CN113583929A - 发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法与应用。本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法与应用。所述产嘌呤核苷的重组菌相比于出发菌具有突变的嘌呤操纵子调控区、失活的醛糖转移酶、增强的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶活性和弱化的6‑磷酸葡萄糖异构酶。本发明提供的重组菌肌苷产量显著提高。本发明开辟了新的提高嘌呤核苷的发酵产量的方法，从而在实践上可用于细菌发酵生产肌苷、鸟苷和腺苷。

Description

发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，特别涉及发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法与应用。
背景技术
嘌呤核苷(purine nucleoside)由嘌呤和核苷组成，包括腺嘌呤核苷(腺苷)、鸟嘌呤核苷(鸟苷)、次黄嘌呤核苷(肌苷)和黄嘌呤核苷(黄苷)。嘌呤核苷是生物体内重要的代谢产物，具有重要的生理功能，参与核酸合成、能量提供、氨基酸合成等许多重要的细胞代谢过程，在维持细胞的生理代谢功能中发挥着重要作用，可以作为辅酶类药、抗病毒药和食品增鲜剂等，在医疗、食品和保健等领域中具有非常广泛的应用价值。
嘌呤核苷的生产方法主要为微生物发酵法。目前，国内外发酵生产嘌呤核苷的菌种为传统诱变育种获得。近年来，随着分子生物学技术的快速发展和大规模的基因组测序，利用基因工程技术有目的的改造代谢网络和调控体系，从头构建遗传背景清楚的基因工程菌已经成为国际上微生物遗传育种的研究热点。微生物核苷代谢途径显示，嘌呤核苷经戊糖磷酸途径(PPP)和嘌呤合成途径而从头合成，其载流途径为戊糖磷酸途径。首先，葡萄糖经糖酵解途径第一步反应生成6-磷酸葡萄糖，再经过PPP途径的5步酶促反应生成核苷合成的前体物磷酸核糖焦磷酸(PRPP)。然后，PRPP经过嘌呤合成途径的10步酶促反应生成嘌呤核苷合成的前体物肌苷酸(IMP)。最后，IMP分别经过嘌呤核苷各自的终端代谢途径再合成鸟苷、肌苷、腺苷和黄苷。
围绕嘌呤核苷的代谢途径，国内外研究者对嘌呤核苷工程菌株开展了初步的研究工作。在大肠杆菌中，Matsui等对purF、purA、deoD、purR、add和gsk基因进行敲除，最终构建的工程菌株可以积累1.22g/L的肌苷和0.06g/L的鸟苷(Matsui H et al.，gsk DisruptionLeads to Guanosine Accumulation in Escherichia coli.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65(5)：1230-1235)2010年，Asahara等在枯草芽孢杆菌168中失活了purA、guaB、punA和deoD，破坏了嘌呤操纵子阻遏蛋白编码基因purR和5’-非翻译区，最后对嘌呤操纵子的启动子进行增强，工程菌株的肌苷产量达到6g/L(Asahara T，et al.，Accumulation of Gene-Targeted Bacillus subtilis Mutations that EnhanceFermentative Inosine Production.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87(6)：2195-2207)。以长期诱变筛选得到的腺苷生产菌枯草芽孢杆菌XGL为出发菌，刘玥等通过增强嘌呤合成途径中purF基因及其下游基因purMNHD的表达水平，使腺苷产量达到7.4g/L(刘玥等.枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的修饰对腺苷积累的影响.微生物学报，2014，54(6)：641-647)。为获得遗传背景清楚的肌苷基因工程菌，2011年本研究组以枯草芽孢杆菌W168为出发菌株，通过敲除肌苷支路代谢的purA基因、阻断肌苷降解途径的deoD基因从头构建了肌苷工程菌，500mL摇瓶的肌苷产量达到了7.6g/L(Li H，et al.，De NovoEngineering and Metabolic Flux Analysis of Inosine Biosynthesis in Bacillussubtilis.Biotechnology Letters，2011，33(8)：1575-1580)。2012年，杨慧林等对解淀粉芽孢杆菌的磷酸转移酶系统进行了研究，发现ptsG基因缺陷株的鸟苷产量为19.98g/L，比野生型菌株提高了约24％。ptsHI基因缺陷株的鸟苷产量为2.94g/L，比野生型菌株降低了约82％(杨慧林等，解淀粉芽孢杆菌ptsGHI基因的敲除及缺陷株生长特性.华南理工大学学报(自然科学版)，2012，40(8)：15)。2012年，Zakataeva等通过对PRPP合成酶基因prs进行点突变，解除了ADP和GDP对PRPP合成酶的反馈抑制，并增强了该酶对Pi的敏感度，提高了肌苷和鸟苷产量(Zakataeva N P，et al..Wild-Type and Feedback-ResistantPhosphoribosyl Pyrophosphate Synthetases from Bacillus Amyloliquefaciens：Purification，Characterization，and Application to Increase Purine NucleosideProduction.Applied Microbiology and Biotechnology，2012，93(5)：2023-2033)。在核苷外排转运系统方面，Sheremet等通过过表达自身及来自大肠杆菌中的鸟苷外排基因pbuE和nepI，使解淀粉芽孢杆菌AJ1991的嘌呤核苷产量得到提高(Sheremet A S，et al.，Enhancement of Extracellular Purine Nucleoside Accumulation by BacillusStrains through Genetic Modifications of Genes Involved in NucleosideExport.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，2011，38(1)：65-70.)。2019年，Li等在枯草芽孢杆菌A509中敲除guaA，腺苷产量从7.40g/L提高到10.45g/L，进一步通过发酵优化使腺苷产量提高到14.39g/L(Li B et al.，Increased FermentativeAdenosine Production by Gene-targeted Bacillus subtilis Mutation.Journal ofBiotechnology，2019，298：1-4)。
虽然国内外研究者开展了嘌呤核苷的代谢工程研究，大多集中于敲除或过表达单个或少数基因，只局限在产物合成相关途径基因的局部改造却并未从系统全局考虑。然而，由于嘌呤核苷合成的载流途径为戊糖磷酸途径，并非菌体胞内碳代谢的主流，代谢流分析其载流量不到整个代谢流量的25％。采用传统的代谢工程改造难以实现其代谢流量的显著提高，从而导致嘌呤核苷基因工程菌的遗传改造效果不明显。其次，核苷类物质的合成在胞内受到严谨而复杂的调控，这也是影响核苷类物质高效积累的重要原因之一。因此，已有研究不能整体理解生物体功能和表型，导致对目标微生物代谢网络缺乏全局调控和工程改造策略，具有一定的盲目性，往往不能达到预期的代谢通量改变的效果。
因此，提供发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法，以及利用重组菌生产肌苷的方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法，以及利用重组菌生产肌苷的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了重组菌株，包括突变的嘌呤操纵子调控区、失活或弱化的醛糖转移酶、增强的6-磷酸葡萄糖脱氢酶或弱化的6-磷酸葡萄糖异构酶中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述嘌呤操纵子调控区具有：
(1)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
和/或
所述醛糖转移酶具有：
(I)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
和/或
(i)、具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；和/或
(ii)、如(i)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；和/或
(iii)、与(i)或(ii)所述氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列；
和/或
所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶具有：
(A)、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(B)、如(A)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(A)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(C)、与(A)或(B)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
