CN102181471B

CN102181471B - 莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法

Info

Publication number: CN102181471B
Application number: CN201110070784.1A
Authority: CN
Inventors: 胡章立; 吴锦霞; 陈俊
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2011-03-23
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2031-03-23
Also published as: CN102181471A

Abstract

本发明公开了莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法，本发明利用来源于莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，通过信号肽预测软件预测其信号肽基因序列，对预测获得的信号肽基因进行人工合成，并将其插入到莱茵衣藻表达载体的启动子和克隆位点之间，构建了莱茵衣藻分泌型表达载体。同时，利用外源基因检测构建的莱茵衣藻分泌型表达载体的表达效率，将含有外源基因的莱茵衣藻分泌型表达载体，通过莱茵衣藻遗传转化法，转化到莱茵衣藻，经过筛选，获得能分泌表达外源基因的转基因工程藻株。本发明为利用莱茵衣藻作为生物反应器分泌表达外源基因奠定了基础。

Description

莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法。

背景技术

莱茵衣藻是一种单细胞真核藻，属于绿藻门等鞭毛纲团藻目衣藻属(Chlamydomonas)。莱茵衣藻个体呈卵形、球形或椭圆形，前端略尖突，两侧有两条等长的鞭毛，可以自由游动。一般球形类的衣藻个体的直径为5-17mm，卵形类的长为6-27mm，宽为27mm。莱茵衣藻既能光合自养生长，又能依赖乙酸盐异养生长。生长速度快，细胞数量倍增时间为5-6小时，可以在短时间内获得大量遗传后代进行遗传分析。目前，其基因组序列测序已完成，大大推进了莱茵衣藻作为模式植物用于分子生物学的研究和基因工程的操作。莱茵衣藻的核基因组大小约为100Mb，线状的线粒体基因组大小为15.7kb，环状的叶绿体基因组大小为203.8kb，是目前少数的细胞核、叶绿体和线粒体三套基因组均能进行遗传转化的植物。因此，受到国内外广大学者的关注。

以莱茵衣藻作为生物反应器表达外源基因具有以下优势：①莱茵衣藻生长周期短、生长迅速、光和效率高，有“绿色光和酵母”之称，能解决底物成本高的问题。②作为真核生物，莱茵衣藻可以对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰，如糖基化修饰等。③莱茵衣藻遗传背景清晰，已有较完备的基因组数据库可供利用；叶绿体基因组具有原核基因组的特点，使得莱茵衣藻既可表达真核基因，也可表达原核基因。④莱茵衣藻可以通过“光一生物反应器”进行密闭培养，避免了“基因漂流”对环境安全产生的潜在性危害，且能进行集约化生产，所以是理想的转基因植物受体。

莱茵衣藻作为一种生物反应器，已成功生产多种重组蛋白及抗体，生产的部分产品并已实现了商品化生产（张洪涛, 艾山江·阿不都拉, 徐田枚等. 莱茵衣藻叶绿体生物反应器研究进展. 生物技术通报. 2007; 2:27-31）。目前已有生物可降解性塑料聚-β-羟基丁酸（王潮岗, 胡章立, 胡炜等. phbB基因在莱茵衣藻中的表达与分子检测. 科学通报. 2004; 49(15):1519-1522）、绿色荧光蛋白（Wu JX, Hu ZL, Wang CG et al. Efficient expression of green fluorescent protein （GFP）mediated by a chimeric promoter in Chlamydomonas reinhardtii. Chin. J. Oceanol. Limnol. 2008; 26(3):242-247）等多种外源基因在衣藻细胞核中成功表达。在衣藻叶绿体中也成功表达了人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL蛋白(杨宗岐, 李铁女, 陈凤等. 人可溶性TRAIL蛋白在衣藻叶绿体中的表达. 科学通报. 2006;12(51):1400-1405)、人白细胞介素4（赵雅坤, 史贤明, 张忠明. 人白细胞介素4在衣藻叶绿体中的高效转化及表达. 华中农业大学学报. 2006; 25（2）：110-116）、丙肝病毒融合抗原基因NS 3-6（张中林, 山松, 陈曦等. 丙肝病毒融合抗原基因NS3- C 定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究,遗传HEREDITAS (Beijing). 1999; 21 (6):1-6）等多种药用蛋白。

