CN104212830B - 一种枯草芽孢杆菌自调控表达系统及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌自调控表达系统及其构建方法和应用，属于基因工程领域。本发明的表达系统包括一种木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌和一种组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒表达载体。在含有诱导剂木糖存在的培养基中，只有含有稳定存在该表达载体的枯草芽孢杆菌才能正常生长。利用本发明表达系统分别表达了荧光蛋白基因(gfp)、透明质酸合成酶基因(hasA)和角蛋白酶基因(ker)，通过发酵培养，荧光强度、透明质酸含量和角蛋白酶活分别比利用抗生素维持的质粒提高21.8％、45％和30.2％。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌自调控表达系统及其构建和应用，属于基因工程领域。
背景技术
芽孢杆菌由于具有生长速度快、发酵周期短、胞外分泌蛋白能力强等特点，正在为应用生物学发挥着重要的作用。而其中的枯草芽孢杆菌作为研究透彻模式菌株同时又是被普遍认为是安全的(GRAS)，已广泛应用于食品和药品的研究和生产中。
目前，利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达外源基因时普遍存在以下问题：将外源基因重组到基因组上进行表达时，往往由于拷贝数较低，导致表达量不高；利用质粒进行表达时，经常发生质粒不稳定的现象，质粒的稳定最主要的是通过在发酵过程中添加过量的抗生素来维持。
抗毒素-毒素(antitoxin–toxin)系统广泛存在于微生物中。毒素基因在受到氨基酸缺少或是热刺激等其他外部胁迫的作用下诱导表达，毒素蛋白作用于胞内，使细胞发生停止生长或者利他型自杀，达到对种群有利的目的。但是抗毒素基因的表达可以解除因毒素蛋白造成的休眠作用，这是因为不稳定的抗毒素蛋白可以和稳定的毒素蛋白结合，使其失去功能。抗毒素-毒素系统中最重要的一类就是MazEF家族，其中mazF是一种稳定核酸内切酶蛋白，它能在特异性的位点切割mRNA，而这种位点又很普遍，所以能造成大部分胞内蛋白不能表达，菌体停止生长，而mazE是一种半衰期较短的抗核酸内切酶的蛋白，它特异性的与mazF结合，使其失活。枯草芽孢杆菌中存在与mazEF同族的蛋白endB-ndoA。
发明内容
本发明提供一种枯草芽孢杆菌自调控食品级表达系统，该表达系统包括一种木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌和一种组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒表达载体。
所述表达系统中的木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌是缺失了抗核酸内切酶基因且添加了能诱导核酸内切酶基因表达的木糖诱导启动子的枯草芽孢芽孢杆菌。
所述表达系统中的木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌，即为木糖致死型枯草芽孢杆菌，在木糖浓度1.5g/L以上的培养基中无法生长。
所述表达系统中的质粒表达载体是抗性基因序列被含有抗核酸内切酶基因的片段替换掉的表达质粒。
所述表达系统中的表达质粒是pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或由这几种质粒改造后的任意一种质粒。
所述表达系统中的枯草芽孢杆菌是Bacillus subtilis168。
所述表达系统中的枯草芽孢杆菌还可以是Bacillus subtilis OH131.1、Bacillus subtilis AG1839、Bacillus subtilis PY79、Bacillus subtilis BAB-1、Bacillus subtilis XF-1中的任意一种。
所述表达系统中的枯草芽孢杆菌还可以被解淀粉芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌替代，可以是以下任意一种：Bacillus amyloliquefaciens SQR9，Bacillusamyloliquefaciens Y2，Bacillus amyloliquefaciens TA208，Bacillusamyloliquefaciens DSM7，Bacillus licheniformis ATCC14580,，Bacilluslicheniformis9945A。
本发明还提供一种利用所述表达系统表达外源基因的方法，是将外源基因连接到所述表达系统中的质粒表达载体上，再将其转入到所述表达系统中的木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌中，在含有木糖的培养基中进行表达。
