CN101275118A - 猪防御素酵母工程菌的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪防御素酵母工程菌的制备方法，首先利用基因定点突变的方法对猪防御素基因进行改造，筛选出生物活性高的猪防御素基因的突变体，然后利用酵母菌惯用的密码子人工合成密码子优化的猪防御素基因，通过同源重组将该防御素基因以多拷贝形式整合到酵母染色体中，经过多次筛选得到产量高、生物活性强的生产猪防御素的酵母工程菌。防御素酵母工程菌发酵后通过加热杀死酵母菌后，通过浓缩可直接作为饲料添加剂，而不需要经过任何分离提取过程，降低了防御素的生产成本，提高了生产企业的经济效益。本发明为大规模工业化生产猪防御素和解决猪饲料抗生素添加剂的替代创造了条件。

Description

猪防御素酵母工程菌的制备方法
技术领域
本发明涉及一种猪防御素酵母工程菌的制备方法，属于生物技术及基因工程制药技术领域。
背景技术
防御素(defensin)是动物体重要的抗菌肽类物质，它不仅对细菌、真菌、被膜病毒有杀伤作用，而且对支原体、衣原体、螺旋体及一些恶性细胞也有一定的杀伤作用，因此，在医药工业上具有广泛开发和应用前景。在畜牧生产领域中，动物β-防御素有较好的研发价值。随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品和环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用认识日益加深，抗生素在饲料业中的应用已面临着淘汰或禁用的局面。当前，应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为国内外饲料学科的一项重要内容。特别是随着我国加入WTO，抗生素作饲料添加剂必将严重影响畜产品在国际市场的竞争力，应用生物技术研究与开发新型抗菌剂已经成为我国饲料科学界一项紧迫的任务。重组防御素作为饲料抗菌添加剂以替代抗生素添加剂成为目前研究的热点。但现有技术中，仅有部分动物抗菌肽生产的专利技术，如兔防御素基因在植物体内的表达，家蝇防御素基因在细菌和酵母菌的表达，兔防御素基因在小球藻中表达等，尚未见重组猪防御素的制备方法与技术的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪防御素酵母工程菌的制备方法，为大规模工业化生产猪防御素和解决猪饲料抗生素添加剂的替代创造条件。
本发明的构思是这样的：为降低猪防御素的生产成本和进行大规模工业化生产，本发明通过基因工程的方法利用酵母菌生产猪防御素，首先利用基因定点突变的方法对猪防御素基因进行改造，筛选出生物活性高的猪防御素基因的突变体，然后利用酵母菌惯用的密码子人工合成密码子优化的猪防御素基因，通过同源重组将该防御素基因以多拷贝形式整合到酵母染色体中，经过多次筛选得到产量高、生物活性强的生产猪防御素的酵母工程菌。具体来说本发明的方法包括以下步骤：
(1)猪β-防御素-2基因的改造
通过RT-PCR方法从猪白细胞中扩增猪防御素基因，并将其克隆到由美国Invitrogen公司生产销售的真核生物表达载体pcDNA3.1上，构建成真核表达载体；
利用定点突变方法，对猪防御素基因进行定点突变，得到若干突变体，在培养的人胚胎肾细胞(HEK293T)表达突变体基因，从培养基中纯化表达产物—猪防御素，通过抑菌试验鉴定不同防御素突变体的活性，从中筛选出抗菌活性高的突变体基因；
(2)猪防御素基因的合成
根据上述筛选出的防御素基因的突变体氨基酸序列和酵母惯用的密码子设计基因序列，合成带有两个酶切位点(SnaBI和NotI)、无信号肽的防御素基因，基因序列如下：
ggctacgtaATTAATTTTTTGACTGGTATTGGTCAAAGATCTGATCATTATAATTGTGTTAGAAAAGGTGGTACTTGTAATTATTCTGCTTGTCCATTGTTTAATAAAATTGATGGTACTTGTTATAGAGGTAAAGCTAAATGTTGTTTGAGATGAgcggccgcggc
氨基酸序列为：
INFLTGIGQRSDHYNCVRKGGTCNYSACPLFNKIDGTCYRGKAKCCLR
(3)高效表达猪防御素酵母工程菌的制备
首先将合成的猪防御素基因克隆到酵母表达载体pPIC9K的SnaBI和NotI位点上，构建成pPIC9K/pBDF表达载体，该载体含有酵母信号肽序列(α因子分泌信号肽)，可以使克隆的外源基因实现分泌性表达，用SalI酶切pPIC9K/pBDF表达载体使其线性化，利用电转移方法将线性化的表达载体转化到酵母体内，使其与酵母染色体进行同源重组，通过筛选His+重组体和用G418加压筛选多拷贝重组体，得到高表达猪防御素基因的猪防御素酵母工程菌。
本发明取得的有益效果是：
本发明利用酵母工程菌生产经过改造的猪防御素，不仅有利于提高天然防御素的抗菌活性，同时也有利于防御素的生产和应用。由于酵母菌本身就是一种单细胞蛋白质饲料，所以不存在生物安全性问题，防御素酵母工程菌发酵后通过加热杀死酵母菌后，通过浓缩可直接作为饲料添加剂，而不需要经过任何分离提取过程，降低了防御素的生产成本。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例
(1)猪β-防御素-2基因的改造
