CN110656074B - 一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。该重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，分别敲除大肠杆菌基因组上的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，并且过表达D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF。同时，本发明还提供了该重组菌的制备方法及利用该重组菌的生产次黄嘌呤的方法。本发明首次实现了工程大肠杆菌中次黄嘌呤的高效生物合成。该重组菌适用于发酵生产次黄嘌呤。

Description

一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

嘌呤是一类重要的生命活性物质，参与细胞体内遗传信息物质的合成。嘌呤生物合成过程的中间代谢物对于细胞生命过程的遗传物质传递、信号运输和能量代谢等方面起到重要作用。另外，嘌呤及其衍生类化合物在医药领域也具有广泛的应用，例如疾病的诊断和治疗以及生命科学等研究领域，进而引发了人们对合成嘌呤及衍生物的浓厚兴趣。目前，以嘌呤为骨架的衍生物已广泛应用于药物研究，例如嘌呤类化合物可诱导干扰素释放，可作为促肾上腺皮质激素受体的配体，或者是腺苷受体激动剂拮抗剂，还可通过抑制多种功能性酶类发挥生物学功能。嘌呤类化合物在抗肿瘤药物的研究中也有较长的历史，例如早期的巯基嘌呤类药物，后来发现了奈拉滨、氟达拉滨、克罗拉滨等嘌呤类核苷药物用于癌症的治疗。

目前嘌呤类化合物的生产菌株主要利用诱变筛选技术获得，但往往耗时长、效率低、而且获得的菌株存在不稳定的缺陷。近年来，随着菌株代谢调控机理和生理生化方法的研究、利用代谢工程技术获得嘌呤化合物的合成菌株引起了研究人员的关注。虽然细胞内嘌呤的生物合成路线早已探明，然而其合成路线较长、并受到细胞内多层次、不同水平的严密调控，自然状态下难以实现嘌呤的积累。目前研究人员仅在棒状杆菌中(Corynebacterium glutamicum)实现了次黄嘌呤的微摩尔水平合成，难以满足嘌呤化合物大量生物合成的需求。大肠杆菌因其培养成本低、生长速度快、基因操作简便，是微生物合成领域的首选宿主之一，然而目前暂无工程大肠杆菌制备次黄嘌呤的报道。因此，通过对嘌呤合成途径的调控，利用代谢工程技术建立高效合成嘌呤的工程大肠杆菌具有重要的科研和应用价值。

发明内容

为实现利用生物法大量合成次黄嘌呤，本发明提供了一种合成次黄嘌呤的工程大肠杆菌、该菌株的制备方法以及利用该工程大肠杆菌生产次黄嘌呤的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种合成次黄嘌呤的重组菌，该重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，分别敲除大肠杆菌基因组上的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，并且过表达D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF。

优选地，所述转录阻遏蛋白基因purR的Gene ID为945226；所述磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的Gene ID为946362；所述腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的Gene ID为948695；所述次黄苷酸脱氢酶基因guaB的Gene ID为946985；所述D128A突变的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，以大肠杆菌W3110为出发菌株。

本发明还提供了一种上述任一所述重组菌的构建方法，包括如下步骤：

1)以大肠杆菌W3110为出发菌株，分别敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，获得突变菌株W3110△purR△edd△purA△guaB；所述转录阻遏蛋白基因purR的Gene ID 为945226；所述磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的Gene ID为946362；所述腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的Gene ID为948695；所述次黄苷酸脱氢酶基因guaB的Gene ID为946985；

2)利用片段搭桥法分别克隆获得D128A突变的PRPP合成酶基因prs(D128A)，和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF(K326Q、P410W)；所述D128A突变的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)将步骤2)所得的PRPP转酰胺酶基因purF(K326Q、P410W)连接到质粒载体，获得重组质粒I；

4)将步骤2)所得的PRPP合成酶基因prs(D128A)连接到重组质粒I上，获得重组质粒II；

5)将步骤4)所得的重组质粒II导入步骤1)所得突变菌株，获得重组菌。

优选地，步骤3)所述质粒载体为质粒pACYCDuet-1。

优选地，所述方法包括如下步骤：

1)利用P1噬菌体转导法分别敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，获得突变菌株W3110△purR△edd△purA△guaB；所述转录阻遏蛋白基因purR的GeneID为945226；所述磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的Gene ID为946362；所述腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的Gene ID为948695；所述次黄苷酸脱氢酶基因guaB的Gene ID为946985；

