CN110656073B - 一种生产黄嘌呤的重组菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种生产黄嘌呤的重组菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产黄嘌呤的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。该重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，分别敲除大肠杆菌基因组上的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，过表达D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF。同时，本发明还提供了该重组菌的制备方法及利用该重组菌的生产黄嘌呤的方法。本发明首次实现了重组菌中黄嘌呤的高效生物合成。该重组菌适用于发酵生产黄嘌呤。

Description

一种生产黄嘌呤的重组菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生产黄嘌呤的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
嘌呤碱基及其核苷类产品在医药和食品领域具有广泛的应用。这类产品能影响神经系统活动，产生心血管效应，可起到镇静、扩张血管、降血压等作用。开发研制具有抗肿瘤、抗病毒活性的核苷及其衍生物等新药已成为当今研究热点方向之一。此外，其还可用于生产各种功能性食品，包括抗寒食品、减肥食品等。黄嘌呤(xanthine)是一种广泛分布于人体及其他生物体的器官及体液内的一种嘌呤碱，常用作温和的兴奋剂和支气管扩张剂，特别用于治疗哮喘症状。咖啡因、茶碱及可可碱等常见的温和兴奋剂均由黄嘌呤衍生出来。黄嘌呤是嘌呤衍生物，很少在核酸的成分中发现。目前，黄嘌呤的合成方法主要为化学法合成，通过4-氨基-5-甲酰氨基脲嗪与甲酰胺在180-185℃反应而得。黄嘌呤的化学合成法需要在高温条件下进行，对设备的要求较高，影响了黄嘌呤的生产成本。因此，利用生物法合成黄嘌呤的研究逐渐受到关注。目前嘌呤类化合物的生产菌株主要利用诱变筛选技术获得，但往往耗时长、效率低、而且获得的菌株存在不稳定的缺陷。虽然细胞内嘌呤的生物合成路线早已探明，然而其合成路线较长、并受到细胞内的转录阻遏和转录衰减调控、酶的底物反馈抑制调控等，嘌呤主要用于合成细胞内的遗传物质，难以在细胞内积累。同时，现有的技术尚没有重组菌制备黄嘌呤的报道。大肠杆菌因其培养成本低、生长速度快、基因操作简便，是微生物合成领域的首选宿主之一。因此，通过对嘌呤合成途径的调控，利用代谢工程的方法建立高效的黄嘌呤生物合成技术具有重要的意义，将开拓生物法合成黄嘌呤的新领域。
发明内容
为实现利用生物法大量合成黄嘌呤，本发明提供了一种生产黄嘌呤的重组菌及其构建方法和应用，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种合成黄嘌呤的重组菌，该重组菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组上的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，过表达D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF。
优选地，所述D128A突变的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，以大肠杆菌W3110为出发菌株。
优选地，所述PRPP转酰胺酶基因purF和PRPP合成酶基因prs均来源于大肠杆菌(Escherichia coli)。
本发明提供了一种上述任一所述重组菌的构建方法，该方法包括如下步骤：
1)利用片段搭桥法分别克隆获得K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF(K326Q、P410W)，D128A突变的PRPP合成酶基因prs(D128A)
2)将步骤1)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF(K326Q、P410W)连接到质粒载体pACYCDuet-1，获得重组质粒I；
3)将步骤1)所得的D128A突变的PRPP合成酶基因prs(D128A)连接到重组质粒I上，获得重组质粒II；
4)以大肠杆菌W3110为出发菌株，敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，获得突变菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA；
5)将步骤3)所得的重组质粒II导入步骤4)所得突变菌株，获得重组菌。
优选地，所述的构建方法包括如下步骤：
1)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.3所示的K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF；以K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.2所示的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF；
2)将步骤1)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF连接到到质粒载体pACYCDuet-1，获得重组质粒pACYCDuet1-purF；
3)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游片段，以引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的下游片段，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13，利用片段搭桥法搭桥D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.1所示的D128A突变的PRPP合成酶基因prs；
