CN114410561A - 一种生产胸苷的基因工程菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种生产胸苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。该基因工程菌株异源过表达枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A，天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX和噬菌体PBS1的5’‑核苷酸酶基因TMPase；过表达大肠杆菌的核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC；并且不表达嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC。本发明从大肠杆菌基因组水平出发，主要通过代谢工程技术手段，对尿苷酸合成途径、胸苷分解途径、胸苷支路合成途径各模块进行系统全面的组合优化，提高菌株的胸苷发酵性能。

Description

一种生产胸苷的基因工程菌株及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种生产胸苷的基因工程菌株及其构建方法与应用。
背景技术
嘧啶核苷及其衍生物在抗肿瘤、抗病毒方面具有广泛应用。胸苷是一种嘧啶核苷，用于嘧啶代谢及相关疾病的治疗，主要作为抗艾滋病药物司他夫定、齐多夫定的前体，具有重要的药用价值。随着全球艾滋病患者的增加，胸苷的市场需求不断扩大，迫切需要开发法廉价的可大规模应用的胸苷生产工艺。
胸苷目前的生产方法主要是酶法与化学法相结合，原料成本高，后续分离困难。随着系统代谢工程的快速发展，使微生物发酵法生产胸苷成为可能。发酵法具有工艺简单，产品易分离，生产可持续等优势。有研究通过对大肠杆菌进行理性改造，发酵120h可生产胸苷13.2g/L，为现有报道的最高水平。现存菌株发酵产量低，发酵周期长，生产水平还远不能满足市场需求，亟需构建高性能的胸苷生产菌株以推动胸苷发酵生产的产业化进程。
胸苷的从头合成途径如图8所示：由ATP提供能量，以谷氨酰胺、天冬氨酸和碳酸氢盐等为前体物，经三步反应闭环形成嘧啶环，生成二氢乳清酸；二氢乳清酸由脱氢酶催化形成乳清酸；乳清酸和PRPP经乳清酸磷酸核糖转移酶催化形成乳清核苷酸；最后通过乳清核苷酸脱羧酶催化形成嘧啶核苷的共同前体尿苷酸(UMP)。合成的UMP一部分直接脱去磷酸基团生成尿苷；一部分经过一系列的磷酸化，胺化再去磷酸后生成胞苷；一部分则通过冗长复杂的磷酸化去磷酸化，胺化去胺化，脱羟基及甲基化反应，将UMP及CMP转化为dTMP，再脱磷酸最终生成胸苷。
严谨的反馈调控机制，繁杂的反应过程以及对多种重要前体物的需求是限制嘧啶核苷生物合成的主要因素。迄今为止，从野生型菌株出发从头构建胸苷生产菌的报道颇少，且普遍产能较差。此前，Lee课题组对其进行了一系列研究：2009年，以大肠杆菌BL21为出发菌株，敲除了deoA、tdk、udp、ung基因，以质粒为载体过表达了来自T4噬菌体的td、nrdABC基因，来自PBS2噬菌体的TMPase基因和大肠内源的udk、dcd基因，最终所得菌株经7L发酵罐发酵24h积累胸苷740.3mg/L(Fermentative production of thymidine by ametabolically engineered Escherichia coli strain.Applied&EnvironmentalMicrobiology,2009,75(8):2423)。2010年，在此前菌株基础上，敲除了pgi基因，以质粒为载体过表达了udhA基因，所得菌株在7L发酵罐发酵64h积累胸苷1.9g/L(High NADPH/NADP+ratio improves thymidine production by a metabolically engineered Escherichiacoli strain.Journal of Biotechnology,2010,149(1-2):24-32)。2015年，Kim等人利用基因组重组技术制备了一株新的大肠杆菌胸苷生产菌株。以此前基础上进一步敲除了purR、pepA、argR、rpoS基因，在基因组上整合了T4噬菌体的td、nrdABC基因，PBS2噬菌体的TMPase基因和大肠内源的udk、dcd、pspA基因，在7L发酵罐上发酵120h积累胸苷13.2g/L(Development of a novel plasmid-free thymidine producer by reprogrammingnucleotide metabolic pathways.Applied&Environmental Microbiology,2015)。这是目前已报道的胸苷发酵的最高产量。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是构建一株高效稳定生产胸苷的工程菌株并利用该菌株发酵生产胸苷，本发明从大肠杆菌基因组水平出发，主要通过代谢工程技术手段，对尿苷酸合成途径、胸苷分解途径、胸苷支路合成途径各模块进行系统全面的组合优化，提高菌株的胸苷发酵性能。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株异源过表达枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A，天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX和噬菌体PBS1的5’-核苷酸酶基因TMPase；过表达大肠杆菌的核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC；并且不表达嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC。
第二方面，本发明提供了如上所述的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，包括：在出发菌株大肠杆菌中引入枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A，天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX，噬菌体PBS1的5’-核苷酸酶基因TMPase；过表达核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC；并且将嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC敲除或失活。
第三方面，本发明提供了如上所述的大肠杆菌基因工程菌株在高产胸苷中的用途。
本发明的有益效果如下：
本发明利用理性代谢工程改造的方法获得了具有清晰遗传背景，不含质粒并且高效生产胸苷的工程菌株。从生产表型来看，本发明所述菌株在5L罐上发酵40h，胸苷产量达到了15.2g/L，胸苷产量和生产强度是现有报道的最高水平。从构建策略来看，本发明通过代谢工程技术手段，分模块对尿苷酸合成途径、胸苷分解途径、胸苷分支合成途径进行了系统全面的组合优化，菌株遗传背景清晰且生产性能更高更稳定。最终所得菌株可稳定高效生产胸苷，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1A：pyr1整合片段构建及验证电泳图。其中：M：Marker；1：上游同源臂；2：pyr1片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图1B：pyr2整合片段构建及验证电泳图。其中：M：Marker；1：pyr2上游片段-pyr2片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。
图1C：pyr3整合片段构建及验证电泳图。其中：M：Marker；1：pyr3上游片段-pyr3片段；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。
图2A：deoA基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。
图2B：tdk基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。
图2C：udp基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：原菌对照；5：阳性菌鉴定片段。
图2D：rihA基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性菌鉴定片段5：原菌对照。
图2E：rihB基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性菌鉴定片段5：原菌对照。
图2F：rihC基因敲除片段的构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性菌鉴定片段5：原菌对照。
图3A：pyrHD90A整合片段构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：pyrHD90A片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图3B：nrdA整合片段构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：nrdA片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图3C：nrdBC整合片段构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：nrdBC片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图3D：thyX整合片段构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：thyX片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图3E：TMPase整合片段构建及验证电泳图。其中，M：Marker；1：上游同源臂；2：TMPase片段；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
