CN110249054A - 产生imp的微生物和使用其产生imp的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及具有增强的IMP输出蛋白活性的产生5'‑肌苷一磷酸的棒杆菌属的微生物；使用其制备5'‑肌苷一磷酸的方法；用于产生5'‑肌苷一磷酸的组合物；和用于增加5'‑肌苷一磷酸的输出的方法。

Description

产生IMP的微生物和使用其产生IMP的方法
[技术领域]
本公开涉及具有增强的IMP输出蛋白活性的产生5'-肌苷一磷酸的棒杆菌属的微生物；使用其制备5'-肌苷一磷酸的方法；用于产生5'-肌苷一磷酸的组合物；和增加5'-肌苷一磷酸的输出的方法。
[背景技术]
5'-肌苷一磷酸(下文称为‘IMP’)，其为基于核酸的物质，是核酸代谢途径中的中间体并且在各种领域(诸如食品、药物和各种医学应用)中使用。具体而言，IMP与5'-鸟嘌呤一磷酸(下文称为‘GMP’)一起广泛用作食品调味料添加剂或食品。尽管已知IMP本身具有牛肉味道，但也已知其增强谷氨酸钠(MSG)的风味；因此IMP已作为风味极佳的基于核酸的调味料引起许多关注。
用于制备IMP的方法的实例包括酶促降解从酵母细胞提取的核糖核酸的方法(日本专利公开号1614/1957)，将通过发酵产生的肌苷化学磷酸化的方法(Agri. Biol.Chem., 36, 1511, 等)，和培养直接产生IMP的微生物且在培养基中回收IMP的方法。在这些方法中，最广泛使用的是使用能够直接产生IMP的微生物的方法。
[公开内容]
[技术问题]
为了使用通过微生物发酵直接产生IMP的方法以高产率产生IMP，应当顺利地输出IMP。为了实现这种目的，本发明人进行了广泛的研究，并研究了参与IMP输出能力的输出蛋白；作为结果，他们鉴定了ImpE1和ImpE2，其为参与IMP的输出的蛋白。经证实，当作为参与IMP的输出的蛋白的ImpE1和ImpE2的活性增强时，IMP浓度增加，由此完成了本公开。
[技术方案]
本公开的一个目的是提供产生IMP的棒杆菌属的微生物，其具有增强的IMP输出蛋白的活性。
本公开的另一个目的是提供用于制备IMP的方法，其包括在培养基中培养本公开的棒杆菌属的微生物。
本公开的又另一个目的是提供用于产生IMP的组合物，其包含其中增强本公开的IMP输出蛋白的活性的蛋白。
本公开的又另一个目的是提供用于增加IMP的输出的方法，其包括增强在棒杆菌属的微生物中本公开的IMP输出蛋白的活性。
[有利效果]
在本公开中，可以使用具有增强的IMP输出蛋白的活性的产生IMP的棒杆菌属的微生物制备IMP。
[实施本发明的最佳方式]
在下文中，将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每种描述和实施方案可以分别应用于其他描述和实施方案。也就是说，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。进一步，以下公开的具体描述不应被解释为限制本公开的范围。
为了实现上述目的，本公开的一个方面是提供产生IMP的棒杆菌属的微生物，其具有增强的IMP输出蛋白活性。
如本文所用，术语“5'-肌苷一磷酸输出蛋白”是指参与5'-肌苷一磷酸(IMP)的细胞外输出的蛋白。对于本公开的目的，上述术语可以与具有IMP输出能力的蛋白、具有5'-肌苷一磷酸输出能力的蛋白、IMP输出蛋白等可互换使用，并且具体地可以表示为ImpE，更具体地，ImpE1和ImpE2，但不限于此。此外，所述蛋白可以源自棒杆菌属种，具体地停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但不限于此。例如，可以使用源自停滞棒杆菌并且具有IMP输出能力和与其相应的效果的蛋白作为本公开的蛋白。
所述蛋白可以由例如SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列构成，但包含具有与所述蛋白的活性相同的活性的序列，并且本领域技术人员可以从NCBI的GenBank(众所周知的数据库)获得序列信息。此外，所述蛋白可以包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:1或2具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性或同一性的氨基酸序列。此外，显而易见的是，具有一些序列的缺失、修饰、取代或添加的蛋白可以用作本公开的蛋白，只要所述氨基酸序列具有上述同源性或同一性，并表现出与所述蛋白的效果相应的效果。
也就是说，尽管在本公开中描述为“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白”或“由特定SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白”，但所述蛋白可以具有与由相应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的蛋白的活性相同或相应的活性。在这种情况下，显而易见的是，氨基酸序列在序列的一部分中具有缺失、修饰、取代、保守取代或添加的任何蛋白也可用于本公开中。例如，在具有与修饰蛋白的活性相同或相应的活性的情况下，其不排除不改变所述蛋白的功能的在氨基酸序列的上游或下游的序列的添加，可能天然存在的突变，其沉默突变或保守构成，且甚至当存在序列添加或突变时也是如此，其显然属于本公开的范围。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列匹配的程度，并且可以表示为百分比。