4)将步骤3)所得的D128A突变PRPP合成酶基因prs连接到步骤2)所得的重组质粒，获得新的重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)；
5)利用P1噬菌体转导法分别敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，获得突变菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA；
6)将步骤4)所得的重组质粒导入步骤5)所得的突变菌株，获得重组菌W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA/pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)。
本发明还提供了一种上所述重组菌在发酵生产黄嘌呤及黄嘌呤衍生物中的应用。
优选地，所述应用是活化重组菌，将活化后的重组菌接种到含有氯霉素的LB液体培养基中进行发酵培养。
优选地，所述发酵培养是在培养温度为37℃、搅拌速度为300-700rpm、pH为6.5-7.5的条件下将重组菌培养至OD600为10-12，然后加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度100μM，利用质量分数50-70％的葡萄糖储液继续补料发酵96h后结束。
优选地，所述氯霉素在LB液体培养基中的浓度为50mg/L。
优选地，所述接种是将重组菌种子液按照接种量为2％-5％(v/v)接种到含有氯霉素的LB液体培养基中。
本发明中转录阻遏蛋白基因purR的Gene ID为945226；磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的Gene ID为948535；磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的Gene ID为946362；腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA的Gene ID为947334。
本发明中PRPP合成酶基因prs来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其Gene ID为945772。D128A突变的PRPP合成酶基因prs即PRPP合成酶基因prs中含有D128A突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。D128A即表示第128位的氨基酸D突变为A。
本发明中PRPP转酰胺酶基因purF来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其GeneID为946794。K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF即PRPP转酰胺酶基因purF中含有K326Q、P410W双突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。K326Q、P410W双突变即表示第326位的氨基酸K突变为Q，且第410位的氨基酸P突变为W。
本发明中重组质粒导入受体细胞的方法可以采用热激转化法。
本发明所述的P1噬菌体转导法是本领域基因敲除的常用技术之一，按照标准的操作方法操作即可。
本发明中所涉及的定义和缩写对照如下：
在本发明中使用下列的缩写或简称：
转录阻遏蛋白基因：purR
磷酸葡萄糖异构酶基因：pgi、
磷酸葡萄糖酸脱水酶基因：edd
腺苷酸琥珀酸合成酶基因：purA
GMP合成酶基因：guaA
PRPP合成酶基因：prs
PRPP转酰胺酶基因：purF
大肠杆菌(Escherichia coli)：E.coli
“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。
“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
本发明中重组菌在发酵生产黄嘌呤及其衍生产品中的应用均在本发明的保护范围之内。生物法合成黄嘌呤衍生产品只需要在此菌株上进行基因改造，化学法合成黄嘌呤衍生产品只需要以黄嘌呤为原料化学合成其衍生产品即可。
本发明有益效果：本发明以大肠杆菌这种模式菌株为宿主菌，通过转录阻遏调控、酶的反馈抑制调控、产物的合成调控、底物的积累调控等多方面、多层次对黄嘌呤的生物合成途径进行调控，首次实现了黄嘌呤的大量积累，为黄嘌呤及其衍生物的生物法合成奠定了基础。
本发明通过在大肠杆菌中敲除基因组上的转录阻遏蛋白(PurR)、磷酸葡萄糖异构酶(Pgi)磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)、腺苷酸琥珀酸合成酶(PurA)、GMP合成酶(GuaA)，过表达D128A突变的PRPP合成酶(Prs)和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶(PurF)。首次建立了工程大肠杆菌制备次黄嘌呤的高效生物合成技术。
现有技术中未发现重组菌制备黄嘌呤的报道，而本发明构建的重组菌首次实现了黄嘌呤的大量积累，可以实现黄嘌呤积累达到348mg/L。
附图说明
图1为合成黄嘌呤的代谢途径示意图。
图2为利用P1噬菌体转导法敲除基因的示意图。
图3为重组大肠杆菌发酵生产黄嘌呤的检测结果；
(A，为工程大肠杆菌随时间的发酵结果图；B，为发酵产物黄嘌呤的二级质谱图)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。
2)发酵生产培养基
发酵培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，20g/L glucose.