所述表达外源基因的方法中的外源基因可以是荧光蛋白基因、透明质酸合成酶基因、角蛋白酶基因。
所述表达外源基因的方法中，培养基中木糖含量在木糖致死浓度以上，即1.5g/L以上。
本发明还提供一种所述表达系统的构建方法，是构建抗核酸内切酶基因缺失且添加了能诱导核酸内切酶基因表达的木糖诱导启动子的枯草芽孢杆菌和在质粒上组成型表达抗核酸内切酶基因的表达载体。
所述表达系统的构建方法主要包括以下步骤：
1、构建木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌菌株：PCR扩增获得枯草芽孢杆菌基因组上抗核酸内切酶基因上游片段、核酸内切酶基因下游片段和核酸内切酶基因片段，然后融合上抗性片段和木糖诱导启动子，具体顺序为上游片段-抗性片段-木糖启动子-核酸内切酶基因-下游片段，然后与枯草芽孢杆菌基因组进行重组，筛选获得的阳性菌落即为木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌；
2、构建含有组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒：以表达质粒为模板PCR获得该质粒上除去抗性基因的片段，以枯草芽孢杆菌基因组为模板PCR获得抗核酸内切酶基因片段，将这两个片段进行体外重组后转化大肠杆菌，筛选克隆子，测序验证，将验证正确的质粒即为含有组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒。
所述表达系统的构建方法中的木糖诱导启动子前端可插入终止子T0，以防止其他启动子的干扰，提高重组菌筛选效率。
其中步骤1中木糖诱导表达核酸内切酶基因的菌株的具体构建方法如下：
(1)体外重组片段构建：以Bacillus subtilis168基因组模板，PCR扩增Bacillussubtilis168基因组endB-ndoA上游片段，命名为F；以基因序列如SEQ ID NO.27所示的质粒P7Z6为模板，PCR扩增博来霉素抗性基因片段，命名为Z；以基因序列如SEQ ID NO.28所示的质粒PAX01为模板，PCR扩增基因序列如SEQ ID NO.7所示的T0终止子和基因序列如SEQ IDNO.8所示的木糖诱导启动子Pxyl片段，命名为T0-Pxyl；以Bacillus subtilis168基因组模板，PCR扩增Bacillus subtilis168基因组ndoA基因片段(基因序列见SEQ ID NO.11)，命名为N；以Bacillus subtilis168基因组模板，PCR扩增Bacillus subtilis168基因组endB-ndoA下游片段，命名为R。
以上述五个片段为模板，通过融合PCR的方法将上述五个片段融合为一个片段，即为F-Z-T0-Pxyl-N-R。将PCR获得的F-Z-T0-Pxyl-N-R产物纯化后经测序正确。
(2)F-Z-T0-Pxyl-N-R片段转化Bacillus subtilis168获得木糖致死菌株：将融合后的F-Z-T0-Pxyl-N-R PCR片段转化Bacillus subtilis168菌株，涂布含有博来霉素的平板，筛选阳性克隆，测序验证，验证正确的菌株命名为Bacillus subtilis169。
其中步骤2中含有组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒的构建方法如下：以质粒pP43NMK(基因序列见SEQ ID NO.29)为模板，PCR获得pP43NMK质粒上除去kanR基因的片段，命名为P；以Bacillus subtilis168基因组为模板，PCR获得endB基因片段(基因序列见SEQID NO.20)，命名为E。将片段P和片段E进行体外重组后转化大肠杆菌，筛选克隆子，测序验证。将验证正确的质粒命名为PendB。
本发明的枯草芽孢杆菌自调控食品级表达系统，能够解决目前利用枯草芽孢杆菌在工业上的应用存在的外源基因表达量不高、质粒存在不稳定性、抗生素滥用等问题。因为，核酸内切酶基因的表达对菌株具有致死作用，而在表达载体上组成型地表达抗核酸内切酶基因能够解除这种致死作用。将外源基因连接到质粒表达载体上，再将其转化到枯草芽孢杆菌，在含有诱导剂木糖的培养基中，只有稳定存在该质粒表达载体的菌株才能正常生长。
本发明的枯草芽孢杆菌自调控食品级表达系统能够用于蛋白的表达和代谢产物的生产。利用该表达系统分别表达了荧光蛋白基因(gfp)、透明质酸合成酶基因(hasA)和角蛋白酶基因(ker)，通过发酵培养，荧光强度、透明质酸含量和角蛋白酶活分别比利用抗生素维持的质粒提高21.8％、45％和30.2％。
具体实施方式
荧光蛋白基因表达及酶活测定:
种子培养基(L)：10g木糖，10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。发酵培养基(L)：10g木糖，10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。培养条件：种子培养12h，37℃，220rpm，发酵培养24h，接种量5％，37℃，220rpm，培养过程中确保木糖浓度在1.5g/L以上，优选2-10g/L之间。对照菌株培养过程中添加相应浓度的抗生素以维持其质粒稳定性。
