CN110656075A - 一种合成乙酰辅酶a衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。该底盘细胞以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA；并且过表达碳存储调节因子csrB和乙酰辅酶A合成酶基因acs。同时，本发明还提供了该底盘细胞的制备方法及利用该底盘细胞生产乙酰辅酶A衍生产品的方法。本发明首次完成了乙酰辅酶A衍生类产品生物合成通用性底盘细胞的建立，实现了“一种改造一类生产”的目标，具有较大的创新性和应用潜力。本发明底盘细胞适用于生物合成乙酰辅酶A衍生类产品。

Description

一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方 法与应用

技术领域

本发明涉及一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

乙酰辅酶A是细胞内的核心代谢物，对于维持细胞的正常生命活动至关重要。乙酰辅酶A作为前体可以合成多种类型的衍生产品，例如异戊二烯和萜类，聚酮类、聚羟基脂肪酸、脂类等，已广泛应用于医药、食品添加剂、化工、农业、化妆品等各大领域。

目前国内外针对乙酰辅酶A衍生产品生物合成的研究较多，也取得许多重要的研究进展。例如间苯三酚(PG)是合成黄酮、异黄酮类药物的中间体，具有广泛的抗癌、抗心血管疾病的作用。通过过表达荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phlD、大肠杆菌的乙酰CoA羧化酶基因accADBC，多重抗性激活因子marA，最终获得的菌株Q1944摇瓶水平间苯三酚浓度达到了0.51g/L。3-羟基丙酸(3HP)能够用于生产多种具有重要工业用途的化学品，还可作为合成新型可降解生物塑料的单体，在治理“白色污染”方面具有广阔的应用前景。通过对3HP合成途径关键酶丙二酸单酰辅酶A还原酶(malonyl-CoA reductase，MCR)进行功能域拆分、定向进化改造、酶催化平衡调控等多方面研究，最终获得的菌株Q2191摇瓶水平3-羟基丙酸的产量达到1.68g/L。尽管针对单一的乙酰辅酶A衍生产品的重组菌已有报道，然而，已报道的重组菌仅适用于特定的单一产品的生物合成，重组菌的改造过程繁琐、耗时、不具备通用性。而目前在大肠杆菌中暂无合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞的报道。因此，构建一种高效的乙酰辅酶A衍生产品通用性底盘细胞可以实现“一种改造一类生产”的目标，具有较大的创新性和应用潜力。

发明内容

为解决现有重组菌仅适用于特定的单一产品的生物合成，不具备通用性，如果对重组菌进行改造过程繁琐且耗时的问题，本发明提供了一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法和应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞，该底盘细胞以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA；并且过表达碳存储调节因子csrB和乙酰辅酶A合成酶基因acs。

本发明所述全局调控因子arcA的Gene ID为948874；所述乙酸激酶基因ackA的Gene ID为946775；所述碳存储调节因子csrB的Gene ID为2847719；乙酰辅酶A合成酶基因acs的Gene ID为948572。

优选地，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为出发菌株。

本发明提供了一种上述任一所述的通用性底盘细胞的构建方法，包括如下步骤：

1)分别敲除大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA，获得突变菌株I；

2)将强启动子的序列插入步骤1)所得突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前，获得突变菌株II；其中：强启动子为T7启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

3)将强启动子的序列插入步骤2)所得突变菌株II的乙酰辅酶A合成酶acs基因序列前，获得底盘细胞；其中：强启动子为T7启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选地，所述方法包括如下步骤：

1)利用P1噬菌体转导法分别敲除出发菌株大肠杆菌BL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA，获得突变菌株I，命名为E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA；

2)以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为引物，以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7-csrB同源臂；将T7-csrB同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112-T7-csrB；利用重组质粒pRE112-T7-csrB介导的同源重组法在步骤1)所得的突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前插入T7启动子的核苷酸序列，获得突变菌株II，命名为E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA T7-csrB；其中：T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

3)以如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为引物，以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7-acs同源臂；将T7-acs同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112-T7-acs；利用重组质粒pRE112-T7-acs介导的同源重组法在步骤2)所得的突变菌株II的乙酰辅酶A合成酶acs基因序列前插入T7启动子序列，获得底盘细胞，命名为E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA T7-csrB T7-acs；其中：T7启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，具体为：TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC。