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50mg/L的氯霉素。
以下实验过程中所涉及的引物的核苷酸序列如表1所示：
表1本发明重组菌构建所用的引物的核苷酸序列
Figure BDA0001711830440000051
Figure BDA0001711830440000061
实施例1：重组菌的构建
一、基因的敲除(P1噬菌体转导法，原理如图2)
利用P1噬菌体转导法分别敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR(Gene ID:945226)、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi(Gene ID 948535)、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd(Gene ID:946362)、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA(Gene ID:948695)和GMP合成酶基因guaA(Gene ID 947334)。
转录阻遏蛋白基因purR的敲除按照如下方法进行：
1)噬菌体活化
10ml无菌的EP管中加入4ml加热融化的0.4％琼脂培养基，加入400μL过夜培养的供体菌株JW1650(该供体菌株JW1650来源于Keio Collection文库，可以通过商业途径购买，Keio collection文库构建方法如“Baba T,et al.Construction of Escherichiacoli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.MolecularSystems Biology 2006,2(1):1-11”)，加入10μL存储的噬菌体原液，将溶液混匀后倒于LB无抗平板上，37℃湿润环境下培养，直至出现不规则噬菌斑。
2)噬菌体裂解文库的收集
刮取平板上所有半固体培养基至10ml无菌EP管，加入3ml LB液体培养基，同时加入400μL氯仿，震荡后离心收集上清至另一无菌EP管，同时加入400μL氯仿，此溶液即为供体菌JW1650的裂解文库。
3)转导
过夜培养受体菌E.coli W3110，将步骤2)制备的JW1650供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌E.coli W3110混合后进行转导，涂布抗性平板，过夜培养至生长出单克隆后，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR的突变菌株W3110△purR。
磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的敲除按照如下方法进行：
大肠杆菌W3110基因组的磷酸葡萄糖异构酶基因pgi(Gene ID:948535)的敲除是利用P1噬菌体转导法。P1噬菌体转导法敲除pgi基因的操作流程参考转录阻遏蛋白基因purR的敲除操作流程。不同之处为：步骤1)噬菌体活化的供体菌株为来源于KeioCollection文库的JW3985，步骤2)收集获得供体菌JW3985裂解文库，步骤3)转导是将步骤2)制备的JW3985供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌W3110△purR混合后进行转导，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.16进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的突变菌株W3110△purR△pgi。
磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的敲除按照如下方法进行：
大肠杆菌W3110基因组的磷酸葡萄糖酸脱水酶基因：(edd)(Gene ID:946362)的敲除是利用P1噬菌体转导法。P1噬菌体转导法敲除edd基因的操作流程参考转录阻遏蛋白基因purR的敲除操作流程。不同之处为：步骤1)噬菌体活化的供体菌株为来源于KeioCollection文库的JW1840，步骤2)收集获得JW1840供体菌裂解文库，步骤3)转导是将步骤2)制备的JW1840供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌W3110△purR△pgi混合后进行转导，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.17进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的突变菌株W3110△purR△pgi△edd。
腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的敲除按照如下方法进行：
大肠杆菌W3110基因组的腺苷酸琥珀酸合成酶基因：(purA)(Gene ID:948695)的敲除是利用P1噬菌体转导法。P1噬菌体转导法敲除purA基因的操作流程参考转录阻遏蛋白基因purR的敲除操作流程。不同之处为：步骤1)噬菌体活化的供体菌株为来源于KeioCollection文库的JW4135，步骤2)收集获得JW4135供体菌裂解文库，步骤3)转导是将步骤2)制备的JW4135供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌W3110△purR△pgi△edd混合后进行转导，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.18进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的突变菌株W3110△purR△pgi△edd△purA。
GMP合成酶基因guaA的敲除按照如下方法进行：
大肠杆菌W3110基因组的GMP合成酶基因：(guaA)(Gene ID:947334)的敲除是利用P1噬菌体转导法。P1噬菌体转导法敲除guaA基因的操作流程参考转录阻遏蛋白基因purR的敲除操作流程。不同之处为：步骤1)噬菌体活化的供体菌株为来源于Keio Collection文库的JW2491，步骤2)收集获得JW2491供体菌裂解文库，步骤3)转导是将步骤2)制备的JW2491供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌W3110△purR△pgi△edd△purA混合后进行转导，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.19进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA、GMP合成酶基因guaA的突变菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA。
二、重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)的构建过程
1)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.3所示的K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF；以K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.2所示的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF；