荧光强度测定方法：将发酵液离心10min(10000×g，4℃)，用等体积的tris-Hcl(50mM、pH8.0)洗涤沉淀两次。再次离心10min(10000×g，4℃)以后用一定体积的tris-Hcl(50mM、pH8.0)悬浮沉淀至OD600为2.0，在冰浴上超声波破碎(破碎条件：功率25W，工作时间2s，停歇时间5s，工作破碎时间共4min)。将破碎液再次离心10min(10000×g，4℃)，吸取上清液200μL用NUNC96孔黑色酶标板进行荧光检测，检测时做4个复孔，所用仪器为BioTekSynergy4多功能酶标仪，操作软件为Gen5。荧光强度参数设置为，激发：488/9nm发射：509/9nm,顶端发光，氚气灯，增益为自动调整增益。
角质酶基因表达及酶活测定:
种子培养基(L)：10g木糖，10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。发酵培养基(L)：10g木糖，10g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠，0.1g硫酸镁。培养条件：种子培养12h，37℃，220rpm，发酵培养36h，接种量5％，37℃，220rpm，培养过程中确保木糖浓度1.5g/L以上，优选2-10g/L之间。对照菌株培养过程中添加相应浓度的抗生素以维持其质粒稳定性。
酶活测定：将发酵液离心10min(10000×g，4℃)，取上清液进行适当稀释，吸取200μL与300μL0.05mol/LGly-NaOH缓冲液(pH9.0)溶解1％的底物(角蛋白)混匀，50℃反应15min，加入500μL4mol/LTCA溶液以终止反应。离心10min，吸取200μL上清液，依次加入1mL福林酚试剂和200uL0.5mol/LNa2CO3，50℃反应15min。以零时间的反应液作为空白，于660nm处检测吸光值。
以角蛋白为底物，每15min催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活单位。
透明质酸合成酶基因表达及透明质酸含量测定:
种子培养基(L)：10g木糖，10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。发酵培养基(L)：10g木糖，6.2g磷酸氢二钠，1.3g硫酸钾，20g酵母膏，70g蔗糖，1g硫酸镁。培养条件：种子培养12h，37℃，220rpm，发酵培养48h，接种量5％，37℃，220rpm，培养过程中确保木糖浓度在1.5g/L以上，优选2-10g/L之间。对照菌株培养过程中添加相应浓度的抗生素以维持其质粒稳定性。
透明质酸含量测定方法：将发酵液进行适当稀释，量取5mL发酵液，加入10mL无水乙醇(AR级)，充分混匀，稍加静置后4000rpm下离心5min，弃去上清，用去离子水将沉淀完全溶解，进行适当稀释，然后采用Bitte-Muir法[凌沛学，透明质酸，中国轻工业出版社，2000]测定，根据标准曲线计算出透明质酸的含量。
硼砂硫酸液：称取四硼酸钠4.77g溶于500mL的浓硫酸(AR级)中。咔唑试液：称取咔唑0.125g，溶于100mL的乙醇(AR级)中，然后置于棕色瓶中于冰箱中保存。精密称取葡萄糖醛酸(AR级)20mg，置于100mL的容量瓶中，加水溶解到刻度，摇匀备用。精密量取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别加入10mL的容量瓶中，加水稀释至刻度，得l0、20、30、40和50ug/mL浓度的对照品溶液，取6支具塞刻度试管分别加入硼砂硫酸溶液5mL置于冰浴中冷却至4℃左右。然后分别取空白溶液(去离子水)和不同浓度的标准品溶液各1.0mL于试管中，先轻轻震荡，再充分混匀，这些操作均在冰浴中进行。将试管置沸水中煮沸10min后，放入冷水中冷却至室温。加入咔唑试剂0.2mL，混匀，再在沸水中加热15min，冷却至室温。在530nm处测定吸光度A，以吸光度对应的浓度C作图，即可做出标准曲线。
引物序列表：
表1引物序列表
| 引物编号 | 引物序列(5’-3’) |
| #1 | CATGTCAAACTGATCAGAAAAGGCG |
| #2 | AGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTATTCAAGCAAAGCTGTTTTATGAATT |
| #3 | AATTCATAAAACAGCTTTGCTTGAATACCCGGGGATCCTCTAGAGATTCT |
| #4 | AATTAATCATCGCGACTGCAGAGATTGCCTGCAGGTCGACGATTCTACCG |
| #5 | CGGTAGAATCGTCGACCTGCAGGCAATCTCTGCAGTCGCGATGATTAATT |
