CN102321712B - 一种防御素的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种防御素的制备工艺，包括以下步骤：（1）分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，得聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液；（2）将玉米浆溶于水，制得玉米浆溶液；（3）将步骤（1）制备的聚丙烯酸钠溶液、聚乙二醇溶液和步骤（2）制备的玉米浆溶液混合，将混合后的溶液中加入玉米粉和面粉，并接种防御素基因工程酵母，室温搅拌均匀，得发酵溶液；（4）将步骤（3）所得发酵溶液发酵培养，培养温度为25-30℃，培养时间为16-24小时；（5）将步骤（4）发酵后的产物进行干燥，得成品。采用本发明所述制备工艺制备的防御素，活性高，对温度不敏感，能够在常温下长久保存而活性不明显衰减。
Description
技术领域
本发明涉及一种防御素的制备工艺，尤其涉及一种防御素的发酵制备工艺。
背景技术
酿酒酵母在啤酒和面包行业使用有数千年的历史，被认为是安全生物。此外，酵母是具有易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋白质翻译后加工功能，有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境，还能分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化，因此，酵母表达系统广泛应用于生物医药领域。
聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG），由于其无毒、无刺激性、具有良好的水溶性，在制药、食品等行业有着极为广泛的应用。聚乙二醇在医药工业生产中用作基质，起调节粘度、熔点的作用，由于其具有良好的溶解性和良好的药物相容性，1992年通过了美国FDA认证，符合美国药典（USP），国家处方集（NF），食品化学法典（FCC）标准，被广泛应用于食品、制药、饲料、个人护理、化学等行业的生产。聚丙烯酸钠由于粘性大，乳化分散稳定性好，且耐热、机械稳定性好，能封闭微量金属离子，又无毒，是一种十分理想的食品添加剂，可使食品长久保持风味不变。
防御素（defensins）是一类富含半胱氨酸和精氨酸的阳离子低分子内源性抗微生物短肽，具有特殊的抗菌机理和广谱、高效的抗病原微生物活性，不会产生耐药性，所以防御素在医药、食品和转基因工程上将发挥重要作用。防御素在自然界广泛分布于动物、植物和昆虫体内，是构成生物体先天免疫的重要成分，其抗菌机制为作用于病原微生物细胞膜，导致膜穿孔，致使病原微生物死亡。由于其分子量小，稳定性差，在酸性环境下容易降解，在高温条件下，容易失活，在体内易被蛋白酶降解。因此，研究防御素的包被工艺对于保持防御素的活性具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种可提高防御素的耐酸、耐高温性，所得抗菌素不易被蛋白酶降解，且工艺更简单的防御素的制备工艺。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种防御素的制备工艺，包括以下步骤：
（1）分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，得聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液；
（2）将玉米浆溶于水，制得玉米浆溶液；
（3）将步骤（1）制备的聚丙烯酸钠溶液、聚乙二醇溶液和步骤（2）制备的玉米浆溶液混合，将混合后的溶液中加入玉米粉和面粉，并接种防御素基因工程酵母，室温搅拌均匀，得发酵溶液；
（4）将步骤（3）所得发酵溶液发酵培养，培养温度为25-30℃，培养时间为16-24小时；
（5）将步骤（4）发酵后的产物进行干燥，得成品。
在本发明的一个优选实施例中，所述聚乙二醇的分子量为1000-4000。