然而，利用衣藻生产得到的重组蛋白，主要是胞内表达的蛋白，需要对细胞进行破碎后再纯化，繁琐的纯化操作程序，不仅降低重组蛋白的回收率，还使蛋白的构象容易发生改变。即便是在目的蛋白加上序列标签，通过各种亲和层析手段进行纯化，除了具有以上的缺点外，还需要去除序列标签，这对目的蛋白的分离纯化以及应用生产带来极大的不便。

此外，体外基因表达系统进行外源基因表达，在进行转基因生物的检测时，一般会通过宿主细胞是否赋有新的抗性而进行筛选。因此，这种抗性基因导入宿主细胞后，会产生相应的抗性蛋白。人类在进食转基因食品的同时，就会担心这些抗性蛋白对人类的健康会产生不利的影响。利用信号肽构建分泌型表达载体进行外源基因的表达，则可以将目的蛋白分泌到细胞外，利于目的蛋白的分离纯化，不需要担心因食用转基因抗性蛋白而对身体产生影响。但目前国内市面上未有莱茵衣藻分泌型表达载体出售，同时未见有莱茵衣藻分泌表达外源基因的构建方法及应用。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法，旨在解决现有技术中存在的问题。

本发明的技术方案如下：

一种莱茵衣藻分泌型表达载体的构建方法，其中：根据莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信号肽预测软件进行信号肽预测，人工合成或扩增预测的莱茵衣藻分泌型蛋白的信号肽基因序列，将信号肽基因序列插入到莱茵衣藻启动子序列和克隆位点之间，构建莱茵衣藻分泌型表达载体。

所述的莱茵衣藻分泌型表达载体的构建方法，其中，包括以下步骤：

S1、以碱性磷酸酶(PHOX)蛋白信号肽序列为来源，合成含有Nhe I限制性酶切位点和TspE I酶切位点的信号肽基因序列Sg1，Sg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

S2、将信号肽基因序列Sg1克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，得到含有Sg1序列的载体pUCSg1；

S3、使用限制性内切酶EcoR I消化质粒pSP124，将获得的表达盒RBCS2∷ble∷RBCS2与经EcoR I消化的pH105载体连接，通过Kpn I酶切筛选正向连接的质粒，获得的质粒命名为pH124；

S4、使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSg1，回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收Sg1片段，插入经Nhe I和Pmac I消化的载体pH124，获得pHSg1载体。

S1、以PHOX蛋白信号肽序列为来源，合成含有Nhe I限制性酶切位点和TspE I酶切位点的信号肽基因序列Sg1，在Sg1的基础上，增加了Bgl II、Afe I、Age I、Mlu I、Pmac I限制性酶切位点，合成信号肽基因序列Sg2， Sg2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

S2、将信号肽基因序列Sg2克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，得到载体pUCSg2；

S3、使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSg2，回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收Sg2片段，将获得的Sg2片段插入经Nhe I和Pmac I消化的pH124载体中，获得pHSg2载体。

S1、以Fe-assimilating protein 2信号肽序列为来源，合成上游含有Nhe I位点和下游含有多克隆位点Bgl II、Pst I、Afe I、Age I、Mlu I、Pmac I限制性酶切位点的信号肽基因序列SgFe，SgFe的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

S2、将信号肽基因序列SgFe克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，得到载体pUCSgFe；

S3、使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSgFe，回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收SgFe片段，将获得的SgFe片段插入经Nhe I和Pmac I消化的pH124载体中，获得pHSgFe载体。

S1、以VAMP72-family的R-SNARE protein信号肽序列为来源，合成上游含有Nhe I位点和下游含有多克隆位点Bgl II、Pst I、Afe I、Age I、Mlu I、Pmac I限制性酶切位点的信号肽基因序列SgRS，SgRS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

S2、将信号肽基因序列SgRS克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，得到载体pUCSgRS；

S3、使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSgRS，回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收SgRS片段，将获得的SgRS片段插入经Nhe I和Pmac I消化的pH124载体中，获得pHSgRS载体。

