CN109097386B

CN109097386B - 一种基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统

Info

Publication number: CN109097386B
Application number: CN201811044297.6A
Authority: CN
Inventors: 康振; 陈坚; 堵国成; 韦朝宝; 金学荣
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-09-07
Also published as: CN109097386A

Abstract

本发明公开了一种基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统，属于生物工程技术领域。本发明在基因组上对基因的表达进行精确的调控，例如改变细胞形态达到所希望的生物形态，例如对代谢途径进行精确的动态调控提高生物合成目标产物产量，达到良好效果。与其他调控方法相比，具有较低的诱导浓度和很高的稳定性，具有精确的动态调控的优势，操作简便，应用广泛。

Description

一种基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统

技术领域

本发明涉及一种基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统，属于生物工程技术领域。

背景技术

随着生物技术的快速的发展，人们越来越希望在基因组上对基因的表达进行精确的调控。sRNA在细菌基因转录后调控中起非常关键的作用，在大量的物种中发现它们以RNA/RNA碱基配对或与蛋白质结合的方式来抑制或激活靶基因表达，毒素-抗毒素(TA)系统也是以这样的机理发挥作用的。毒素-抗毒素(TA)系统是成对的相邻基因，毒素-抗毒素(TA)系统表达的稳定的毒性肽被毒素-抗毒素(TA)系统表达的不稳定的抗毒素中和。毒素-抗毒素(TA)系统包括三种类型，在I型TA系统中，抗毒素是小的反义RNA，其会与转录成编码mRNA的毒素通过RNA/RNA结合发挥抑制作用；在II型系统中，发生相互作用的毒素和抗毒素都是蛋白质；III型系统(ToxIN)中，肽毒素与作为抗毒素的短[36核苷酸(nt)]RNA假结合相互作用。

枯草芽孢杆菌的内源性毒素-抗毒素系统有txpA/RatA、bsrG-sr4、bsrE-sr5、yonT/as-yonT、bsrH/as-bsrH，其中，bsrE-sr5是位于枯草芽孢杆菌染色体的原噬菌体样区域P6上的I型毒素/抗毒素系统。编码30个氨基酸疏水性毒素的bsrE基因和抗毒素基因sr5在bsrE-sr5的3'末端重叠112bp。bsrE基因过表达会导致细胞裂解，RNase J1是bsrE与sr5两种RNA降解的主要参与者，RNaseⅢ切割bsrE/SR5双链体。txpA/RatA、bsrG-sr4、yonT/as-yonT、bsrH/as-bsrH也有相似的功能和作用机理。

发明内容

本发明利用枯草芽孢杆菌内源性毒素-抗毒素系统bsrE-sr5，构建了基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控方法，可以实现对基因的表达进行精确的调控。

所述方法包括以下步骤：

先将枯草芽孢杆菌基因组上内源性毒素-抗毒素系统bsrE-sr5的基因序列从基因组敲除，再(1)在枯草芽孢杆菌基因组上将毒素基因opr⁵整合至目标基因的终止密码子TAA之后，或(2)将由组成型启动子调控的毒素基因opr⁵连接至目标基因(尤其是外源基因)终止密码子TAA之后以构建表达框，将表达框整合到枯草芽孢杆菌基因组上；然后，将由木糖诱导型启动子调节的抗毒素基因sr5的表达框组装在内源表达载体中，将内源表达载体转入枯草芽孢杆菌中，通过木糖诱导控制抗毒素基因sr5的表达，达到对目标基因进行精确的动态调控的目的。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。

在本发明的一种实施方式中，可以抑制ftsZ基因的表达，使枯草芽孢杆菌的菌体变长。

在本发明的一种实施方式中，可以对枯草芽孢杆菌异源表达透明质酸、软骨素、肝素等产物途径进行精确的动态调控，以提高生物合成目标产物产量。

有益效果：本发明在基因组上对基因的表达进行精确的调控，例如改变细胞形态达到所希望的生物形态，例如对代谢途径进行精确的动态调控提高生物合成目标产物产量，达到良好效果。与其他调控方法相比，本发明具有非常大的应用优势。首先，本发明的调控方法具有较低的诱导浓度和很高的稳定性(在100代中没有观察到质粒的丢失)。其次，本发明的调控方法具有精确的动态调控的优势，操作简便，应用广泛。

