CN103305435A

CN103305435A - 一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法

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Publication number: CN103305435A
Application number: CN2012104085033A
Authority: CN
Inventors: 李本涛; 印遇龙; 夏新界; 何宏轩; 李爱科; 佘锐萍; 王从峰; 李刚; 李帅伟
Original assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2013-09-18

Abstract

本发明公开了一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法，采用植物乳酸杆菌作为发酵菌种，在优化的固体培养基中，在温度为37℃的条件下培养，经过三级放大而进行大规模发酵生产，经过聚乙二醇PEG4000和聚丙烯酸钠处理之后，制成活性稳定的植物乳酸杆菌制剂。本发明有益效果：本发明提供一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法，经此方法制备的植物乳酸杆菌，耐酸和耐胆盐能力更强，且能在营养不均的恶劣环境下生存，进入动物肠道存活率更高，定植能力更强，故将其作为饲料添加剂添加到饲料中，能够促进饲料中营养成分的吸收，改善肠道环境，提高机体免疫力和抗病能力。

Description

一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法

技术领域

本发明涉及固体发酵工程领域，尤其涉及一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法。

背景技术

到目前为止，开发应用的饲用微生物的品种很多，但出于对菌种安全性的考虑，我国《饲料添加剂品种目录（2006）》准予使用的有16种。按其菌种类型，饲用微生物添加剂可分为：乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、酵母和霉菌。乳酸杆菌（Lactic acid bacteria）是一群杆状或球状的革兰氏阳性细菌，其DNA中G+C含量少于55%，可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)产生大量乳酸，在自然界分布广泛，是动物和人肠道等处的重要的生理性菌群之一。该类群细菌绝大多数对动物和人无毒、无害，负担着动物体内重要的生理功能。在乳酸菌中，乳酸杆菌是最大的一个属，其定义为杆形乳酸杆菌。

乳酸杆菌属与动物关系最密切，它是动物肠道和阴道中占优势的菌群之一。乳杆菌分布广泛，动物和人类从口腔到直肠始终都有该菌存在。乳酸杆菌己知的生理功能主要表现为：阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制病原菌和抗感染，维持肠道的微生态平衡，预防和抑制肿瘤的发生，增强机体免疫力，促进消化，合成氨基酸和维生素，降低胆固醇，抑制内毒素的生产，延缓衰老和抗辐射等。大量事实证明，只要肠道中乳酸杆菌的数量减少或丢失，出现菌群失调，就可能导致这种或那种疾病的发生；只要肠道中乳酸杆菌的数量增加，区系得到平衡，就可以促进机体健康和治疗某种疾病，可见，增加机体肠道中乳酸杆菌数量是预防和治疗某些疾病的一种重要措施。此外，乳酸杆菌对于妇科炎症、儿童艾滋病、儿童糖尿病等疾病有着确切的防治作用。

植物乳酸杆菌（L.plantarum）属于乳酸杆菌属，革兰氏阳性菌，最适生长温度为30~37℃，兼性厌氧，在pH4.5~9.5生长，最适pH6.5左右。目前人们所食用的酸奶等乳酸菌制品多是动物性乳酸菌发酵而来的。然而植物性乳酸菌与动物性乳酸菌相比，耐酸和耐胆盐能力更强，且能在营养不均的恶劣环境下生存，所以进入人体肠道存活率更高，定植能力更强。故植物性乳酸菌制品在改善肠道环境、提高机体免疫力方面更有优势。

聚乙二醇PEG-4000可用于药品中的片剂、胶囊剂、薄膜衣、滴丸、栓剂，由于在制片的过程中，PEG的可塑性和它可提高片剂释放药物的能力，高分子量的PEG（PEG4000、PEG6000、PEG8000）作为制造片剂的粘合剂是很有用途的。食品级聚丙烯酸钠系水溶性高分子化合物，具有极强的增稠保水功能，产品纯度高、性能极为稳定、无臭无味，久存不腐败，可广泛应用于面食类、加工食品和冷冻食品，是美国FDA、日本厚生省和中国卫生部批准使用的食品添加剂，对人体无害，易于保存和储藏。经过PEG-4000和聚丙烯酸钠处理过的植物乳酸杆菌固体发酵培养物，菌种活性更加稳定，在加工、运输和储藏过程中活性损失更小，并且由于其缓释作用而能够达到动物肠道，大大提高了植物乳酸杆菌定植动物肠道的能力，大大提高了该制剂生物活性的稳定性。