一种莱茵衣藻分泌型表达载体，其中，含有以莱茵衣藻分泌型蛋白的信号肽来源合成的信号肽基因序列，信号肽基因序列位于构建的载体中启动子序列和多克隆位点之间。

所述的莱茵衣藻分泌型表达载体，其中，所述载体含有以PHOX蛋白信号肽来源的信号肽基因序列Sg1，位于构建的载体中启动子序列和多克隆位点之间；所述Sg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的莱茵衣藻分泌型表达载体，其中，所述载体含有Sg2信号肽基因序列；所述Sg2信号肽基因序列是在Sg1基础上增加了多个限制性酶切位点，Sg2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的莱茵衣藻分泌型表达载体，其中，所述载体含有以Fe-assimilating protein 2信号肽序列为来源的信号肽基因序列SgFe；所述SgFe的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的莱茵衣藻分泌型表达载体，其中，所述载体含有以R-SNARE protein信号肽序列为来源的信号肽基因序列SgRS；所述SgRS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

一种莱茵衣藻分泌表达外源基因系统，其中，包含有莱茵衣藻分泌型表达载体；所述莱茵衣藻分泌型表达载体是含有以莱茵衣藻分泌型蛋白的信号肽序列为来源合成的信号肽基因序列。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统，其中，所述莱茵衣藻分泌型表达载体含有以PHOX蛋白信号肽序列为来源合成的信号肽基因序列。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统，其中，所述莱茵衣藻分泌型表达载体含有以Fe-assimilating protein 2的信号肽序列为来源合成的信号肽基因序列。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统，其中，所述莱茵衣藻分泌型表达载体含有以R-SNARE protein的信号肽序列为来源合成的信号肽基因序列。

一种莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其中，包括如下步骤：

S1、莱茵衣藻分泌型表达载体的构建：根据莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信号肽预测软件进行信号肽预测，然后人工合成或扩增预测得到的信号肽基因序列，将信号肽基因序列插入到莱茵衣藻启动子序列和克隆位点之间，构建莱茵衣藻分泌型表达载体;

S2、转基因受体藻株的选择与培养；

S3、外源基因分泌型表达载体的构建：将外源基因插入所述莱茵衣藻分泌型载体中，构建含有外源基因的外源基因分泌型表达载体；

S4、外源基因分泌型表达载体的遗传转化；

S5、分泌型转基因衣藻的筛选。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其中，所述信号肽基因序列是以PHOX蛋白信号肽序列为来源合成的信号肽基因序列。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其中，所述信号肽基因序列是以Fe-assimilating protein 2的信号肽序列为来源合成的信号肽基因序列。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其中，所述信号肽基因序列是以R-SNARE protein的信号肽序列为来源合成的信号肽基因序列。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其中，步骤S2中所述的转基因受体藻株为莱茵衣藻的不同品系。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其中，步骤S4中所述的遗传转化是采用珠磨法、基因枪法或电转化法。

所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其中，步骤S5中所述的分泌型转基因衣藻的筛选包括以下步骤：

通过抗性平板筛选或者营养缺陷型筛选，对经过初步筛选获得的转基因衣藻进行分子检测，确定能分泌表达外源基因。

有益效果：本发明所提供的一种莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法，利用信号肽基因序列构建分泌型表达载体，通过莱茵衣藻遗传转化，进行外源基因在莱茵衣藻的表达，可以将目的蛋白分泌到细胞外，利于目的蛋白的分离纯化，提高目的蛋白的回收率，且不需要担心因食用转基因抗性蛋白而对身体产生影响。

附图说明

图1为本发明实施例1中含信号肽Sg1分泌型莱茵衣藻表达载体pHsg1构建示意图。

图2为本发明实施例2中含信号肽Sg2分泌型莱茵衣藻表达载体pHsg2构建示意图。

图3为本发明实施例3中含信号肽SgFe分泌型莱茵衣藻表达载体pHSgFe构建示意图。

图4为本发明实施例4中含信号肽SgRS分泌型莱茵衣藻表达载体pHSgRS构建示意图。

图5为本发明实施例5中外源基因ckkn基因的分泌型莱茵衣藻表达载体pHSg2ckkn构建示意图。

图6为本发明实施例8中SG转基因莱茵衣藻的基因组DNA-PCR电泳图。

图7为本发明实施例8中SG转基因莱茵衣藻的RT-PCR电泳图。

图8为本发明实施例8中SG转基因莱茵衣藻的western杂交分析结果。

具体实施方式

本发明提供一种莱茵衣藻分泌型表达载体及分泌型表达系统的构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明利用来源于莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，通过信号肽预测软件预测其信号肽，对预测获得的信号肽进行人工合成信号肽基因序列，并将其插入到莱茵衣藻表达载体的启动子和克隆位点之间，构建了莱茵衣藻分泌型表达载体。同时，通过莱茵衣藻遗传方法进行转化。实施例中利用外源基因ckkn检测构建的莱茵衣藻分泌型表达载体的表达效率。