术语“同源性”和“同一性”经常可以与彼此可互换使用。
保守多核苷酸或多肽序列的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法确定，并且可以连同由所使用的程序建立的默认空位罚分使用。基本上，通常预期同源或相同的序列在中等或高严格性下沿着所述序列的整个长度或所述序列整个长度的至少约50%、约60%、约70%、约80%或约90%进行杂交。还考虑在杂交多肽中含有简并密码子而不是密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以使用已知的计算机算法诸如“FASTA”程序(Pearson等人, (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA85]: 2444: 使用2444中的默认参数)来确定。或者，这可以使用以下来确定：Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)（其在EMBOSS包的Needleman程序((EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人, 2000, Trends Genet.16:276-277) (版本5.0.0或其后的版本) (GCG程序包(Devereux, J., 等人, Nucleic Acids Research 12:387 (1984))中进行）、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, [S.] [F.] 等人, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guideto Huge Computers, Martin J. Bishop, [编,] Academic Press, San Diego, 1994,和[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073)。例如，可以使用NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI)的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。
多核苷酸或多肽序列的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如如所公开(例如，Smith和Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482)的GAP计算机程序(例如，Needleman等人, (1970), J Mol Biol.48 : 443)比较序列信息来确定。简而言之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将相似比对的符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短的符号的总数获得的值。GAP程序的默认参数可以包括：(1)一元比较矩阵(对于同一性，含有值1，且对于非同一性，含有值0)和Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff, 编, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,pp.353-358, 1979中所公开；(2)每个空位的罚分为3.0，且每个空位中的每个符号的额外罚分为0.10(或空位开放罚分为10，且空位延长罚分为0.5)；和(3)末端空位没有罚分。因此，如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指序列之间的相关性。
如本文所用，术语“活性的增强”意味着引入蛋白的活性，或者与内源活性或微生物修饰前的活性相比活性得到提高。活性的“引入”意味着出现特定蛋白的活性，其不是微生物天然或人工固有的。“内源活性”是指当通过由天然或人工因素引起的遗传变异转化微生物时，转化前的亲本菌株最初具有的特定蛋白的活性。
例如，活性的增强可以包括通过将外来IMP输出蛋白引入宿主细胞来增强活性，或增加内源IMP输出蛋白的活性。
具体地，在本公开中，活性的增强可以通过以下方法进行：
1) 增加编码(也即是说，编码)所述蛋白的多核苷酸的拷贝数；
2) 修饰表达调节序列用于增加多核苷酸表达；
3) 修饰染色体上的多核苷酸序列用于增强所述蛋白的活性；或者
4) 其组合，所述方法不限于此。