2)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.3所示的K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF；以K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.2所示的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF；

3)将步骤2)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF(K326Q、P410W)连接到到质粒载体pACYCDuet-1，获得重组质粒pACYCDuet1-purF(K326Q、P410W)；

4)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游片段，以引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的下游片段，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13，利用片段搭桥法搭桥D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.1所示的D128A突变的PRPP合成酶基因prs；

5)将步骤4)所得的PRPP合成酶基因prs(D128A)连接到步骤3)所得的重组质粒pACYCDuet1-purF(K326Q、P410W)，获得重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)；

6)将步骤5)所得的重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)导入步骤1)所得的受体细胞W3110△purR△edd△purA△guaB，获得重组菌。

本发明中重组质粒导入受体细胞的方法可以采用热激转化法。

本发明还提供了上述任一所述的重组菌在生产次黄嘌呤及生产次黄嘌呤衍生物中的应用。

优选地，所述应用是活化重组菌，将活化后的重组菌接种到含有氯霉素的LB液体培养基中进行发酵培养。

更优选地，所述发酵培养是在培养温度为37℃、搅拌速度为400-800rpm、pH值为6.5-7.5的条件下将重组菌培养至OD600为8-12，然后加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度100μM，利用质量分数为50-80％的葡萄糖储液继续补料发酵96h后结束。

优选地，所述氯霉素在LB液体培养基中的浓度为50mg/L。

优选地，所述接种是将重组菌种子液按照接种量为2％-5％(v/v)接种到含有氯霉素的LB液体培养基中。

本发明所述转录阻遏蛋白基因purR的Gene ID为945226；所述磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的Gene ID为946362；所述腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的Gene ID为948695；所述次黄苷酸脱氢酶基因guaB的Gene ID为946985。

本发明中PRPP合成酶基因prs来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其Gene ID为945772。D128A突变的PRPP合成酶基因prs即PRPP合成酶基因prs中含有D128A突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。D128A即表示第128位的氨基酸D突变为A。

本发明中PRPP转酰胺酶基因purF来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，其GeneID为946794。K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF即PRPP转酰胺酶基因purF中含有K326Q、P410W双突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。K326Q、P410W双突变即表示第326位的氨基酸K突变为Q，且第410位的氨基酸P突变为W。

本发明所述的P1噬菌体转导法是本领域基因敲除的常用技术之一，按照标准的操作方法操作即可。

本发明中所涉及的定义和缩写对照如下：

转录阻遏蛋白基因：purR

磷酸葡萄糖酸脱水酶基因：edd

腺苷酸琥珀酸合成酶基因：purA

次黄苷酸脱氢酶基因：guaB

PRPP合成酶基因：prs

PRPP转酰胺酶基因：purF

大肠杆菌(Escherichia coli)：E.coli

本发明中“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。

本发明中“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

本发明中重组菌在发酵生产次黄嘌呤及其衍生产品中的应用在本发明的保护范围之内。

本发明有益效果：

本发明对次黄嘌呤生物合成途径进行了改造，构建了一种可以实现次黄嘌呤的大量积累的工程菌株，具体是通过在大肠杆菌中敲除基因组上的转录阻遏蛋白(PurR)、磷酸葡萄糖酸脱水酶(Edd)、腺苷酸琥珀酸合成酶(PurA)、次黄苷酸脱氢酶(GuaB)，过表达D128A突变的PRPP合成酶(Prs)和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶(PurF)。

本发明以大肠杆菌这种模式菌株为宿主菌，通过调控嘌呤的生物合成途径，经代谢工程技术建立了生产次黄嘌呤的重组菌，首次建立了工程大肠杆菌制备次黄嘌呤的高效生物合成技术，弥补了工程大肠杆菌制备次黄嘌呤的空白。为次黄嘌呤及其衍生物的高效生物合成提供了新的技术方法。