在本发明的一个优选实施例中，所述聚丙烯酸钠的分子量为2000-5000。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤（3）的发酵溶液中含有的聚乙二醇与聚丙烯酸钠的质量比为20-25：1。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤（1）中制备的聚丙烯酸钠溶液的质量浓度为1%，聚乙二醇溶液的质量浓度为20-50%。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤（1）中，所述聚丙烯酸钠溶液的配制方法为：将聚丙烯酸钠在搅拌下缓慢加入水中，聚丙烯酸钠完全加入水中后，继续搅拌0.5小时，使其均匀乳化，配得聚丙烯酸钠溶液；所述聚乙二醇溶液的配制方法为：将聚乙二醇在搅拌下缓慢加入水中，水温为70-80℃，聚乙二醇完全加入水后，继续搅拌0.5小时，使其均匀乳化，配得聚乙二醇溶液。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤（2）制备的玉米浆溶液的质量浓度为2%-3%。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤（3）中加入的玉米粉和面粉的质量各占聚丙烯酸钠、聚乙二醇、玉米浆、玉米粉、面粉和水的质量总和的25%。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤（3）中防御素基因工程酵母菌的接种量为1%。
在本发明的一个优选实施例中，所述步骤（4）中培养时间为16-17小时。
在本发明的一个优选实施例中，步骤（5）中采用闪蒸干燥机对发酵后的产物进行干燥，进口温度为180℃，出口温度为68-75℃。
本发明所述防御素基因工程酵母是指转化了防御素基因的酵母。防御素基因工程酵母的制备方法为：
（1）防御素基因的筛选。利用生物信息学技术在基因文库中查找并筛选防御素基因，通过与已有防御素基因序列的同源比对和分析并结合文献和软件进行分子设计和改良，获得多个新的高活性和潜在应用价值较高的基因。为了增加防御素在酿酒酵母中的可溶性表达，按照酿酒酵母密码子使用的偏好性进行碱基优化。
（2）表达载体的选择。由于防御素具有抗菌活性，为了使在生产过程中不
会对宿主产生毒副作用，选择pYES-ASA高效可溶性分泌表达防御素-SUMO融合蛋白的基因载体，pHSP-SP为分泌表达SUMO蛋白酶的载体。将以上两个载体分别转化到酿酒酵母中进行复合发酵。首先，在30℃条件下表达产生SUMO-DEFENSIN融合蛋白，由于此融合蛋白不具有抗菌活性，因此不会对酿酒酵母宿主菌产生毒害作用，能够保证菌体长时间持续表达。待防御素融合蛋白表达充分后，再将温度升高至37℃，使热激蛋白启动子开始诱导SUMO蛋白酶的表达。最后，调整SUMO蛋白酶水解需要的适宜条件，防御素即可从融合蛋白中水解释放出来，表现出生物学活性。
（3）宿主菌的选择。选择酵母尤其是食品级的酿酒酵母作为表达宿主菌最合适，对动物有益，且成本低廉。
（4）重组载体的构建。使用TRIzol法制备防御素基因mRNA，然后逆转录成cDNA，合成引物，用PCR方法，以cDNA为模板，扩增防御素基因。将得到的基因片段连接到pYES-ASA表达载体上，得到含有防御素基因的重组载体。
（5）防御素基因工程酵母的制备。将含有防御素基因的pYES-ASA载体和pHSP-SP载体共转化酿酒酵母，经过筛选，得到防御素基因工程酵母。
本发明所述防御素的制备工艺中，加入的聚乙二醇和聚丙烯酸钠可保护发酵过程中分泌的防御素不被蛋白酶降解，同时可在干燥过程中保护防御素的活性。本发明所述制备工艺，可以阻止酵母表达出来的防御素与发酵液中的蛋白酶、酸的接触，提高防御素的稳定性，保护防御素在高温干燥环境中的活性，而且所述制备工艺操作简单。采用本发明所述制备工艺制备的防御素，活性高，对温度不敏感，能够在常温下长久保存而活性不明显衰减。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
本发明一种实施例的银杏防御素基因工程酵母的制备，包括以下步骤：
1、pYES-ASA-DEFENSIN真核表达载体的构建
1.1根据已发表在GeneBank上银杏防御素基因的序列，经过引物设计软件Primer Premier 5.0 分析，设计合成了引物P1、P2。
P1：GAATTCcggacgtgcaaaagtcaaag
P2：AAGCTTttgcgtcccaaatatcgtcatcg
1.2 Trizol抽提细胞总RNA
（1）每1g银杏果仁加1mL Trizol，吹打细胞，将液体吸至1.5mL经DEPC水处理过的离心管中，室温孵育5min；
（2）加入200μL氯仿，剧烈振荡30s，室温放置3min；