图4：过表达嘧啶核苷操纵子对嘧啶产量的影响。
图5：阻断胸苷分解途径对胸苷产量的影响。
图6：过表达胸苷下游合成途径基因对胸苷产量的影响。
图7：菌株THY3-5在5L发酵罐上的发酵过程曲线。
图8：本发明技术方案原理示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
第一方面，本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株异源过表达枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A，天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX和噬菌体PBS1的5’-核苷酸酶基因TMPase，其中pyrHD90A是pyrH基因编码的氨基酸序列第90位的天冬氨酸替换为丙氨酸；过表达大肠杆菌的核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC；并且不表达嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC。
优选的，所述嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。其中，pyrHD90A是表示pyrH基因编码氨基酸序列的第90位的天冬氨酸(D)替换为丙氨酸(A)。位置的编号是对应于亲本枯草芽孢杆菌的尿苷酸激酶氨基酸序列的位置。
优选的，所述胸苷酸合酶基因thyX的NCBI-GeneID:1101182。
优选的，所述5’-核苷酸酶基因TMPase的NCBI-GeneID:40524272。
根据本发明，不表达上述基因的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过本领域常规手段使该基因失活或者将该基因敲除。
根据本发明，所述不表达是指该基因表达产物的量显著低于原有水平，例如，显著降低了至少50％、60％、70％、80％、90％、100％。
根据本发明，过表达上述基因的方式可以采取本领域常规手段，例如，增加基因的拷贝数或者使该基因连接强启动子。
根据本发明，所述过表达是指该基因表达产物的量显著高于原有水平。
根据本发明一种优选的实施方式，所述嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE连接有启动子Ptrc；和/或所述尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A连接有启动子Ptrc；和/或核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC连接有启动子Ptrc；和/或所述启动子胸苷酸合酶基因thyX连接有启动子Ptrc；和/或所述5’-核苷酸酶基因TMPase连接有启动子Ptrc。
根据本发明，用于构建所述大肠杆菌基因工程菌株的出发菌株可以是任意的大肠杆菌，根据本发明一种优选的实施方式，所述出发菌株是E.coli MG1655。
第二方面，本发明提供了如上所述的大肠杆菌基因工程菌株的构建方法，包括：在出发菌株大肠杆菌中引入枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A，天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX，噬菌体PBS1的5’-核苷酸酶基因TMPase；过表达核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC；并且将嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC敲除或失活。
本发明第一方面已经详细介绍了上述各基因的选择、启动子的选择、出发菌株的选择等，此处不再赘述第一方面已经介绍过的内容。
根据本发明一种具体的实施方式，该方法包括：
(1)增强尿苷酸合成途径
从菌株E.coli MG1655基因组出发，将B.subtilis A260的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-pyrBCAKDFE整合在yghX假基因位点；该步骤强化了嘧啶核苷从头合成通量，解除了尿苷酸对氨甲酰磷酸合成酶的反馈抑制；
(2)阻断胸苷分解途径
将嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp，核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC敲除，该步骤阻断了胸苷的降解；
(3)增强胸苷下游合成支路
将枯草芽孢杆菌来源的尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-pyrHD90A整合在yeeL假基因位点；将大肠杆菌的核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-nrdABC整合在yciQ假基因位点；将天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-thyX整合在gapC假基因位点；将噬菌体PBS1的5’-核苷酸酶基因TMPase与Ptrc的融合片段Ptrc-TMPase整合在mbhA假基因位点；该步骤增强胸苷下游合成途径。
本发明上述构建过程的原理可参考图8所示。
第三方面，本发明提供了如上所述的大肠杆菌基因工程菌株在高产胸苷中的应用，包括：在适宜条件培养所述基因工程菌株，并从其培养物中收集胸苷。
根据本发明一种优选的实施方式，所述适宜条件是指培养温度35℃，维持pH在7.0左右，溶氧在25～35％之间，并且培养基组成为：葡萄糖15～25g/L，酵母粉1～4g/L，蛋白胨1～5g/L，柠檬酸0.1～2g/L，K2HPO4·3H2O 3～7g/L，MgSO4·7H2O 0.1～2g/L，FeSO4·7H2O5～20mg/L，MnSO4·H2O 5～20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12和VH各0.1～2mg/L，微量元素混合液1mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0～7.2。
以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。以下实施例中：
如无特别说明，本发明实施例中所涉及的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9meditated genome editing.Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行，其他所涉及的分子生物学、基因工程等具体操作手段根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现。
实施例1：大肠杆菌基因工程菌株E.coli THY3-5的构建
1.增强尿苷酸合成途径
将枯草芽孢杆菌(B.subtilis A260)的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE(包含pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB、pyrK、pyrD、pyrF、pyrE八个基因)共9495bp，在本实施例中分pyr1、pyr2、pyr3三段依次整合至大肠杆菌yghX基因位点，并由启动子Ptrc启动该外源操纵子的转录表达，构建了菌株E.coli THY1-3。具体包括：
1.1 Ptrc-pyr1的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yghX-S、UP-yghX-A)和下游同源臂引物(DN-yghX-S1、DN-yghX-A)，PCR扩增其上下游同源臂片段；以B.subtilis A260基因组为模板，根据pyr1(SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第1-3260位)设计引物(pyr1-S、pyr1-A)，PCR扩增pyr1片段；启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和pyr1基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得pyr1基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-pyr1-下游同源臂)，构建pGRB-yghX使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yghX-S和gRNA-yghX-A退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-yghX电转至MG1655的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY1-1。Ptrc-pyr1片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1A。其中上游同源臂长度为658bp，pyr1基因片段长度为3363bp，下游同源臂长度为604bp，重叠片段的长度为4560bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为4560bp，原菌PCR扩增片段长度应为1765bp。
1.2 Ptrc-pyr2的整合