本发明实施例中所提供的莱茵衣藻分泌型表达载体，是以碱性磷酸酶（PHOX）蛋白的信号肽序列为来源构建的表达载体，所述以PHOX蛋白的信号肽序列为来源的信号肽基因序列在构建的载体中位于启动子序列和多克隆位点序列之间。

所述信号肽基因序列和多克隆位点序列可具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

含有SEQ ID NO.1的信号肽基因序列和克隆位点序列的分泌型莱茵衣藻表达载体可具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列，其物理图谱如图1所示，命名为pHSg1。

所述信号肽序列和多克隆位点序列还可具有SEQ ID NO.3的核苷酸序列。

含有SEQ ID NO.3的信号肽基因序列和多克隆位点序列的分泌型莱茵衣藻表达载体可具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列，其物理图谱如图2所示，命名为pHSg2。

本发明实施例中还提供的一种莱茵衣藻分泌型表达载体，是以Fe-assimilating protein 2的信号肽序列为来源构建表达载体，所述以Fe-assimilating protein 2的信号肽序列为来源的信号肽基因序列在构建的载体中位于启动子序列和多克隆位点序列之间。所述信号肽基因序列和多克隆位点序列还可具有SEQ ID NO.5的核苷酸序列。

含有SEQ ID NO.5的信号肽基因序列和多克隆位点序列的分泌型莱茵衣藻表达载体可具有SEQ ID NO.6的核苷酸序列，其物理图谱如图3所示，命名为pHSgFe。

本发明实施例中还提供的一种莱茵衣藻分泌型表达载体，是以R-SNARE protein的信号肽序列为来源构建表达载体，所述以R-SNARE protein的信号肽序列为来源的信号肽基因序列在构建的载体中位于启动子序列和多克隆位点序列之间。所述信号肽基因序列和多克隆位点序列还可具有SEQ ID NO.7的核苷酸序列。

含有SEQ ID NO.7的信号肽基因序列和多克隆位点序列的分泌型莱茵衣藻表达载体可具有SEQ ID NO.8的核苷酸序列，其物理图谱如图4所示，命名为pHSgRS。

本发明莱茵衣藻分泌表达外源基因系统中的分泌型莱茵衣藻表达载体，可引导表达的目的蛋白到细胞外；多克隆位点丰富；不含有任何序列标签。

本发明莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法包括以下步骤：

1、根据莱茵衣藻分泌型蛋白的氨基酸序列，使用信号肽预测软件进行信号肽预测，人工合成或扩增预测的信号肽基因序列，将信号肽基因序列插入到莱茵衣藻启动子序列和克隆位点之间，构建莱茵衣藻分泌型表达载体。

2、将信号肽基因序列插入到莱茵衣藻启动子序列和克隆位点之间，构建莱茵衣藻分泌型表达载体。

3、将外源基因插入上述载体中，构建含有外源基因的分泌型表达载体。

4、转基因受体藻株的选择和培养：

进行莱茵衣藻外源基因分泌表达载体的遗传转化，可选择莱茵衣藻的不同品系进行转化。在转基因受体藻株筛选标记选择中，以上不同的遗传转化方法均可选择营养缺陷型藻株或抗生素筛选标记。

莱茵衣藻的培养：将纯化的莱茵衣藻单藻落从固体TAP平板中，接种于TAP液体培养基中，在连续光照条件下培养至对数中期。

4、外源基因分泌型表达载体的遗传转化：

莱茵衣藻遗传转化方法可以选择珠磨法、基因枪法、电转化法等。

在本发明的实施案例中，使用珠磨法将带有ckkn基因的分泌型表达载体转入细胞壁缺陷型莱茵衣藻（购自美国Duck大学衣藻遗传中心）受体藻株中。

5、转基因莱茵衣藻的筛选：

经过遗传转化获得的转基因藻株可以在含有筛选抗生素的TAP培养基平板进行培养和筛选，经过初步筛选获得的转基因衣藻进行如下的分子检测：基因组DNA的PCR检测、RT-PCR检测、Western杂交检测等。

本发明莱茵衣藻分泌表达外源基因系统是适用于莱茵衣藻不同细胞系作为宿主，实施例选择的是细胞壁缺陷型莱茵衣藻cc-503作为宿主。采用Tris-acetate-phosphate（TAP）培养基，在光照（~90μE/m²·s）通气或密闭条件下培养。