（3） 4℃，10000rpm离心15min；
（4） 加入600μL预冷异丙醇，-20℃，放置10min至1h，4℃，10000g离心样品5min；
（5） 4℃，10000rpm离心15min；
（6）小心倒去上清液，用70%乙醇洗涤两次，每次500μl，4℃，10000rpm离心5min；
（7）尽可能彻底地吸走上清，室温下放置15 min使酒精完全挥发；
（8） 沉淀用50μL DEPC水溶解。
1.3逆转录
在DEPC 水处理过的PCR管中按下表准备反应体系。
1.4 PCR反应体系
将PCR反应管置于已预热至50℃的PCR仪上，按以下条件进行反应
1.5 1.0%琼脂糖凝胶电泳，180V电泳约20min。
1.6 PCR产物胶回收
(1) 用小刀切下目的条带，尽可能切小，去除多余琼脂糖；
(2) 称量切下凝胶的重量，按照1g加入1mL 的原则加入Binding buffer,在55℃-60℃孵育7min-10min，其间不时晃动，待凝胶完全融解；
(3) 准备一个2mL 的HiBind DNA column；
(4) 往HiBind DNA column加入700μL DNA/agarose 溶液，10,000×g，1min，室温离心；
(5) 弃废液，加入300μL Binding buffer, 10,000×g，1min，室温离心；
(6) 弃废液，加入700μL SPW Wash Buffer(用前使用无水乙醇稀释)，10,000×g，1min，室温离心；
(7) 重复步骤（6）；
(8) 弃废液，将空HiBind DNA column室温离心，13,000×g，2min，甩干柱子；
(9) 将HiBind DNA column装入1.5ml EP管，加入50μL无菌ddH20，室温静置1min，13,000×g，1min，室温离心；
(10) 取2μL样品用MillQ水稀释30倍后测定A260及A280，以判定回收DNA的浓度及纯度。
1.7 产物双酶切
使用EcoRⅠ和HindⅢ酶切PCR产物，酶切反应条件如下：
| Component | Volume |
| PCR产物 | 30μL |
| 10×H buffer | 5.0 μL |
| EcoRⅠ (2 U~10 U/μl) | 2.0 μL |
| HindⅢ (2 U~10 U/μl) | 2.0 μL |
| ddH2O | Up to 50 μL |
| Total volume | 50 μL |
酶切反应条件：37°C水浴4 h；酶切反应结束后，使用Omega Cycle-Pure Kit清洁试盒回收酶切后片段。取2μL回收后样品用MillQ水稀释30倍后测定A260及A280，以判定回收DNA的浓度及纯度。
清洁试剂盒回收酶切反应产物
(1) 确定酶切反应体积，转入一个干净的EP管，添加4-5倍体积的Buffer CP；
(2) 将溶液转入一干净已经预装了2mL收集管的HiBind DNA Spin-column；
(3) 弃废液，加入700μL DNA Wash Buffer(已用酒精稀释过)，10,000×g，1min，室温离心；
(4) 弃废液，重复步骤（3）；
(5) 去上清，将柱子空甩，10,000×g，1min，室温离心；
(6) 将柱子放入一干净的1.5ml EP管，加入50μL无菌ddH20，室温静置1min，13,000×g，1min，室温离心；
(7) 取2 μL清洁后样品用MillQ水稀释30倍后测定A260及A280，以判定清洁后DNA的浓度及纯度
1.9 质粒pYES-ASA提取（omega质粒提取试剂盒）
(1) 接种含有目的质粒的DH5α于3mL LB培养基（含抗生素），37℃培养12-16h；
(2) 将1.5-3mL 菌液加入柱子，10,000×g，1min，室温离心；
(3) 弃废液，加入250μL SolutionⅠ/RNase A，完全重悬菌体；
(4) 加入250μL SolutionⅡ，颠倒混匀4-6次，得到澄清的裂解液；
(5) 加入350μL SolutionⅢ，颠倒混匀，10,000×g，10min，室温离心；
(6) 将上清转入一干净已经预装了2mL收集管的HiBind DNA Minicolumn，10,000×g，1min，室温离心；
(7) 弃废液，加入500μL buffer HB，10,000×g，1min，室温离心；
(8) 弃废液，加入700μL DNA wash buffer(已经用酒精稀释过)， 10,000×g，1min，室温离心；