在上述方法1)中，编码酶的多核苷酸的拷贝数的增加可以通过将多核苷酸可操作连接至载体，或通过将其插入宿主细胞的染色体中来实现，但不特别限于此。此外，在一个实施方案中，拷贝数的增加可以通过将表现出蛋白活性的外源多核苷酸或变体形式多核苷酸(其中针对上述多核苷酸进行密码子优化)引入宿主细胞来进行。可以使用外源多核苷酸而不限制其来源或序列，只要其表现出相同/相似的蛋白活性。本领域技术人员可以通过适当选择已知的转化方法来实施引入，并且可以通过在宿主细胞中表达引入的多核苷酸来产生蛋白以增加其活性。拷贝数的增加可以使得所述多核苷酸以串联形式连续存在。在这种情况下，编码不同IMP输出蛋白的多核苷酸序列可以以交叉、依次和重复的方式存在。当所述多核苷酸以串联形式连续存在时，可能存在重叠部分，但不限于此。具体地，在本公开中，可以增加SEQ ID NO:3、4或5的多核苷酸序列的拷贝数。
此外，2)用于增加多核苷酸表达的表达调节序列的修饰可以通过经由核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合来诱导对表达调节序列的修饰；或者通过用具有更强活性的核苷酸序列替换表达调节序列来进行，但不限于此。所述表达调节序列包括但不特别限于启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列和调节转录和翻译的终止的序列。具体地，可以在多核苷酸表达单元的上游连接强异源启动子而不是原始启动子，并且强启动子的实例可以包括CJ7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等。通过将启动子与多核苷酸可操作连接，可以提高编码蛋白的多核苷酸的表达率，但不限于此。
此外，3)染色体上多核苷酸序列的修饰，尽管不特别限于此，但可以通过如下进行：经由多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导表达调节序列上的变异以进一步增强多核苷酸序列的活性，或者用经修饰以具有更强活性的多核苷酸序列替换所述序列。
最后，4)用于通过1)至3)的组合增强的修饰方法可以通过应用以下中的一种或多种方法来实施：增加编码蛋白的多核苷酸的拷贝数的方法，修饰多核苷酸序列用于增强多核苷酸表达的方法，以及修饰染色体上的多核苷酸序列和修饰表现出蛋白活性的外源多核苷酸或变体形式多核苷酸(其中密码子被优化)的方法。
此外，显而易见的是，也可以包括这样的多核苷酸，其可以通过密码子简并性翻译成由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白，或者翻译成与其具有同源性的蛋白。例如，所述蛋白可以由SEQ ID NO:3、4或5的多核苷酸序列构成。此外，可以非限制性地包括编码具有由SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列组成的蛋白的活性的蛋白的序列，所述序列在严格条件下与可以从已知基因序列（例如，核苷酸序列的全部或部分的互补序列）制备的探针杂交。术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间的特异性杂交的条件。这些条件在文献(例如，J. Sambrook等人, Sangdong)中具体描述。例如，所述严格条件可以包括其中具有高同源性(例如，40%或更高、具体地90%或更高、更具体地95%或更高、甚至更具体地97%或更高且最具体地99%或更高)的基因在它们之间可以杂交，而具有其更低同源性的基因不能与彼此杂交的条件；或者用于常规southern杂交的条件(即，用于在对应于60℃、1× SSC和0.1%SDS；具体地60℃、0.1× SSC和0.1% SDS；且更具体地68℃、0.1× SSC和0.1% SDS的盐条件和温度下洗涤一次、且具体地两次或三次的条件)。
杂交需要两个核酸具有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述能够与彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括实质上相似的核酸序列以及与完整序列互补的分离的核酸片段。
具体地，可以使用包括在55℃的Tm值下的杂交步骤的杂交条件和使用上述条件来检测具有同源性的多核苷酸。进一步，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此；并且可以根据其目的由本领域技术人员合适地调整。
杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补性，并且变量是本领域众所周知的(请参考Sambrook等人, 同上, 9.50-9.51, 11.7-11.8)。
如本文所用，术语“载体”是指含有编码期望蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，所述编码期望蛋白的多核苷酸的核苷酸序列与合适的调节序列可操作连接，使得期望蛋白在合适的宿主细胞中表达。所述调节序列可以包括能够起始转录的启动子，用于调节转录的任何操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和调节转录和翻译的终止的序列。在合适的宿主细胞中转化之后，所述载体可以复制或执行其功能而无论宿主基因组，或者可以整合至基因组本身中。
本公开中使用的载体没有特别限制，只要其可以在宿主细胞中表达，并且可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A可用作噬菌体载体或粘粒载体；并且基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL和基于pET的可以用作质粒载体。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC载体，但载体不限于此。