实施例1：本发明表达载体pHsg1的构建

根据已知的莱茵衣藻PHOX蛋白氨基酸序列（GenBank登录号：XP_001703098.1），利用信号肽分析软件SignalP V3.0，预测得到能引导合成蛋白质从细胞核分泌到细胞外的信号肽。根据预测信号肽的核苷酸序列，在上游添加Nhe I限制性酶切位点，下游进行核苷酸序列点突变以形成TspE I酶切位点，送上海生物工程有限公司通过人工合成的方法进行合成，核苷酸序列命名为Sg1，信号肽基因Sg1合成后克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，构建后含有该序列的载体命名为pUCSg1。Sg1信号肽基因序列如SEQ ID NO.1所示。

莱茵衣藻表达载体pH105（Jinxia Wu, Zhangli Hu, Wang Chaogang et al. Efficient expression of green fluorescent protein (GFP) mediated by a chimeric promoter in Chlamydomonas reinhardtii. Chin. J. Oceanol. Limnol. 2008(26): 242-247.）克隆有HSP70A-RBCS2启动子序列（HSP70A-RBCS2 promoter）和RBCS2终止子序列(RBCS2 terminater)，中间携带有PmacⅠ、NheⅠ、XbaⅠ和SalⅠ等多克隆酶切位点，可以插入外源基因并在衣藻核基因组中表达。载体pSP124（Lambreras v, Stevens DR, Purton S. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron. Plant J. 1998; 14(4):441-447）含有表达盒RBCS2∷ble∷RBCS2，可使转化的宿主细胞获得腐草霉素和Zeomycin抗性，在本发明中作为衣藻转化的筛选标记。

使用限制性内切酶EcoR I消化质粒pSP124，将获得的表达盒RBCS2∷ble∷RBCS2与经EcoR I消化的pH105载体连接，通过Kpn I酶切筛选正向连接的质粒，获得的质粒命名为pH124。

使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSg1，用TaKaRa Fragment Purification Kit试剂盒回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收Sg1片段（111bp），插入经Nhe I和Pmac I消化的载体pH124，获得pHSg1载体（图1），其含有SEQ ID NO.1序列的部分（包含商业载体pBluscript从Sac I 到Kpn I的多克隆接头）基因序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：本发明表达载体pHsg2的构建

为了便于目的基因与分泌型莱茵衣藻表达载体的连接，在信号肽基因Sg1的基础上，增加了Bgl II、Afe I、Age I、Mlu I、Pmac I限制性酶切位点，送上海生物工程有限公司通过人工合成的方法进行合成，核苷酸序列命名为Sg2，信号肽Sg2合成后克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，构建后含有该序列的载体命名为pUCSg2。Sg2信号肽基因序列如SEQ ID NO.3所示。

使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSg2，用TaKaRa Fragment Purification Kit试剂盒回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收Sg2片段（144bp），插入经Nhe I和Pmac I消化的pH124载体，获得pHSg2载体（图2），其含有SEQ ID NO.3序列的部分（包含商业载体pBluscript从Sac I 到Kpn I的多克隆接头）基因序列如SEQ ID NO.4所示。

实施案例3：本发明表达载体pHSgFe-1的构建

根据已知的莱茵衣藻Fe-assimilating protein 2氨基酸序列（GenBank登录号：ABB04462.1），利用信号肽分析软件SignalP V3.0，预测得到能引导合成蛋白质从细胞核分泌到细胞外的信号肽。根据预测信号肽的核苷酸序列，在上游添加Nhe I限制性酶切位点，下游添加Bgl II、Pst I、Afe I、Age I、Mlu I、Pmac I限制性酶切位点，送上海生物工程有限公司通过人工合成的方法进行合成，核苷酸序列命名为SgFe，信号肽基因SgFe合成后克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，构建后含有该序列的载体命名为pUCSgFe。SgFe信号肽基因序列如SEQ ID NO.5所示。

使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSgFe，用TaKaRa Fragment Purification Kit试剂盒回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收SgFe片段（117bp），插入经Nhe I和Pmac I消化的pH124载体，获得pHSgFe载体（图3），其含有SEQ ID NO.5序列的部分（包含商业载体pBluscript从Sac I 到Kpn I的多克隆接头）基因序列如SEQ ID NO.6所示。