附图说明

图1为基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统构建及作用机理示意图；

图2为pstop1622-sr5构建示意图；

图3为bsrE-sr5系统应用于抑制gfp表达的构建过程及其效果示意图；

图4为bsrE-sr5系统应用于抑制ftsZ表达的效果示意图；

图5为bsrE-sr5系统应用于枯草芽孢杆菌异源表达透明质酸途径来进行精确的动态调控提高生物合成HA产量的效果示意图。

具体实施方式

实施例涉及的核苷酸序列信息：

(1)SEQ ID NO.1序列信息组成型启动子P_xpaC的基因编码序列；

(2)SEQ ID NO.2序列信息为opr⁵的基因序列；

(3)SEQ ID NO.3序列信息为sr5的基因序列；

(4)SEQ ID NO.4序列信息为gfp的基因序列；

(5)SEQ ID NO.5序列信息为ftsZ的基因序列；

(6)SEQ ID NO.6序列信息为lox71-cre-lox66的基因序列；

(7)SEQ ID NO.7序列信息为bsrE上游的500bp DNA片段的基因序列；

(8)SEQ ID NO.8序列信息为bsrE下游的500bp DNA片段的基因序列；

(9)SEQ ID NO.9序列信息为ftsZ上游的500bp DNA片段的基因序列；

(10)SEQ ID NO.10序列信息为ftsZ下游的500bp DNA片段的基因序列。

毒素-抗毒素系统bsrE-sr5中，单独的毒素基因为opr⁵，单独的抗毒素基因为sr5。

枯草芽孢杆菌感受态制备及质粒转入的方法参考论文：Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].杨森，江南大学，2017。

pSTOP1622-sr5的构建：使用引物SR5-F/SR5-F通过PCR扩增sr5DNA片段，得到序列如SEQ ID NO.3所示的sr5DNA片段，将所得的sr5DNA PCR产物与骨架pSTOP1622组装(使用引物Pstop-F/Pstop-R扩增)以产生pSTOP1622-sr5。

枯草芽孢杆菌BS G5的构建：通过融合PCR将以下5个模块的DNA片段按顺序融合：1)bsrE-sr5上游的500bp DNA片段(通过PCR获得，引物yoyA-F/yoyA-R)，2)从菌株B.subtilis GFP(Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].杨森，江南大学，2017)的基因组扩增的GFP表达盒PxpaC-gfp，pPxpaC-gfp(通过PCR使用引物PxpaC-F/GFP-R获得)，3)opr⁵(通过PCR获得，使用引物OPR5-F/OPR5-R)，4)从质粒p7Z6(Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].杨森，江南大学，2017)扩增的lox71-cre-lox66DNA片段(PCR使用引物Lox-zeo-F/Lox-zeo-R)，5)bsrE-sr5下游的500bp DNA片段(通过PCR获得使用引物yobJ-F/yobJ-F-R)。将融合重组的DNA片段转移到枯草芽孢杆菌168中并在含有博来霉素的LB平板上筛选。通过菌落PCR验证和基因测序获得正确的重组子。将含有zeoR抗性标记的重组子制备成感受态，然后转入pTSC质粒，通过在含有卡那霉素的LB平板上进行筛选，获得了阳性转化子。将该阳性转化子在含有卡那霉素和IPTG的LB培养基中培养12h以消除zeoR，得到枯草芽孢杆菌BS G5。

枯草芽孢杆菌BS G5s5的构建：向枯草芽孢杆菌BS G5中转入pSTOP1622-sr5，得到枯草芽孢杆菌BS G5s5。

基因组上在ftsZ基因后插入opr⁵的枯草芽孢杆菌BS F5的构建：为了在枯草芽孢杆菌BSG5菌株的基因组上ftsZ基因后插入opr⁵，构建了一个包含四个模块的重组DNA片段，分别是：1)B.subtilis168基因组上ftsZ基因终止密码子上游500bp DNA片段(使用引物ftsZ F-F/ftsZ-R从B.subtilis168基因组上通过PCR获得)；2)opr⁵片段(使用引物ftsZopr5-F1/opr5-R从B.subtilis168基因组上通过PCR获得)；3)lox71-cre-lox66DNA片段(使用引物Lox-zeo-F/Lox-zeo-R1从质粒p7Z6上通过PCR获得的)；4)B.subtilis168基因组上ftsZ基因终止密码子下游500bp DNA片段(使用引物ftsZ R-F/ftsZ R-R从B.subtilis168基因组上PCR获得)。将重组DNA片段转移到枯草芽孢杆菌BS G5中并在含有博来霉素的LB平板上筛选。通过菌落PCR验证和基因测序获得正确的重组子。将含有zeoR抗性标记的正确的重组子制备成感受态，然后转入pTSC质粒(Bacillus subtilis基因调控表达系统构建及其在发酵工程中的应用[D].杨森，江南大学，2017)，通过在含有卡那霉素的LB平板上进行筛选，获得了阳性转化子。将该转化子在含有卡那霉素和IPTG的LB培养基中培养12h以消除zeoR，得到枯草芽孢杆菌BS F5。