本发明还提供了上述的通用性底盘细胞在发酵生产乙酰辅酶A衍生产品中的应用。优选地，所述乙酰辅酶A衍生产品为间苯三酚或3-羟基丙酸。

所述应用包括如下步骤：

1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；

2)将待生产的目标乙酰辅酶A衍生产品的重组质粒导入至步骤1)制备的感受态细胞中，获得待生产的乙酰辅酶A衍生产品的重组菌；

3)将步骤2)所得重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。

优选地，步骤3)是将步骤2)所得的重组菌按照1％(v/v)的接种量接种到培养基中，然后在37℃、180rpm的条件下培养至OD600达到0.6时，加入100μM异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养至发酵结束。

优选地，步骤2)所述乙酰辅酶A衍生产品为间苯三酚或3-羟基丙酸。

本发明还提供了一种利用上述所述的通用性底盘细胞发酵生产间苯三酚的方法，包括如下步骤：

1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；

2)将重组质粒pET-phlD-mar和pA-accADBC导入至步骤1)制备的感受态细胞中，获得

生产间苯三酚的重组菌；

3)将步骤2)所得生产间苯三酚的重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。

本发明还提供了一种利用上述通用性底盘细胞发酵生产3-羟基丙酸的方法，包括如下步骤：

1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；

2)将重组质粒pMCR-N-C-N940V/K1106W/S1114R和pA-accADBC导入至步骤1)制备的

感受态细胞中，获得生产3-羟基丙酸的重组菌；

3)将步骤2)所得生产3-羟基丙酸的重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。

本发明中制备感受态细胞的方法可以采用氯化钙法。

本发明中重组质粒导入感受态可以采用热激转化法。

本发明所述的P1噬菌体转导法是本领域基因敲除的常用技术之一，按照标准的操作方法操作即可。

本发明的底盘细胞是以细胞整体水平出发，利用全局调控因子arcA和碳存储调节因子csrB的改造，从全局性调控的方式，促进碳代谢流向乙酰辅酶A衍生产品生物合成方向进行，并且对乙酸激酶基因ackA和乙酰辅酶A合成酶基因acs的改造可以降低副产物乙酸的合成，促进乙酰辅酶A衍生产品的合成底物(乙酰辅酶A)的积累。本发明以两种重要的乙酰辅酶A衍生产品间苯三酚和3-羟基丙酸的生物合成为例说明本发明底盘细胞的通用性，但本发明的底盘细胞不仅仅局限于所列举两种乙酰辅酶A衍生产品的生物合成，该底盘细胞同样适用于其他乙酰辅酶A衍生类产品的生物合成，只需要向底盘细胞的感受态中导入不同目标乙酰辅酶A衍生产品的重组质粒即可。

本发明中所涉及的定义和缩写或简称：

全局调控因子基因：arcA，

乙酸激酶基因：ackA；

碳存储调节因子基因：csrB，

乙酰辅酶A合成酶基因：acs。

间苯三酚：PG

3-羟基丙酸：3HP

高效液相层析：HPLC

大肠杆菌(Escherichia coli)：E.coli

“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。

“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

本发明有益效果：

1、现有技术构建的重组菌仅适用于单一乙酰辅酶A衍生产品的生物合成，不具备通用性，本发明的底盘细胞是以细胞整体水平为出发点，采取全局性调控碳代谢的方式，提供一种合成乙酰辅酶A衍生产品通用性底盘细胞的构建方法，该底盘细胞首次实现了一类产品，即乙酰辅酶A衍生类产品的生物合成，具有通用性。

2、本发明在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基础上敲除基因组的全局调控因子arcA，乙酸激酶基因ackA，同时过表达碳存储调节因子csrB，乙酰辅酶A合成酶基因acs，获得乙酰辅酶A衍生产品生物合成的通用性底盘细胞。该底盘细胞能够在全局性水平、转录后水平、乙酸代谢水平调控细胞碳代谢流的分配，提高乙酰辅酶A衍生产品的产量、底物转化率，降低乙酸副产物的合成，具有较大的应用潜力和广泛的应用范围。

附图说明

图1为利用P1噬菌体转导法敲除基因的示意图。

图2为利用pRE112介导的同源重组法在基因组前插入强启动子的示意图。

图3为乙酰辅酶A衍生产品间苯三酚和3-羟基丙酸的生物合成路径。

图4为底盘细胞应用于乙酰辅酶A衍生产品间苯三酚(A)和3-羟基丙酸(B)的发酵结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)种子液摇瓶培养基

LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，

20min灭菌。

2)发酵生产摇瓶培养基

PG发酵培养基：9.8g/l K₂HPO₄·3H₂O，2.1g/l一水合柠檬酸，0.3g/l柠檬酸铁铵,3.0g/l硫酸铵,0.2g/l MgSO₄·7H₂O,20g/l葡萄糖，1000×微量元素3.7g/l(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，2.9g/l ZnSO₄·7H₂O，24.7g/l H₃BO₃，2.5g/l CuSO₄·5H₂O，15.8g/l MnCl₂·4H₂O)。

3HP的发酵培养基：14g/l K₂HPO₄·3H₂O，5.2g/l KH₂PO₄，1g/l NaCl,1g/l NH₄Cl，0.25g/l MgSO₄·7H₂O，0.2g/l酵母提取物，20g/l葡萄糖。

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的氨苄青霉素、50mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素。

以下实施例中所涉及的序列如表1所示。

表1核苷酸序列表

实施例1：通用性底盘细胞的构建

一、基因的敲除

利用P1噬菌体转导法(原理如图1)分别敲除大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组的全局调控因子arcA，乙酸激酶基因ackA。

1、全局调控因子arcA的敲除方法：

1)噬菌体活化

10ml无菌的EP管中加入4ml加热融化的0.4％琼脂培养基，加入400μL过夜培养的供体菌株JW4364(该供体菌株来源于Keio Collection文库，可通过商业途径购买，KeioCollection文库构建方法如Baba T,et al.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular SystemsBiology 2006,2(1):1-11)，加入10μL存储的噬菌体原液，将溶液混匀后倒于LB无抗平板上，37℃湿润环境下培养，直至出现不规则噬菌斑。

2)噬菌体裂解文库的收集

刮取平板上所有半固体培养基至10ml无菌EP管，加入3ml LB液体培养基，同时加入400μL氯仿，震荡后离心收集上清至另一无菌EP管，同时加入400μL氯仿，此溶液即为供体菌JW4364裂解文库。

3)转导

过夜培养受体菌E.coli BL21(DE3)，将步骤2)制备的供体菌JW4364裂解文库以不同浓度与受体菌E.coli BL21(DE3)混合后进行转导，涂布抗性平板，过夜培养至生长出单克隆后，以引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15进行阳性克隆的验证，获得敲除全局调控因子arcA的突变菌株W3110△arcA。

2、乙酸激酶基因ackA的敲除方法：

大肠杆菌W3110基因组的乙酸激酶基因ackA的敲除是利用P1噬菌体转导法。P1噬菌体转导法敲除ackA基因的操作流程参考全局调控因子arcA的敲除方法。不同之处为：步骤1)噬菌体活化的供体菌株为来源于Keio Collection文库的JW2293，步骤2)收集获得JW2293供体菌裂解文库，步骤3)转导是将步骤2)制备的JW2293供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌W3110△arcA混合后进行转导，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15进行阳性克隆的验证，获得敲除全局调控因子arcA、乙酸激酶基因ackA的突变菌株W3110△arcA△ackA。二、碳存储调节因子csrB和乙酰辅酶A合成酶基因acs的过表达

利用pRE112介导的同源重组法分别在碳存储调节因子csrB，乙酰辅酶A合成酶基因acs的基因组前插入T7启动子序列，实现基因的过表达，其中：T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCC。

1、碳存储调节因子csrB基因的过表达方法为：

1)同源臂的构建

以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)野生菌株csrB基因的一部分约700bp作为下游同源臂，csrB上游序列约700bp作为上游同源臂，并将T7启动子序列作为上游和下游同源臂的搭桥序列，以此为模板设计引物。以引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增T7-csrB的上游同源臂，以引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增T7-csrB的下游同源臂，以引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4，利用片段搭桥法搭桥T7-csrB的上游和下游同源臂，获得T7-csrB的同源臂片段，利用胶回收试剂盒回收目的同源臂片段T7-csrB。

2)重组质粒pRE112-T7-csrB的构建

利用限制性内切酶KpnI、SacI分别双酶切步骤1)所得的T7-csrB片段和自杀质粒pRE112，利用胶回收试剂盒回收酶切后基因片段和载体，片段与载体按摩尔比2:1在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜酶连，酶连产物42℃热激转化E.coliCC118感受态，过夜培养至生长出单克隆后，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.16进行阳性克隆的验证，得到重组质粒pRE112-T7-csrB。