(9) 重复步骤（8）；
(10)将柱子空甩，10,000×g，1min，室温离心；
(11)将柱子放入一干净的1.5ml EP管，加入50μL无菌ddH20，室温静置1min，13,000×g，1min，室温离心；
(12)取2μL样品用MillQ水稀释100倍后测定A260及A280，以判定回收DNA的浓度及纯度。
1.10质粒pYES-ASA双酶切（质粒可以购买或者用omega质粒提取试剂盒提取）
| pYES-ASA | 5μL |
| 10×H buffer | 3μL |
| EcoR I | 1μL |
| Hind Ⅲ | 1μL |
| ddH20 | 20μL |
| 总计 | 30μL |
酶切反应条件：37°C水浴4 h；酶切反应结束后，使用Omega Cycle-Pure Kit清洁试盒回收酶切后质粒片段。取2 μL回收后样品用MillQ水稀释30倍后测定A260及A280，以判定回收DNA的浓度及纯度。
1.11 酶切产物连接
质粒pYES-ASA经EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的产物，与EcoRⅠ和HindⅢ酶切产物后获得的PCR片段进行连接，连接体系如下：
| Component | Volume |
| PCR片段 | 50 ng |
| pYES-ASA (+)质粒EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的产物 | 60 ng |
| 10×T4 DNA Ligase Buffer | 2.0 μL |
| T4 DNA Ligase | 1.0 μL |
| dd H2O | up to 20μL |
| Total volume | 20 μL |
连接反应条件：16°C水浴16-20 h；转化DH5α感受态细胞。
2 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
2.1 DH5α大肠细菌感受态的制备
(1) 将冻存的DH5α菌种划线于LB琼脂板上, 37℃培养过夜；
(2) 挑取单菌落接种于3 mL LB培养基中, 37℃振荡培养过夜；
(3) 次日取菌液10 μL接种至含有3 ml LB培养基的试管中, 37℃剧烈振荡培养至约3 h～4 h, 待OD600值达到0.3～0.4时将试管置于冰浴10 min～15 min；1000rpm, 4℃离心10 min, 弃培养基, 将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽；
(4) 加预冷的已高压灭菌的0.1 mol/L CaCl2 6 mL重悬菌体, 置冰浴30 min。1000rpm, 4℃离心10 min, 弃培养基；
(5) 加300 μL预冷的0.1 mol/L CaCl2, 轻轻重悬菌体, 分装为100 μL/管，置4℃冰箱12 h～16 h。
2.2 连接产物转化感受态DH5α
(1) 在无菌条件下，在1.5 mL EP管中加入100 μL的感受态DH5α和10μL连接反应液，混匀，冰浴30min；
(2) 调整水浴锅温度为42℃, 热休克90 s, 中途不要摇动离心管，冰上静置2min，每管加800 μL无抗生素的LB培养基, 于37℃空气摇床中以130 r/min速度振摇45 min, 使细菌复苏；
(3) 预先倒好含Ampr的LB琼脂平板，每管取200 μL加至含Ampr的LB琼脂平板上, 用涂布器涂布均匀, 室温放置20 min, 使液体吸收, 然后37℃倒置培养12 h～16 h至单菌落形成，观察转化情况，平板倒置保存于4℃冰箱。
2.3 重组子的快速鉴定
(1) 从转化菌落中挑取单菌落于3μL含50μg/mL Amp的LB培养基试管中，培养16h；
(2) 12000rpm离心1min，收集菌体（1.5ml培养物）沉淀；
(3) 将细菌沉淀温和重悬于30μLddH2O中；
(4) 等体积酚氯仿抽提；
(5) 12000rpm，5min，将上清转移到另一离心管中；
(6) 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒大小，上样量为5μL。选出克隆成功的菌落重新培养，严格抽质粒后，PCR扩增鉴定质粒，扩增引物为P1、P2；
（7）对已鉴定的重组子质粒进行测序，由上海生物工程技术有限公司代为完成。