和/或
(a)、具有如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；和/或
(b)、如(a)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(a)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；和/或
(c)、与(a)或(b)所述氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列；
和/或
所述6-磷酸葡萄糖异构酶具有：
<1>、如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
<2>、如<1>所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与<1>所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
<3>、与<1>或<2>所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
和/或
①、具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；和/或
②、如①所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与①所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；和/或
③、与①或②所述氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述突变的嘌呤操纵子调控区通过如下任意方式实现：
(1)、替换嘌呤操纵子的启动子区域；或
(2)、对嘌呤操纵子的启动子区域进行突变；和/或
所述失活或弱化的醛糖转移酶通过如下任意方式实现：
(I)、全部或部分缺失醛糖转移酶编码基因；或
(II)、对醛糖转移酶编码基因进行点突变；或
(III)、将醛糖转移酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件；和/或
所述增强的6-磷酸葡萄糖脱氢酶通过如下任意方式实现：
(i)、在染色体上整合一个或一个以上的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因；或
(ii)、将6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的启动子区表达调控元件替换为具有更强活性的元件；和/或
所述弱化的6-磷酸葡萄糖异构酶通过如下任意方式实现：
(A)、全部或部分缺失6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因；或
(B)、对6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因进行点突变；或
(C)、将6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件。
在本发明的一些具体实施方案中，出发菌株是能够累积肌苷、鸟苷、腺苷和/或黄苷的菌株。
在本发明的一些具体实施方案中，所述出发菌株包括磷酸戊糖变位酶降低的细菌。
在本发明的一些具体实施方案中，所述细菌选自芽孢杆菌属和/或短杆菌属的细菌，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，更优选为B.subtilis W168。
本发明提供了所述重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
突变嘌呤操纵子调控区；
弱化或失活醛糖转移酶；
增强6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性；
弱化6-磷酸葡萄糖异构酶；
得到所述重组菌。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的构建方法中：
所述突变嘌呤操纵子调控区通过如下任意方式实现：
(1)、替换嘌呤操纵子的启动子区域；或
(2)、对嘌呤操纵子的启动子区域进行突变；和/或
所述失活或弱化醛糖转移酶通过如下任意方式实现：
(I)、全部或部分缺失醛糖转移酶编码基因；或
(II)、对醛糖转移酶编码基因进行点突变；或
(III)、将醛糖转移酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件；和/或
所述增强6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性通过如下任意方式实现：
(i)、在染色体上整合一个或一个以上的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因；或
(ii)、将6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的启动子区表达调控元件替换为具有更强活性的元件；和/或
所述弱化6-磷酸葡萄糖异构酶通过如下任意方式实现：
(A)、全部或部分缺失6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因；或
(B)、对6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因进行点突变；或
(c)、将6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件。
本发明还提供了所述的重组菌株或所述的构建方法获得的重组菌株在生产嘌呤核苷中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述嘌呤核苷包括肌苷、鸟苷或腺苷中的一种或多种。
本发明还提供了生产嘌呤核苷的方法，经所述的重组菌株或所述的构建方法获得的重组菌株，发酵，获得嘌呤核苷。
本发明还提供了混合菌株，其特征在于，包括所述的重组菌株或所述的构建方法获得的重组菌株，以及任意菌株。在本发明中，任意菌株与本发明提供的重组菌株的组合均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
本发明还提供了所述混合菌株在生产嘌呤核苷中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述嘌呤核苷包括肌苷、鸟苷或腺苷中的一种或多种。
本发明以枯草芽孢杆菌基因组代谢网络模型为基础，运用局部搜索启发式算法(GDLS)分析预测最佳的敲除靶点，并进一步运用最小开关调整算法(ROOM)对预测的靶点进行分析筛选，预测出了有利于嘌呤核苷积累的改造靶点磷酸戊糖变位酶drm、嘌呤操纵子pur operon、醛糖转移酶.ywjH、6-磷酸葡萄糖脱氢酶zwf和6-磷酸葡萄糖异构酶编码pgi，首次提出与验证了有利于嘌呤核苷合成的新的改造策略。在已有的研究基础上构建了嘌呤核苷通用底盘菌，肌苷工程菌株的产苷能力达到25g/L以上，证明了基因组代谢网络模型在嘌呤代谢工程改造中的实用性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示关联性分析IMP代谢流和菌株生长之间的关系图；
图2示替换嘌呤操纵子Ppur的质粒酶切鉴定电泳图；
图3示醛糖转移酶缺失菌的PCR鉴定电泳图；
图4示6-磷酸葡萄糖脱氢酶整合菌的PCR鉴定电泳图；
图5示6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因敲除菌的PCR鉴定；
图6示6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因条件性表达菌的PCR鉴定图；
图7示腺苷酸琥珀酸合成酶purA基因回补菌的PCR鉴定；
图8示工程菌IR-13在不同木糖浓度下的生长曲线图。
具体实施方式
本发明公开了发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的一方面提供一种发酵生产嘌呤核苷的重组菌，所述重组菌相比于出发菌(CN201510977763.6)具有突变的嘌呤操纵子调控区、失活的醛糖转移酶、增强的6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性和弱化的6-磷酸葡萄糖异构酶。
其中，所述出发菌可以是对细菌进行遗传改造，也可以是缺失其编码腺苷酸琥珀酸合成酶的purA基因或/和弱化或失活其编码磷酸戊糖变位酶drm基因而获得的能够积累嘌呤核苷的菌株，也可以是通过对细菌进行诱变处理获得的能够积累嘌呤核苷的菌株。
所述细菌优选为芽孢杆菌属或短杆菌属的细菌，更优选为枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌168或W168。
所述嘌呤操纵子调控序列为序列表SEQ ID NO：1所示。
所述醛糖转移酶的编码基因序列为序列表SEQ ID NO：2所示。
所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性磷酸戊糖变位酶的编码基因序列为序列表SEQ IDNO：3所示。
所述6-磷酸葡萄糖异构酶的编码基因序列为序列表SEQ ID NO：4所示。
本发明的另一方面，提供一种嘌呤核苷重组菌的构建方法。包括如下步骤：(1)突变的嘌呤操纵子调控区；
(2)失活或弱化醛糖转移酶；