3)同源重组

将重组质粒pRE112-T7-csrB转化至E.coliχ7213，并作为供体菌与受体菌株W3110△arcA△ackA进行两次同源重组，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6通过PCR验证T7启动子序列插入成功的菌株，即为阳性克隆，获得突变菌株W3110△arcA△ackA T7-csrB。

2、乙酰辅酶A合成酶基因acs的过表达方法为：

1)同源臂的构建

以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)野生菌株acs基因的一部分约700bp作为下游同源臂，acs上游序列约700bp作为上游同源臂，并将T7启动子序列作为上游和下游同源臂的搭桥序列，以此为模板设计引物。以引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8扩增T7-csrB的上游同源臂，以引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10扩增T7-csrB的下游同源臂，以引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10，利用片段搭桥法搭桥T7-acs的上游和下游同源臂，获得T7-acs的同源臂片段，利用胶回收试剂盒回收同源臂基因片段T7-acs。

2)重组质粒pRE112-T7-acs的构建

利用限制性内切酶KpnI、SacI分别双酶切步骤1)所得的T7-acs片段和自杀质粒pRE112，利用胶回收试剂盒回收酶切后基因片段和载体，片段与载体按摩尔比2:1在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜酶连，酶连产物42℃热激转化E.coliCC118感受态，过夜培养至生长出单克隆后，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.16进行阳性克隆的验证，得到重组质粒pRE112-T7-acs。

3)同源重组

将重组质粒pRE112-T7-acs转化至E.coliχ7213，并作为供体菌与受体菌株W3110△arcA△ackA T7-csrB进行两次同源重组，利用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.6通过PCR验证T7启动子序列插入成功的菌株，即为阳性克隆，获得底盘细胞W3110△arcA△ackA T7-csrB T7-acs。

实施例2乙酰辅酶A衍生产品的生物合成

本实施例列举了两种重要的乙酰辅酶A衍生产品间苯三酚(PG)和3-羟基丙酸(3HP)的合成实验，以说明本发明底盘细胞在乙酰辅酶A衍生产品生物合成的通用性。

一、PG的生物合成检测

1、PG合成菌株的构建

按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备野生型对照菌株E.coliBL21(DE3)和实施例1构建的乙酰辅酶A衍生产品通用性底盘细胞(E.coli BL21(DE3)△arcA△ackAT7-csrB T7-acs)的感受态，将乙酰辅酶A衍生产品PG合成途径的重组质粒pET-phlD-mar和pA-accADBC(质粒的构建方法参照Cao Y,et al.Improved phloroglucinol productionby metabolically engineered Escherichia coli.Appl Microb Biotechnol 2011,91(6):1545-1552.)通过热激法分别转化至野生型对照菌株和本发明底盘细胞的感受态细胞，获得PG合成菌株E.coliBL21(DE3)/pET-phlD-mar/pA-accADBC(Q1944)和E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA T7-csrB T7-acs/pET-phlD-mar/pA-accADBC(Q2957)。

2、PG检测方法的建立

PG浓度采用肉桂醛显色法测定OD446吸收值，其原理是根据PG与肉桂醛的显色反应，测定发酵液中PG的含量，具体步骤如下：

1)配制100mg/L的肉桂醛显色液(肉桂醛直接溶解于体积比1:3的浓盐酸/乙醇溶液中)；

2)向1.5ml离心管中加入1ml肉桂醛显色液，再加入5μl发酵液上清，颠倒混匀；

3)室温放置15min；

4)制作标准曲线(0.2g/L、0.5g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.5g/L)，用来计算PG浓度；

5)用10mm光径石英比色杯读取OD446值，OD446值在2h内稳定。

3、PG的发酵实验

本实施例共进行两组实验，以说明本发明所能够获得的有益效果

对照菌株：Q1944

实验菌株：Q2957

1)将活化后的对照菌株Q1944及实验菌株Q2957按1:100的比例接种到含有50mL的PG发酵培养基的250mL摇瓶中(内含50mg/L的氯霉素和50mg/L的卡那霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，加入100μM/L IPTG诱导表达，诱导后置于30℃、180rpm继续培养24至发酵结束。