枯草芽孢杆菌BSH6的构建：将枯草芽孢杆菌BS G5菌株制备成感受态，同时转入质粒pSKIZH和pAX01-hasA(质粒pSKIZH是水蛭透明质酸酶的整合质粒，pAX01-hasA是透明质酸合酶的整合质粒，这两个质粒的构建方法参见论文：透明质酸寡聚糖生物合成与DNA编辑组装工具构建[D].金鹏，江南大学，2016)，并在同时含有博来霉素和红霉素的LB平板上筛选。通过菌落PCR验证、基因测序筛选正确的重组子。将含有zeoR抗性标记的菌株制备成感受态，然后转入pTSC质粒，通过在含有卡那霉素的LB平板上进行筛选，获得了阳性转化子。将该转化子在含有卡那霉素和IPTG的LB培养基中培养12h以消除zeoR，得到枯草芽孢杆菌BSH6。

表1引物信息如下：5’-3’方向

实施例1bsrE-sr5转录后调控系统调控GFP的表达

分别将枯草芽孢杆菌BS G5、枯草芽孢杆菌BS G5s5及对照菌(向枯草芽孢杆菌BSG5中转入pSTOP1622空质粒)的单克隆接种于5mL的LB培养基，置于200rpm 37℃培养过夜；然后按10％的接种量转接于250mL三角摇瓶，培养基为加40g/L的葡萄糖的LB培养基，装液量为25mL，接种的同时加入2.0g/L木糖进行诱导，置于200rpm 37℃培养12h。培养12h时对BS G5s5、BS G5的荧光强度进行分析结果如图2所示，从附图2看出，对照菌BS G5中，没有表达抗毒素基因sr5，gfp基因的表达不受抑制，荧光强度很强；而BS G5s5重组菌，通过质粒pSTOP1622-sr5表达了抗毒素基因sr5，抗毒素基因sr5转录的RNA与带毒素基因opr⁵的gfp基因转录的RNA结合，抑制了荧光蛋白的表达，荧光强度很弱，可见，枯草芽孢杆菌BS G5s5中GFP的表达受bsrE-sr5转录后调控系统调控，其表达被强烈抑制。证明bsrE-sr5转录后调控系统的调控水平取得理想效果。

实施例2bsrE-sr5转录后调控系统调控ftsZ的表达

分别将枯草芽孢杆菌BS F5、枯草芽孢杆菌BS G5s5及对照菌(向枯草芽孢杆菌BSF5中转入pSTOP1622空质粒)的单克隆接种于5mL的LB培养基，置于200rpm 37℃培养过夜，然后按10％的接种量转接于250mL三角摇瓶，培养基为加了40g/L的葡萄糖的LB培养基，装液量为25mL，在接种时加入2.0g/L木糖进行诱导，置于200rpm 37℃培养12h。培养12h时对菌株BS F5s5、BS F5的菌体长度进行分析，结果如图3所示，重组菌BS F5s5的菌体长度比对照菌BS F5长很多，说明ftsZ的表达受bsrE-sr5转录后调控系统调控，重组菌的分裂受到抑制而变长。GFP的表达受bsrE-sr5转录后调控系统调控，其表达被强烈抑制。证明bsrE-sr5转录后调控系统在基因组上对基因的表达进行精确的调控达到所希望的生物形态。