采集新鲜抗凝猪血100ml，离心后取白细胞层，利用Trizol法从猪白细胞中制备总RNA，根据动物防御素保守序列，设计上下游引物，上游引物：5’-gcggggtaccaccatgagggccctctgcttg，下游引物：5’-ctagtctagatcagcggatgcagcacttg。采用RT-PCR方法扩增猪防御素基因，通过酶切位点将此基因克隆到由美国Invitrogen公司生产销售的真核生物表达载体pcDNA3.1的KpnI和XbaI位点上，构建成真核表达载体。
利用定点突变方法，参考其它动物防御素的序列，对猪防御素基因进行定点突变，得到若干突变体，在培养的293T细胞表达突变体基因，从培养基中纯化表达产物—猪防御素，通过抑菌试验鉴定不同防御素突变体的活性，从中筛选出抗菌活性高的突变体基因。
(2)猪防御素基因的人工合成
根据上述技术方案中筛选出的防御素基因有益突变体的氨基酸序列和酵母惯用的密码子设计基因序列(去除信号肽防御素基因序列)，委托有关公司合成无信号肽的防御素基因(带有两个酶切位点)。基因序列如下：ggctacgta(SnaBI)ATTAATTTTTTGACTGGTATTGGTCAAAGATCTGATCATTATAATTGTGTTAGAAAAGGTGGTACTTGTAATTATTCTGCTTGTCCATTGTTTAATAAAATTGATGGTACTTGTTATAGAGGTAAAGCTAAATGTTGTTTGAGATGAgcggccgc(NotI)ggc。由此基因编码序列对应的猪防御素多肽的氨基酸序列为：
INFLTGIGQRSDHYNCVRKGGTCNYSACPLFNKIDGTCYRGKAKCCLR该序列与天然猪防御素氨基酸序列(Genbank编号：NP_999607)比较如下：
本发明基因序列：
天然基因序列：
Figure A20071018539500062
经过改造，将天然猪防御素氨基酸的序列的第3，7，15，17，18，25，27，33，35，40，47位的氨基酸：亮氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、异亮氨酸被人工合成序列的脯氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸取代。
(3)高效表达猪防御素酵母工程菌的制备
首先将上述合成的猪防御素基因克隆到酵母表达载体pPIC9K的SnaBI和NotI位点上，构建成pPIC9K/pBDF表达载体。该载体含有信号肽序列(α因子分泌信号肽)，可以使克隆的基因实现分泌性表达。
首先用SalI酶切pPIC9K/pBDF表达载体使其线性化，将5-15μg线性化质粒与80μl用预冷的1M山梨醇制备的浓缩约300倍的酵母悬浮液(原液OD600为1.3-1.5)混合，利用电转化的方法将线性化的表达载体转化至毕赤酵母体内(电转化条件为：1500v，25uF，200欧)，使其与酵母染色体进行同源重组。然后通过组氨酸缺陷型平板筛选His+重组体，再利用MD(minimaldextrose medium)/MM(minimal dextrose medium histidine)平板筛选Mut+(methanol utilization plus)的菌株，最后利用含有不同浓度遗传霉素G418的平板筛选多拷贝重组体，对多拷贝重组体进行PCR分析检测，进一步确定目的基因是否整合到酵母基因组中，进而得到高表达猪防御素基因的猪防御素酵母工程菌。

Claims (1)

1、猪防御素酵母工程菌的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)猪β-防御素-2基因的改造
通过RT-PCR方法从猪白细胞中扩增猪防御素基因，并将其克隆到真核生物表达载体pcDNA3.1上，构建成真核表达载体；
利用定点突变方法，对猪防御素基因进行定点突变，得到若干突变体，在培养的293T细胞表达突变体基因，从培养基中纯化表达产物—猪防御素，通过抑菌试验鉴定不同防御素突变体的活性，从中筛选出抗菌活性高的突变体基因；
(2)猪防御素基因的合成
根据上述筛选出的防御素基因的突变体氨基酸序列和酵母惯用的密码子设计基因序列，合成带有两个酶切位点(SnaBI和NotI)、无信号肽的防御素基因，基因序列如下：
ggctacgtaATTAATTTTTTGACTGGTATTGGTCAAAGATCTGATCATTATAATTGTGTTAGAAAAGGTGGTACTTGTAATTATTCTGCTTGTCCATTGTTTAATAAAATTGATGGTACTTGTTATAGAGGTAAAGCTAAATGTTGTTTGAGATGAgcggccgcggc
氨基酸序列为：
INFLTGIGQRSDHYNCVRKGGTCNYSACPLFNKIDGTCYRGKAKCCLR
(3)高效表达猪防御素酵母工程菌的制备
首先将合成的猪防御素基因克隆到酵母表达载体pPIC9K的SnaBI和NotI位点上，构建成pPIC9K/pBDF表达载体，用SalI酶切pPIC9K/pBDF表达载体使其线性化，利用电转移方法将线性化的表达载体转化到酵母体内，使其与酵母染色体进行同源重组，通过筛选His+重组体和用G418加压筛选多拷贝重组体，得到高表达猪防御素基因的猪防御素酵母工程菌。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102190732A (zh) * 2011-03-22 2011-09-21 成都市金之源生物技术有限公司 Pgbd-2融合防御素及其制备方法与其应用