3 重组质粒pYES-ASA-DEFENSIN转化酿酒酵母
(1) 从-20℃冰箱拿出AH109菌液，取1μL菌液，划线于YPDA固体培养基中，30℃培养箱中培养3-5天后，挑取1个生长良好的新鲜酵母AH109单菌落至50mLYPDA培养基中，剧烈振荡混匀，250rpm于30℃培养16h后，检测OD600值（注：OD600必须大于1.5，方可将菌液用于以下实验）；
(2) 取适量过夜培养的酵母菌液转接至300mLYPDA培养基中，使OD600＝0.2～0.3；
(3) 250rpm、30℃培养2.5-3h左右，使0.4＜OD600＜0.6；
(4) 在超净台中，将菌液移至6个80mL的已灭菌的离心管中，室温条件（20～21℃）1,000×g离心5min；
(5) 弃上清，将6支管中的菌液全部移到1支离心管中，1,000×g离心5min，弃上清，加入50mL灭菌去离子水悬浮菌体，室温条件下1,000×g离心5min；
(6) 弃尽上清，加入1.5mL新鲜配制的1×TE/LiAC，悬浮菌体；
(7) 新鲜配制1×PEG/LiAC溶液3mL；
(8) 配制转化液：
(9) 向装有转化液的1.5mLEP管中加入100μL的新鲜制备的感受态细胞，轻弹EP管管底，使转化液与细胞充分混匀；
(10) 向EP管加入600μLPEG/LiAC溶液，尽量在9s内完成漩涡振荡混匀；
(11) 30℃、200rpm培养30min；
(12) 在培养菌液的30min期间，配制1×TE；
(13) 向EP管加入70μL DMSO，轻柔颠倒数次混匀，42℃水浴热冲击15min，使其均匀受热；
(14) 冰上冷冻1～2min；
(15) 室温条件12,000rpm离心30s，弃尽上清；
(16) 加入400μL1×TE重悬浮菌体；
(17) 将转化液分别涂布于有氨苄青霉素的固体培养基中，30℃培养，培养后得到银杏防御素基因工程酵母。
挑选阳性克隆做PCR，鉴定，鉴定引物用P1、P2。将鉴定的阳性克隆送上海生工测序，鉴定序列正确。
其他种类的防御素基因工程酵母可采用与上述类似的方法制得。
实施例2
本发明一种防御素制备工艺的一种实施例，包括以下步骤：
（1）分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，分别制备聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液：称取分子量为2000的聚丙烯酸钠0.1kg，溶于10kg的水中，搅拌均匀使其均匀乳化，得聚丙烯酸钠溶液；称取分子量为4000的聚乙二醇2kg，溶于2kg温度为80℃的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚乙二醇溶液；
（2）玉米浆溶液的配制：称取718g玉米浆干粉，加水至35.9kg，室温搅拌均匀，得玉米浆溶液；
（3）称取25kg玉米粉、25kg面粉，将步骤（1）制得的聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液与步骤（2）制备的玉米浆溶液混合，然后加入称取的玉米粉、面粉，并按接种量为1%接种实施例1所得银杏防御素基因工程酵母，室温搅拌10分钟，得发酵溶液；
（4）将步骤（3）所得发酵溶液置于发酵箱中开始发酵，发酵温度为27℃，发酵时间为18h，发酵完成后得发酵产物；
（5）将步骤（4）所得发酵产物送入闪蒸干燥机进行干燥，进口温度为180℃，出口温度为68℃，干燥后冷却，得成品。
实施例3
本发明一种防御素制备工艺的一种实施例，包括以下步骤：
（1）分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，分别制备聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液：称取分子量为2000的聚丙烯酸钠0.1kg，溶解于10kg的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚丙烯酸钠溶液；称取分子量为4000的聚乙二醇2.5kg，溶解于10kg温度为80℃的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚乙二醇溶液；
（2）玉米浆溶液的配制：称取822g玉米浆干粉，加水至27.4kg，室温下搅拌均匀，得玉米浆溶液；
