和头孢噻肟的TAP固体培养基，备用；将在TAP固体培养基上培养好的已被混合污染的衣藻转接划线到混合除菌剂TAP固体培养基平板上培养；将除菌剂平板上已经除过菌的衣藻再次转接划线至普通的TAP固体培养基平板上进行培养。本发明利用醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟三者相互配合使用从而有效的去除衣藻培养过程中细菌、真菌的污染。其具有广普性，高效低毒等特性，在珍贵衣藻藻种的保存以及提高后续实验的准确性这些问题上具有极好的推广应用价值。

Description

一种利用三种混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中除菌的 方法

技术领域

本发明涉及一种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)除细菌与真菌的方法，具体为利用抗真菌剂醚菌酯与抗细菌剂氨苄青霉素和头孢噻肟三者混合进行衣藻培养过程中杂菌去除的方法。

背景技术

衣藻是一类真核单细胞藻类，素有“绿色酵母(green yeast)”之称。因其结构简单、生长快、世代时间短、易于培养和操作等特点作为模式生物被广泛应用于生物学研究，如植物的光合作用、趋光性与感光性研究、植物细胞周期的调控、植物细胞凋亡、叶绿体的发生、叶绿体DNA的损伤与修复、鞭毛和中心体等细胞骨架的研究、细胞间的信息传递等。近年来，随着基因测序与组学的发展与完善，有关衣藻基因及其功能分析的研究也快速发展：衣藻突变体文库的制备、衣藻基因基因干扰与敲出、衣藻基因的功能分析与鉴定等。然而，有关衣藻的理论基础实验研究都需要在无菌的条件下进行，但在实验室环境内细菌、真菌种类很多，如何有效的防止实验及保种过程中衣藻不被杂菌污染、以及污染后如何有效的清除杂菌是难题之一。

在此之前衣藻除菌研究中，包括有物理方法和化学方法。研究表明用戊唑醇和奈啶酮酸分别清除莱茵衣藻培养过程中的细菌、真菌的污染(Grover,2006,Med.Chem.；Dimitrov,2014,Sci.Total Environ.；Wang,2016,BioTechniques)可以；多菌灵、嘧菌酯等可以有效去除真菌的污染(Mahan,2005,BioTechniques；Kan,2009,J.Phycol.)，但也并不是始终都有效的。因此，新型的除菌方法来针对衣藻培养过程中的细菌、真菌污染是迫在眉睫的，以便于除菌剂的混合使用。

因细菌和真菌在细胞结构、代谢方式等方面存在巨大差异，故除细菌、真菌需分别进行考虑。即分别选用针对细菌的抗菌剂和针对真菌的抗菌剂，两者相互配合使用，从而达到清除细菌、真菌的目的。细菌种类繁多，依革兰氏染色结果的不同可将细菌分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。真菌的种类也很多，实验室污染衣藻培养的真菌主要是霉菌和酵母。对于抗菌剂的选择，原则上是选用广谱、高效、且对衣藻生长无明显抑制的抗菌剂。由于加抗菌剂的目的是保护衣藻，因此在选用抗菌剂时必须要考虑抗菌剂不能显著抑制衣藻的生长，应做到“使用最少的剂量，达到满意的效果”。

本发明利用抗真菌剂醚菌酯与抗细菌剂氨苄青霉素和头孢噻肟三种混合进行衣藻杂菌去除。抗真菌剂醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂，其机理是通过阻断细胞色素b与c之间的电子传递链，进而抑制线粒体的功能，从而使ATP的合成受阻。抗细菌剂采用氨苄青霉素和头孢噻肟联用。氨苄青霉素为半合成的广谱青霉素，对大多数革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，但对革兰氏阴性菌效果不佳。头孢噻肟为第三代头孢菌素，对革兰阴性菌有较强的抗菌效能，且对革兰阴性菌产生的广谱β-内酰胺酶高度稳定，但对革兰氏阳性菌效果不佳。两种抗生素的作用机理类似，均是通过抑制细菌细胞壁肽聚糖的生成而达到杀菌的目的，而衣藻细胞壁不含肽聚糖，故氨苄青霉素和头孢噻肟对衣藻生长影响不大。通过对三者联合使用，优劣互补，使得该方法具有广谱杀菌特性，适用于衣藻各个研究环境下细菌真菌污染的去除。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗真菌剂醚菌酯与抗细菌剂氨苄青霉素和头孢噻肟三种混合进行莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)培养过程中除菌的方法。该方法可实现既不抑制衣藻自身生长，又能去除真菌、细菌污染，而且具有操作方法简便，易于推广应用等优点，能够有效防治衣藻实验与应用过程中出现的杂菌污染问题。