2)步骤1)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF(K326Q、P410W)与载体pACYCDuet-1经SacI、HindIIII双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段purF(K326Q、P410W)和载体pACYCDuet-1，再利用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet1-purF(K326Q、P410W)；
3)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游片段，以引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的下游片段，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13，利用片段搭桥法搭桥D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.1所示的D128A突变的PRPP合成酶基因prs；
4)步骤3)所得的D128A突变的PRPP合成酶基因prs(D128A)与步骤2)所得重组质粒pACYCDuet1-purF(K326Q、P410W)经BamHI、SacI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段prs(D128A)和载体pACYCDuet1-purF(K326Q、P410W)，再利用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)；
三、重组菌株构建
按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备突变菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA感受态，将重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)通过热激法转化至突变菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA感受态细胞，得到重组菌株，编号为ZG-2960。
实施例2重组菌株的发酵试验
1)将重组菌株ZG-2960接种至LB液体培养基，37℃、180rpm条件下振荡过夜培养。
2)将步骤1)的过夜培养物按照1:100的比例接种到含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中(内含50mg/L的氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养4h，作为种子液。
3)将步骤2)的种子液按照培养基体积的2％接种量接种至发酵罐中，培养温度为37℃，搅拌速度为300-700rpm，20％溶氧与转速关联，利用氨水和10％硫酸自动调节pH约7.0，重组细胞培养至OD600为8，然后加入诱导剂IPTG至终浓度100μM，利用质量分数60％的葡萄糖储液继续补料发酵96h后结束。
4)发酵过程中定期吸取发酵液进行LC-MS检测，黄嘌呤在发酵过程中不断积累，至发酵96h结束后，黄嘌呤积累达到348mg/L(图3)。
本发明通过对黄嘌呤合成途径的调控，首次实现了黄嘌呤的大量积累，具有创新性。
本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 一种生产黄嘌呤的重组菌及其构建方法和应用
<130> 1
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 948
<212> DNA
<213> D128A突变的PRPP合成酶基因prs
<400> 1
gtgcctgata tgaagctttt tgctggtaac gccaccccgg aactagcaca acgtattgcc 60
aaccgcctgt acacttcact cggcgacgcc gctgtaggtc gctttagcga tggcgaagtc 120
agcgtacaaa ttaatgaaaa tgtacgcggt ggtgatattt tcatcatcca gtccacttgt 180
gcccctacta acgacaacct gatggaatta gtcgttatgg ttgatgccct gcgtcgtgct 240
tccgcaggtc gtatcaccgc tgttatcccc tactttggct atgcgcgcca ggaccgtcgc 300
gtccgttccg ctcgtgtacc aatcactgcg aaagtggttg cagacttcct ctccagcgtc 360
ggtgttgacc gtgtgctgac agtggcgctg cacgctgaac agattcaggg tttcttcgac 420
gttccggttg ataacgtatt tggtagcccg atcctgctgg aagacatgct gcagctgaat 480
ctggataacc caattgtggt ttctccggac atcggcggcg ttgtgcgtgc ccgcgctatc 540
gctaagctgc tgaacgatac cgatatggca atcatcgaca aacgtcgtcc gcgtgcgaac 600
gtttcacagg tgatgcatat catcggtgac gttgcaggtc gtgactgcgt actggtcgat 660
gatatgatcg acactggcgg tacgctgtgt aaagctgctg aagctctgaa agaacgtggt 720
gctaaacgtg tatttgcgta cgcgactcac ccgatcttct ctggcaacgc ggcgaacaac 780
ctgcgtaact ctgtaattga tgaagtcgtt gtctgcgata ccattccgct gagcgatgaa 840
atcaaatcac tgccgaacgt gcgtactctg accctgtcag gtatgctggc cgaagcgatt 900
cgtcgtatca gcaacgaaga atcgatctct gccatgttcg aacactaa 948
<210> 2
<211> 1518
<212> DNA
<213> K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF
<400> 2
atgtgcggta ttgtcggtat cgccggtgtt atgccggtta accagtcgat ttatgatgcc 60
ttaacggtgc ttcagcatcg cggtcaggat gccgccggca tcatcaccat agatgccaat 120
aactgcttcc gtttgcgtaa agcgaacggg ctggtgagcg atgtatttga agctcgccat 180
atgcagcgtt tgcagggcaa tatgggcatt ggtcatgtgc gttaccccac ggctggcagc 240
tccagcgcct ctgaagcgca gccgttttac gttaactccc cgtatggcat tacgcttgcc 300
cacaacggca atctgaccaa cgctcacgag ttgcgtaaaa aactgtttga agaaaaacgc 360
cgccacatca acaccacttc cgactcggaa attctgctta atatcttcgc cagcgagctg 420
gacaacttcc gccactaccc gctggaagcc gacaatattt tcgctgccat tgctgccaca 480
aaccgcttaa tccgcggcgc gtatgcctgt gtggcgatga ttatcggcca cggtatggtt 540
gctttccgcg atccaaacgg gattcgtccg ctggtactgg gaaaacgtga tattgacgag 600
aaccgtacag aatatatggt cgcttccgaa agcgtagcgc tcgatacgct gggctttgat 660