(3)过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性；
(4)弱化的6-磷酸葡萄糖异构酶。
所述增强嘌呤操纵子，可以通过如下步骤实现：
(1)替换嘌呤操纵子的启动子区域；
(2)对嘌呤操纵子的启动子区域进行突变。
所述失活或弱化醛糖转移酶，可以通过如下步骤实现：
(1)全部或部分缺失醛糖转移酶编码基因；
(2)对醛糖转移酶编码基因进行点突变；
(3)将醛糖转移酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件。
所述过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性，可以通过如下步骤实现：
(1)在染色体上整合一个或一个以上的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因；
(2)将6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的启动子区表达调控元件替换为具有更强活性的元件。
所述弱化的6-磷酸葡萄糖异构酶，可以通过如下步骤实现：
(1)全部或部分缺失6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因；
(2)对6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因进行点突变；
(3)将6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件。
本发明所用的染色体基因敲除、整合和替换的方法是采用枯草芽孢杆菌无痕遗传操作的通用型载体pWYE486，通过携带改造靶基因的同源臂，发生同源重组实现的。也可以采用其它基因编辑技术进行染色体突变。
本发明所述的生产嘌呤核苷的重组菌，发酵结束时的嘌呤核苷产量为0.1～100g/L，一般地，腺苷产量可达0.1g/L以上，鸟苷产量可达1g/L以上，肌苷产量可达10g/L以上。
综上所述，本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高嘌呤核苷的发酵产量的改造靶点并构建了相应的工程菌，观察到了可以显著提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产嘌呤核苷，便于推广应用。
本发明提供的发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法与应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
本发明所涉及序列如下所示：
SEQ ID No.1
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)PPUR
AACACGAACATTAGTAGAATGAATTTTTGTATCGTTCGATAATATCGTTGACATTATCCATGTCCGTTGTTAAGATAAACATGAAATCAAAACACGACCTCATATAATCTTGGGAATATGGCCCATAAGTTTCTACCCGGCAACCGTAAATTGCCGGACTATGCAGGAAAGTGATCGATAAAACTGACATGGATATATCGCAGAAGCGAACGACTGACGATACATGTACCATGCCCGGTTTGTATTGCTTCCTCATAAGTGCAATGCAGAGCGGGTATTTTTTATTTTCTGAAAACAAAAGCATTAGAAGGTGGGGAACAGA
SEQ ID No.2
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)YWJH
ATGTTATTCTTTGTTGATACAGCCAATATCGATGAAATTAGAGAAGCGAATGAATTAGGAATTCTCGCCGGTGTAACGACGAATCCTAGTTTAGTAGCAAAGGAAGCTAACGTATCATTCCACGACCGTCTTCGCGAGATCACAGACGTCGTGAAAGGGTCTGTAAGCGCAGAGGTTATTTCTTTGAAAGCTGAGGAAATGATCGAGGAAGGAAAAGAACTGGCGAAGATCGCTCCGAACATTACGGTGAAAATCCCAATGACGTCTGACGGTTTAAAAGCGGTAAGAGCACTTACTGACTTAGGCATCAAAACAAACGTTACATTGATCTTCAATGCCAACCAGGCGCTTCTTGCTGCCAGAGCGGGGGCAACATATGTATCTCCATTCCTGGGACGTTTAGATGACATCGGCCACAACGGGCTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAGATTTTTGACATTCACGGCCTTGACACGCAAATCATTGCAGCGTCAATCCGCCATCCGCAGCACGTGACAGAAGCTGCTCTTAGAGGGGCTCATATCGGCACAATGCCGCTGAAAGTCATTCATGCGCTCACTAAACACCCGTTAACAGACAAAGGAATCGAACAATTCCTGGCAGACTGGAACAAATAA
SEQ ID No.3
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)ZWF
GTGAAAACAAACCAACAACCAAAAGCAGTAATTGTCATATTCGGTGCAACTGGAGATTTAGCAAAACGAAAATTGTATCCGTCTATTCACCGTTTATATCAAAACGGACAAATCGGAGAAGAGTTTGCAGTGGTAGGAGTTGGAAGAAGACCTTGGTCTAATGAGGATCTTCGCCAAACTGTTAAAACATCCATTTCCTCATCTGCAGATAAGCATATAGATGATTTCACGTCTCATTTTTACTATCACCCGTTTGACGTGACAAACCCTGGTTCTTATCAAGAGCTAAACGTATTGCTTAACCAGCTGGAAGATACATATCAAATTCCTAACAACAGAATGTTCTACTTGGCAATGGCTCCTGAATTCTTCGGAACGATTGCAAAAACATTAAAATCAGAGGGTGTAACAGCTACAACCGGCTGGTCCCGCCTTGTCATCGAAAAACCGTTCGGCCATGATCTGCCAAGCGCACAGGCATTGAATAAAGAAATCCGCGAAGCATTTACGGAAGATCAAATTTACAGAATCGACCATTATCTAGGCAAACAAATGGTTCAGAACATTGAAGTGATTCGATTTGCCAATGCGATTTTCGAACCGCTTTGGACAAACCGCTACATTTCAAACATTCAAATCACATCTAGCGAATCACTAGGCGTTGAAGACCGCGCAAGATATTACGAAAAATCAGGCGCCCTTCGCGACATGGTGCAAAACCATATTATGCAGATGGTTGCCCTTCTTGCAATGGAGCCGCCTATCAAATTGAACACAGAAGAAATCCGCAGCGAGAAAGTGAAGGTGCTGAGAGCACTGCGTCCTATTGCAAAAGACGAAGTGGATGAATACTTTGTGCGCGGACAATATCATGCTGGTGAAATTGACGGTGTACCGGTTCCTGCTTATACAGATGAAGATAATGTCGCTCCTGACTCCAATACAGAAACCTTTGTTGCCGGCAAGCTCTTGATCGACAACTTCAGATGGGCTGGTGTTCCATTCTACATCAGAACCGGAAAACGAATGAAAGAAAAGTCCACAAAAATTGTCGTTCAATTTAAGGACATTCCGATGAACCTGTACTACGGTAATGAAAACAACATGAATCCGAACTTGCTTGTCATTCATATTCAGCCTGACGAAGGCATTACGCTTTACTTAAATGCTAAAAAGCTTGGCGGAGCAGCACACGCACAGCCAATCAAACTCGATTATTGCAGCAATTGCAATGACGAGTTGAACACCCCTGAAGCATATGA典AAACTAATTCACGACTGTCTTCTTGGCGATGCAACAAACTTTGCACACTGGGATGAAGTTGCCCTTTCTTGGAGCTTTGTCGACTCTATTTCTGAAACATGGGCAGCAAACAAAACCTTATCTCCTAACTACGAATCAGGCTCAATGGGACCGAAAGAATCTGATGATCTTTTGGTGAAAGACGGCTTACACTGGTGGAACATATAA
SEQ ID No.4
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)PGI