| #6 | AAACATCGCCGCGTTTCACAATCAAGGATCCCATTTCCCCCTTTGATTTT |
| #7 | AAAATCAAAGGGGGAAATGGGATCCTTGATTGTGAAACGCGGCGATGTTT |
| #8 | CTATTTGAGCAACCTGCAAATATGTCTAAAAATCAATGAGTGCCAAACTG |
| #9 | CAGTTTGGCACTCATTGATTTTTAGACATATTTGCAGGTTGCTCAAATAG |
| #10 | TTAAAAATTTCTGTGTTAATCGGGC |
| #11 | CCCTGCATTCGACACTGTCACATGT |
| #12 | TTCGACATCAAATTCGCTTACCTCC |
| #13 | ATTATCTGAAAAGGGAATGAGAATATTGTCTGAATCCAGCGCAAGAACCG |
| #14 | ATTAACAATTATTAGAGGTCATCGTTTATCCTCCGCTGACTAAGCGCTCA |
| #15 | TGAGCGCTTAGTCAGCGGAGGATAAACGATGACCTCTAATAATTGTTAAT |
| #16 | CGGTTCTTGCGCTGGATTCAGACAATATTCTCATTCCCTTTTCAGATAAT |
| #17 | GGTACCAAAGGAGGTGAAATGTACACATGGGTAAGGGAGAAGAACTT |
| #18 | CTGCAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCAT |
| #19 | GGTACCTAAAAAGGAGCGATTTACATATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGC |
| #20 | CCCGGGTTATTGAGCGGCAGCTTCGAC |
| #21 | GGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAGAACATTAAAAAACCTCATAA |
| #22 | CCCGGGTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTCAGC |
实施例1 体外重组片段构建
以Bacillus subtilis168基因组模板，#1(如SEQ ID NO.1所示)和#2(如SEQ IDNO.2所示)为引物，通过PCR扩增Bacillus subtilis168基因组endB-ndoA上游452bp片段，命名为F；以质粒P7Z6(如SEQ ID NO.27所示)为模板，#3(如SEQ ID NO.3所示)和#4(如SEQID NO.4所示)为引物，通过PCR扩增引物博来霉素抗性基因片段，命名为Z；以质粒PAX01(如SEQ ID NO.28所示)模板，#5(如SEQ ID NO.5所示)和#6(如SEQ ID NO.6所示)为引物，通过PCR扩增T0终止子(如SEQ ID NO.7所示)和木糖诱导启动子Pxyl(如SEQ ID NO.8所示)片段，命名为T0-Pxyl；以Bacillus subtilis168基因组模板，#7(如SEQ ID NO.9所示)和#8(如SEQ ID NO.10所示)为引物，通过PCR扩增Bacillus subtilis168基因组ndoA基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)，命名为N；以Bacillus subtilis168基因组模板#9(如SEQ ID NO.12所示)和#10(如SEQ ID NO.13所示)为引物，通过PCR扩增Bacillussubtilis168基因组endB-ndoA下游500bp片段，命名为R。
以上述五个片段为模板，#1(如SEQ ID NO.1所示)和#10(如SEQ ID NO.13所示)为引物，通过融合PCR的方法将上述五个片段融合为一个片段，即为F-Z-T0-Pxyl-N-R。PCR反应条件：预变性98℃3min；变性98℃10s；延伸68℃4min；后延伸5min。将PCR获得的F-Z-T0-Pxyl-N-R产物纯化后经测序正确。
实施例2 F-Z-T0-Pxyl-N-R片段转化Bacillus subtilis168
将融合后的F-Z-T0-Pxyl-N-R PCR产物纯化后，用水稀释，将DNA的浓度调整至100μg/mL，然后添加40μL稀释液至500μL的Bacillus subtilis168化转感受态细胞(感受态制备方法参考Anagnostopoulos,C.,and Spizizen,J.:Requirements for transformationin Bacillus subtilis.J.Bacterial.81(1961)741-746.)中，45℃热激3min，放入37℃摇床，220rpm条件下培养1h，后涂布于含有50ug/ml博来霉素的LB平板，避光培养10h，挑选长出的菌落，#11(如SEQ ID NO.14所示)和#12(如SEQ ID NO.15所示)为引物，进行PCR验证，后将验证结果正确的菌株提取基因组，并以该基因组为模板，#11(如SEQ ID NO.14所示)和#12(如SEQ ID NO.15所示)为引物，PCR得到的片段进行测序验证，验证正确的菌株命名为Bacillus subtilis169。