实施例3bsrE-sr5系统应用枯草芽孢杆菌异源表达透明质酸途径进行精确的动态调控提高生物合成HA产量

在重组菌BSH6的基础上分别构建重组菌H6-zwf5、H6-pfkA5、H6-MnaA5、H6-Z5F5、H6-Z5F5M5，重组菌H6-zwf是在基因组上在ftsZ基因后插入opr⁵，同理在基因组上pfkA、MnaA基因后单独插入opr⁵取可得到重组菌H6-pfkA5、H6-MnaA5，在基因组上同时在zwf、pfkA基因后插入opr⁵可得到重组菌H6-Z5F5，在基因组上同时在zwf、pfkA、MnaA基因后插入opr⁵取可得到重组菌H6-Z5F5M5，重组菌H6-zwf5、H6-pfkA5、H6-MnaA5、H6-Z5F5、H6-Z5F5M5的构建过程与重组菌BS F5构建过程一致。

进一步分别向H6-zwf5、H6-pfkA5、H6-MnaA5、H6-Z5F5、H6-Z5F5M5中转入pSTOP1622-sr5。

分别将转入了pSTOP1622-sr5重组菌H6-zwf5、H6-pfkA5、H6-MnaA5、H6-Z5F5、H6-Z5F5M5及对照菌(向BSH6中转入pSTOP1622空质粒)的单克隆接种于5mL的LB培养基，置于200rpm 37℃培养过夜，然后按10％的接种量转接于250mL三角摇瓶，培养基为LB培养基加40g/L的葡萄糖，装液量为25mL，置于200rpm 37℃培养12h，并在接种时加入2.0g/L木糖进行诱导，发酵12h时分析重组菌与对照菌的HA产量。

分别取重组菌和对照菌的第12h发酵液样品，在5000r/min，4℃离心5min，保留上清，并加入3倍体积100％乙醇进行沉淀，混匀后放置30min，再5000r/min离心10min，加入等体积的蒸馏水，于4℃重新溶解沉淀，该纯化步骤重复三次。透明质酸的含量采用Bitter-Muir咔唑比色法测定，在比色管中加入1mL硼砂硫酸试剂和200μL经一定倍数稀释后的透明质酸样品，混匀并在沸水中煮15min，冷却至室温，再加入50μL咔唑试剂，混匀并再在沸水中煮15min，冷却后测定530nm处的吸光值，根据标准曲线计算产量。测得透明质酸的产量如图5所示。与对照菌BSH6相比，重组菌H6-zwf5、H6-pfkA5、H6-MnaA5、H6-Z5F5、H6-Z5F5M5的透明质酸的产量分别提高了100％、127％、60％、180％、247％。说明bsrE-sr5系统对枯草芽孢杆菌异源表达透明质酸途径进行精确的动态调控，将低旁路途径的碳通量，提高生物合成HA产量。同时重组菌H6-Z5F5M5的HA产量最高，说明bsrE-sr5系统可以同时对多个基因进行进行动态调控。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌转录后调控系统

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 1

aggtggagaa gatggacgaa acagttaaac ttaatcatac atgtgtgatt tgtgatcaag 60

agaagaatag aggcattcat ctttatacga aattcatatg cttagattgt gagagaaaag 120

taatttctac atcaacttct gatcctgact atgcgtttta cgtaaaaaaa ctaaagagca 180

ttcatacacc gccattatat tcatagacct gaaaaggtct ttttttgtac tcttaataat 240

aaaaagaaga tgaaacttgt ttaaggattg aacgtagtag ataataatat taaaactgag 300

<210> 2

<211> 113

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 2

gacctccctt gagcctcaga acctgaaggg ataggcctac ctagaaccac atcgagcaag 60

ccctttgatg ggcaactttt tgtacagagc cggggtgttg gtagcacctc ggt 113

<210> 3

<211> 160

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 3

caatacatta cagtgcattt ctttaatgag aaatgcataa aataaaaaag accgaggtgc 60

taccaacacc ccggctctgt acaaaaagtt gcccatcaaa gggcttgctc gatgtggttc 120

taggtaggcc tatcccttca ggttctgagg ctcaagggag 160

<210> 4

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcctgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