我们对植物乳酸杆菌固体发酵培养基进行碳源、氮源和缓冲盐的选择、单因素试验和4因素3水平正交试验对其培养基进行改进，得到最佳固体培养基配方，固体干基：以豆饼粉、玉米粉和小麦粉为基础料（质量之比为1:1:1）、葡萄糖5.0%、NaAc 0.5%和CaCO₃ 1.5%。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值调为6.5，搅拌均匀。将固体培养基在温度为121℃的条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用。对乳酸杆菌发酵条件进行优化以得到其最佳培养温度为35~37℃，起始 pH值6.5，接种量10%。将固体发酵的产物经过PEG4000和聚丙烯酸钠处理后，干燥，制得稳定的植物乳酸杆菌制剂。通过具体实施例动物实验表明，该菌的固体发酵培养物在促进食欲、增加体重、防止腹泻等方面具有明显的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法，以克服现有的植物乳酸杆菌培养物的制备方法存在的上述不足。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基固体平板上划线，在温度为37℃的条件下培养16个小时左右，使菌种活化，所述菌种为植物乳酸杆菌；

（2）制备一级种子：将活化的植物乳酸杆菌，用接种环挑取一环接种于300 mL 液体种子培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为37℃和转数为250rpm的条件下，振荡培养16~20小时后，制得一级种子菌；

（3）配制固体发酵培养基：将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为6.5的条件下，搅拌均匀，将固体培养基在温度为121℃的条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（4）固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%和温度为35~37℃的条件下，培养16~20个小时，制得二级种子；

（5）将得到的二级种子，按照步骤（4）进一步固体发酵得到三级种子；

（6）可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照步骤（4）进一步固体发酵扩大培养；

（7）将植物乳酸杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达8.0×10⁹CFU/g 鲜曲以上；

（8）将烘干的植物乳酸杆菌固体发酵培养物，加入质量比为0.2% 的聚丙烯酸钠和5% 的PEG4000（预先溶解于水），搅拌混匀，干燥制得成品。

优选的，所述步骤（1）中的固体种子培养基的组成为：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g和琼脂粉15g；所述步骤（2）中的液体种子培养基的组成为：蛋白胨 10g、酵母提取物 5g和NaCl 10g；所述培养基均通过高温高压灭菌后使用。

优选的，所述步骤（3）中的固体干基为：以豆饼粉、玉米粉和小麦粉为基础料、葡萄糖5.0%、NaAc 0.5%和CaCO₃ 1.5%；所述基础料中豆饼粉、玉米粉和小麦粉的质量之比为1:1:1。

本发明的另一个目的在于提供该植物乳酸杆菌培养物作为饲料添加剂在动物养殖业中的应用，优选的，所述植物乳酸杆菌制剂作为饲料添加剂的添加量为1~2wt%。

本发明有益效果：本发明提供一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法，经此方法制备的植物乳酸杆菌，耐酸和耐胆盐能力更强，且能在营养不均的恶劣环境下生存，进入动物肠道存活率更高，定植能力更强，故将其作为饲料添加剂添加到饲料中，能够促进饲料中营养成分的吸收，改善肠道环境，提高机体免疫力和抗病能力。

附图说明

下面根据附图对本发明作进一步详细说明。

图1是本发明实施例二所述的植物乳酸杆菌制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌活性检测示意图，图中：1为阴性对照ddH₂O；2和3为新鲜制备的未经过稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂的抑菌活性；4和5为新鲜制备的经过稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂的抑菌活性；

图2是本发明实施例二所述的植物乳酸杆菌制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌活性稳定性检测示意图，图中：1为阴性对照ddH₂O；2和3为室温保存半年的未经稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂的抑菌活性；4为室温保存半年的经过稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂的抑菌活性。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

实施例1 固体发酵生产乳酸杆菌培养物的工艺流程，包括以下步骤：

（1）菌种活化：

本发明采用植物乳酸杆菌作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号，GIM 1.358，将-80℃保存的植物乳酸杆菌菌种在固体种子培养基（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，高温高压灭菌备用）固体平板上划线，在温度为37℃的条件下培养16个小时左右，活化；

（2）制备一级种子：

将活化的植物乳酸杆菌，用接种环挑取一环接种于300 mL 液体种子培养基中（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，在温度为37℃和转数为250rpm的条件下，振荡培养16~20小时后，制得一级种子液；

（3）配制固体发酵培养基：

固体干基：以豆饼粉、玉米粉和小麦粉为基础料（质量之比为1:1:1），葡萄糖5.0%，NaAc 0.5%，CaCO₃ 1.5%。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，将pH值调为6.5，搅拌均匀。将固体培养基在温度为121℃的条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（4）固体发酵：

将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得二级种子。将二级种子按照10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得三级种子。可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照10%的接种量进一步扩大培养。将植物乳酸杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达8.0×109 CFU/g 鲜曲以上；