实施例3 木糖致死浓度的确定
将改造好的endB基因缺失且木糖诱导表达ndoA基因的菌株Bacillussubtilis169接种到含有不同浓度木糖的LB平板上，确定木糖致死浓度为1.5g/L。
实施例4 含有组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒的构建
以质粒pP43NMK(如SEQ ID NO.29所示)为模板，#13(如SEQ ID NO.16所示)和#14(如SEQ ID NO.17所示)为引物，PCR获得pP43NMK质粒上除去kanR基因的片段，命名为P；以Bacillus subtilis168基因组为模板，#15(如SEQ ID NO.18所示)和#16(如SEQ ID NO.19所示)为引物，PCR获得endB基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示)，命名为E。将片段P和片段E等摩尔量混合，按照文献(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,HutchisonCA,Smith HO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat.Methods.2009，6:343–345)所述方法进行体外重组。反应条件：反应温度50℃；反应时间1h。将反应液20μL加入100μL的Escherichia coli JM109感受态中，冰浴中放置30min，42℃热激90s，放置2min后，加入880μL的LB，37℃摇床上220rpm后培养1h，涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上，37度培养10h。将平板上长出的菌落提取质粒测序验证。将验证正确的质粒命名为PendB。
实施例5 阳性克隆子筛选
将10μL的浓度为100μg/mL的PendB质粒或者含有外源基因的PendB质粒加入到500μL的Bacillus subtilis169的感受态细胞中，45℃热激3min，37℃摇床220rpm后培养1h，涂布于含有木糖浓度为1.5g/L以上的的LB平板上，37℃培养10h，将长出的菌落进行菌落PCR验证。
实施例6 利用枯草芽孢杆菌自调控食品级表达系统表达荧光蛋白
(1)以质粒pMD-19T simple-GFP(如SEQ ID NO.30所示)为模板，#17(如SEQ IDNO.21所示)和#18(如SEQ ID NO.22所示)为引物，克隆gfp荧光蛋白基因，前端添加KpnI酶切位点和RBS，后端添加PstI酶切位点。利用KpnI和PstI酶切获得的PCR产物，连接到相同酶处理过的pP43NMK和PendB上，构成新的质粒pP43-gfp和PendB-gfp。
(2)将10μL的浓度为100μg/mL的pP43-gfp、PendB-gfp质粒分别加入到500μL的Bacillus subtilis168、Bacillus subtilis169的感受态细胞中，45℃热激3min，37℃摇床220rpm后培养1h，涂布于含有10g/L的木糖的LB平板上，37℃培养10h，将长出的菌落进行菌落PCR验证。
(3)将上一步得到的两种菌进行培养，测定荧光强度，结果显示，Bacillussubtilis169(PendB-gfp)的荧光强度为6513，比Bacillus subtilis168(pP43-gfp)的荧光强度5347提高了21.8％。
实施例7利用枯草芽孢杆菌自调控食品级表达系统表达透明质酸合酶
(1)将来源于兽疫链球菌的透明质酸合成酶基因以兽疫链球菌StreptococcuszooepidemicusATCC35246基因组为模板，#21(如SEQ ID NO.23所示)和#22(如SEQ IDNO.24所示)为引物，PCR得到hasA基因片段，前端添加有KpnI酶切位点和RBS，后端添加有SmaI酶切位点。利用KpnI和SmaI酶切获得的PCR产物，连接到相同酶处理过的pP43NMK和PendB上，构成新的质粒pP43-hasA和PendB-hasA。将新构建的两个质粒分别转入到Bacillus subtilis168和Bacillussubtilis169中，筛选阳性转化子并进行PCR验证。
(2)将两株菌进行发酵培养，透明质酸产量测定结果显示，Bacillus subtilis169(PendB-hasA)的透明质酸产量为0.581g/L，比Bacillus subtilis168(pP43-hasA)的0.401g/L提高了45％。