2)取1mL发酵液，4℃，12000rpm离心10min，取上清进行OD446的检测，并根据标准曲线换算PG的浓度。

3)根据本实施例操作步骤，在含有相同的PG合成途径，即两种重组质粒pET-phlD-mar和pA-accADBC的基础上，摇瓶水平，对照菌株Q1944的PG产量为0.51g/L，实验菌株Q2957的PG产量为2.48g/L，由此表明，在含有相同的PG合成途径条件下，本发明提供的底盘细胞，乙酰辅酶A衍生产品PG的产量比野生宿主菌E.coli BL21(DE3)提高了4.86倍。

二、3HP的生物合成检测

1、3HP合成菌株的构建

按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备野生型对照菌株E.coliBL21(DE3)和本发明乙酰辅酶A衍生产品通用性底盘细胞(E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA T7-csrBT7-acs)的感受态，将含乙酰辅酶A衍生产品3HP合成途径的重组质粒pMCR-N-C-N940V/K1106W/S1114R和pA-accADBC(质粒的构建方法参照Liu C，et al.Functional balancebetween enzymes in malonyl-CoA pathway for 3-hydroxypropionatebiosynthesis.Metab Eng 2016,34(1):104-111.)通过热激法分别转化至野生型对照菌株和本发明底盘细胞的感受态细胞，获得3HP合成菌株E.coliBL21(DE3)/pMCR-N-C-N940V/K1106W/S1114R/pA-accADBC(Q2191)和E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA T7-csrB T7-acs/pMCR-N-C-N940V/K1106W/S1114R/pA-accADBC(2909)。

2、3HP检测方法的建立

1)3HP的发酵采用高效液相层析法(HPLC)检测。发酵液4℃下10000g离心10min，用0.22μm水量滤膜过滤后经HPLC检测产物，根据标准曲线计算3HP的浓度。

2)HPLC检测体系为：采用安捷伦Agilent 1200系统，检测柱选用HPX-87H column(300mm×7.8mm)，紫外检测210nm吸收峰，流速为0.4mL/min，流动相为0.5mM H₂SO₄，检测温度为60℃。

3)标准曲线制作：配置10g/L的3HP纯物质溶液，适当稀释到0.05g/L，0.1g/L，0.5g/L，1.0g/L，2.0g/L，5.0g/L进行HPLC分析，将测得的峰面积与已知浓度进行线性拟合，绘制标准曲线。

3、3HP的发酵实验

本实施例共进行两组实验，以说明本发明所能够获得的有益效果，具体实验如下：

对照菌株：Q2191

实验菌株：Q2909

1)将活化后的对照菌株Q2191及实验菌株Q2909按1:100的比例接种到含有50mL的3HP发酵培养基的250mL摇瓶中(内含100mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的卡那霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，加入100μM/L IPTG诱导表达，诱导后置于30℃、180rpm继续培养48至发酵结束。

2)取1mL发酵液，4℃，12000rpm离心10min，取上清进行HPLC的检测，并根据标准曲线计算3HP的浓度。

3)根据本实施例操作步骤，在含有相同的3HP合成途径，即两种重组质粒pMCR-N-C-N940V/K1106W/S1114R和pA-accADBC，摇瓶水平，对照菌株Q2191的3HP产量为1.68g/L，实验菌株Q2909的3HP产量为3.78g/L，由此表明，在含有相同的3HP合成途径条件下，本发明提供的底盘细胞，乙酰辅酶A衍生产品3HP的产量比野生宿主菌E.coli BL21(DE3)提高了2.25倍。

本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

本发明以两种重要的乙酰辅酶A衍生产品间苯三酚和3-羟基丙酸的生物合成为例，说明本发明底盘细胞的通用性，但本发明的底盘细胞并非局限于上述两种乙酰辅酶A衍生产品的应用，而是应用于所有乙酰辅酶A衍生类产品的生物合成。

虽然本发明以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞及其构建方法与应用

<130> 1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> csrB-up-5'

<400> 1

cagagctcca gctcagccag aataagcgcg 30

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> csrB- up -3'

<400> 2

ctatagggga attgtgagcg gataacaatt ccgtcgacag ggagtcagac aac 53

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> csrB-down-5'

<400> 3

cgctcacaat tcccctatag tgagtcgtat tagaagatag aatcgtcttt ttc 53

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> csrB-down-3'

<400> 4

atctgcggta ccgtggcatg aagagcataa aa 32

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> ID-csrB-5'