可以在本公开中使用的载体没有特别限制，并且可以使用已知的表达载体。此外，编码靶蛋白的多核苷酸可以通过用于细胞内染色体插入的载体插入染色体中。将多核苷酸插入染色体中可以通过任何方法进行，例如通过同源重组进行，但不限于此。所述载体可以进一步包括选择标记，用于指示载体插入染色体中。适合于表示用载体转化的细胞，也就是说，靶基因是否插入宿主细胞的基因组中，选择标记可以为细胞提供显示药物抗性、细胞毒性剂抗性、营养缺陷型或可选择性表型表达诸如表面蛋白的表达的能力。在处理选择性试剂的环境中，只有表达选择标记的细胞存活或表达另一种表型，且因此可以选择转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”意味着将含有编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，使得由多核苷酸编码的蛋白能够在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸可以是任一种，而无论位置，只要所述多肽能够在宿主细胞中表达，无论多核苷酸是否插入并定位至宿主细胞的染色体中或位于染色体的外部。此外，所述多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。可以以任何形式(shape)引入多核苷酸，只要所述多核苷酸能够被引入待表达的宿主细胞中。例如，可以将所述多核苷酸作为表达盒形式引入宿主细胞中，所述表达盒形式是包括自我表达所需的所有因子的基因结构。所述表达盒可以包括启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和可与所述多核苷酸可操作连接的翻译终止信号。所述表达盒可以是进行自我复制的表达载体。另外，可以将所述多核苷酸自身引入宿主细胞中，以便与宿主细胞中表达所需的序列可操作连接，但不限于此。转化方法包括将核酸引入细胞的任何方法，并且可以通过选择本领域已知的合适标准技术来实施。例如，所述方法的实例可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)、沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术和乙酸锂 -DMSO技术，但不限于此。
此外，术语“可操作连接”是指启动子序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，所述启动子序列起始和介导编码本公开的靶蛋白的多核苷酸的转录。可以使用本领域已知的基因重组技术制备可操作的连接，并且可以使用本领域已知的限制性酶和连接酶进行位点特异性DNA切割和连接，但不限于此。
如本文所用，术语“产生IMP的棒杆菌属的微生物”是指这样的棒杆菌属的微生物，其具有通过其天然形式或变异产生IMP的能力。具体地，在本公开中，产生IMP的棒杆菌属的微生物可以是这样的微生物，其通过插入与天然菌株本身的产生机制或外源IMP相关的基因、或通过增强或减弱内源基因的活性而具有提高的产生IMP的能力。更具体地，产生IMP的棒杆菌属的微生物可以是这样的微生物，其中产生IMP的能力与转化前的亲本菌株或未修饰微生物的能力相比提高。
在本公开中，“棒杆菌属的微生物”可以具体地是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)等，但不限于此。更具体地，在本公开中，所述棒杆菌属的微生物可以是停滞棒杆菌。棒杆菌属的微生物的具体实例可以是这样的停滞棒杆菌，其中通过增强具有将IMP输出至细胞外部的功能的蛋白的活性来提高产生IMP的能力，但不限于此。
本公开的另一个方面提供了用于制备IMP的方法，其包括在培养基中培养具有增强的IMP输出蛋白的活性的棒杆菌属的微生物。
具体地，本公开的方法可以进一步包括从微生物或培养基回收IMP的步骤。
在该方法中，培养微生物可以通过本领域已知的分批培养、连续培养和补料分批培养来实施。此外，关于培养条件，可以使用碱性化合物(即，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(即，磷酸或硫酸)维持合适的pH(即，pH 5至9，特别是pH 6至8，且最特别是pH6.8)。此外，可以通过将氧气或含氧气体混合物引入培养物中来维持需氧条件。培养温度可以维持在20℃至45℃，且特别是25℃至40℃。进一步，培养时间可以是约10至160小时。然而，所述培养条件不限于此。由上述培养物产生的IMP可以分泌至培养基中或可以保留在细胞内。