<210> 5

<211> 1149

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 5

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ggcggcggta acaacgccgt taaccgaatg attgaaaatg aagtgcaagg agtagagtat 120

atcgcggtaa acacggacgc tcaagctctt aacctgtcaa aagcagaagt gaaaatgcaa 180

atcggcgcaa agctgactag aggattggga gcaggtgcga atccggaagt cgggaaaaaa 240

gccgctgaag aaagcaaaga gcagattgaa gaagcactta aaggtgctga catggtattc 300

gtgacagctg gtatgggcgg cggaacagga acaggtgccg caccggttat cgcacaaatc 360

gcgaaagact taggcgcatt aacagtcggc gttgtgacaa gaccgtttac cttcgaagga 420

cgcaaaagac agcttcaggc tgcaggcgga atctcggcaa tgaaagaagc ggtggataca 480

ctgatcgtga tcccgaacga ccgtatcctt gaaattgttg ataaaaacac accgatgctt 540

gaagcattcc gcgaagcgga taacgtactt cgccaagggg ttcaaggtat ttctgacttg 600

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attgtcgctt cggcgtctga tcaagacgta aacatgattt tcggttctgt tattaatgaa 900

aatctaaaag atgagattgt ggtgacagtg attgcaaccg gctttatcga acaagagaag 960

gacgtgacga agcctcagcg tccaagctta aatcaaagca tcaaaacaca caatcaaagt 1020

gttccgaagc gtgagccaaa acgtgaggaa cctcagcagc agaacacagt aagccgtcat 1080

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cgcggctaa 1149

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<211> 556

<212> DNA

<213> 人工序列

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agttatcttg atatggcttt ttatatgtgt tactctacat acagaaagga ggaactaaat 120

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 180

gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 240

gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 300

aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 360

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 420

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 480

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<210> 7

<211> 500

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

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gctttttata attgtagcac cttttccatt tttacacata ttaaatatcg acaatcattc 240

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<211> 500

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

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ttttttattg tttcttgtaa cgttataatg atctaaaata gcgcacaagc ctttatacat 120

cttcatcatt tcttactctt ctagctcgtc tttcaacatt ccaattccca atctttcccc 180

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<211> 450

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

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<210> 10

<211> 501

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 12

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taactgtttc gtccatcttc tccaccttat tttttctata tacgtcaata gggcg 55

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaatcgtcga cctgcaggca tgcctgatta taacacattt tccgtgaaat 50

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctttttaga acgaattata ttttaagcg 29

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgccctattg acgtatatag aaaaaataag gtggagaaga tggacgaaac 50

<210> 16

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccttcaggtt ctgaggctca agggaggtct tatttgtata gttcatccat gcca 54

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tggcatggat gaactataca aataagacct cccttgagcc tcagaa 46

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaatctctag aggatccccg ggtacaccga ggtgctacca acacc 45

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggtgttggta gcacctcggt gtacccgggg atcctctaga g 41

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

catttcacgg aaaatgtgtt ataatcaggc atgcctgcag gtcgac 46

<210> 21

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gttgatggat aaacttgttc acttaacaat acattacagt gcatttcttt aatga 55

<210> 22

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtttagccgg catgcggccg gtaccgggac ctcccttgag cctcagaac 49

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tctgaggctc aagggaggtc ccggtaccgg ccgcatgccg gctaaac 47

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aaatgcactg taatgtattg ttaagtgaac aagtttatcc atcaa 45

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gaaaatcgcg cggcagag 18

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccttcaggtt ctgaggctca agggaggtct tagccgcgtt tattacggtt 50

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aaccgtaata aacgcggcta agacctccct tgagcctcag aacctgaagg 50

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aaaacgattt tgtcctttac atgcatgcct gcaggtcgac 40

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gtcgacctgc aggcatgcat gtaaaggaca aaatcgtttt 40

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tttttctttc tttttaaagc t 21

Claims

1.一种基于sRNA介导的枯草芽孢杆菌中的基因转录后调控的方法，其特征在于，包括以下步骤：先将枯草芽孢杆菌基因组上内源性毒素-抗毒素系统bsrE-sr5的基因序列从基因组敲除，再(1)在枯草芽孢杆菌基因组上将毒素基因opr⁵整合至目标基因的终止密码子TAA之后，或(2)将由组成型启动子调控的毒素基因opr⁵连接至目标基因终止密码子TAA之后以构建表达框，将表达框整合到枯草芽孢杆菌基因组上；然后，将由木糖诱导型启动子调节的抗毒素基因sr5的表达框组装在内源表达载体pSTOP1622中，将内源表达载体pSTOP1622转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中，通过木糖诱导控制抗毒素基因sr5的表达，达到对目标基因进行精确的动态调控的目的；所述毒素基因opr⁵的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；抗毒素基因sr5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述对目的基因的动态调控为调控蛋白的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因包括透明质酸、软骨素、肝素的合成代谢途径的基因。

3.应用权利要求1或2所述方法构建得到的基因工程菌。