以B.subtilis A260基因组为模板，根据pyr2及其上游序列(SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第2448-6472位)设计引物(pyr2-S、pyr2-A)，PCR扩增pyr2片段；以E.coliMG1655基因组为模板，根据其yghX基因的下游同源臂引物(DN-yghX-S2、DN-yghX-A)，PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得pyr2基因的整合片段(pyr2-下游同源臂)，构建pGRB-pyr2使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-S1和gRNA-A1退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-pyr2电转至THY1-1的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY1-2。pyr2片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1B。其中pyr2基因片段及其上游同源臂长度为4068bp，下游同源臂长度为604bp，重叠片段的长度为4649bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为4649bp，原菌PCR扩增片段长度应为1437bp。
1.3 Ptrc-pyr3的整合
以B.subtilis A260基因组为模板，根据pyr3及其上游序列(SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第5671-9495位)设计引物(pyr3-S、pyr3-A)，PCR扩增pyr3片段；以E.coliMG1655基因组为模板，根据其yghX基因的下游同源臂引物(DN-yghX-S3、DN-yghX-A)，PCR扩增其下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合，获得pyr3基因的整合片段(pyr3-下游同源臂)，构建pGRB-pyr3使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-S2和gRNA-A2退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-pyr3电转至THY1-2的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY1-3。pyr3片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图1C。其中pyr3基因片段及其上游同源臂长度为3888bp，下游同源臂长度为622bp，重叠片段的长度为4471bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为4471bp，原菌PCR扩增片段长度应为1426bp。
2.阻断胸苷分解途径
2.1 deoA基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其deoA基因(NCBI-GeneID:948901)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-deoA-S、UP-deoA-A)和下游同源臂引物(DN-deoA-S、DN-deoA-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得deoA基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-deoA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-deoA-S和gRNA-deoA-A退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-deoA电转至THY1-3的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY2-1。deoA敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2A。其中，上游同源臂的长度为384bp，下游同源臂的长度为487bp，重叠片段的总长为833bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为833bp，原菌PCR扩增片段长度应为1704bp。
2.2 tdk基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其tdk基因(NCBI-GeneID:945834)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-tdk-S、UP-tdk-A)和下游同源臂引物(DN-tdk-S、DN-tdk-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得tdk基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-tdk使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-tdk-S和gRNA-tdk-A退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-tdk电转至THY2-1的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY2-2。tdk敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2B。其中，上游同源臂的长度为483bp，下游同源臂的长度为467bp，重叠片段的总长为910bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为910bp，原菌PCR扩增片段长度应为1278bp。
2.3 udp基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其udp基因(NCBI-GeneID:948987)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-udp-S、UP-udp-A)和下游同源臂引物(DN-udp-S、DN-udp-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得udp基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-udp使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-udp-S和gRNA-udp-A退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-udp电转至THY2-2的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY2-3。udp敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2C。其中，上游同源臂的长度为492bp，下游同源臂的长度为516bp，重叠片段的总长为1008bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1008bp，原菌PCR扩增片段长度应为1653bp。
2.4 rihA基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其rihA基因(NCBI-GeneID:945503)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-rihA-S、UP-rihA-A)和下游同源臂引物(DN-rihA-S、DN-rihA-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得rihA基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-rihA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-rihA-S和gRNA-rihA-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-rihA电转至THY2-3的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY2-4。rihA敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2D。其中，上游同源臂的长度为547bp，下游同源臂的长度为536bp，重叠片段的总长为1042bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1042bp，原菌PCR扩增片段长度应为1857bp。
2.5 rihB基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其rihB基因(NCBI-GeneID:946646)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-rihB-S、UP-rihB-A)和下游同源臂引物(DN-rihB-S、DN-rihB-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得rihB基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-rihB使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-rihB-S和gRNA-rihB-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-rihB电转至THY2-4的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY2-5。rihB敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2E。其中，上游同源臂的长度为494bp，下游同源臂的长度为459bp，重叠片段的总长为912bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为912bp，原菌PCR扩增片段长度应为1789bp。