实施例8 利用枯草芽孢杆菌自调控食品级表达系统表达角质酶
(1)菌株构建：将来源于Bacillus licheniformisATCC14580的角蛋白酶基因以地衣芽孢杆菌基因组为模板，#19(如SEQ ID NO.25所示)和#20(如SEQ ID NO.26所示)为引物，PCR得到ker基因片段，前端添加有KpnI酶切位点和RBS，后端添加有SmaI酶切位点。利用KpnI和SmaI酶切获得的PCR产物，连接到相同酶处理过的pP43NMK和PendB上，构成新的质粒pP43-ker和PendB-ker。将新构建的两个质粒分别转入到Bacillus subtilis168和Bacillus subtilis169中，筛选阳性克隆并进行PCR验证。
(2)酶活比较：将两株菌进行发酵培养，测定角蛋白酶酶活性。结果显示，Bacillussubtilis169(PendB-ker)的角蛋白酶酶活为328uint/mL，比Bacillus subtilis168(pP43-ker)的252uint/mL提高了30.2％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌自调控食品级表达组合物，其特征在于，所述表达组合物包括一种木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌和一种组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒表达载体。
2.根据权利要求1所述的表达组合物，其特征在于，所述木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌是缺失了抗核酸内切酶基因且添加了能使核酸内切酶基因表达的木糖诱导启动子的枯草芽孢芽孢杆菌；所述质粒表达载体是抗性基因序列被含有抗核酸内切酶基因的片段替换掉的表达质粒。
3.根据权利要求2所述的表达组合物，其特征在于，所述被替换掉抗性基因的表达质粒是pP43NMK、pUB110、pC194、pE194以及由这几种质粒改造后的质粒的任意一种。
4.根据权利要求1所述的表达组合物，其特征在于，所述核酸内切酶基因是来源于Bacillus subtilis 168基因组的ndoA基因，核苷酸序列是SEQ ID NO.11；所述抗核酸内切酶基因是来自Bacillus subtilis 168基因组的endB基因，核苷酸序列是SEQ ID NO.20。
5.根据权利要求1所述的表达组合物，其特征在于，所述芽孢杆菌是Bacillussubtilis 168、Bacillus subtilis OH 131.1、Bacillus subtilis AG1839、Bacillussubtilis PY79、Bacillus subtilis BAB-1、Bacillus subtilis XF-1、Bacillusamyloliquefaciens SQR9、Bacillus amyloliquefaciens Y2、Bacillusamyloliquefaciens TA208、Bacillus amyloliquefaciens DSM7、Bacilluslicheniformis ATCC 14580、Bacillus licheniformis 9945A中的任意一种。
6.一种应用权利要求1所述的表达组合物表达外源基因的方法，其特征在于，所述方法是将外源基因连接到权利要求1所述的质粒表达载体上，再将其转入到权利要求1所述的木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌中，在含有木糖的培养基中进行表达。
7.一种构建权利要求1所述表达组合物的方法，其特征在于，所述构建方法包括：PCR的方法获得Bacillus subtilis基因组上抗核酸内切酶基因上游片段、核酸内切酶基因下游片段和核酸内切酶基因片段，然后融合上抗性片段和木糖诱导启动子，具体顺序为上游片段-抗性片段-木糖启动子-核酸内切酶基因-下游片段，然后与枯草芽孢杆菌基因组进行重组，筛选获得的阳性菌落即为木糖诱导表达核酸内切酶基因的枯草芽孢杆菌；将含有抗核酸内切酶基因的片段替换掉表达质粒上原有的抗性基因序列，形成的新的质粒即为组成型表达抗核酸内切酶基因的质粒表达载体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述木糖诱导启动子为Pxyl，序列是SEQID NO.8，其前端添加有序列是SEQ ID NO.7的T0终止子。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组是通过双交换置换Bacillussubtilis 168基因组的endB-ndoA基因；所述阳性菌落的筛选是将菌体在木糖含量1.5g/L以上的培养基上进行筛选。
10.权利要求1所述表达组合物在蛋白合成和代谢产物生产方面的应用。
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