ATGACGCATGTACGCTTTGACTACTCAAAAGCGTTGACTTTCTTCAACGAACATGAACTTACATACCTGCGGGACTTTGTAAAAACAGCACACCATAATATCCATGAGAAAACAGGCGCGGGCAGCGATTTTCTAGGCTGGGTGGACCTCCCTGAACATTATGATAAAGAAGAATTCGCGCGCATCAAAAAAAGCGCGGAAAAAATCAAATCTGACTCTGATGTCTTGCTTGTTGTCGGCATCGGCGGTTCTTATCTTGGAGCGCGGGCAGCGATTGAAGCGCTGAATCACGCGTTTTATAACACTTTGCCAAAAGCAAAACGCGGCAATCCGCAAGTCATTTTTATCGGGAACAACATCAGTTCATCTTATATGAGAGACGTCATGGATCTTCTTGAAGATGTTGACTTCTCTATTAATGTGATTTCTAAATCAGGTACGACAACTGAACCTGCAATCGCTTTCCGTATTTTCCGCAAGCTTCTTGAAGAGAAATACGGTAAAGAAGAAGCGAAAGCGCGGATTTATGCAACAACTGATAAAGAGCGCGGCGCATTAAAAACGCTTTCTAACGAAGAAGGCTTTGAATCATTCGTAATTCCTGACGATGTCGGCGGCCGTTATTCAGTTTTAACAGCTGTAGGTCTCTTGCCGATTGCTGTCAGCGGCGTCAACATTGACGACATGATGAAAGGCGCCCTGGATGCGAGCAAAGATTTTGCAACATCTGAACTGGAAGATAACCCAGCATACCAATATGCGGTTGTTCGCAATGTCCTTTATAATAAGGGCAAAACAATTGAAATGCTCATCAACTACGAACCGGCGCTTCAATACTTTGCGGAATGGTGGAAGCAGCTGTTCGGAGAAAGCGAAGGGAAAGATGAGAAGGGCATTTATCCTTCTTCAGCGAACTATTCAACAGACCTTCATTCTTTAGGCCAGTATGTACAAGAAGGCCGCAGAGATTTATTCGAAACGGTCCTGAACGTAGAGAAGCCTAAACATGAACTGACAATTGAGGAAGCGGATAACGATCTTGACGGCTTGAACTATTTAGCCGGTAAAACTGTTGATTTCGTTAACAAAAAAGCATTCCAAGGTACAATGCTTGCCCATACAGACGGAAATGTTCCGAAC
TTAATCGTTAACATTCCTGAGCTGAATGCATATACTTTTGGATACCTTGTATATTTCTTCGAAAAAGCCTGCGCGATGAGCGGTTACCTCCTTGGCGTCAATCCGTTTGACCAGCCTGGTGTAGAAGCGTATAAAGTCAATATGTTTGCGTTACTCGGCAAACCTGGCTTTGAAGAGAAAAAAGCAGAGCTTGAAAAACGTCTGGAAGATTAA
SEQ ID No.5
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)YWJH
MLFFVDTANIDEIREANELGILAGVTTNPSLVAKEANVSFHDRLREITDVVKGSVSAEVISLKAEEMIEEGKELAKIAPNITVKIPMTSDGLKAVRALTDLGIKTNVTLIFNANQALLAARAGATYVSPFLGRLDDIGHNGLDLISEVKQIFDIHGLDTQIIAASIRHPQHVTEAALRGAHIGTMPLKVIHALTKHPLTDKGIEQFLADWNK
SEQ ID No.6
枯草芽孢杆菌(BAcILLUSSUBTILIS)ZWF
MKTNQQPKAVIVIFGATGDLAKRKLYPSIHRLYQNGQIGEEFAVVGVGRRPWSNEDLRQTVKTSISSSADKHIDDFTSHFYYHPFDVTNPGSYQELNVLLNQLEDTYQIPNNRMFYLAMAPEFFGTIAKTLKSEGVTATTGWSRLVIEKPFGHDLPSAQALNKEIREAFTEDQIYRIDHYLGKQMVQNIEVIRFANAIFEPLWTNRYISNIQITSSESLGVEDRARYYEKSGALRD MVQNHIMQMVALLAMEPPIKLNTEEIRSEKVKVLRALRPIAKDEVDEYFVRGQYHAGEIDGVPVPAYTDEDNVAPDSNTETFVAGKLLIDNFRWAGVPFYIRTGKRMKEKSTKIVVQFKDIPMNLYYGNENNMNPNLLVIHIQPDEGITLYLNAKKLGGAAHAQPIKLDYCSNCNDELNTPEAYEKLIHDCLLGDATNFAHWDEVALSWSFVDSISETWAANKTLSPNYESGSMGPKESDDLLVKDGLHWWNI
SEQ ID No.7
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)PGI
MTHVRFDYSKALTFFNEHELTYLRDFVKTAHHNIHEKTGAGSDFLGWVDLPEHYDKEEFARIKKSAEKIKSDSDVLLVVGIGGSYLGARAAIEALNHAFYNTLPKAKRGNPQVIFIGNNISSSYMRDVMDLLEDVDFSINVISKSGTTTEPAIAFRIFRKLLEEKYGKEEAKARIYATTDKERGALKTLSNEEGFESFVIPDDVGGRYSVLTAVGLLPIAVSGVNIDDMMKGALDASKDFATSELEDNPAYQYAVVRNVLYNKGKTIEMLINYEPALQYFAEWWKQLFGESEGKDEKGIYPSSANYSTDLHSLGQYVOEGRRDLFETVLNVEKPKHELTIEEADNDLDGLNYLAGKTVDFVNKKAFQGTMLAHTDGNVPNLIVNIPELNAYTFGYLVYFFEKACAMSGYLLGVNPFDQPGVEAYKVNMFALLGKPGFEEKKAELEKRLED
SEQ ID No.8
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)P43
TGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAATACAGCCATTGAACATACGGTTGATTTAATAACTGACAAACATCACCCTCTTGCTAAAGCGGCCAAGGACGCTGCCGCCGGGGCTGTTTGCGTTTTTGCCGTGATTTCGTGTATCATTGGTTTACTTATTTTTTTGCCAAAGCTGTAATGGCTGAAAATTCTTACATTTATTTTACATTTTTAGAAATGGGCGTGAAAAAAAGCGCGCGATTATGTAAAATATAAAGTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACAC
SEQ ID No.9
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)PVEG
CAGTTGAAAACCTGCATAGGAGAGCTATGCGGGTTTTTTATTTTACATAATGATACATAATTTACCGAAACTTGCGGAACATAATTGAGGAATCATAGAATTTTGTCAAAATAATTTTATTGACAACGTCTTATTAACGTTGATATAATTTAAATTTTATTTGACAAAAATGGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTAGTATTAGAAGGTGGGGAACAGA
SEQ ID No.10
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)PCTC
TAATTCAACAATTAAAGAGCTTGTTGTGACAAACAGCATCAAGCTTCCTGAAGAAAAGAAAATTGAACGCTTTAAGCAGCTTTCAGTCGGACCGCTTCTGGCCGAAGCGATTATTCGCGTTCATGAGCAGCAATCAGTCAGCTATCTGTTCAGCTAAACCATTTTTCGAGGTTTAAATCCTTATCGTTATGGGTATTGTTTGTAATAGGACAACTAAAACGACATTAGAAGGTGGGGAACAGA
SEQ ID No.11
枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)PGSIB
CAGAAAGCAGACGGACACCGCGATCCGCCTGCTTTTTTTAGTGGAAACATACCCAATGTGTTTTGTTTGTTTAAAAGAATTGTGAGCGGGAATACAACAACCAACACCAATTATTAGAAGGTGGGGAACAGA
SEQ ID No.12
PXYL
ATAAACTTGTTCACTTAAATCAAAGGGGGAAATGACAAATGGTCCAAACTAGTGATATCTAAAAATCAAAGGGGGAAATG
SEQ ID No.13
XYLR
ATGAATCAAAAATTAATATTAGATGAAATTTTGAAGAACTCCCCTGTCTCCAGGGCAACTCTCTCTGAGATTACAGGATTAAACAAGTCTACTGTCTCCTCTCAAGTAAATACACTGCTTGAAAAAGATTTTATTTTTGAAATTGGGGCAGGGCAATCTAGAGGCGGCAGAAGACCTGTAATGCTTGTTTTTAATAAGAATGCAGGCTACTCGATTGGTATTGATATAGGAGTCGACTATCTTAACGGAATTCTAACCGACTTAGAAGGAAATATTATTCTCGAGAAGACTTCTGACTTGTCTAGTTCTTCCGCTAGTGAAGTAAAAGAGATTTTATTTGCACTTATTCATGGTTTTGTAACCCATATGCCTGAGTCCCCTTATGGTCTAGTCGGAATAGGAATTTGTGTTCCAGGCCTTGTAGATCGTCATCAGCAAATTATTTTCATGCCTAACTTAAATTGGAATATCAAAGATTTGCAGTTTTTAATTGAGAGTGAGTTTAATGTTCCGGTTTTTGTTGAAAATGAAGCTAATGCAGGAGCATACGGTGAAAAAGTATTTGGTATGACAAAAAACTATGAAAACATCGTTTACATCAGTATTAATATCGGAATTGGAACTGGACTTGTTATTAACAACGAATTGTATAAAGGTGTTCAGGGTTTTTCTGGGGAAATGGGTCATATGACGATAGATTTTAATGGACCCAAATGCAGCTGTGGAAATCGATGCATGCGCTAG