2.6 rihC基因的敲除
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其rihC基因(NCBI-GeneID:944796)的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-rihC-S、UP-rihC-A)和下游同源臂引物(DN-rihC-S、DN-rihC-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得rihC基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-rihC使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-rihC-S和gRNA-rihC-A的退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-rihC电转至THY2-5的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY2-6。rihC敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2F。其中，上游同源臂的长度为539bp，下游同源臂的长度为475bp，重叠片段的总长为975bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为975bp，原菌PCR扩增片段长度应为1787bp。
3.增强胸苷支路合成途径
3.1 pyrHD90A突变基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其yeeL基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yeeL-S、UP-yeeL-A)和下游同源臂引物(DN-yeeL-S、DN-yeeL-A)，PCR扩增其上下游同源臂片段；以B.subtilis A260基因组为基础，根据其pyrHD90A基因(SEQ ID NO：2)设计引物(pyrH-S、pyrHD90A-A、pyrHD90A-S、pyrH-A)，扩增pyrHD90A突变基因前后片段，并利用重叠PCR的方法获得pyrHD90A突变基因片段，启动子Ptrc设计在上游同源臂的下游引物和pyrHD90A基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得pyrHD90A基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-pyrHD90A-下游同源臂)，构建pGRB-yeeL使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yeeL-S和gRNA-yeeL-A退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-yeeL电转至THY2-6的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY3-1。Ptrc-pyrHD90A片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3A。其中上游同源臂长度为632bp，pyrHD90A基因片段长度为723bp，下游同源臂长度为626bp，重叠片段的长度为2023bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2023bp，原菌PCR扩增片段长度应为1452bp。
3.2 nrdABC基因的整合
3.2.1 nrdA基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其yciQ基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yciQ-S、UP-yciQ-A)和下游同源臂引物(DN-yciQ-S、DN-yciQ-A)，PCR扩增其上下游同源臂片段；根据其nrdA基因(NCBI-GeneID:946612)设计引物(nrdA-S、nrdA-A)，扩增nrdA基因片段，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和nrdA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得nrdA基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-nrdA-下游同源臂)，构建pGRB-yciQ使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yciQ-S和gRNA-yciQ-A退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-yciQ电转至THY3-1的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY3-2。Ptrc-nrdA片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3B。其中上游同源臂长度为632bp，nrdA基因片段长度为2622bp，下游同源臂长度为664bp，重叠片段的长度为3853bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为3853bp，原菌PCR扩增片段长度应为1844bp。
3.2.2 nrdBC基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其yciQ基因的下游序列设计下游同源臂引物(DN-yciQ-S1、DN-yciQ-A)，PCR扩增其下游同源臂片段；根据其nrdBC基因(NCBI-GeneID:946732，946729)及其上游基因序列设计引物(UP-nrdBC-S、UP-nrdBC-A、nrdBC-S、nrdBC-A)，扩增nrdBC上游同源臂及基因片段，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和nrdBC基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得nrdBC基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-nrdBC-下游同源臂)，构建pGRB-nrdBC使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-S1和gRNA-A1退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-nrdBC电转至THY3-2的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY3-3。nrdBC片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3C。其中上游同源臂长度为1007bp，nrdBC基因片段长度为1508bp，下游同源臂长度为684bp，重叠片段的长度为3118bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为3118bp，原菌PCR扩增片段长度应为1635bp。
3.3链霉菌来源的胸苷酸合酶基因thyX的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其gapC基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-gapC-S、UP-gapC-A)和下游同源臂引物(DN-gapC-S、DN-gapC-A)，PCR扩增其上下游同源臂片段；以Streptomyces coelicolor A3(2)基因组为基础，根据其thyX基因(NCBI-GeneID:1101182)设计引物(thyX-S、thyX-A)，扩增thyX基因片段，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和thyX基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得thyX基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-thyX-下游同源臂)，构建pGRB-gapC使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-gapC-S和gRNA-gapC-A退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-gapC电转至THY3-3的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY3-4。Ptrc-thyX片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3D。其中上游同源臂长度为452bp，thyX基因片段长度为861bp，下游同源臂长度为494bp，重叠片段的长度为1800bp。设计鉴定引物并进行PCR验证，阳性菌PCR扩增片段长度应为1086bp，原菌无条带。
3.4 TMPase基因的整合