本发明通过以下具体技术方案实现：该除菌的方法如下：杂菌污染的衣藻转接划线至含有醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟三种混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行除菌培养5-6天，实现衣藻的除菌；所述的菌剂浓度：抗真菌剂20μg/ml醚菌酯和抗细菌剂500μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml头孢噻肟。

所述的衣藻即实验藻种为：莱茵衣藻，即Chlamydomonas reinhardtii。

所述TAP固体培养基平板为：25ml/L的TAP盐溶液(NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O 2g/L)，0.375ml/L的磷酸盐溶液(K₂HPO₄ 288g/L,KH₂PO₄ 144g/L)，1ml/L的Hutner微量元素溶液(EDTA二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O 22g/L,H₃BO₃ 11.4g/L,MnCl₂·4H₂O5.06g/L,CoCl·6H₂O 1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，1ml/L的乙酸，2.42g/L的Tris，15g/L的琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min，倒平板备用。

所述的含有三种混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为：抗真菌剂醚菌酯使用终浓度20μg/ml，在上述TAP固体培养基配制时添加，抗细菌剂氨苄青霉素使用终浓度500μg/ml和头孢噻肟使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基配制灭菌以后，冷却至约55℃后添加。

有益效果，由于采取了本方案，利用醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟混合抗菌剂进行衣藻除菌。抗真菌剂醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂，其机理是通过阻断细胞色素b与c之间的电子传递链，进而抑制线粒体的功能，从而使ATP的合成受阻。抗细菌剂采用氨苄青霉素和头孢噻肟联用。氨苄青霉素为半合成的广谱青霉素，对大多数革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，但对革兰氏阴性菌效果不佳。头孢噻肟为第三代头孢菌素，对革兰阴性菌有较强的抗菌效能，且对革兰阴性菌产生的广谱β-内酰胺酶高度稳定，但对革兰氏阳性菌效果不佳。两种抗生素的作用机理类似，均是通过抑制细菌细胞壁肽聚糖的生成而达到杀菌的目的，而衣藻细胞壁不含肽聚糖，故氨苄青霉素和头孢噻肟对衣藻生长影响不大。通过对三者联合使用，优劣互补，使得该方法具有广谱杀菌特性，适用于衣藻各个研究环境下细菌真菌污染的去除，达到了本发明的目的。

优点：分别利用醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟三者的特性，三者联用优劣互补，可有效解决莱茵衣藻科研使用期间的杂菌污染问题，可提高被污染衣藻藻株保种的存活率，以及提高后续实验的准确度，具有良好的使用前景。

1、本发明所采用的除菌剂醚菌酯、氨苄青霉素、头孢噻肟的三种混合试剂未曾报道用于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的除菌。该藻株是一类真核单细胞藻类，素有“绿色酵母(green yeast)”之称。因其结构简、生长快、易培养以及其功能保守，遗传分析与生化分析简单等特点作为模式生物被广泛应用于生物学研究，所以本方案可推广至其他类似生物。

2、本发明提供了混合除菌剂的另一方案，为防止杂菌抗性产生，可以将本方案与戊唑醇/奈啶酮酸，多菌灵/氨苄抗生素/头孢抗生素，嘧菌酯/奈啶酮酸等混合除菌方案交替使用，已达到最优效果。

3、本发明能有效解决利用衣藻进行科学实验与应用过程中产生的杂菌污染问题，可实现即不抑制衣藻自身生长，又能去除真菌、细菌污染，而且具有操作方法简便，易于推广应用等优点，能够有效解决衣藻实验与应用过程中出现的杂菌污染问题。

附图说明

图1是普通TAP固体培养基平板上被杂菌污染衣藻的生长状况。

图2是通过除菌剂TAP固体培养基除菌后，转接至普通TAP固体培养基上衣藻的生长情况。

其中，除菌剂TAP固体培养基中氨苄青霉素浓度均为500μg/ml；头孢噻肟浓度均为100μg/ml；醚菌酯浓度分别为20μg/ml,、50μg/ml、100μg/ml。

具体实施方式

该除菌方法如下：杂菌污染的衣藻转接划线至含有醚菌酯；氨苄青霉素和头孢噻肟三种混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行除菌培养5-6天，实现衣藻的除菌；所述的菌剂浓度：抗真菌剂20μg/ml醚菌酯和抗细菌剂500μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml头孢噻肟。

所述的衣藻即实验藻种为：莱茵衣藻，即Chlamydomonas reinhardtii。

所述TAP固体培养基平板为：25ml/L的TAP盐溶液(NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O 2g/L)，0.375ml/L的磷酸盐溶液(K₂HPO₄ 288g/L,KH₂PO₄ 144g/L)，1ml/L的Hutner微量元素溶液(EDTA二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O 22g/L,H₃BO₃ 11.4g/L,MnCl₂·4H₂O5.06g/L,CoCl·6H₂O 1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，1ml/L的乙酸，2.42g/L的Tris，15g/L的琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min，倒平板备用。