实施案例4：本发明表达载体pHSgRS的构建

根据已知的莱茵衣藻R-SNARE protein氨基酸序列（GenBank登录号：XP_001692216.1），利用信号肽分析软件SignalP V3.0，预测得到能引导合成蛋白质从细胞核分泌到细胞外的信号肽。根据预测信号肽的核苷酸序列，在上游添加Nhe I限制性酶切位点，下游添加Bgl II、Pst I、Afe I、Age I、Mlu I、Pmac I限制性酶切位点，送上海生物工程有限公司通过人工合成的方法进行合成，核苷酸序列命名为SgRS，信号肽基因SgRS合成后克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，构建后含有该序列的载体命名为pUCSgRS。SgRS信号肽基因序列如SEQ ID NO.7所示。

使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSgRS，用TaKaRa Fragment Purification Kit试剂盒回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收SgRS片段（104bp），插入经Nhe I和Pmac I消化的pH124载体，获得pHSgRS载体（图4），其含有SEQ ID NO.7序列的部分（包含商业载体pBluscript从Sac I 到Kpn I的多克隆接头）基因序列如SEQ ID NO.8所示。

实施例5：人组织激肽释放酶基因分泌型莱茵衣藻表达载体pHSg2ckkn的构建

质粒pckkn18（由本实验室构建获得，详见专利申请号：200810066705.8）含有人组织激肽释放酶基因（ckkn基因），其表达产物为人组织激肽释放酶（hK1蛋白）。设计引物扩增ckkn基因，上游引入酶切位点Bgl II，下游引入酶切位点Pmac I。将获得的ckkn基因与经Bgl II和Pmac I消化的pHSg2载体连接，获得人组织激肽释放酶基因分泌型莱茵衣藻表达载体，命名为pHSg2ckkn，其构建示意图如图5所示。

实施例6：转基因受体藻株的选择与培养

选择细胞壁缺陷型莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii, cc-503, 购自美国Duck大学衣藻遗传中心）作为转基因的受体藻株。使用TAP培养基作为莱茵衣藻的培养基，其配方及成分如下所示：2.42g Tris, 25mL 4×Beijerinck salts （16g NH₄Cl, 2g CaCl₂·2H₂O, 4g MgSO₄·7 H₂O溶于水中，定容至1L）, 1mL 1M(K)PO₄, 1mL Trace微量元素混合液（11.4g H₃BO₃, 5.6g MnCl₂·4 H₂O, 22g ZnSO₄·7 H₂O, 4.99g FeSO₄·7 H₂O, 1.61g CoCl₂·6 H₂O, 1.57g CuSO₄·5 H₂O, 1.1g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4 H₂O, 50g Na₂EDTA, 溶于水中，20% KOH调pH6.5-6.8, 定容至1L）, 溶解到975mL水中，使用冰醋酸调pH6.95-7.05，定容至1L。

莱茵衣藻的培养条件：在22-25℃，90μE/m²/s光照条件下连续培养，藻细胞对数生长期浓度为1-2×10⁶cells/mL。

实施例7：莱茵衣藻的遗传转化

在本发明实施例中，莱茵衣藻的遗传转化方法为珠磨法。具体方法如下：

采用QIAGEN^? Plasmid Purification Kit提取重组质粒pHSg2ckkn。莱茵衣藻cc-503采用“珠磨法”进行遗传转化。具体步骤如下：（1）将莱茵衣藻在连续光照和TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1~2×10⁶cells/ml。5000rmp室温离心5min，收集藻细胞；弃上清；（2）用灭过菌的新鲜TAP培养液重悬藻细胞沉淀，调整细胞浓度至2×10⁸cells/ml；（3）吸取270μl藻细胞悬浮液到1.5ml EP管里（里面有灭过菌的合金锡珠），加入1μg酶切成线状的pHSg2ckkn以及30μl 50％ PEG6000到EP管中；同时建立一个不添加PEG6000的样品组；此外，还建立一个不添加DNA的对照组；（4）把衣藻细胞/合金锡珠/外源DNA混合物在振荡器上以最高速振荡25s；（5）把混合液转移到含有10ml新鲜TAP培养基的离心管中，在100rpm摇床弱光下过夜培养（22℃），使细胞恢复；（6）3000rmp室温离心5min，收集细胞，弃上清；用500μl新鲜TAP培养液小心重悬细胞，加入3.5ml 0.5％TAP培养基，混匀后倒在含有10μg/ml的Zeomycin TAP固体平板上，置于22℃光照培养箱里倒置培养约3周，待平板上长出绿色的单克隆，单克隆转基因藻命名为SG。