ttcctgcgtg acgtcgcgcc gggcgaagcg atttacatca ctgaagaagg gcagttgttt 720
acccgtcaat gtgctgacaa tccggtcagc aatccgtgcc tgtttgagta tgtatacttt 780
gcccgcccgg actcgtttat cgacaaaatt tccgtttaca gcgcgcgtgt gaatatgggc 840
acgaaactgg gcgagaaaat tgcccgcgaa tgggaagatc tggatatcga cgtggtgatc 900
ccgatcccag aaacctcgtg tgatatcgcg ctggaaattg ctcgtattct gggcaaaccg 960
taccgccagg gcttcgttca gaaccgctat gttggccgca cctttatcat gccgggccag 1020
cagctgcgtc gtaagtccgt gcgccgtaaa ctgaatgcca accgcgccga gttccgcgat 1080
aaaaacgtcc tgctggtcga cgactccatc gtccgtggca ccacttctga gcagattatc 1140
gagatggcac gcgaagccgg agcgaagaaa gtgtacctcg cttctgcggc accggaaatt 1200
cgcttcccga acgtttatgg tattgatatg tggagcgcca cggaactgat cgctcacggt 1260
cgcgaagttg atgaaattcg ccagatcatc ggtgctgacg ggttgatttt ccaggatctg 1320
aacgatctga tcgacgccgt tcgcgctgaa aatccggata tccagcagtt tgaatgctcg 1380
gtgttcaacg gcgtctacgt caccaaagat gttgatcagg gctacctcga tttcctcgat 1440
acgttacgta atgatgacgc caaagcagtg caacgtcaga acgaagtgga aaatctcgaa 1500
atgcataacg aaggatga 1518
<210> 3
<211> 1518
<212> DNA
<213> K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF
<400> 3
atgtgcggta ttgtcggtat cgccggtgtt atgccggtta accagtcgat ttatgatgcc 60
ttaacggtgc ttcagcatcg cggtcaggat gccgccggca tcatcaccat agatgccaat 120
aactgcttcc gtttgcgtaa agcgaacggg ctggtgagcg atgtatttga agctcgccat 180
atgcagcgtt tgcagggcaa tatgggcatt ggtcatgtgc gttaccccac ggctggcagc 240
tccagcgcct ctgaagcgca gccgttttac gttaactccc cgtatggcat tacgcttgcc 300
cacaacggca atctgaccaa cgctcacgag ttgcgtaaaa aactgtttga agaaaaacgc 360
cgccacatca acaccacttc cgactcggaa attctgctta atatcttcgc cagcgagctg 420
gacaacttcc gccactaccc gctggaagcc gacaatattt tcgctgccat tgctgccaca 480
aaccgcttaa tccgcggcgc gtatgcctgt gtggcgatga ttatcggcca cggtatggtt 540
gctttccgcg atccaaacgg gattcgtccg ctggtactgg gaaaacgtga tattgacgag 600
aaccgtacag aatatatggt cgcttccgaa agcgtagcgc tcgatacgct gggctttgat 660
ttcctgcgtg acgtcgcgcc gggcgaagcg atttacatca ctgaagaagg gcagttgttt 720
acccgtcaat gtgctgacaa tccggtcagc aatccgtgcc tgtttgagta tgtatacttt 780
gcccgcccgg actcgtttat cgacaaaatt tccgtttaca gcgcgcgtgt gaatatgggc 840
acgaaactgg gcgagaaaat tgcccgcgaa tgggaagatc tggatatcga cgtggtgatc 900
ccgatcccag aaacctcgtg tgatatcgcg ctggaaattg ctcgtattct gggcaaaccg 960
taccgccagg gcttcgttca gaaccgctat gttggccgca cctttatcat gccgggccag 1020
cagctgcgtc gtaagtccgt gcgccgtaaa ctgaatgcca accgcgccga gttccgcgat 1080
aaaaacgtcc tgctggtcga cgactccatc gtccgtggca ccacttctga gcagattatc 1140
gagatggcac gcgaagccgg agcgaagaaa gtgtacctcg cttctgcggc accggaaatt 1200
cgcttcccga acgtttatgg tattgatatg ccgagcgcca cggaactgat cgctcacggt 1260
cgcgaagttg atgaaattcg ccagatcatc ggtgctgacg ggttgatttt ccaggatctg 1320
aacgatctga tcgacgccgt tcgcgctgaa aatccggata tccagcagtt tgaatgctcg 1380
gtgttcaacg gcgtctacgt caccaaagat gttgatcagg gctacctcga tttcctcgat 1440
acgttacgta atgatgacgc caaagcagtg caacgtcaga acgaagtgga aaatctcgaa 1500
atgcataacg aaggatga 1518
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> purF-up-5'
<400> 4
ccggagctcc tttacacttt aagcttttta tgtttatgtt gtgtggaatt gagcaaatca 60
cagctgatcc 70
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> purF-down-3'
<400> 5
ccgaagcttc gcagaacctg taataagcg 29
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> purF-up(K326Q)-3'
<400> 6
aacgaagccc tggcggtacg 20
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> purF-down(K326Q)-5'
<400> 7
cgtaccgcca gggcttcgtt cagaaccgct atgttggccg ca 42
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> purF-up(P410W)-3'
<400> 8
catatcaata ccataaacgt 20