<400> 5

ttccagcatt agctcgcatc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> T7-3'

<400> 6

ttgttatccg ctcacaattc 20

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> acs-up-5'

<400> 7

cggggtaccg gtagcggacc atcttcagcg 30

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> acs-up-3'

<400> 8

aataatatgt ggcataagcg gaattgttat ccgctcacaa ttcccctata gtgagtcgta 60

tta 63

<210> 9

<211> 63

<212> DNA

<213> acs-down-5'

<400> 9

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttccgcttat gccacatatt 60

att 63

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> acs-down-3'

<400> 10

ccggagctcc cacatgctct acgctggtg 29

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> ID-acs-5'

<400> 11

ctggagaggc ggtgttatgg c 21

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> T7 启动子

<400> 12

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcc 44

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> ID-arcA-5'

<400> 13

gtcatgttac gccgatcatg 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> ID-ackA-5'

<400> 14

cataaaacgg atcgcataac gc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Kan-3'

<400> 15

ggtgagatga caggagatcc 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> ID-pRE112-5'

<400> 16

caaggcgaca aggtgctgat g 21

Claims (10)

1.一种合成乙酰辅酶A衍生产品的通用性底盘细胞，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA；并且过表达碳存储调节因子csrB和乙酰辅酶A合成酶基因acs。

2.根据权利要求1所述的通用性底盘细胞，其特征在于，以大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)为出发菌株。

3.一种权利要求1或2所述的通用性底盘细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)分别敲除大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA，获得突变菌株I；

2)将强启动子的序列插入步骤1)所得突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前，获得突变菌株II；其中：强启动子为T7启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

3)将强启动子的序列插入步骤2)所得突变菌株II的乙酰辅酶A合成酶acs基因序列前，获得底盘细胞；其中：强启动子为T7启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用P1噬菌体转导法分别敲除出发菌株大肠杆菌BL21(DE3)基因组上的全局调控因子arcA和乙酸激酶基因ackA，获得突变菌株I，命名为E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA；

2)以如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为引物，以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7-csrB同源臂；将T7-csrB同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112-T7-csrB；利用重组质粒pRE112-T7-csrB介导的同源重组法在步骤1)所得的突变菌株I的碳存储调节因子csrB基因序列前插入T7启动子的核苷酸序列，获得突变菌株II，命名为E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA T7-csrB；其中：T7启动子的核苷酸序列如SEQID NO.12所示；

3)以如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为引物，以T7启动子的核苷酸序列为搭桥序列，克隆获得T7-acs同源臂；将T7-acs同源臂连接至自杀质粒pRE112，获得重组质粒pRE112-T7-acs；利用重组质粒pRE112-T7-acs介导的同源重组法在步骤2)所得的突变菌株II的乙酰辅酶A合成酶acs基因序列前插入T7启动子序列，获得底盘细胞，命名为E.coli BL21(DE3)△arcA△ackA T7-csrB T7-acs；其中：T7启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。

5.权利要求1或2所述的通用性底盘细胞在生产乙酰辅酶A衍生产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；

2)将待生产的目标乙酰辅酶A衍生产品的重组质粒导入至步骤1)制备的感受态细胞中，获得待生产的乙酰辅酶A衍生产品的重组菌；

3)将步骤2)所得重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤3)是将步骤2)所得的重组菌按照1％(v/v)的接种量接种到培养基中，然后在37℃、180rpm的条件下培养至OD600达到0.6时，加入100μM异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养至发酵结束。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述乙酰辅酶A衍生产品为间苯三酚或3-羟基丙酸。

9.一种利用权利要求1或2所述的通用性底盘细胞发酵生产间苯三酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；

2)将重组质粒pET-phlD-mar和pA-accADBC导入至步骤1)制备的感受态细胞中，获得生产间苯三酚的重组菌；

3)将步骤2)所得生产间苯三酚的重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。

10.一种利用权利要求1或2所述的通用性底盘细胞发酵生产3-羟基丙酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)活化底盘细胞，将活化后的底盘细胞接种至无抗的LB培养基中，制备感受态细胞；

2)将重组质粒pMCR-N-C-N940V/K1106W/S1114R和pA-accADBC导入至步骤1)制备的感受态细胞中，获得生产3-羟基丙酸的重组菌；

3)将步骤2)所得生产3-羟基丙酸的重组菌接种到含抗生素的液体培养基中进行发酵培养。

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