以E.coli MG1655基因组为模板，根据其mbhA基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-mbhA-S、UP-mbhA-A)和下游同源臂引物(DN-mbhA-S、DN-mbhA-A)，PCR扩增其上下游同源臂片段；以Escherichia virus PBS1基因组为基础，通过化学合成的方法合成TMPase基因(NCBI-GeneID:40524272)并设计引物(TMPase-S、TMPase-A)，扩增TMPase基因片段，启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和TMPase基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法融合获得TMPase基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-TMPase-下游同源臂)，构建pGRB-mbhA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-mbhA-S和gRNA-mbhA-A退火制得。将该重组片段和质粒pGRB-mbhA电转至THY3-4的感受态细胞，筛选阳性菌株后再将质粒消除获得菌株THY3-5。TMPase片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3E。其中上游同源臂长度为692bp，TMPase基因片段长度为849bp，下游同源臂长度为749bp，重叠片段的长度为2209bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2209bp，原菌PCR扩增片段长度应为1837bp。
5.上述构建过程所涉及的引物见下表：
Figure BDA0003493919810000131
Figure BDA0003493919810000141
Figure BDA0003493919810000151
实施例2：胸苷菌株摇瓶发酵实验
摇瓶培养方法如下：
斜面活化培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，再传代一次；
种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养7～10h；
发酵培养：按种子培养液体积10-15％的接种量接种到装有发酵培养基的500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0～7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期24h。
斜面培养基：葡萄糖1～5g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母粉1～5g/L，牛肉膏5～10g/L，NaCl 1～2.5g/L，琼脂15～20g/L，其余为水，pH 7.0～7.2。
种子培养基：葡萄糖15～30g/L，酵母粉1～5g/L，蛋白胨1～3g/L，KH2PO4·3H2O0.1～1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/L，FeSO4·7H2O 2～10mg/L，MnSO4·H2O 2～10mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12和VH各0.1～1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0～7.2。
发酵培养基：葡萄糖15～30g/L，酵母粉1～5g/L，蛋白胨1～5g/L，KH2PO4·3H2O 1～7g/L，柠檬酸0.5～2g/L，FeSO4·7H2O 2～10mg/L，MnSO4·H2O 2～10mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12和VH各0.1～1mg/L，微量元素混合液1mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0～7.2。
摇瓶发酵结果：
以E.coli MG1655为出发菌株，过表达嘧啶核苷操纵子基因后，摇瓶发酵结果显示(图4)，菌株THY1-3发酵24h积累了尿嘧啶2.1g/L，说明尿苷酸合成途径得到了有效增强。依次对胸苷分解途径基因敲除后得到菌株THY2-6，摇瓶发酵结果显示(图5)，24h胸苷能够积累0.18g/L。虽然菌株THY2-6可以积累胸苷，但是同时积累5.56g/L的尿苷(表1)，说明菌株自身的尿苷酸激酶活性不足。大肠杆菌自身的尿苷酸激酶pyrH受到胞苷等产物的反馈抑制。在菌株THY2-6中，过表达了大肠杆菌的尿苷酸激酶突变基因pyrHD93A和枯草芽孢杆菌的尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A。结果表明，过表达枯草芽孢杆菌的尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A的效果更好，尿苷含量大幅减少到0.42g/L，与菌株THY2-6相比减少了92.4％，说明枯草芽孢杆菌的pyrHD90A的过表达可以有效地将尿苷合成代谢流引入到胸苷支路合成途径。接着对胸苷支路合成途径涉及的关键基因依次进行强化，最终得到的菌株THY3-5，摇瓶发酵结果显示(图6)，24h胸苷积累量达到1.76g/L，说明增强胸苷支路合成途径能有效增加胸苷产率。
表1
Figure BDA0003493919810000161
实施例3：菌株THY3-5在5L罐上发酵生产胸苷实验
发酵罐培养方法如下：
斜面活化培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，转接茄形瓶继续培养12～16h；
种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25～35％之间，培养至细胞干重达到5～6g/L；
发酵培养：按照15～20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在35℃，溶氧在25～35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-2g/L。
斜面培养基：葡萄糖1～5g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母粉1～5g/L，牛肉膏5～10g/L，NaCl 1～2.5g/L，琼脂15～20g/L，其余为水，pH 7.0～7.2。
种子培养基：葡萄糖15～30g/L，酵母粉1～5g/L，蛋白胨1～3g/L，KH2PO4·3H2O0.1～1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1～0.5g/L，FeSO4·7H2O 2～10mg/L，MnSO4·H2O 2～10mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12和VH各0.1～1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0～7.2。
发酵培养基：葡萄糖15～30g/L，酵母粉1～5g/L，蛋白胨1～5g/L，KH2PO4·3H2O 1～7g/L，柠檬酸0.5～2g/L，FeSO4·7H2O 2～10mg/L，MnSO4·H2O 2～10mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12和VH各0.1～1mg/L，微量元素混合液1mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0～7.2。
5L发酵罐分批补料发酵结果：如图7所示，菌株THY3-5发酵8h进入对数生长期，于28h OD600值达到最高，随后略有降低。16h后，胸苷开始快速积累，12～32h之间能够保持较高的合成速率，40h的产量达到15.2g/L，生产强度0.38g/L/h，均为现有报道中的最高水平。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。
序列表
<120> 一种生产胸苷的基因工程菌株及其构建方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9495
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（B.subtilis A260）
<400> 1
atgaagcatt taacgacgat gagtgaactt agcactgagg aaatcaaaga tttgcttcaa 60
acagcacaag agctcaaaag cggaaaaaca gacaatcagc ttacaggaaa gtttgcagca 120
aacctgtttt tcgaaccgag cacgagaacg cggttcagct ttgaggtcgc agaaaaaaag 180
ctgggcatga atgtgcttaa ccttgatgga acaagcacaa gcgtgcaaaa aggcgaaacc 240
ttatatgaca cgatccggac gcttgaatca atcggtgtgg acgtctgcgt catcaggcac 300
agtgaggatg agtattatga agagcttgtc agccaggtga acattccgat tctgaatgcg 360
ggagacgggt gcggccagca tccaacacaa tcactgcttg atttaatgac gatttatgaa 420
gagttcaata cgtttaaagg gcttaccgtc tccattcacg gcgacatcaa gcatagcaga 480
gtggcaaggt caaatgcgga agtgttgaca agattgggtg cccgggtcct attttccggc 540
ccttcggaat ggcaggatga agaaaataca ttcggcacgt atgtctcaat ggatgaagca 600
gttgagtctt ccgatgttgt catgctgctg cgcattcaaa atgaacgaca tcagtccgct 660
gtcagtcagg aaggctattt aaacaaatac ggcttgaccg tagaacgggc tgagcgtatg 720
aagcggcatg cgatcatcat gcatcctgct ccggtaaaca gaggagtgga gattgatgac 780
agcttagtag aaagcgaaaa atcaagaatc ttcaagcaaa tgaaaaatgg cgtatttatc 840
agaatggcag tgatacagcg tgccttacaa accaatgtga aaagaggaga agcagcgtat 900