此外，用于培养的培养基可以单独或组合包含糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)，油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)，脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)，醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(例如乙酸)作为碳源，但培养基不限于此。此外，用于培养的培养基可以单独或组合包含含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米溶液、豆粕粉和尿素)，或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸盐或铵、碳酸铵和硝酸铵)作为氮源，但培养基不限于此。此外，用于培养的培养基可以单独或组合包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其相应的含钠盐作为磷源，但培养基不限于此。此外，所述培养基可以包含其他必需的生长模拟物质，包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。
本公开的用于回收从上述培养方法产生的IMP的方法可以根据培养方法使用本领域已知的合适方法从培养基收集期望的IMP。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物回收期望的IMP。
此外，上述回收方法可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的合适方法实施。因此，回收的IMP可以是纯化形式或含有IMP的微生物发酵液。
本公开的又另一个方面提供了用于产生IMP的组合物，其包含本公开的由SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白，或编码其的多核苷酸。
本公开的组合物可以进一步包括但不限于能够操作所述多核苷酸的组成。此外，在本公开的组合物中，所述多核苷酸可以呈包含在载体内的形式，使得可以表达与引入的宿主细胞可操作连接的基因。
此外，所述组合物可以进一步包含用于产生IMP的组合物中的常规使用的任何合适的赋形剂。此类赋形剂可以是例如防腐剂、保湿剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。
本公开的又另一个方面提供了由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白用于增加棒杆菌属的微生物中IMP的产生的用途。
本公开的又另一个方面提供了用于增加IMP的输出的方法，其包括增强棒杆菌属的微生物中由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白的活性。
本公开的又另一个方面提供了由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白用于增加棒杆菌属的微生物中IMP的输出的用途。
术语“由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白”、“增强”和“棒杆菌属的微生物”如上所述。
[实施方案的详述]
在下文中，将结合所附示例性实施方案详细描述本公开。然而，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本公开的范围。
实施例1：基因组DNA文库的产生
产生停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA文库以鉴定参与IMP输出的棒杆菌的膜蛋白。
其后，由于棒杆菌属的野生型菌株不能产生IMP或产生非常少量的IMP，所以产生具有产生IMP能力的源自ATCC6872的菌株CJI0323以证实产生IMP的能力。将ATCC6872的基因组DNA文库转化至产生的菌株CJI0323中，且然后针对参与IMP输出的野生型膜蛋白实施筛选。具体实验如下。
实施例1-1：产生IMP的菌株CJI0323的选择
将ATCC6872(107个细胞/mL至108个细胞/mL)悬浮于磷酸盐缓冲液(pH 7.0)或柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中以制备ATCC6872-衍生的产生IMP的菌株，且然后通过UV处理诱导突变。将所得物用0.85%盐水溶液洗涤两次，且然后稀释并涂布在培养基上，所述培养基在含有1.7%琼脂的基本培养基中含有适当浓度的抗性物质。其后，获得菌落。将每个菌落在营养培养基中培养，并在种子培养基中培养24小时。在发酵培养基中培养3至4天之后，选择具有最高量的在培养基中积累的IMP的菌落。为了产生高浓度IMP产生菌株，并提供腺嘌呤营养缺陷型、鸟嘌呤渗漏型、溶菌酶敏感性、3,4-二氢脯氨酸抗性、链霉素抗性、氮杂环丁烷羧酸抗性、硫代脯氨酸抗性、重氮丝氨酸抗性、磺胺胍抗性、正缬氨酸抗性和甲氧苄啶抗性，对于每种物质，依次进行上述程序。最终选择对上述物质具有抗性且具有优异的产生IMP的能力的CJI0323。下表1显示ATCC6872的抗性相比于CJI0323的抗性。
[表1]
特性 <i>ATCC6872</i> <i>CJI0323</i>
腺嘌呤营养缺陷型 非营养缺陷型 营养缺陷型
鸟嘌呤渗漏型 非营养缺陷型 渗漏营养缺陷型
溶菌酶敏感性 80 μg/mL 8 μg/mL
3,4-二氢脯氨酸抗性 1000 μg/mL 3500 μg/mL
链霉素抗性 500 μg/mL 2000 μg/mL
氮杂环丁烷羧酸抗性 5 mg/mL 30 mg/mL
硫代脯氨酸抗性 10 μg/mL 100 μg/mL
重氮丝氨酸抗性 25 μg/mL 100 μg/mL