所述的含有三种混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为：抗真菌剂醚菌酯使用终浓度20μg/ml，在上述TAP固体培养基配制时添加；抗细菌剂氨苄青霉素使用终浓度500μg/ml和头孢噻肟使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基配制灭菌以后，冷却至约55℃后添加。

实施例1：A.在TAP固体培养基平板上接种已被混合污染的衣藻，放置于23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强环境下培养3-5天；B.配制混合除菌剂平板，该平板为添加20μg/ml醚菌酯，500μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml头孢噻肟的TAP固体培养基，备用；C.将在TAP固体培养基上培养好的已被混合污染的衣藻转接划线到混合除菌剂TAP固体培养基平板上，放置于23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强环境下培养5-6天；D.将除菌剂平板上已经除过菌的衣藻再次转接划线至普通的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养3-5天，观察是否除菌干净，若仍有杂菌重复除菌操作，若无杂菌则进行后续实验或者保种备用。

具体步骤为：

污染衣藻活化：将受到污染的衣藻接种至TAP固体培养基平板(25ml/L的TAP盐溶液(NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O 2g/L)，0.375ml/L的磷酸盐溶液(K₂HPO₄288g/L,KH₂PO₄ 144g/L)，1ml/L的Hutner微量元素溶液(EDTA二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O22g/L,H₃BO₃ 11.4g/L,MnCl₂·4H₂O 5.06g/L,CoCl·6H₂O 1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，1ml/L的乙酸，2.42g/L的Tris，15g/L的琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min，倒平板备用)上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养3-5天，以便于衣藻处于生长能力较旺盛的状态。

污染衣藻除菌：配制含有醚菌酯20μg/ml(在TAP配置时添加)、氨苄青霉素500μg/ml(在TAP灭菌后降温约至55℃时添加)、头孢噻肟100μg/ml(在TAP灭菌后降温约至55℃时添加)的含灭菌剂的TAP固体培养基平板。将上述已经在TAP固体培养基平板长好的污染衣藻转接划线至含有上述混合抗菌剂的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养5-6天，保证污染杂菌的去除。

去除菌后的衣藻转接：将已经去除杂菌的衣藻再次转接划线至普通的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养3-5天，进行后续实验或者保种备用。

进一步污染衣藻除菌(可选步骤)：如果衣藻污染杂菌较为严重，第3步培养时仍有少量杂菌未被处理干净时，可重复第2步处理，将已经经过第2步处理的衣藻再次转接划线到相同的灭菌剂TAP固体培养基平板上，仍在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养5-6天，以保证污染杂菌的彻底去除。再进行第3步培养，可进行后续实验或者保种备用。

Claims (5)

1.一种利用三种混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中除菌的方法，其特征在于被杂菌污染的衣藻转接划线至含有三种混合抗菌剂(20μg/ml醚菌酯、500μg/ml氨苄青霉素、100μg/ml头孢噻肟)的TAP固体培养基平板上，在23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养5-6天，实现衣藻的除菌。

2.根据权利要求1所述的利用三种混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中除菌的方法，其特征在于，所述实验藻种为：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。

3.根据权利要求1所述的利用三种混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中除菌的方法，其特征是：所述TAP固体培养基平板为：25ml/L的TAP盐溶液(NH₄Cl 15g/L,MgSO₄·7H₂O 4g/L,CaCl₂·2H₂O 2g/L)，0.375ml/L的磷酸盐溶液(K₂HPO₄ 288g/L,KH₂PO₄ 144g/L)，1ml/L的Hutner微量元素溶液(EDTA二钠盐50g/L,ZnSO₄·7H₂O 22g/L,H₃BO₃ 11.4g/L,MnCl₂·4H₂O5.06g/L,CoCl·6H₂O 1.61g/L,CuSO₄·5H₂O 1.57g/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.1g/L,FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，用KOH或者HCl调节pH至7.0)，1ml/L的乙酸，2.42g/L的Tris，15g/L的琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min，倒平板备用。

4.根据权利要求1所述的利用三种混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中除菌的方法，其特征在于，三种混合抗菌剂的类型、浓度与使用方法为：抗真菌剂醚菌酯使用终浓度20μg/ml，在上述TAP固体培养基配制时添加，抗细菌剂氨苄青霉素使用终浓度500μg/ml以及头孢噻肟使用终浓度100μg/ml，在上述TAP固体培养基配制灭菌以后，冷却至约55℃后添加。

5.根据权利要求1所述的利用三种混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中除菌的方法，其特征在于，所述除菌培养条件为：在光照培养箱中，设置参数23±0.5℃，14/10小时明暗光周期，8000Lx光强下进行培养5-6天，最终实现衣藻的除菌。