（3）称取25kg玉米粉、25kg面粉，将步骤（1）制得的聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液与步骤（2）制备的玉米浆溶液混合，然后加入称取的玉米粉、面粉，并按接种量为1%接种实施例1所得银杏防御素基因工程酵母，室温搅拌10分钟，得发酵溶液；
（4）将步骤（3）所得发酵溶液置于发酵箱中开始发酵，发酵温度为27℃，发酵时间为24h，发酵完成后得发酵产物；
（5）将步骤（4）所得发酵产物送入闪蒸干燥机进行干燥，进口温度为180℃，出口温度为68℃，干燥后冷却，得成品。
实施例4
本发明一种防御素制备工艺的一种实施例，包括以下步骤：
（1）分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，分别制备聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液：称取分子量为2000的聚丙烯酸钠0.1kg，溶解于10kg的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚丙烯酸钠溶液；称取分子量为4000的聚乙二醇2.5kg，溶解于10kg温度为80℃的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚乙二醇溶液；
（2）玉米浆溶液的配制：称取822g玉米浆干粉，加水至27.4kg，室温搅拌均匀，得玉米浆溶液；
（3）称取25kg玉米粉、25kg面粉，将步骤（1）制得的聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液与步骤（2）制备的玉米浆溶液混合，然后加入称取的玉米粉、面粉，并按接种量为1%接种实施例1所得银杏防御素基因工程酵母，室温搅拌10分钟，得发酵溶液；
（4）将步骤（3）所得发酵溶液置于发酵箱中开始发酵，发酵温度为27℃，发酵时间为18h，发酵完成后得发酵产物；
（5）将步骤（4）所得发酵产物送入闪蒸干燥机进行干燥，进口温度为180℃，出口温度为75℃，干燥后冷却，得成品。
实施例5
本发明一种防御素制备工艺的一种实施例，包括以下步骤：
（1）分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，分别制备聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液：称取分子量为2000的聚丙烯酸钠0.1kg，溶解于10kg的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚丙烯酸钠溶液；称取分子量为4000的聚乙二醇2.5kg，溶解于10kg温度为80℃的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚乙二醇溶液；
（2）玉米浆溶液的配制：称取822g玉米浆干粉，加水至27.4kg，室温搅拌均匀，得玉米浆溶液；
（3）称取25kg玉米粉、25kg面粉，将步骤（1）制得的聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液与步骤（2）制备的玉米浆溶液混合，然后加入称取的玉米粉、面粉，并按接种量为1%接种实施例1所得银杏防御素基因工程酵母，室温搅拌10分钟，得发酵溶液；
（4）将步骤（3）所得发酵溶液置于发酵箱中开始发酵，发酵温度为27℃，发酵时间为24h，发酵完成后得发酵产物；
（5）将步骤（4）所得发酵产物送入闪蒸干燥机进行干燥，进口温度为180℃，出口温度为75℃，干燥后冷却，得成品。
实施例6
本发明一种防御素制备工艺的一种实施例，包括以下步骤：
（1）分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，分别制备聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液：称取分子量为5000的聚丙烯酸钠0.1kg，溶解于10kg的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚丙烯酸钠溶液；称取分子量为1000的聚乙二醇2.5kg，溶解于10kg温度为75℃的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚乙二醇溶液；