实施例8：转基因莱茵衣藻的筛选与鉴定

SG转基因衣藻由于整合入ble基因（获得Zeomycin抗性），经过抗生素平板初步筛选获得的转化子，可在含有10ug/ml的Zeomycin抗性平板上进行继代培养。

初步筛选获得的SG转基因衣藻进行如下的分子检测：基因组DNA的PCR检测、RT-PCR检测、Western杂交。具体步骤如下所示：

（1）转基因衣藻总DNA的提取及PCR检测

将莱茵衣藻cc-503和获得的转基因衣藻SG接种于新鲜的TAP培养基中培养，在光照条件下培养至对数中后期，使用TAKARA Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒分别提取其总DNA。

以提取得到的莱茵衣藻cc-503和转基因衣藻基因组DNA作为模板，进行PCR扩增检测。根据ckkn基因序列设计特异性引物扩增ckkn目的条带。

PCR引物：

Prckkn1: 5’- GCTAGCAGTTCCTCCACC -3’

Prckkn2: 5’- AGGTGGAGGAACTGCTAGC-3’

PCR程序： 94℃, 1min；60℃, 1min；72℃, 1min；30个循环。

电泳结果如图6所示：共有6条泳道，其中M示DL 2000 marker；1示阴性对照（未转基因衣藻cc-503基因组PCR产物）；2-4示转基因衣藻SG基因组PCR产物；5示阴性对照（H₂O的PCR产物）。从图4中可见，可扩增出与预计结果一致的目的条带。电泳结果表明，ckkn基因已整合入莱茵衣藻细胞核基因组中。

（2）转基因衣藻总RNA的提取及RT-PCR检测

莱茵衣藻cc-503和转基因衣藻SG在光照条件下培养至对数中后期，进行热激诱导。40℃光照下培养20min后，置于22℃光照培养箱中连续培养90min。采用RNAfast200-总RNA极速抽提试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）提取其总RNA。

以提取的莱茵衣藻cc-503和转基因衣藻RNA作为模板，采用RNA PCR Kit （AMV） Ver.3.0（TaKaRa公司）进行RT-PCR。使用Oligo dT-Adaptor primer进行cDNA第一链的合成（50℃，30min；99℃，5min；5℃，5min；）。分别以反转录的莱茵衣藻cc-503和转基因衣藻cDNA作为模板，使用ckkn基因的特异性引物进行cDNA第二链的合成和目的片段的PCR扩增。RT-PCR扩增结果如图7所示，共6条泳道，其中M示DL 2000 marker；1示阴性对照（H₂O的PCR产物）；2-4示转基因衣藻SG的RT-PCR产物；5示阴性对照（未转基因衣藻cc-503的RT-PCR产物）；从图5中可见，转基因衣藻SG总RNA经过反转录成cDNA后，可扩增出与预计结果一致的目的条带。电泳结果表明ckkn基因在莱茵衣藻中具有转录活性。

（3）转基因衣藻外源蛋白的诱导表达

由于HSP70A-RBCS2启动子为热激诱导型启动子，通过热激诱导可以提高外源蛋白的表达量。将莱茵衣藻cc-503和转基因衣藻SG培养至对数生长后期，并进行热激诱导。先置于40℃培养箱下，光照热激诱导30min，然后放回22℃光照培养箱中，光照培养5h；光照完毕后再次置于40℃培养箱下，进行第二次热激诱导30min，再放回22℃光照培养箱中培养1h。

离心收集培养上清液，上清液使用0.22μm针头式无菌滤膜进行过滤藻细胞后，再用超滤离心管进行超滤浓缩分泌到培养上清液的蛋白。

（4）转基因衣藻的Western分析

将浓缩的未转基因衣藻和转基因衣藻培养上清液蛋白，行12％SDS-PAGE电泳分离，使用KLK1单克隆抗体（Sigma公司）作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG（KPL公司）作为二抗，进行免疫印记，检测转基因衣藻中目的蛋白hK1的表达。具体方法参照Sigma公司的Western印记方法。Western杂交结果如图8所示，共7条泳道，其中M示DL 2000 marker；1-3示转基因衣藻SG培养上清液总蛋白；4示阴性对照（非分泌型转基因衣藻培养上清液总蛋白）；5示阴性对照（未转基因衣藻cc-503培养上清液总蛋白）。与对照组（cc-503）相比，转基因衣藻SG在55kD附近有一杂交信号带，推测表达的蛋白即为hK1。