现有技术中次黄嘌呤仅仅在棒状杆菌中实现了微摩尔水平的合成，大肠杆菌中次黄嘌呤的合成未见报道，本发明构建的重组大肠杆菌可以实现次黄嘌呤积累达到796mg/L(换算为5.85mM/L)。

附图说明

图1为重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)的质粒图谱。

图2为重组菌Q2955的摇瓶发酵检测结果；

(A为Q2955发酵产物的LC-MS检测结果，B为次黄嘌呤的二级质谱图)。

图3为重组菌Q2955的5L-发酵罐检测结果。

图4为利用P1噬菌体转导法敲除基因的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，

20min灭菌。

2)发酵生产培养基

发酵培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，20g/L glucose.

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50mg/L的氯霉素。

以下实验过程中所涉及的引物的核苷酸序列如表1所示。

表1本发明重组菌构建所用的引物的核苷酸序列

实施例1：重组菌的构建

一、基因的敲除(P1噬菌体转导法，原理如图4所示)

转录阻遏蛋白基因purR的敲除按照如下方法进行：

大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR(Gene ID:945226)的敲除是利用P1噬菌体转导法，利用P1噬菌体侵染Keio Collection文库的供体菌株JW1650，制备供体菌株裂解文库，利用JW1650的裂解文库转导受体菌株大肠杆菌W3110，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR的突变菌株W3110△purR；

1)噬菌体活化

10ml无菌的EP管中加入4ml加热融化的0.4％琼脂培养基，加入400μL过夜培养的供体菌株JW1650(该供体菌株来源于Keio Collection文库，可以通过商业途径购买，KeioCollection文库构建方法如“Baba T,et al.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular SystemsBiology 2006,2(1):1-11”)，加入10μL存储的噬菌体原液，将溶液混匀后倒于LB无抗平板上，37℃湿润环境下培养，直至出现不规则噬菌斑。

2)噬菌体裂解文库的收集

刮取平板上所有半固体培养基至10ml无菌EP管，加入3ml LB液体培养基，同时加入400μL氯仿，震荡后离心收集上清至另一无菌EP管，同时加入400μL氯仿，此溶液即为JW1650供体菌裂解文库。

3)转导

过夜培养受体菌E.coli W3110，将步骤2)制备的JW1650供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌E.coli W3110混合后进行转导，涂布抗性平板，过夜培养至生长出单克隆后，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR的突变菌株W3110△purR。

磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的敲除按照如下方法进行：

大肠杆菌W3110基因组的磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd(Gene ID:946362)的敲除是利用P1噬菌体转导法。P1噬菌体转导法敲除edd基因的操作流程参考转录阻遏蛋白基因purR的敲除操作流程。不同之处为：步骤1)噬菌体活化的供体菌株为来源于KeioCollection文库的JW1840，步骤2)收集获得JW1840供体菌裂解文库，步骤3)转导是将步骤2)制备的JW1840供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌W3110△purR混合后进行转导，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.16进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd的突变菌株W3110△purR△edd。

腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的敲除按照如下方法进行：

大肠杆菌W3110基因组的腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA(Gene ID:948695)的敲除是利用P1噬菌体转导法。P1噬菌体转导法敲除purA基因的操作流程参考转录阻遏蛋白基因purR的敲除操作流程。不同之处为：步骤1)噬菌体活化的供体菌株为来源于KeioCollection文库的JW4135，步骤2)收集获得JW4135供体菌裂解文库，步骤3)转导是将步骤2)制备的JW4135供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌W3110△purR△edd混合后进行转导，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.17进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA的突变菌株W3110△purR△edd△purA。

次黄苷酸脱氢酶基因guaB的敲除按照如下方法进行：

大肠杆菌W3110基因组的次黄苷酸脱氢酶基因guaB(Gene ID:946985)的敲除是利用P1噬菌体转导法。P1噬菌体转导法敲除guaB基因的操作流程参考转录阻遏蛋白基因purR的敲除操作流程。不同之处为：步骤1)噬菌体活化的供体菌株为来源于Keio Collection文库的JW5401，步骤2)收集获得JW5401供体菌裂解文库，步骤3)转导是将步骤2)制备的JW5401供体菌裂解文库以不同浓度与受体菌W3110△purR△edd△purA混合后进行转导，以引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.18进行阳性克隆的验证，获得敲除转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA、次黄苷酸脱氢酶基因guaB的突变菌株W3110△purR△edd△purA△guaB。