（2）玉米浆溶液的配制：称取200g玉米浆干粉，加水至10kg，室温搅拌均匀，得玉米浆溶液；
（3）称取16.3kg玉米粉、16.3kg面粉，将步骤（1）制得的聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液与步骤（2）制备的玉米浆溶液混合，然后加入称取的玉米粉、面粉，并按接种量为0.8%接种实施例1所得银杏防御素基因工程酵母，室温搅拌12分钟，得发酵溶液；
（4）将步骤（3）所得发酵溶液置于发酵箱中开始发酵，发酵温度为30℃，发酵时间为16h，发酵完成后得发酵产物；
（5）将步骤（4）所得发酵产物送入闪蒸干燥机进行干燥，进口温度为180℃，出口温度为70℃，干燥后冷却，得成品。
实施例7
本发明一种防御素制备工艺的一种实施例，包括以下步骤：
（1）分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，分别制备聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液：称取分子量为3000的聚丙烯酸钠0.1kg，溶解于10kg的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚丙烯酸钠溶液；称取分子量为2000的聚乙二醇2.5kg，溶解于2.5kg温度为85℃的水中，搅拌均匀使其乳化，得聚乙二醇溶液；
（2）玉米浆溶液的配制：称取600g玉米浆干粉，加水至20kg，室温搅拌均匀，得玉米浆溶液；
（3）称取17.55kg玉米粉、17.55kg面粉，将步骤（1）制得的聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液与步骤（2）制备的玉米浆溶液混合，然后加入称取的玉米粉、面粉，并按接种量为1.2%接种实施例1所得银杏防御素基因工程酵母，室温搅拌9分钟，得发酵溶液；
（4）将步骤（3）所得发酵溶液置于发酵箱中开始发酵，发酵温度为25℃，发酵时间为20h，发酵完成后得发酵产物；
（5）将步骤（4）所得发酵产物送入闪蒸干燥机进行干燥，进口温度为180℃，出口温度为72℃，干燥后冷却，得成品。
实施例8
对上述实施例2至7所述方法制备的成品进行活性测定，实验过程如下：
实验试剂、样品与仪器：金黄色葡萄球菌、根据上述实施例1至6所述方法制备的防御素成品、温摇床、离心机、天平、0.22μm滤器、LB培养基。
实验方法：（1）分别对实施例2至7发酵后干燥前的产品作以下处理：精密称取发酵后干燥前样品2g，置于容积为5ml聚丙烯管中，加入2ml去离子水，置于恒温摇床，在37℃和75rpm的条件下恒温震荡，4h后将聚丙烯管取出，5000rpm离心10min，取上清液1ml作为供试液，将供试液用LB培养基按1：500和1：1000稀释于50ml摇瓶，接种金黄色葡萄球菌，接种量为1%，将摇瓶置于恒温摇床，37℃、200rpm培养12h，使用分光光度计测定OD值。通过OD值判断防御素的抑菌活性，实验结果见表1。
抑菌活性计算：抑菌率（%）=（对照OD-实验组OD）×100%/对照组OD。
表1 酸、蛋白酶对防御素活性的影响
| 稀释比例 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
| 1：500 | 91.34% | 92.66% | 92.74% | 92.52% | 92.36% | 91.85% |
| 1：1000 | 88.36% | 89.42% | 89.57% | 89.82% | 89.61% | 88.74% |
由表1可看出，采用本发明所述制备工艺制备的防御素，能够抵抗发酵过程中产生的酸、蛋白酶对其活性的影响。
（2）分别精密称取实施例2至7干燥后的成品2g，置于容积为5ml聚丙烯管中，加入2ml去离子水，置于恒温摇床，在37℃和75rpm的条件下恒温震荡，4h后将聚丙烯管取出，5000rpm离心10min，取上清液1ml作为供试液，将供试液用LB培养基按1：500和1：1000稀释于50ml摇瓶，接种金黄色葡萄球菌，接种量为1%，将摇瓶置于恒温摇床，37℃、200rpm培养12h，使用分光光度计测定OD值。通过OD值判断防御素的抑菌活性，实验结果见表2。
抑菌活性计算：抑菌率（%）=（对照OD-实验组OD）×100%/对照组OD。
表2 温度对防御素活性的影响