实验证明，在利用本发明的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统表达外源蛋白hK1（人组织激肽释放酶）的过程中，信号肽能引导目的蛋白hK1分泌到细胞外，并具有生物学活性。本发明的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统可使转基因受体藻株高效分泌表达外源蛋白。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种莱茵衣藻分泌型表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以PHOX蛋白信号肽序列为来源，合成含有NheI限制性酶切位点和TspE I酶切位点的信号肽基因序列Sg1；在Sg1的基础上，增加了Bgl II、AfeI、Age I、MluI、PmacI限制性酶切位点，合成信号肽基因序列Sg2；

S3、使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSg2，回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收Sg2片段，将获得的Sg2片段插入经Nhe I和Pmac I消化的pH124载体中，获得pHSg2载体；

其中，所述pH124载体是使用限制性内切酶EcoR I消化质粒pSP124，将获得的表达盒RBCS2∷ble∷RBCS2与经EcoR I消化的pH105载体连接，通过Kpn I酶切筛选正向连接的质粒所获得的质粒；

所述信号肽基因序列Sg1的基因序列是根据莱茵衣藻PHOX蛋白氨基酸序列，GenBank登录号：XP_001703098.1，利用信号肽分析软件SignalP V3.0，预测得到能引导合成蛋白质从细胞核分泌到细胞外的信号肽，根据预测信号肽的核苷酸序列，在上游添加Nhe I限制性酶切位点，下游进行核苷酸序列点突变以形成TspE I酶切位点，合成含有NheI限制性酶切位点和TspE I酶切位点的信号肽基因序列Sg1获得的；

所述信号肽基因序列Sg2的基因序列是在在Sg1的基础上，增加了Bgl II、AfeI、Age I、MluI、PmacI限制性酶切位点，合成信号肽基因序列Sg2获得的。

2.一种莱茵衣藻分泌型表达载体，其特征在于，所述莱茵衣藻分泌型表达载体是通过如权利要求1所述的莱茵衣藻分泌型表达载体的构建方法制备而得，所述载体含有以莱茵衣藻分泌型蛋白的信号肽来源合成的信号肽基因序列，信号肽基因序列位于构建的载体中启动子序列和多克隆位点之间；

所述载体含有Sg2信号肽基因序列，所述Sg2信号肽基因序列是在Sg1基础上增加了多个限制性酶切位点；

所述Sg1是以PHOX蛋白信号肽来源的信号肽基因序列。

3.一种莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、莱茵衣藻分泌型表达载体的构建：以PHOX蛋白信号肽序列为来源，合成含有NheI限制性酶切位点和TspE I酶切位点的信号肽基因序列Sg1；在Sg1的基础上，增加了Bgl II、AfeI、Age I、MluI、PmacI限制性酶切位点，合成信号肽基因序列Sg2；将信号肽基因序列Sg2克隆到商用载体pUC57中，插入位点为Sma I，得到载体pUCSg2；使用限制性内切酶Nhe I消化质粒pUCSg2，回收，再用Sma I酶切位点消化，切胶回收Sg2片段，将获得的Sg2片段插入经Nhe I和Pmac I消化的pH124载体中，获得pHSg2载体；

S2、转基因受体藻株的选择与培养；

S4、外源基因分泌型表达载体的遗传转化；

S5、分泌型转基因衣藻的筛选；

所述质粒pH124是通过使用限制性内切酶EcoR I消化质粒pSP124，将获得的表达盒RBCS2∷ble∷RBCS2与经EcoR I消化的pH105载体连接，通过Kpn I酶切筛选正向连接的质粒获得的；

4.根据权利要求3所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其特征在于，步骤S2中所述的转基因受体藻株为细胞壁缺陷型莱茵衣藻。

5.根据权利要求3所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其特征在于，步骤S4中所述的遗传转化是采用珠磨法。

6.根据权利要求3所述的莱茵衣藻分泌表达外源基因系统的构建方法，其特征在于，步骤S5中所述的分泌型转基因衣藻的筛选包括以下步骤：通过抗性平板筛选或者营养缺陷型筛选，对经过初步筛选获得的转基因衣藻进行分子检测，确定能分泌表达外源基因。