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> purF-down(P410W)-5'
<400> 9
acgtttatgg tattgatatg tggagcgcca cggaactgat cgc 43
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> prs(D128A)-up-5'
<400> 10
ccgggatccg ccattgcaca gagccatgct 30
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> prs(D128A)-up-3'
<400> 11
ccactgtcag cacacggtca 20
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> prs(D128A)-down-5'
<400> 12
tgaccgtgtg ctgacagtgg cgctgcacgc tgaacagatt ca 42
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> prs(D128A)-down-3'
<400> 13
ccggagctcc cagcaagcgt cgatcagag 29
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Kan-3'
<400> 14
ggtgagatga caggagatcc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> ID-purR-5'
<400> 15
tccacgctta cactatttgc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> ID-pgi-5'
<400> 16
tcagctaata aatgcttcac 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> ID-edd-5'
<400> 17
atgatcttgc gcagattgta g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> ID-purA-5'
<400> 18
gtaactctga aaaagcgatg g 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> ID-guaA-5'
<400> 19
gtgaccatta ctaaagagtc 20

Claims (10)

1.一种合成黄嘌呤的重组菌，其特征在于，该重组菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除大肠杆菌基因组上的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，过表达D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述D128A突变的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌W3110为出发菌株。
4.一种权利要求1-3任一所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)利用片段搭桥法分别克隆获得K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF，D128A突变的PRPP合成酶基因prs；
2)将步骤1)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF连接到质粒载体pACYCDuet-1，获得重组质粒I；
3)将步骤1)所得的D128A突变的PRPP合成酶基因prs连接到重组质粒I上，获得重组质粒II；
4)以大肠杆菌W3110为出发菌株，敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，获得突变菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA；
5)将步骤3)所得的重组质粒II导入步骤4)所得突变菌株，获得重组菌。
5.权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.3所示的K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF；以K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.2所示的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF；
2)将步骤1)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF连接到质粒载体pACYCDuet-1，获得重组质粒pACYCDuet1-purF；
3)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游片段，以引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的下游片段，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13，利用片段搭桥法搭桥D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.1所示的D128A突变的PRPP合成酶基因prs；
4)将步骤3)所得的D128A突变PRPP合成酶基因prs连接到步骤2)所得的重组质粒，获得新的重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)；
5)利用P1噬菌体转导法分别敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖异构酶基因pgi、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和GMP合成酶基因guaA，获得突变菌株W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA；
6)将步骤4)所得的重组质粒导入步骤5)所得的突变菌株，获得重组菌W3110△purR△pgi△edd△purA△guaA/pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)。
6.权利要求1-3任一所述重组菌在生产黄嘌呤中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，活化重组菌，将活化后的重组菌接种到含有氯霉素的LB液体培养基中进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述发酵培养是在培养温度为37℃、搅拌速度为300-700rpm、pH值为6.5-7.5的条件下将重组菌培养至OD600为10-12，然后加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度100μM，利用质量分数50-70％的葡萄糖储液继续补料发酵96h后结束。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述氯霉素在LB液体培养基中的浓度为50mg/L。
10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述接种是将重组菌种子液按照接种量为2％-5％(v/v)接种到含有氯霉素的LB液体培养基中。
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