SEQ ID No.14
XYLR
MNQKLILDEILKNSPVSRATLSEITGLNKSTVSSQVNTLLEKDFIFEIGAGQSRGGRRPVMLVFNKNAGYSIGIDIGVDYLNGILTDLEGNIILEKTSDLSSSSASEVKEILFALIHGFVTHMPESPYGLVGIGICVPGLVDRHQQIIFMPNLNWNIKDLQFLIESEFNVPVFVENEANAGAYGEKVFGMTKNYENIVYISINIGIGTGLVINNELYKGVQGFSGEMGHMTIDFNGPKCSCGNRCMR
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细地说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。具体来说，以下描述均以枯草芽孢杆菌为例对重组工程菌的构建以及肌苷和鸟苷等嘌呤核苷的生产进行说明和实验，然而本领域技术人员应理解，本发明对嘌呤代谢途径的改造策略可用于其他合适的菌株以提高其嘌呤核苷产量。
实施例1.基于基因组代谢网络模型预测嘌呤核苷的改造靶点
(1)IMP与生物量间的关联性分析
以枯草芽孢杆菌基因组代谢网络模型iBsu1103V3为基础，运用通量平衡分析(flux balance analysis，以下简称FBA)计算分析可得细胞的最大理论生长速率为0.26；IMP的最大理论合成通量为1.52mmol·gDW-1·h-1，IMP的最大理论转化率为0.84mol/mol(IMP/glucose)。进一步利用分析合成IMP代谢通量与生物量生长之间的相互作用关系。如图1所示，IMP的生成速率随着细胞生长速率的不断增加而减小，表明野生型菌株中IMP的生成和生长是一种竞争关系，菌株最优化生长的结果将使IMP的生成量为零。因此需对菌株进行理性的代谢工程改造，使菌株生长速率在一定范围内，强化合成IMP的代谢流。(2)IMP优化靶点的预测、筛选与比较
以基因组代谢网络模型iBsu1103V3为基础，基于弱化糖酵解途径代谢流而强化磷酸戊糖途径代谢流的目的，将糖酵解途径及磷酸戊糖途径的各基因所编码的酶催化的各步反应式均选作为潜在的敲除靶点，将合成IMP的反应式作为目标反应式，限定菌株的生长速率不小于0.05，运用局部搜索启发式算法(GDLS)分析预测最佳的敲除靶点，获得能强化合成IMP的优化策略。分析结果显示，在增强嘌呤操纵子合成和提高PPP代谢关键节点流量的基础上，敲除磷酸戊糖途径的由drm编码的磷酸戊糖变位酶催化的反应rxn01986：cpd00509[c]<＝>cpd00510[c](deoxyribose-1-phosphate<＝>deoxyribose-5-phosphate)及由ywjH编码的转醛醇酶催化的反应rxn01333：cpd00072[c]+cpd00236[c]-＞cpd00102[c]+cpd00238[c](D-Erythrose4-phosphate+D-Fructose6-phosphate-＞Glyceraldehyde-3-phosphate+Sedoheptulose7-phosphate)。
由于GDLS分析预测所涉及的靶点同时催化其他反应，通过ChangeRxnBounds命令将预测靶点所催化的反应上下线都设为“0”，然后运用最小开关调整算法(ROOM)进一步分析模拟改造策略对菌株生长及产苷的影响。分析结果表明改造策略能使菌株的生长速率有野生型(WT)的0.26下降到0.24，下降了8％；合成IMP的代谢流则由0.07上调到了0.08，上调了18％。所预测的改造策略强化了合成IMP代谢流的同时对菌株的生长没有明显影响。在前期对枯草芽孢杆菌产肌苷代谢工程的研究，发现敲除drm基因能显著提高肌苷的产量。因此，在前期工作的基础上，根据代谢网络模拟预测的策略优化合成IMP的代谢流，构建嘌呤核苷工程菌。
实施例2.嘌呤核苷通用工程菌株的构建与摇瓶发酵
为了增强嘌呤合成途径，本发明在野生型W168中进行嘌呤操纵子的表达调控元件进行改造。选取了四个强度不同的组成型启动子(P43、Pveg、Pctc和PgsiB)替换嘌呤操纵子的启动子Ppur。
首先，根据Genbank中枯草芽孢杆菌168基因组序列设计引物P1-P16，分别扩增启动子；然后，将扩增得到的片段分别与Ppur的上下游片段进行重叠PCR(SOE-PCR)；最后，NheI酶切纯化回收的PCR产物，并与基因编辑载体pWYE486连接，连接产物转化至大肠杆菌EC135中。在合100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，采用菌落PCR鉴定转化子。对鉴定正确的转化子提取质粒，酶切鉴定确定目的片段成功与载体连接。结果如图2所示，分别用Nhe I酶切重组质粒pWYE486-P43、pWYE486-Pveg、pWYE486-Pctc和pWYE486-PgsiB，其产物大小与理论值相一致。经进一步序列测定验证，成功构建启动子替换载体。
将质粒转化至枯草芽孢杆菌W168中，在合有1％木糖和20μg/mL红霉素的LB平板上正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过反向筛选，得到发生第二次同源重组的阳性菌落。对突变菌株进行PCR扩增鉴定。同时纯化PCR产物进行序列测定和分析，以确定重组子的正确性，将Ppur分别替换为P43、Pveg、Pctc和PgsiB的嘌呤核苷工程菌株依次命名为IR-5、IR-6、IR-7和IR-8。
对嘌呤操纵子启动子替换菌株进行摇瓶发酵72h后，各嘌呤核苷工程菌株发酵液中的嘌呤类物质主要为肌苷、次黄嘌呤和鸟苷。肌苷在各菌株中的积累量相近，在85.50～97.25mg/L之间；次黄嘌呤在各菌株中积累量差异最明显。替换为Pveg启动子的菌株IR-6中次黄嘌呤积累量最高为738.53±31.66mg/L，为野生型菌株的32.11倍。鸟苷积累量在不同菌株中也有明显差异，在替换为Pveg的菌株中积累量最高，为417.33±63.59mg/L，为野生型菌株的3.16倍。该结果表明，将Ppur替换为Pveg启动子后，菌株嘌呤合成途径明显增强。因此，在后续工程菌构建中选择Pveg替换Ppur启动子。
表1.嘌呤工程菌株IR-5、IR-6、IR-7和IR-8摇瓶发酵积累嘌呤核苷的产量
Figure BDA0003179189680000131
上述所用引物如下：
P1：GTGATTGCACTTGACATTCATGCGCCGCAAATTC(如SEQ ID NO.15所示)；
P2：GGAATTCCATATG TTCAGCACCATCCTCTTG(如SEQ ID NO.16所示)；
P3：CCCCACCTTCTAATAATGGTACCGCTATCACTTT(如SEQ ID NO.17所示)；
P4：ATAGCGGTACCATTATTAGAAGGTGGGGAACAGA(如SEQ ID NO.18所示)；
P5：TGCAGGTTTTCAACTGTTAGATCAATTTCCCTTC(如SEQ ID NO.19所示)；
P6：GGAAATTGATCTAACAGTTGAAAACCTGCATAGG(如SEQ ID NO.20所示)；
P7：TGTTCCCCACCTTCTAATACTACATTTATTGTAC(如SEQ ID NO.21所示)；
P8：TACAATAAATGTAGTATTAGAAGGTGGGGAACAG(如SEQ ID NO.22所示)；
P9：TTTAATTGTTGAATTATTAGATCAATTTCCCTTC(如SEQ ID NO.23所示)；
P10：GGAAATTGATCTAATAATTCAACAATTAAAGAGC(如SEQ ID NO.24所示)；
P11：GTTCCCCACCTTCTAATGTCGTTTTAGTTGTCCT(如SEQ ID NO.25所示)；
P12：GACAACTAAAACGACATTAGAAGGTGGGGAACAG(如SEQ ID NO.26所示)；
P13：GTCCGTCTGCTTTCTGTTAGATCAATTTCCCTTC(如SEQ ID NO.27所示)；
P14：AGGGAAATTGATCTAACAGAAAGCAGACGGACAC(如SEQ ID NO.28所示)；
P15：TTCCCCACCTTCTAATAATTGGTGTTGGTTGTTG(如SEQ ID NO.29所示)；
P16：CAACCAACACCAATTATTAGAAGGTGGGGAACAG(如SEQ ID NO.30所示)。
实施例3.嘌呤操纵子增强的肌苷工程菌株IR-9的构建与摇瓶发酵
为提高肌苷工程菌的肌苷积累量，将工程菌株IR-4的嘌呤操纵子启动子替换为筛选到的Pveg。具体为：将pWYE486-Pveg转入IR-4中，在合有1％木糖和20μg/mL红霉素的LB平板上正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落；通过反向筛选，得到发生第二次同源重组的阳性菌落，对菌株进行PCR扩增鉴定。同时纯化PCR产物进行序列测定和分析，进一步确定重组子的正确性，命名为IR-9。
对菌株IR-6和IR-9进行500mL摇瓶发酵试验，摇瓶发酵结果显示在W168中将Ppur替换为Pveg，肌苷产量无明显变化，次黄嘌呤积累量由0.02±0.00g/L增加到0.70±0.07g/L，表明嘌呤合成途径增强。在IR-9中将Ppur替换为Pveg，肌苷产量比替换前提高了20％，达到了16.86±0.78g/L，次黄嘌呤积累量为0.22±0.01g/L，与Ppur替换前相近(表2)。结果表明，将Ppur替换为Pveg有效增强了嘌呤合成途径的流量，提高了各肌苷工程菌的肌苷积累能力。