CN102321712A (zh) * 2011-09-19 2012-01-18 广州和仕康生物技术有限公司 一种防御素的制备工艺
CN101525629B (zh) * 2009-02-23 2012-06-06 中国人民解放军第三军医大学 人α防御素5活性肽的基因工程制备方法
CN102584977A (zh) * 2012-02-17 2012-07-18 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪防御素pBD2多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN102617724A (zh) * 2012-03-23 2012-08-01 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪防御素pBD1多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN103074241A (zh) * 2013-01-15 2013-05-01 北京大北农科技集团股份有限公司 一种酿酒酵母工程菌及其应用与饲料添加剂
CN103103196A (zh) * 2013-02-04 2013-05-15 华中农业大学 一种修饰的山羊防御素基因及制备方法和应用
CN103205453A (zh) * 2011-12-06 2013-07-17 佛山科学技术学院 一种含有合成的重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒
CN103539850A (zh) * 2012-07-16 2014-01-29 拜宁生物科技股份有限公司 自猪单独分离的肽及其用途
CN104404049A (zh) * 2014-11-28 2015-03-11 四川华德生物工程有限公司 一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101525629B (zh) * 2009-02-23 2012-06-06 中国人民解放军第三军医大学 人α防御素5活性肽的基因工程制备方法
CN102190732A (zh) * 2011-03-22 2011-09-21 成都市金之源生物技术有限公司 Pgbd-2融合防御素及其制备方法与其应用
CN102321712A (zh) * 2011-09-19 2012-01-18 广州和仕康生物技术有限公司 一种防御素的制备工艺
CN102321712B (zh) * 2011-09-19 2014-08-20 广州和仕康生物技术有限公司 一种防御素的制备工艺
CN103205453A (zh) * 2011-12-06 2013-07-17 佛山科学技术学院 一种含有合成的重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒
CN103205453B (zh) * 2011-12-06 2016-06-29 佛山科学技术学院 一种含有合成的重组鸭β-防御素-2基因的重组质粒
CN102584977B (zh) * 2012-02-17 2014-08-13 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪防御素pBD2多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN102584977A (zh) * 2012-02-17 2012-07-18 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪防御素pBD2多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN102617724A (zh) * 2012-03-23 2012-08-01 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪防御素pBD1多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN102617724B (zh) * 2012-03-23 2015-11-18 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪防御素pBD1多肽及其在抑制猪病原菌中应用
CN103539850A (zh) * 2012-07-16 2014-01-29 拜宁生物科技股份有限公司 自猪单独分离的肽及其用途
CN103074241A (zh) * 2013-01-15 2013-05-01 北京大北农科技集团股份有限公司 一种酿酒酵母工程菌及其应用与饲料添加剂
CN103103196A (zh) * 2013-02-04 2013-05-15 华中农业大学 一种修饰的山羊防御素基因及制备方法和应用
CN104404049A (zh) * 2014-11-28 2015-03-11 四川华德生物工程有限公司 一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途
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