gtcatatctc attaaaaacg gctggatact aaacgaaaat ggtgaaaaaa cacaagcgga 960
tatccgagtg actggagaaa ccatcaccgc aatcggcaag cttgatgcaa cggataatga 1020
aacggtaatt gatgcaaaag gtttgctcgt ttcacctggg tttgttgatc tccacgtgca 1080
tttcagagag ccgggcggag agaaaaaaga aactattgaa accggggcaa aagcagcggc 1140
gcgcggcggc tatactacag tagcagcaat gccgaatacg cggccggttc ctgatacaaa 1200
ggagcagatg gaatgggtgc aaaacagaat taaagaaaca tcatgcgtaa gagttcttcc 1260
atatgcatcc attacgatca gacaaatcgg cgatgaaatg acaaactttg aagcgttaaa 1320
agaagccggg gcatttgctt ttacagatga cggcgttggt atacagacag caggaatgat 1380
gtatgaagcg atgaaacggg cagccgcaat tgacaaagcg attgttgcac attgcgagga 1440
caactcctta atttacggag ggagcgtaca tgaggggaca ttctccaaag cgaacgggct 1500
aaacggcatt ccttctgtgt gtgaatcggt tcatattgct cgcgatgtgc tgctggctga 1560
ggcggcaaac tgccattatc atgtatgcca tatcagcaca aaagaatctg tcagagttgt 1620
acgcgatgcg aaaaaagcgg gaatcagagt gacagcagaa gtatcgccgc atcatttgct 1680
gctttgtgat gaggacatcc cggggctgga cacaaactat aaaatgaatc ctccgctccg 1740
cagcccagaa gacagagctg ctttaattga aggtctttta gacggaacaa ttgattttat 1800
cgcaacagac catgcaccgc atacggaaga agagaagaac acagaaatga agctggcgcc 1860
attcggaatt gtcggcttag aaacagcatt cccgcttctt tacacacact ttgtcaaaaa 1920
tggcagctgg tcactgaagc agctgattga ctacatgaca atcaagccat gcgaagcgtt 1980
cggtctccca tatggaacat tacaaacggg gcaagctgcg gacattacgt taatcgattt 2040
agaaaaagaa gcagttatag acaaagagac atttttatca aaaggaaaaa atacaccatt 2100
caacggcatc agttgcaccg gctggccggt cgctacaatt gcggcaggga agcttgctta 2160
tgaagagggg agacttgtca aatgaagaga cgattagtac tggaaaacgg agcggtattc 2220
gagggagaag ctttcggaag cttagaacac aacatgggag aagtcgtttt taatactggg 2280
atgacaggct atcaggaaat tttatctgat ccttcttact gcggacagat cgtaacatta 2340
acatacccgc ttatcggaaa ttacggcatt aaccgtgatg attttgaatc cattacccct 2400
tttgtcaaag ggctgatcat caaagaatta tgtgagctgc cttccaactg gcgttcagca 2460
tacaccttag acgagtattt aaaaatgaaa aacattcccg gactccaggg aattgataca 2520
aggaagctga caagaatgat ccgcacggca ggcgcgctaa aaggaacatt cgcttcatct 2580
gatgaagata tcgaagcagt gctgaaaaga ctgaacgaaa cggaattgcc aagaaatcaa 2640
gtatcccaag tatcagcaaa aacagcatat ccgagcccgg gaagaggcaa acgcattgtc 2700
ttggttgact tcggcatgaa acacgggatt ctaagagagc tgaacaaacg gaaatgtgac 2760
gtcatcgttg tgccttacaa cattacagcg gaagaggtgc ttcagctgaa accggacggt 2820
atcatgcttt ctaacggacc tggagacccg aaggatgtgc ctgaagcgat tgaaatgatt 2880
aaaggtgttc ttggaaaagt gccattattc ggaatatgtc tcggccacca attattcgcg 2940
ctggcgtgcg gggcgaatac tgaaaaaatg aaattcggcc acaggggctc aaaccacccg 3000
gtaaaagagc tggctacagg aaaagttgcc ttaacatctc aaaaccatgg atatacagtt 3060
tcgtctatca gtaaaacaga actggaagtg acgcatatcg caattaacga cgatacgatt 3120
gaagggctga agcataaaac attgccggca tttacggttc aatatcatcc cgaagcctca 3180
cctggtcctg aggatgccaa ccatctattt gacagattca tcgaaatgat cgaaacaaca 3240
gagaaagaag gggaagcggt atgccaaaac gcgtagacat taacaaaatt ttagtaatcg 3300
gatctggacc gatcatcatc ggccaagcag cagaatttga ctatgcggga acacaagcct 3360
gtcttgcttt gaaagaagaa ggctatgaag tcatccttgt caactcaaac cctgcaacga 3420
tcatgacaga tacagaaatg gctgaccggg tttacatcga accgctcaca cctgaattcc 3480
tgacacgaat catcagaaaa gagcgcccgg atgccattct tcctacactc ggaggccaaa 3540
ccggtttgaa tcttgcggtt gagctttctg aaagaggcgt tttggcagaa tgcggcgtcg 3600
aagtgcttgg cacgaaactg tctgcgattc agcaagctga agaccgtgac ttgttcagaa 3660
cattaatgaa tgaactgaat gaaccggtgc ctgaaagtga gattatccac tcccttgaag 3720
aagcagaaaa attcgtcagt caaattggat tccctgtcat tgtccgcccg gcatatacat 3780
taggcggaac aggcggaggc atctgctcga atgaaacaga gctaaaagaa atcgttgaga 3840
acggcttgaa attaagcccg gtacaccaat gtctgcttga aaaaagcatc gccggctata 3900
aagaaatcga gtatgaagtc atgagagaca gccaggatca cgccattgtc gtttgtaaca 3960
tggaaaacat tgatccagtt ggaatccata ctggagacag tattgttgtc gcgccgagcc 4020
aaacgctcag cgatcgcgaa tatcagctct tgcggaatgt atcgttaaaa ctgattcgcg 4080
cgcttgggat cgaaggcgga tgtaatgtcc agctcgcctt agatccagac agcttccaat 4140
attacattat tgaagtaaat ccgcgtgtca gccgttcatc tgcccttgca tcaaaagcaa 4200
cggggtaccc gattgcaaag ctcgctgcta aaattgcagt cggactttca ttagatgaaa 4260
tgatgaaccc ggtgacagga aaaacatatg cagcatttga acctgctctt gactatgtcg 4320
tatccaaaat tccgcgctgg ccgtttgata agtttgaatc agcaaacaga aagcttggca 4380
cgcaaatgaa agcgacaggt gaggtcatgg caatcggccg cacgcttgaa gagtcattgc 4440
tgaaggcagt gcgatcactg gaagcggatg tgtatcatct tgaattgaag gacgccgctg 4500
acatttcaga tgagcttctt gaaaagcgaa ttaaaaaggc cggtgatgaa cgcttattct 4560
acttagctga agcgtacaga agaggctaca cggtagaaga cctccatgaa ttttccgcta 4620
tcgatgtctt cttcttgcat aagctgttcg gaatcgtaca gtttgaaaaa gaattgaagg 4680
ccaatgcggg cgatacagat gtgctgagac gggcaaaaga actcggcttc tctgatcagt 4740