表2.工程菌IR-9摇瓶发酵72h的肌苷和次黄嘌呤积累量
Figure BDA0003179189680000141
实施例4.醛糖转移酶失活的工程菌株的构建
根据Genbank中枯草芽孢杆菌W168的ywjH基因及其上下游序列分别设计引物。以枯草芽孢杆菌W168基因组DNA为模板，以P17和P18为引物PCR扩增ywjH基因上游同源臂；以P19和P20为引物扩增ywjH基因下游同源臂。再以上述PCR纯化产物为模板，以P17和P20为引物，采用重叠延伸PCR技术扩增得到1209bp的ywjH基因的上下游同源臂片段。经Sph1和Kpn1双酶切后，纯化回收的PCR产物与载体pWYE486连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子。转化子传代培养三代后，以P17和P20为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，扩增得到1209bp片段的转化子为阳性。对鉴定正确的转化子提取质粒并送测序，经序列测定验证获得重组质粒pWYE486-ΔywjH。
将pWYE486-ΔywjH化转至枯草芽孢杆菌IR-9中，在合有1％木糖和20μg/mL红霉素的LB平板上正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以P21和P22为引物，对菌落进行基因组DNA提取及PCR扩增鉴定，得到1478bp片段的重组子为阳性，命名为IR-10(IR-9ΔywjH)。经进一步序列测定分析，确定已成功将ywjH基因从染色体中敲除，工程菌株IR-10构建成功(图3)。
上述所用引物如下：
P17：CGGGGTACCAGCTTGCTCATTTCCACGGA(如SEQ ID No.31所示)；
P18：TTTGCCGCCCCTTTCAAAGCCTCCCTGATTAAGAA(如SEQ ID No.32所示)；
P19：CTTAATCAGGGAGGCTTTGAAAGGGGCGGCAAACAGCTT(如SEQ ID No.33所示)；
P20：ACATGCATGCAACCATTTCCCCATTCTCAA(如SEQ ID No.34所示)；
P21：TCCAATGACCGCCTGCTTGA(如SEQ ID No.35所示)；
P22：GCTATGGTAAAAGCACTTATGG(如SEQ ID No.36所示)。
实施例5. 6-磷酸葡萄糖脱氢酶过表达工程菌株的构建
根据Genbank中枯草芽孢杆菌W168的ywjH位点上下游序列、启动子序列和zwf基因序列分别设计引物。以枯草芽孢杆菌W168基因组DNA为模板，以P23和P24为引物PCR扩增整合位点的上游同源臂；以P25和P26为引物扩增P43启动子；以P27和P28为引物扩增zwf基因，以P29和P30为引物扩增整合位点的下游同源臂。再以上述PCR纯化产物为模板，以P23和P30为引物，采用重叠延伸PCR技术扩增得到3433bp的zwf整合基因。经Sph1酶切后，纯化PCR产物与载体pWYE486连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子。转化子传代培养三代后，菌落PCR鉴定转化子，得到3433bp片段的转化子为阳性。对鉴定正确的转化子提取质粒并送测序，验证重组质粒pWYE486-zwf构建成功。
将同源重组质粒化转至枯草芽孢杆菌IR-10中，在含有1％木糖和20μg/mL红霉素的LB平板上正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以P31和P32为引物，对菌落进行基因组DNA提取及PCR扩增鉴定，扩增得到3563bp片段的重组子为阳性，命名为IR-11(IR-10：：zwf)。经进一步序列测定分析，验证zwf基因已成功整合至染色体上，工程菌株IR-11构建成功(图4)。
上述所用引物如下：
P23：ACATGCATGCGTGCACCAGGCCCTGTAGATATG(如SEQ ID No.37所示)；
P24：GCTGAGCTCTACAAGGAAGCCGCAAAATCAATTTCATTTACACAA(如SEQ ID No.38所示)；
P25：TTGTGTAAATGAAATTGATTTTGCGGCTTCCTTGTAGAGCTCAGC(如SEQ ID No.39所示)；
P26：GCTTTTGGTTGTTGGTTTGTTTTCACGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAA(如SEQ IDNo.40所示)；
P27：TTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACGTGAAAACAAACCAACAACCAAAAGC(如SEQ IDNo.41所示)；
P28：TTAAATCTTAACCTGAGCACAACAATTATATGTTCCACCAGTGTAAGCCG(如SEQ ID No.42所示)；
P29：CGGCTTACACTGGTGGAACATATAATTGTTGTGCTCAGGTTAAGATTTAA(如SEQ ID No.43所示)；
P30：ACATGCATGCCGAATAAGCGTTTGTTGGCATCC(如SEQ ID No.44所示)；
P31：CACGATTACTGTCACAATTGC(如SEQ ID No.45所示)；
P32：CTCTAAGGATACGAGAATGAC(如SEQ ID No.46所示)。
实施例6. 6-磷酸葡萄糖异构酶失活与弱化工程菌株的构建
(1)6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi敲除质粒的构建
根据Genbank中枯草芽孢杆菌W168的pgi基因及其上下游序列分别设计引物。以枯草芽孢杆菌W168基因组DNA为模板，以P33和P34为引物PCR扩增pgi基因上游同源臂；以P35和P36为引物扩增pgi基因下游同源臂。再以上述2个PCR纯化产物为模板，以P33和P36为引物，采用重叠延伸PCR技术扩增得到1228bp的含敲除基因pgi的上下游同源臂的片段。经Sph1和Kpn1双酶切后，PCR纯化回收产物与载体pWYE486连接。连接产物采用化学法转化至大肠杆菌EC135，在氨苄青霉素平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后菌落PCR鉴定转化子，扩增得到1247bp片段的转化子为阳性。提取阳性转化子质粒并送测序，经进一步序列测定验证，重组质粒pWYE486-Δpgi构建成功。
(2)6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi条件性表达质粒的构建
根据Genbank中枯草芽孢杆菌W168的pgi启动子上下游序列、木糖启动子和xylR基因序列分别设计引物。以枯草芽孢杆菌W168基因组DNA和质粒pHCMC04为模板，以P37和P38为引物PCR扩增pgi启动子的上游同源臂；以P39和P40为引物扩增pgi启动子下游同源臂；以P41和P42为引物扩增Pxly和xylR基因。再以上述PCR纯化产物为模板，以P37和P42为引物，采用重叠延伸PCR技术扩增得到2604bp合pgi启动子的上下游同源臂、Pxly和xylR基因的PCR产物。经Sph1和Kpn1双酶切后，PCR纯化回收产物与载体pWYE486连接。连接产物转化至大肠杆菌EC135，在氨苄青霉素平板上筛选转化子。转化子传代培养三代后，菌落PCR鉴定转化子，扩增得到2604bp片段的转化子为阳性。提取阳性转化子质粒并送测序，经进一步序列测定验证重组质粒pWYE486-Pxly-xylR构建成功。
(3)6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi敲除工程菌的构建
将重组质粒pWYE486-Δpgi化转至枯草芽孢杆菌IR-11中，在含有1％木糖和20μg/mL红霉素的LB平板上筛选重组质粒整合至染色体上的菌落。通过反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以菌落的基因组DNA为模板，以P43和P44为引物，PCR扩增得到1427bp片段的重组子为阳性，命名为IR-12(IR-11Δpgi)。经进一步序列测定分析，确定已成功将pgi基因从染色体中敲除，工程菌株IR-12构建成功(图5)。
(4)6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因pgi条件性表达工程菌的构建
将序列测定正确的同源重组质粒pWYE486-Pxly-xlyR化转至枯草芽孢杆菌IR-11中，在合有1％木糖和20μg/mL红霉素的LB平板上筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落。通过反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以菌落的基因组DNA为模板，以P45和P46为引物，PCR扩增鉴定，得到2848bp片段的重组子为阳性，命名为IR-13(IR-11Ppgi：：Pxyl)。经进一步序列测定分析，确定成功将pgi启动子从染色体中替换为木糖启动子，工程菌株IR-13构建成功(图6)。
上述所用引物如下：
P33：ACATGCATGCCAGACGGTCATCGAAACAGCTC(如SEQ ID No.47所示)；
P34：CCAGTCAGCTTTCTCACATGCTTGTCCCTCCATAACGG(如SEQ ID No.48所示)；