二、重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)的构建过程

1)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，利用片段搭桥法以引物SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5搭桥K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.3所示的K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF；以K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，利用片段搭桥法以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5搭桥P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.2所示的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF；

2)步骤1)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF(K326Q、P410W)与载体pACYCDuet-1经SacI、HindIIII双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段purF(K326Q、P410W)和载体pACYCDuet-1，再利用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet1-purF(K326Q、P410W)；

3)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游片段，以引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的下游片段，利用片段搭桥法以引物SEQ ID NO.10和SEQID NO.13搭桥D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.1所示的D128A突变的PRPP合成酶基因prs；

4)步骤3)所得的D128A突变的PRPP合成酶基因prs(D128A)与步骤2)所得重组质粒pACYCDuet1-purF(K326Q、P410W)经BamHI、SacI双酶切后，利用回收试剂盒回收酶切后目的片段prs(D128A)和载体pACYCDuet1-purF(K326Q、P410W)，再利用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)；

三、重组菌株构建

按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备突变菌株W3110△purR△edd△purA△guaB感受态，将重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)通过热激法转化至突变菌株W3110△purR△edd△purA△guaB感受态细胞，得到重组菌株，编号为Q2955。

实施例2重组菌株的摇瓶发酵试验

本实施例共进行二组实验，以说明本发明所能够获得的效果，具体实验方法如下：

对照组：野生菌株E.coli W3110，

实验组：重组菌株Q2955，

1)将活化后的野生菌株E.coli W3110及重组菌株Q2955按1:100的比例接种到含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中(内含50mg/L的氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，加入100μM IPTG诱导表达，诱导后置于30℃、180rpm继续培养96h至发酵结束。

2)取1mL发酵液，4℃，12000rpm离心10min，取上清，0.22μm滤膜过滤后，利用LC-MS检测发酵产物。

3)LC-MS检测结果(图2)证明，野生菌株未检测到次黄嘌呤，而实验组得到了产物次黄嘌呤。在250mL摇瓶发酵水平，工程菌株Q2955的次黄嘌呤产量为72mg/L，且二级质谱特征峰与标准品完全一致。由此表明，在不含本发明的次黄嘌呤合成途径的代谢改造，野生菌株无法天然积累次黄嘌呤。因此，本发明提供了一种高效合成次黄嘌呤的重组菌。

实施例3重组菌株的发酵罐实验

1)将重组菌株Q2955接种至3mL的液体LB培养基，37℃、180rpm条件下振荡过夜培养，作为一级种子液。

2)将活化培养的一级种子液按照1:100的比例接种到含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中(内含50mg/L的氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养4h，作为二级种子液。

3)二级种子液按照培养基体积的2％接种量接种至发酵罐中，培养温度为37℃，搅拌速度为400-800rpm，20％溶氧与转速关联，利用氨水和10％硫酸自动调节pH约7.0，重组细胞培养至OD600为10，然后加入诱导剂IPTG至终浓度100μM，利用质量分数60％的葡萄糖储液继续补料发酵96后结束。

4)发酵过程中定期取1mL发酵液，4℃，12000rpm离心10min，取上清，0.22μm滤膜过滤后，利用LC-MS检测发酵产物。

5)发酵产物经LC-MS检测得知，发酵过程中次黄嘌呤不断积累(图3)，发酵至96h，次黄嘌呤积累达到796mg/L，本发明首次在工程大肠杆菌中实现了次黄嘌呤的大量积累。