| 稀释比例 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
| 1：500 | 91.75% | 92.16% | 92.53% | 92.86% | 92.78% | 91.95% |
| 1：1000 | 88.44% | 89.21% | 89.19% | 89.71% | 89.62% | 88.73% |
由表2可看出，采用本发明所述制备工艺制备的防御素，能够抵抗高温对其活性的影响。
实施例9
本发明所述制备工艺对产品贮藏性能的影响
实验试剂、样品及仪器：金黄色葡萄球菌、根据本发明实施例2至7所述制备工艺制备的产品、恒温摇床、离心机、天平、0.22μm滤器、LB培养基。
分别对本发明实施例2至7所述方法制备的产品进行以下处理：分别精密称取贮藏1个月、3个月、6个月、12个月的样品2g，置于容积为5ml聚丙烯管中，加入2ml去离子水，置于恒温摇床，在37℃和75rpm的条件下恒温震荡，4h后将聚丙烯管取出，5000rpm离心10min，取上清液1ml作为供试液，将供试液用LB培养基按1：1000稀释于50ml摇瓶，接种金黄色葡萄球菌，接种量为1%，将摇瓶置于恒温摇床37℃、200rpm培养12h，使用分光光度计测定OD值，通过OD值判断防御素的抑菌活性，实验结果见表3。
抑菌活性计算：抑菌率（%）=（对照OD-实验组OD）×100%/对照组OD。
表3 贮藏时间对防御素抑菌活性的影响
| 贮藏时间 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
| 1个月 | 88.45% | 89.21% | 88.63% | 88.72% | 88.68% | 89.12% |
| 3个月 | 88.21% | 88.61% | 88.02% | 88.44% | 88.35% | 88.82% |
| 6个月 | 88.76% | 88.01% | 87.97% | 88.12% | 88.11% | 88.42% |
| 12个月 | 88.56% | 87.84% | 87.43% | 88.32% | 87.63% | 87.96% |
由表3可看出，本发明所述制备工艺能够很好的保护所制备的防御素的活性，所制备的防御素的活性不会因为贮藏时间的延长而明显下降。
以上所述仅是本发明的优选实施方式而非对本发明保护范围的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明技术方案进行修改或等同替换，这些修改或等同替换也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种防御素的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别将聚丙烯酸钠、聚乙二醇溶于水进行乳化，得聚丙烯酸钠溶液和聚乙二醇溶液；
(2)将玉米浆溶于水，制得玉米浆溶液；
(3)将步骤(1)制备的聚丙烯酸钠溶液、聚乙二醇溶液和步骤(2)制备的玉米浆溶液混合，将混合后的溶液中加入玉米粉和面粉，并接种防御素基因工程酵母，室温搅拌均匀，得发酵溶液；
(4)将步骤(3)所得发酵溶液发酵培养，培养温度为25-30℃，培养时间为16-24小时；
(5)将步骤(4)发酵后的产物进行干燥，得成品；
所述聚乙二醇的分子量为1000-4000；所述聚丙烯酸钠的分子量为2000-5000；
所述步骤(3)的发酵溶液中含有的聚乙二醇与聚丙烯酸钠的质量比为20-25：1；
所述步骤(1)中制备的聚丙烯酸钠溶液的质量浓度为1％，聚乙二醇溶液的质量浓度为20-50％；
所述步骤(1)中，所述聚丙烯酸钠溶液的配制方法为：将聚丙烯酸钠在搅拌下缓慢加入水中，聚丙烯酸钠完全加入水中后，继续搅拌0.5小时，使其均匀乳化，配得聚丙烯酸钠溶液；所述聚乙二醇溶液的配制方法为：将聚乙二醇在搅拌下缓慢加入水中，水温为70-80℃，聚乙二醇完全加入水后，继续搅拌0.5小时，使其均匀乳化，配得聚乙二醇溶液；
所述步骤(2)制备的玉米浆溶液的质量浓度为2％-3％；
所述步骤(3)中加入的玉米粉、面粉的质量各占聚丙烯酸钠、聚乙二醇、玉米浆、玉米粉、面粉和水的质量总和的25％；
所述步骤(3)中防御素基因工程酵母菌的接种量为1％；
步骤(5)中采用闪蒸干燥机对发酵后的产物进行干燥，进口温度为180℃，出口温度为68-75℃。
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