P35：CGTTATGGAGGGACAAGCATGTGAGAAAGCTGACTGGCAT(如SEQ ID No.49所示)；
P36：CGGGGTACCAGTAGCCATGATCGTATTCC(如SEQ ID No.50所示)；
P37：CGGGGTACCGAAAACACGCCGCTTCAGGATAG(如SEQ ID No.51所示)；
P38：CCCTATAAGTTAGGAGCTCAAGAAAGGGCGGAATGACTGG(如SEQ IDNo.52所示)；
P39：CAAAGGGGGAAATGGGATCCATGACGCATGTACGCTTTGAC(如SEQ ID No.53所示)；
P40：ACATGCATGCCGCGCTCTTTATCAGTTGTTG(如SEQ ID No.54所示)；
P41 CCAGTCATTCCGCCCTTTCTTGAGCTCCTAACTTATAGGG(如SEQ ID No.55所示)；
P42：GTCAAAGCGTACATGCGTCATGGATCCCATTTCCCCCTTTG(如SEQ ID No.56所示)；
P43：GTATACGGCATGGTTGACAT(如SEQ ID No.57所示)；
P44：GTTCATCGAGACTGCCCTGTA(如SEQ ID No.58所示)；
P45：GATGAGCCACGTATTCGAAC(如SEQ ID No.59所示)；
P46：ATTGGTATGCTGGGTTATCTTC(如SEQ ID No.60所示)。
实施例7.嘌呤核苷通用底盘菌株的构建与摇瓶发酵
(1)腺苷酸琥珀酸合成酶purA过表达质粒的构建
根据Genbank中以枯草芽孢杆菌W168的purA基因及其上下游序列分别设计引物。以枯草芽孢杆菌W168基因组DNA为模板，以P47和P48为引物PCR扩增启动子序列；以P49和P50为引物扩增purA基因。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P47和P50为引物，采用重叠延伸PCR技术扩增，得到l736bp的合敲除基因purA的上下游同源臂的片段。胶回收的PCR产物与PstI酶切的表达载体pMK4进行组装连接，连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在氨苄青霉素平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，菌落PCR鉴定转化子，得到阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒并送测序，经进一步序列测定验证，表达质粒pMK4-purA构建成功。
(2)腺苷酸琥珀酸合成酶purA染色体整合表达质粒的构建
根据Genbank中以枯草芽孢杆菌W168的yhdH基因的上下游序列、Zeo和purA基因序列分别设计引物。以枯草芽孢杆菌W168基因组DNA为模板，以P51和P52为引物PCR扩增yhdH基因的上游序列，P53和P54为引物扩增Zeo基因，P55和P56为引物扩增purA基因，P57和P58为引物扩增yhdH基因的下游同源臂。胶回收纯化的上述PCR产物，以P5l和P58为引物，采用重叠延伸PCR技术扩增，得到2780bp合yhdH的上下游同源臂、Zeo和purA基因的PCR产物。纯化回收的PCR产物与T载体连接，连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌EC135，在氨苄青霉素平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，菌落PCR鉴定转化子，得到2780bp的为阳性转化子。对鉴定正确的转化子提取质粒并送测序，经进一步序列测定验证，重组质粒pUC-DHA-zeo-purA-DHA构建成功。
(3)腺苷酸琥珀酸合成酶purA过表达工程菌的构建
将序列测定正确的同源重组质粒pMK4-purA转至本发明的枯草芽孢杆菌工程菌中，在含有10μg/mL氯霉素的LB平板上筛选得到转入表达质粒的菌落。以P59和P60为引物，对整合菌株的purA-DHA菌落进行PCR扩增鉴定，得到1736bp片段的菌落为阳性，命名为IR-14。提取质粒并进一步测序分析，确定已成功将pMK4-purA转入菌株，工程菌株IR-14构建成功(图5)。
(4)腺苷酸琥珀酸合成酶purA染色体整合表达工程菌的构建
将序列测定正确的同源重组质粒pUC-UHA-zeo-purA-DHA转至枯草芽孢杆菌工程菌中，在含有100μg/mL博来霉素的LB平板上筛选得到整合至染色体上的菌落。以P45和P46为引物，对菌落进行基因组DNA提取及PCR扩增鉴定，得到1859bp片段的菌株为阳性，命名为IR-15。经进一步序列测定分析，确定已成功将purA整合于染色体中，工程菌株IR-15构建成功(图6)。
(5)嘌呤核苷工程菌的鉴定与摇瓶发酵
将构建得到的嘌呤核苷工程菌株划线接种在MM与MM+Ade平板上，放置在30℃培养箱中培养48-72小时，鉴定工程菌株在MM培养基上的生长情况和purA基因的表达。筛选出在MM培养基上生长速度快的菌株，表明回补的purA基因表达水平较高。进一步对优选菌株进行500mL摇瓶发酵试验，采用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中嘌呤核苷成分。发酵结果显示嘌呤核苷工程菌株的发酵液中能够检测到多种嘌呤核苷及其衍生物，包括肌苷(Inosine)、鸟苷(Guanosine)、腺苷(Adenosine)、腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)、次黄嘌呤核苷酸(IMP)、鸟嘌呤苷酸(GMP)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)等。其中产生最多的是IMP，能够达成13.63g/L，肌苷、鸟苷产量分别为5.44g/L和1.21 g/L(表3)。
表3.嘌呤核苷工程菌摇瓶发酵的产物积累量
Figure BDA0003179189680000181
上述所用引物如下：
P47：AGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGGCTGCACTTCCTTGTAGAGCTCAGCATTAT(如SEQID No.61所示)；
P48：TGTGCCAACAACAACAACAGAAGACATAAGAGCACTCCTCCTCTTAATATGT(如SEQ IDNo.62所示)；
P49：ACATATTAAGAGGAGGAGTGCTCTTATGTCTTCTGTTGTTGTTGTTGGCACA(如SEQ IDNo.63所示)；
P50：AACGACGGCCAGTGAATTCCCGGGGATCCGTCGACTATTAGTTAGCACGGTAAACAGAA(如SEQID No.64所示)；
P51：GACTTGTGCCGGGTTCACTTTCTAA(如SEQ ID No.65所示)；
P52：AGCAGATGTAAGTTTAGCCATTAAACGTCACTTCCTTTCCA(如SEQ ID No.66所示)；
P53：TGGAAAGGAAGTGACGTTTAATGGCTAAACTTACATCTGCT(如SEQ ID No.67所示)；
P54：AACAACAACAACAGAAGACATTGCTAGATTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATC(如SEQ IDNo.68所示)；
P55：GATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAATCTAGCAATGTCTTCTGTTGTTGTTGTT(如SEQ IDNo.69所示)；
P56：TCCGTCTCTCTATCACTGATAGGGATTGCTCTATTAGTTAGCACGGTAAACAGAA(如SEQ IDNo.70所示)；
P57：TTCTGTTTACCGTGCTAACTAATAGAGCAATCCCTATCAGTGATAGAGAGACGGA(如SEQ IDNo.71所示)；
P58：ACAACGAGTACAGTCAGTGCCATA(如SEQ ID No.72所示)；
P59：ATGTCTTCTGTTGTTGTTGTT(如SEQ ID No.73所示)；
P60：TACCCGTTCAATCCCTTTTTGAA(如SEQ ID No.74所示)。
实施例8.肌苷工程菌的摇瓶发酵
对工程菌IR-9、IR-10、IR-11、IR-12和IR-13进行500mL摇瓶发酵试验，在发酵过程中，对菌株生长和葡萄糖消耗情况进行监测。结果显示菌株IR-12其生长和葡萄糖消耗速率均显著慢，表明敲除pgi抑制菌株耗糖和生长。将pgi基因的启动子替换为木糖启动子的菌株生长和葡萄糖消耗速率均显著快于敲除pgi基因菌株的菌株生长和葡萄糖消耗速率，表明将pgi基因的启动子替换为木糖启动子比敲除pgi基因更利于菌株生长。与出发菌株IR-9相比，工程菌IR-10、IR-11和IR-13的生长和葡萄糖消耗速率没有明显的变化。在添加木糖的条件下，工程菌株的生长明显优于不加木糖的条件(图8)。
采用高效液相色谱法(HPLC)检测发酵液中的肌苷的含量。结果如表3所示，敲除模型预测的靶点ywjH后，IR-10在发酵过程中肌苷的积累及糖苷转化率均显著提高，发酵72h的肌苷产量为20.89g/L，比IR-9提高了10.6％；糖苷转化率则提高了25％；在生产强度上则与对照组IR-9无显著性差异，表明敲除ywjH对于肌苷的积累有明显促进作用。