本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种合成次黄嘌呤的重组菌及其构建方法与应用

<130> 1

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 948

<212> DNA

<213> D128A突变的PRPP合成酶基因prs

<400> 1

gtgcctgata tgaagctttt tgctggtaac gccaccccgg aactagcaca acgtattgcc 60

aaccgcctgt acacttcact cggcgacgcc gctgtaggtc gctttagcga tggcgaagtc 120

agcgtacaaa ttaatgaaaa tgtacgcggt ggtgatattt tcatcatcca gtccacttgt 180

gcccctacta acgacaacct gatggaatta gtcgttatgg ttgatgccct gcgtcgtgct 240

tccgcaggtc gtatcaccgc tgttatcccc tactttggct atgcgcgcca ggaccgtcgc 300

gtccgttccg ctcgtgtacc aatcactgcg aaagtggttg cagacttcct ctccagcgtc 360

ggtgttgacc gtgtgctgac agtggcgctg cacgctgaac agattcaggg tttcttcgac 420

gttccggttg ataacgtatt tggtagcccg atcctgctgg aagacatgct gcagctgaat 480

ctggataacc caattgtggt ttctccggac atcggcggcg ttgtgcgtgc ccgcgctatc 540

gctaagctgc tgaacgatac cgatatggca atcatcgaca aacgtcgtcc gcgtgcgaac 600

gtttcacagg tgatgcatat catcggtgac gttgcaggtc gtgactgcgt actggtcgat 660

gatatgatcg acactggcgg tacgctgtgt aaagctgctg aagctctgaa agaacgtggt 720

gctaaacgtg tatttgcgta cgcgactcac ccgatcttct ctggcaacgc ggcgaacaac 780

ctgcgtaact ctgtaattga tgaagtcgtt gtctgcgata ccattccgct gagcgatgaa 840

atcaaatcac tgccgaacgt gcgtactctg accctgtcag gtatgctggc cgaagcgatt 900

cgtcgtatca gcaacgaaga atcgatctct gccatgttcg aacactaa 948

<210> 2

<211> 1518

<212> DNA

<213> K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF

<400> 2

atgtgcggta ttgtcggtat cgccggtgtt atgccggtta accagtcgat ttatgatgcc 60

ttaacggtgc ttcagcatcg cggtcaggat gccgccggca tcatcaccat agatgccaat 120

aactgcttcc gtttgcgtaa agcgaacggg ctggtgagcg atgtatttga agctcgccat 180

atgcagcgtt tgcagggcaa tatgggcatt ggtcatgtgc gttaccccac ggctggcagc 240

tccagcgcct ctgaagcgca gccgttttac gttaactccc cgtatggcat tacgcttgcc 300

cacaacggca atctgaccaa cgctcacgag ttgcgtaaaa aactgtttga agaaaaacgc 360

cgccacatca acaccacttc cgactcggaa attctgctta atatcttcgc cagcgagctg 420

gacaacttcc gccactaccc gctggaagcc gacaatattt tcgctgccat tgctgccaca 480

aaccgcttaa tccgcggcgc gtatgcctgt gtggcgatga ttatcggcca cggtatggtt 540

gctttccgcg atccaaacgg gattcgtccg ctggtactgg gaaaacgtga tattgacgag 600

aaccgtacag aatatatggt cgcttccgaa agcgtagcgc tcgatacgct gggctttgat 660

ttcctgcgtg acgtcgcgcc gggcgaagcg atttacatca ctgaagaagg gcagttgttt 720

acccgtcaat gtgctgacaa tccggtcagc aatccgtgcc tgtttgagta tgtatacttt 780

gcccgcccgg actcgtttat cgacaaaatt tccgtttaca gcgcgcgtgt gaatatgggc 840

acgaaactgg gcgagaaaat tgcccgcgaa tgggaagatc tggatatcga cgtggtgatc 900

ccgatcccag aaacctcgtg tgatatcgcg ctggaaattg ctcgtattct gggcaaaccg 960

taccgccagg gcttcgttca gaaccgctat gttggccgca cctttatcat gccgggccag 1020

cagctgcgtc gtaagtccgt gcgccgtaaa ctgaatgcca accgcgccga gttccgcgat 1080

aaaaacgtcc tgctggtcga cgactccatc gtccgtggca ccacttctga gcagattatc 1140

gagatggcac gcgaagccgg agcgaagaaa gtgtacctcg cttctgcggc accggaaatt 1200

cgcttcccga acgtttatgg tattgatatg tggagcgcca cggaactgat cgctcacggt 1260

cgcgaagttg atgaaattcg ccagatcatc ggtgctgacg ggttgatttt ccaggatctg 1320