acatcagccg tgaatggaaa atgaaagaat ctgagcttta cagcttgaga aaacaagcgg 4800
ggattgcgcc ggtattcaaa atggtagata catgcgcggc ggaatttgag tcagaaacgc 4860
catacttcta tagcacatat gaagaagaaa atgaatctgt cgttacagat aagaaaagtg 4920
tgatggtgct tggttcgggt ccgattcgaa tcggtcaggg tgtcgagttc gactatgcga 4980
cggttcactc tgtatgggca attaaacaag caggctatga agccattatt gtcaacaaca 5040
acccggaaac cgtttcaaca gacttcagca tctcagacaa gctgtatttt gaaccgctta 5100
cgattgaaga tgtcatgcac atcattgacc tcgaacagcc aatgggcgtt gtcgtacaat 5160
ttggcggaca aactgcgatt aaccttgctg acgagctttc tgcacgcgga gtgaaaatcc 5220
ttggaacttc attagaagat ttagaccgtg ccgaagaccg ggataaattt gaacaagcgc 5280
ttggagaact tggtgttcct cagccgcttg gcaaaacagc gacatcagtt aatcaggcgg 5340
taagcatcgc aagtgatatc ggttatccgg tactggtacg cccttcctat gtacttggcg 5400
gccgggcgat ggagattgtt taccatgaag aggaactgct tcattacatg aaaaatgcag 5460
tcaaaatcaa tccacagcac cctgtattaa ttgatagata cttgaccgga aaagaaattg 5520
aagtcgatgc agtatccgac ggtgaaacag tcgtcattcc gggaattatg gagcacattg 5580
aacgtgcggg cgttcactcc ggagactcaa tcgctgttta tccgcctcag tctctcacag 5640
aggacattaa gaaaaaaatt gaacaataca cgatcgcatt ggctaaaggg ctgaatattg 5700
tcggtttgct caatattcaa ttcgtcttgt cgcaaggcga ggtgtacgtg ctagaagtga 5760
atccgagatc aagcagaacc gtaccgtttt taagcaaaat tacgggtatc ccaatggcga 5820
atctcgcaac aaaaatcatt cttggtcaaa agctggctgc gtttggctat acagagggcc 5880
ttcagcctga acagcaaggt gtatttgtaa aagcgccggt cttctccttt gccaagctga 5940
gaagagtgga tattacgtta gggcctgaaa tgaaatcaac aggtgaagtc atggggaaag 6000
attcgacact tgaaaaggcg ctctacaaag ccttgatcgc ttcaggtatt caaatcccga 6060
actacggttc cgtgctttta acagtagctg ataaggacaa agaagaaggg cttgccattg 6120
ctaagcggtt ccacgcgatc ggctacaaca ttttagcgac ggaaggaacg gcaggctacc 6180
tgaaagaagc ttccattcca gcgaaggtcg tcggaaaaat cggtcaggat ggcccgaact 6240
tgcttgatgt catcagaaac ggagaagcgc agtttgtcat caatacgctg acaaaaggaa 6300
agcagccggc aagagacggt tttagaatca gacgtgaatc agtagaaaat ggtgttgcct 6360
gcctaacatc tttagatacg gcagaggcga tattgcgagt gctggaaagc atgacattcc 6420
gtgctgatca aatgccggca gtcaacacaa atcaggaggc ggcagtcact atatgaaaaa 6480
agcgtatttg acagtatgtt ctaaccagca aattgcagac cgggtgtttc aaatggttct 6540
gaaaggggag cttgtccaag ggtttacaac ccctggacag ttccttcatc ttaaagtgag 6600
cgaagcggtt acgcctcttt tgagaaggcc gatcagcatc gcagacgtca actttgaaaa 6660
aaatgaagtc accatcattt atcgggtaga tggggaaggg acaagactct tgtcactgaa 6720
gcagcaggga gaacttgtgg atgtcctcgg gcctttggga aatggctttc ctgttaatga 6780
agttcaaccc ggaaagacgg ctttgctggt aggaggcgga gtaggtgtgc cgcctctcca 6840
agagctgtcg aaacgcttga ttgaaaaagg ggtaaatgtc atccacgttt taggattcca 6900
atcggcaaag gatgtttttt acgaggaaga atgccggcag tacggagaca cgtatgtggc 6960
aacagctgac ggaagctacg gggaaaccgg atttgtcaca gatgtgatta aacggaaaaa 7020
gctagagttt gatatcctcc tcagctgcgg gccgacaccg atgctcaagg cgttaaaaca 7080
ggaatatgcc cataaagaag tatatctgtc catggaggaa cgaatgggct gcggaatcgg 7140
cgcatgcttc gcgtgtgtgt gccatacaaa cgaaagtgag acatcctatg taaaagtatg 7200
tctcgacggg cctgtattta aagctcagga ggtggcgctg taatgctaga ggtgaaattg 7260
ccgggacttg atttgaaaaa cccaatcatt cctgcatcag gctgcttcgg ttttggaaaa 7320
gaattttcac gtttttatga tttgtcttgt cttggagcta tcatgattaa ggctacgaca 7380
aaggagccgc gctttgggaa tccgacgccg cgggtagctg agactggtgc tggaatgctc 7440
aatgcgatcg gtctccaaaa tccggggctg gatagtgtgt tgcatcatga gctgccgtgg 7500
cttgagcagt ttgatacacc gatcattgcc aatgtcgcag gttctcaagt cgatgattat 7560
gttgaagtcg cagaacatat cagcaaagcg cctaatgttc atgctcttga attgaatatt 7620
tcctgcccga atgtgaaaac aggcggaatc gcttttggca cgaatcctga aatggctgcc 7680
gatttgacaa aagcggtgaa agaggtttcg gatgtacccg tttatgtgaa gctatccccg 7740
aacgtggcta atatcacaga aattgcatta gcgatcgagg aagcgggagc ggacggtctt 7800
acgatgatca acacactaat cggcatgaga ctcgatttaa aaaccggcaa accgatatta 7860
gcgaataaaa cagggggact ttcgggccct gctgtgaagc cggttgccat tcgcatggtg 7920
tatgaagtca gccagatggt caacatcccg attatcggaa tgggaggcgt gcaaacggct 7980
gaagatgccc tggaatttct tctcgcggga gcaagcgcag tcgctgtcgg aacagcaaac 8040
tttgtgaatc cttttgcatg tccagagatt attgaacagc tcccatctgt tttgctccaa 8100
tacggctatc aatcaattga agaatgcatc ggaaggagct ggaatcatga aaaacaacct 8160
gcccatcatc gcgcttgatt ttgcgtcagc tgaagaaaca cttgcgttct tagcgccttt 8220
tcagcaagaa ccgttatttg taaaggttgg gatggagctt ttttatcaag aagggccatc 8280
tatcgtgaaa caactaaaag aaagaaactg cgagctattt ttagatctaa agcttcatga 8340
catcccgact actgtaaaca aagcgatgaa gcgccttgcc agtcttggag tagacctcgt 8400
caatgttcat gctgccgggg gcaaaaaaat gatgcaggca gctctcgaag gcttagaaga 8460
aggtacgccg gctggaaaaa aacgtccgtc acttatcgcg gtaacccagc tgacaagcac 8520
atctgaacaa atcatgaaag atgaactgct gatcgaaaag tctctgattg atacggttgt 8580