过表达zwf后，菌株IR-11在发酵过程中肌苷的积累量增加，达到22.00g/L，比IR-10提高了5.31％，且菌株的生产强度明显增强。敲除pgi后，菌株IR-12在发酵过程中肌苷的积累显著降低。糖苷转化率的分析结果显示，敲除pgi后菌株的糖苷转化率显著提高。表明敲除pgi靶点不利于肌苷的积累，其原因可能是敲除pgi靶点抑制了菌株的生长从而导致产苷降低。条件性控制pgi表达后，在无诱导剂的条件下弱化pgi表达，工程菌株IR-13相比于菌株IR-12，肌苷产量显著提高，从18.84g/L提升到22.81g/L，提高了21.09％。糖苷转化率的分析结果显示，敲除pgi或将pgi基因的启动子替换为木糖启动子，菌株的糖苷转化率均显著提高。生产强度分析结果显示，将pgi基因的启动子替换为木糖启动子的菌株生产强度明显增强。表明将pgi基因的启动子替换为木糖启动子比敲除pgi靶点更有利于肌苷的积累。
为进一步提高工程菌株的肌苷产量，条件性控制pgi表达水平，从而将菌株的生长与产苷进行解偶联，建立了两阶段发酵方法。在生长阶段添加木糖，提高菌株IR-13的生长浓度；在发酵阶段不添加木糖，提高菌株的核苷生产能力。优化后的发酵结果显示(表4)，工程菌IR-13的肌苷产量进一步提高，达到25.85g/L，显著提高了从头构建工程菌的肌苷产量。
表4.肌苷工程菌株摇瓶发酵的产苷结果分析
Figure BDA0003179189680000201
*优化培养基条件下的摇瓶发酵结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.重组菌株，其特征在于，包括突变的嘌呤操纵子调控区、失活或弱化的醛糖转移酶、增强的6-磷酸葡萄糖脱氢酶或弱化的6-磷酸葡萄糖异构酶中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，
所述嘌呤操纵子调控区具有：
(1)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
和/或
所述醛糖转移酶具有：
(I)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
和/或
(i)、具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；和/或
(ii)、如(i)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(i)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；和/或
(iii)、与(i)或(ii)所述氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列；
和/或
所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶具有：
(A)、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(B)、如(A)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(A)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(C)、与(A)或(B)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
和/或
(a)、具有如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；和/或
(b)、如(a)所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(a)所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；和/或
(c)、与(a)或(b)所述氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列；
和/或
所述6-磷酸葡萄糖异构酶具有：
<1>、如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
<2>、如<1>所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与<1>所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
<3>、与<1>或<2>所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
和/或
①、具有如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；和/或
②、如①所述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与①所述氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；和/或
③、与①或②所述氨基酸序列具有80％以上同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，
所述突变的嘌呤操纵子调控区通过如下任意方式实现：
(1)、替换嘌呤操纵子的启动子区域；或
(2)、对嘌呤操纵子的启动子区域进行突变；和/或
所述失活或弱化的醛糖转移酶通过如下任意方式实现：
(I)、全部或部分缺失醛糖转移酶编码基因；或
(II)、对醛糖转移酶编码基因进行点突变；或
(III)、将醛糖转移酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件；和/或
所述增强的6-磷酸葡萄糖脱氢酶通过如下任意方式实现：
(i)、在染色体上整合一个或一个以上的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因；或
(ii)、将6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的启动子区表达调控元件替换为具有更强活性的元件；和/或
所述弱化的6-磷酸葡萄糖异构酶通过如下任意方式实现：
(A)、全部或部分缺失6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因；或
(B)、对6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因进行点突变；或
(C)、将6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件。
4.如权利要求1至3任一项所述重组菌株，其特征在于，出发菌株是能够累积肌苷、鸟苷、腺苷和/或黄苷的菌株；
所述出发菌株包括磷酸戊糖变位酶降低的细菌；
所述细菌选自芽孢杆菌属和/或短杆菌属的细菌，优选为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，更优选为B.subtilis W168。
5.如权利要求1至4任一项所述重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
突变嘌呤操纵子调控区；
弱化或失活醛糖转移酶；
增强6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性；
弱化6-磷酸葡萄糖异构酶；
得到所述重组菌。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，
所述突变嘌呤操纵子调控区通过如下任意方式实现：
(1)、替换嘌呤操纵子的启动子区域；或
(2)、对嘌呤操纵子的启动子区域进行突变；和/或
所述失活或弱化醛糖转移酶通过如下任意方式实现：
(I)、全部或部分缺失醛糖转移酶编码基因；或
(II)、对醛糖转移酶编码基因进行点突变；或
(III)、将醛糖转移酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件；和/或
所述增强6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性通过如下任意方式实现：
(i)、在染色体上整合一个或一个以上的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因；或
(ii)、将6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的启动子区表达调控元件替换为具有更强活性的元件；和/或
所述弱化6-磷酸葡萄糖异构酶通过如下任意方式实现：
(A)、全部或部分缺失6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因；或
(B)、对6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因进行点突变；或
(C)、将6-磷酸葡萄糖异构酶编码基因的表达调控元件替换为具有更弱活性的元件。
7.如权利要求1至4任一项所述的重组菌株或如权利要求5～6任一项所述的构建方法获得的重组菌株在生产嘌呤核苷中的应用；
所述嘌呤核苷包括肌苷、鸟苷或腺苷中的一种或多种。
8.生产嘌呤核苷的方法，其特征在于，经如权利要求1至4任一项所述的重组菌株或如权利要求5～6任一项所述的构建方法获得的重组菌株发酵获得嘌呤核苷。
9.混合菌株，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的重组菌株或如权利要求5～6任一项所述的构建方法获得的重组菌株，以及任意菌株。
10.如权利要求9所述混合菌株在生产嘌呤核苷中的应用；
所述嘌呤核苷包括肌苷、鸟苷或腺苷中的一种或多种。
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