（5）稳定化处理：

将烘干的植物乳酸杆菌固体发酵培养物，加入质量比为0.2% 的聚丙烯酸钠和5% 的PEG4000（预先溶解于水），搅拌混匀，晾晒或干燥制得成品。

实施例2 植物乳酸杆菌制剂抑菌活性和稳定性检测

1、植物乳酸杆菌制剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果检测

检测方法是琼脂空穴扩散法：将琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50℃左右，用无菌操作法吸取60 μL的生测菌（OD600＝0.3）（此处用的是金黄色葡萄球菌），加入20 mL琼脂培养基中，迅速混匀，倾倒入直径为9 cm的无菌平面皿内，水平放置待凝固。在琼脂上打直径为2.7 mm的圆孔，分别在孔中加入发酵液上清、无菌水和100mg/mL Amplicin。将平皿倒置于37℃培养过夜，次日观察结果。

分别将新鲜的经过稳定化和未经稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂用PBS进行10倍稀释，颠倒混匀后，离心取上清液进行抑菌活性检测，结果如图1所示，新鲜制备的经过稳定化和未经稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂均对金黄色葡萄球菌表现出了抑制活性，并且活性差异不大。

分别将室温保存半年左右的经过稳定化处理和未未经稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂用PBS进行10倍稀释，颠倒混匀后，离心取上清液进行抑菌活性检测，结果如图2所示，经过稳定化处理的制剂室温保存半年左右，仍然可见非常明显的抑菌活性，但是没有稳定化处理的制剂，室温保存半年之后对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显减弱。这一结果说明：将植物乳酸杆菌进行质量比为0.2% 的聚丙烯酸钠和5% 的PEG4000的稳定化处理是能够延长有效保存期的，对于植物乳酸杆菌制剂的菌种活性和稳定性有重要作用。

2、植物乳酸杆菌制剂的活菌稳定性检测

活菌数测定方法：采用平皿稀释涂布计数法。植物乳酸杆菌的计数培养基为LB培养基，稀释涂布后，于37℃恒温培养24h后计数。

分别将新鲜的经过稳定化和未经稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂进行活菌数测定，结果表1所示，两类样品的活菌数都达到产品的要求并且差异不大。

分别将室温保存半年左右的经过稳定化处理和未未经稳定化处理的植物乳酸杆菌制剂进行活菌数测定，结果表1所示，经过稳定化处理的制剂室温保存半年左右，其活菌数目明显高于未经过稳定化处理的制剂组。

这一结果说明：将植物乳酸杆菌进行质量比为0.2% 的聚丙烯酸钠和5% 的PEG4000的稳定化处理是能够延长有效保存期的，对于产品的菌种活性和稳定性有显著作用。

表 1 植物乳酸杆菌制剂的活菌稳定性检测

实施例3 植物乳酸杆菌制剂促进育肥猪生长的应用

为验证植物乳酸杆菌制剂对育肥猪生长性能以及免疫力的影响，实验组与对照组分别选取110头体重在68kg左右的育肥猪，实验组1.5%添加植物乳酸杆菌制剂，对照组不添加，其他实验条件不变，实验结果如表2所示：

表 2 植物乳酸杆菌饲料产品促进育肥猪生长的实验结果分析

由表2可知：试验组日均增重比对照组多77.4g，料肉比由对照组的3.06降低到2.72，因此，植物乳酸杆菌饲料产品能够有效提高饲料利用率，促进消化吸收，保持肠道健康，增强机体免疫力，降低料肉比。

Claims

1.一种植物乳酸杆菌培养物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的植物乳酸杆菌培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的固体种子培养基的组成为：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g和琼脂粉15g。

3.根据权利要求1所述的植物乳酸杆菌培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的液体种子培养基的组成为：蛋白胨 10g、酵母提取物 5g和NaCl 10g。

4.根据权利要求3所述的植物乳酸杆菌培养物的制备方法，其特征在于：所述培养基均通过高温高压灭菌后使用。

5.根据权利要求1所述的植物乳酸杆菌培养物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的固体干基为：以豆饼粉、玉米粉和小麦粉为基础料、葡萄糖5.0%、NaAc 0.5%和CaCO₃ 1.5%。

6.根据权利要求5所述的植物乳酸杆菌培养物的制备方法，其特征在于：所述基础料中豆饼粉、玉米粉和小麦粉的质量之比为1:1:1。

7.权利要求1-6任一项所述的植物乳酸杆菌培养物的制备方法制备的植物乳酸杆菌培养物用于动物养殖业中的饲料添加剂。

8.根据权利要求7所述的植物乳酸杆菌培养物用于动物养殖业中的饲料添加剂，其特征在于：所述植物乳酸杆菌制剂作为饲料添加剂的添加量为1~2wt%。