gcactacagc aaacaggcgg aagaaagcgg actggatgga gtggtctgct ctgttcatga 8640
agcaaaagcc atttaccaag cggtgtcgcc ttcatttctg actgtcactc cggggatcag 8700
aatgtcagag gacgctgcga atgaccaagt tcgcgtagcg acgcctgcca ttgcaagaga 8760
gaaaggttca tcagcgattg tagtaggacg ctcgattaca aaagcggaag acccggtaaa 8820
agcctataag gctgtcagac ttgaatggga gggaatcaaa tcttgaaaca aatcatcgca 8880
aaacatctat tagacatcca agctgtattt ttacgcccga acgagccgtt cacatgggca 8940
agcggcattt tatcaccgat ctactgtgac aaccgcctta cgctatcttt cccagaggtc 9000
agaaacgatg ttgcttcagg tatcagcaag cttgttaaag agcattttcc tgaagctgaa 9060
atgattgcgg gaacagcaac tgccggtatt cctcatgctg ctcttgcggc ggaccatttg 9120
aatcttccga tgtgttatgt gaggagcaag ccgaaggcgc acggaaaagg caatcagatt 9180
gagggagctg tgcaagaagg gcaaaaaaca gtcgtcattg aagacttaat ttccacagga 9240
ggcagcgtgc ttgaagcttg tgcagcttta caagcggccg gctgtgaagt gcttggtgtc 9300
gtctcaatct ttacgtacgg acttcctaaa gcggaggaag ccttcgcaaa ggcagaactg 9360
ccatactact cattaaccga ttatgatacg ctcacagagg tcgcgcttga aaacggaaat 9420
attcattcag atgatctaaa aaagctgcaa acatggaaac gaaatcccga gtcaaaagat 9480
tggtttaaaa aataa 9495
<210> 2
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaaaaac caaaatacaa acgtatcgta ttaaagctta gcggggaagc attggcagga 60
gaacagggaa atggaattaa cccgactgtc attcaatcca ttgcaaagca agtgaaggaa 120
atcgctgagc ttgaagtcga agtggctgtt gttgtaggcg gcggcaactt atggcgcgga 180
aaaacaggaa gtgacctggg catggaccgc gcgactgctg actatatggg aatgctggcg 240
acagtaatga attcgcttgc tcttcaagcc agcttggaaa cactcggaat ccagtccaga 300
gtgcaaacat ccattgaaat gagacaagtt gctgaaccgt acataagaag aaaagcgata 360
cgccacttag agaaaaaacg tgtcgttatt ttcgctgcgg gcacaggaaa cccatatttc 420
tcaactgata cgacagctgc actgcgggct gctgaaattg aggcagacgt tattttaatg 480
gctaaaaata acgttgacgg tgtgtataat gctgatccta gaaaagatga atcagctgtt 540
aagtatgaat cactttctta tcttgacgtt cttaaagacg gcctggaagt catggattca 600
acagcttcct ctttatgcat ggacaatgac attccgctta tcgtcttttc tattatggaa 660
gaaggaaata tcaaacgtgc cgttatcggt gaatcaatcg gaacgatcgt gagggggaaa 720
taa 723

Claims (8)

1.一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：该基因工程菌株异源过表达枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A，天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX和噬菌体PBS1的5’-核苷酸酶基因TMPase，其中pyrHD90A是pyrH基因编码的氨基酸序列第90位的天冬氨酸替换为丙氨酸；过表达大肠杆菌的核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC；并且不表达嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于：所述嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；和/或
所述尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；和/或
所述胸苷酸合酶基因thyX的NCBI-GeneID:1101182；和/或
所述5’-核苷酸酶基因TMPase的NCBI-GeneID:40524272。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：所述嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE连接有启动子Ptrc；和/或
所述尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A连接有启动子Ptrc；和/或
核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC连接有启动子Ptrc；和/或
所述胸苷酸合酶基因thyX连接有启动子Ptrc；和/或
所述5’-核苷酸酶基因TMPase连接有启动子Ptrc。
4.根据权利要求1或2所述的基因工程菌株，其特征在于：用于构建所述大肠杆菌基因工程菌株的出发菌株是E.coli MG1655。
5.权利要求1-4任一所述基因工程菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括：在出发菌株大肠杆菌中引入枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷操纵子基因pyrBCAKDFE，尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A，天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX，噬菌体PBS1的5’-核苷酸酶基因TMPase；过表达核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC；并且将嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp以及核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC敲除或失活。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述构建方法进一步包括：
(1)从菌株E.coli MG1655基因组出发，将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的嘧啶核苷操纵子pyrBCAKDFE与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-pyrBCAKDFE整合在yghX假基因位点；
(2)将嘧啶核苷磷酸化酶基因deoA，胸苷激酶基因tdk，尿苷磷酸化酶基因udp，核苷水解酶基因rihA、rihB、rihC敲除；
(3)将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的尿苷酸激酶突变基因pyrHD90A与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-pyrHD90A整合在yeeL假基因位点；
(4)将大肠杆菌的核糖核苷二磷酸还原酶操纵子基因nrdABC与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-nrdABC整合在yciQ假基因位点；
(5)将天蓝色链霉菌的胸苷酸合酶基因thyX与启动子Ptrc的融合片段Ptrc-thyX整合在gapC假基因位点；
(6)将噬菌体PBS1的5’-核苷酸酶基因TMPase与Ptrc的融合片段Ptrc-TMPase整合在mbhA假基因位点。
7.权利要求1-4任一所述基因工程菌株在发酵生产胸苷中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：在适宜条件培养所述基因工程菌株，并从其培养物中收集胸苷；所述适宜条件是指培养温度35℃，维持pH在7.0左右，溶氧在25～35％之间，并且培养基组成为：葡萄糖15～25g/L，酵母粉1～4g/L，蛋白胨1～5g/L，柠檬酸0.1～2g/L，K2HPO4·3H2O 3～7g/L，MgSO4·7H2O 0.1～2g/L，FeSO4·7H2O 5～20mg/L，MnSO4·H2O 5～20mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12和VH各0.1～2mg/L，微量元素混合液1mL/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0～7.2。
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