aacgatctga tcgacgccgt tcgcgctgaa aatccggata tccagcagtt tgaatgctcg 1380

gtgttcaacg gcgtctacgt caccaaagat gttgatcagg gctacctcga tttcctcgat 1440

acgttacgta atgatgacgc caaagcagtg caacgtcaga acgaagtgga aaatctcgaa 1500

atgcataacg aaggatga 1518

<210> 3

<211> 1518

<212> DNA

<213> K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF

<400> 3

atgtgcggta ttgtcggtat cgccggtgtt atgccggtta accagtcgat ttatgatgcc 60

ttaacggtgc ttcagcatcg cggtcaggat gccgccggca tcatcaccat agatgccaat 120

aactgcttcc gtttgcgtaa agcgaacggg ctggtgagcg atgtatttga agctcgccat 180

atgcagcgtt tgcagggcaa tatgggcatt ggtcatgtgc gttaccccac ggctggcagc 240

tccagcgcct ctgaagcgca gccgttttac gttaactccc cgtatggcat tacgcttgcc 300

cacaacggca atctgaccaa cgctcacgag ttgcgtaaaa aactgtttga agaaaaacgc 360

cgccacatca acaccacttc cgactcggaa attctgctta atatcttcgc cagcgagctg 420

gacaacttcc gccactaccc gctggaagcc gacaatattt tcgctgccat tgctgccaca 480

aaccgcttaa tccgcggcgc gtatgcctgt gtggcgatga ttatcggcca cggtatggtt 540

gctttccgcg atccaaacgg gattcgtccg ctggtactgg gaaaacgtga tattgacgag 600

aaccgtacag aatatatggt cgcttccgaa agcgtagcgc tcgatacgct gggctttgat 660

ttcctgcgtg acgtcgcgcc gggcgaagcg atttacatca ctgaagaagg gcagttgttt 720

acccgtcaat gtgctgacaa tccggtcagc aatccgtgcc tgtttgagta tgtatacttt 780

gcccgcccgg actcgtttat cgacaaaatt tccgtttaca gcgcgcgtgt gaatatgggc 840

acgaaactgg gcgagaaaat tgcccgcgaa tgggaagatc tggatatcga cgtggtgatc 900

ccgatcccag aaacctcgtg tgatatcgcg ctggaaattg ctcgtattct gggcaaaccg 960

taccgccagg gcttcgttca gaaccgctat gttggccgca cctttatcat gccgggccag 1020

cagctgcgtc gtaagtccgt gcgccgtaaa ctgaatgcca accgcgccga gttccgcgat 1080

aaaaacgtcc tgctggtcga cgactccatc gtccgtggca ccacttctga gcagattatc 1140

gagatggcac gcgaagccgg agcgaagaaa gtgtacctcg cttctgcggc accggaaatt 1200

cgcttcccga acgtttatgg tattgatatg ccgagcgcca cggaactgat cgctcacggt 1260

cgcgaagttg atgaaattcg ccagatcatc ggtgctgacg ggttgatttt ccaggatctg 1320

aacgatctga tcgacgccgt tcgcgctgaa aatccggata tccagcagtt tgaatgctcg 1380

gtgttcaacg gcgtctacgt caccaaagat gttgatcagg gctacctcga tttcctcgat 1440

acgttacgta atgatgacgc caaagcagtg caacgtcaga acgaagtgga aaatctcgaa 1500

atgcataacg aaggatga 1518

<210> 4

<211> 70

<212> DNA

<213> purF-up-5'

<400> 4

ccggagctcc tttacacttt aagcttttta tgtttatgtt gtgtggaatt gagcaaatca 60

cagctgatcc 70

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> purF-down-3'

<400> 5

ccgaagcttc gcagaacctg taataagcg 29

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> purF-up(K326Q)-3'

<400> 6

aacgaagccc tggcggtacg 20

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> purF-down(K326Q)-5'

<400> 7

cgtaccgcca gggcttcgtt cagaaccgct atgttggccg ca 42

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> purF-up(P410W)-3'

<400> 8

catatcaata ccataaacgt 20

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> purF-down(P410W)-5'

<400> 9

acgtttatgg tattgatatg tggagcgcca cggaactgat cgc 43

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> prs(D128A)-up-5'

<400> 10

ccgggatccg ccattgcaca gagccatgct 30

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> prs(D128A)-up-3'

<400> 11

ccactgtcag cacacggtca 20

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> prs(D128A)-down-5'

<400> 12

tgaccgtgtg ctgacagtgg cgctgcacgc tgaacagatt ca 42

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> prs(D128A)-down-3'

<400> 13

ccggagctcc cagcaagcgt cgatcagag 29

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Kan-3'

<400> 14

ggtgagatga caggagatcc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> ID-purR-5'

<400> 15

tccacgctta cactatttgc 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> ID-edd-5'

<400> 16

atgatcttgc gcagattgta g 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> ID-purA-5'

<400> 17

gtaactctga aaaagcgatg g 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> ID-guaB-5'

<400> 18

gcaggttatt cagtcgatag 20

Claims (10)

1.一种合成次黄嘌呤的重组菌，其特征在于，该重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，分别敲除大肠杆菌基因组上的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，并且过表达D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述转录阻遏蛋白基因purR在 NCBI中的Gene ID为945226；所述磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd在 NCBI中的Gene ID为946362；所述腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA在 NCBI中的Gene ID为948695；所述次黄苷酸脱氢酶基因guaB在 NCBI中的Gene ID为946985；所述D128A突变的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌W3110为出发菌株。

4.一种权利要求1-3任一所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以大肠杆菌W3110为出发菌株，分别敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，获得突变菌株W3110△purR△edd△purA△guaB；

2)利用片段搭桥法分别克隆获得D128A突变的PRPP合成酶基因prs和K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶purF；所述D128A突变的PRPP合成酶基因prs的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

3)将步骤2)所得的PRPP转酰胺酶基因purF连接到质粒载体，获得重组质粒I；

4)将步骤2)所得的PRPP合成酶基因prs连接到重组质粒I上，获得重组质粒II；

5)将步骤4)所得的重组质粒II导入步骤1)所得突变菌株，获得重组菌。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)利用P1噬菌体转导法分别敲除大肠杆菌W3110基因组的转录阻遏蛋白基因purR、磷酸葡萄糖酸脱水酶基因edd、腺苷酸琥珀酸合成酶基因purA和次黄苷酸脱氢酶基因guaB，获得突变菌株W3110△purR△edd△purA△guaB；

2)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7克隆K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.3所示的K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF；以K326Q突变的PRPP转酰胺酶基因purF为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游片段，以引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.9克隆P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的下游片段，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，利用片段搭桥法搭桥P410W突变的PRPP转酰胺酶基因purF的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.2所示的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF；

3)将步骤2)所得的K326Q、P410W双突变的PRPP转酰胺酶基因purF连接到质粒载体pACYCDuet-1，获得重组质粒pACYCDuet1-purF；

4)以大肠杆菌的基因组DNA为模板，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游片段，以引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13克隆D128A突变的PRPP合成酶基因prs的下游片段，以引物SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.13，利用片段搭桥法搭桥D128A突变的PRPP合成酶基因prs的上游和下游片段，获得如SEQ ID NO.1所示的D128A突变的PRPP合成酶基因prs；

5)将步骤4)所得的PRPP合成酶基因prs连接到步骤3)所得的重组质粒pACYCDuet1-purF，获得重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)；

6)将步骤5)所得的重组质粒pACYCDuet1-prs(D128A)-purF(K326Q、P410W)导入步骤1)所得的受体细胞W3110△purR△edd△purA△guaB，获得重组菌。

6.权利要求1-3任一所述的重组菌在生产次黄嘌呤及生产次黄嘌呤衍生物中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，活化重组菌，将活化后的重组菌接种到含有氯霉素的LB液体培养基中进行发酵培养。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述发酵培养是在培养温度为37℃、搅拌速度为400-800rpm、pH值为6.5-7.5的条件下将重组菌培养至OD600为8-12，然后加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度100μM，利用质量分数为50-80％的葡萄糖储液继续补料发酵96h后结束。

9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述氯霉素在LB液体培养基中的浓度为50mg/L。

10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述接种是将重组菌种子液按照接种量为2％-5％(v/v)接种到含有氯霉素的LB液体培养基中。

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