磺胺胍抗性 50 μg/mL 200 μg/mL
正缬氨酸抗性 0.2 mg/mL 2 mg/mL
甲氧苄啶抗性 20 μg/mL 100 μg/mL
培养基的组成如下：
-基本培养基：2%葡萄糖，0.3%硫酸钠，0.1% KH2SO4，0.3% K2HPO4，0.3%硫酸镁，氯化钙(10 mg/L)，硫酸铁(10mg/L)，硫酸锌(1 mg/L)，氯化锰(3.6 mg/L)，L-半胱氨酸(20 mg/L)，泛酸钙(10 mg/L)，盐酸硫胺素(5 mg/L)，生物素(30 μg/L)，腺嘌呤(20 mg/L)，鸟嘌呤(20mg/L)，pH 7.3
- 营养培养基：1%蛋白胨，1%肉汁，0.25%氯化钠，1%酵母提取物，2%琼脂，pH 7.2
- 种子培养基：1%葡萄糖，1%蛋白胨，1%肉汁，1%酵母提取物，0.25%氯化钠，腺嘌呤(100mg/L)，鸟嘌呤(100 mg/L)，pH 7.5
-发酵培养基：0.1%谷氨酸钠，1%氯化铵，1.2%硫酸镁，0.01%氯化钙，硫酸铁(20 mg/L)，硫酸锰(20 mg/L)，硫酸锌(20 mg/L)，硫酸铜(5 mg/L)，L-半胱氨酸(23 mg/L)，丙氨酸(24mg/L)，烟酸(8 mg/L)，生物素(45 μg/L)，盐酸硫胺素(5 mg/L)，腺嘌呤(30 mg/L)，1.9%磷酸(85%)，2.55%葡萄糖，1.45%果糖。
实施例1-2：CJI0323发酵滴度的实验
将种子培养基(2 mL)分配至试管(18 mm直径)中，然后将其高压灭菌，并将各自用ATCC6872和CJI0323接种。其后，将产物在30℃下振荡培养24小时，且然后用作种子培养溶液。将发酵培养基(29 mL)分配至Erlenmeyer烧瓶(250 mL)中并在121℃下高压灭菌15分钟。其后，向其中接种每种种子培养溶液(2 mL)，且然后将所得物培养3天。培养条件被设定至170 rpm，30℃的温度，和pH 7.5。
在培养之后，使用HPLC (SHIMAZDU LC20A)测量产生的IMP的量，并且培养的结果显示于下表2中。
实施例1-3：输出蛋白的发现
通过在补充有1.7%琼脂的基本培养基中额外添加IMP来建立显示菌株CJI0323的生长抑制的筛选条件。使用电穿孔(van der Rest等人1999)将ATCC6872(基因组文库质粒)转化至菌株CJI0323中。在补充有过量IMP的培养基条件下选择其中释放生长的减少的菌落。从选择的菌落获得质粒，并通过测序技术分析。从上文，在添加过量IMP的条件下鉴定参与释放生长的减少的一种膜蛋白。
通过SEQ ID NO:2的氨基酸序列和SEQ ID NO:5的核苷酸序列(NCBI GenBank:NZ_CP014279，WP_066795121，MFS转运蛋白)鉴定出一种棒杆菌膜蛋白。所述膜蛋白已知为MFS转运蛋白，但其具体功能尚未证实，并且进一步，其关于IMP输出的功能仍然未知。在本公开中，所述膜蛋白被命名为ImpE2(WT)。
实施例2：ImpE1和ImpE2的鉴定
实施例2-1：impE1和impE2的证实
为了检查膜蛋白ImpE2的功能，在NCBI (NCBI GenBank:NZ_CP014279，WP_066795121，MFS转运蛋白)中鉴定SEQ ID NO:5的基因结构。证实SEQ ID NO: 5 (impE2)与位于impE2的上游的基因的ORF (NCBI GenBank:NZ_CP014279，WP_066795119，转录调节因子)的7 bp起始部分重叠。由所述基因或位于impE2上游的相应基因编码的蛋白的功能尚未证实；在本公开中，这种蛋白被命名为ImpE1(WT)(SEQ ID NO:1的氨基酸序列和SEQ ID NO:4的核苷酸序列)。
实施例2-2：impE1-或impE2-缺陷的载体的制备
为了确定当ImpE1或ImpE2(其参与通过IMP释放生长的减少并且通过实施例1和2-1鉴定)被缺失时IMP输出能力是否降低，对于每种基因尝试缺陷载体的制备。
使用ATCC6872基因组DNA 作为模板，通过PCR获得用于构建载体的基因片段。
具体地，将SEQ ID NO:6和7的引物和SEQ ID NO:8和9的引物用于impE1的PCR；并且将SEQ ID NO:10和11的引物和SEQ ID NO:12和13的引物用于impE2的PCR(表3)。
使用的引物基于关于在NIH GenBank中登记的停滞棒杆菌(ATCC6872)基因(NCBIGenbank:NZ_CP014279)和与其相邻的核苷酸序列的信息产生。
如下进行PCR：在94℃下变性5分钟，随后重复25次包括以下的循环：在94℃下变性30秒，在52℃下退火3分钟，和在72℃下聚合1分钟，且然后在72℃下聚合5分钟。使用基因impE1的两个片段(其使用SEQ ID NO:6和7的引物以及SEQ ID NO:8和9的引物增强)作为模板进行重叠聚合酶链式反应。作为结果，获得多核苷酸模板(1.8 kbp)。用限制性酶XbaI消化获得的基因片段。使用T4连接酶用pDZ载体(韩国专利号10-0924065和国际专利公开号2008-033001)制备pDZ-ΔimpE1，所述pDZ载体通过用限制性酶XbaI消化基因片段而获得。此外，使用基因impE2的片段(其通过SEQ ID NO:10和11的引物增强)和基因impE2的两个片段(其通过SEQ ID NO:12和13的引物增强)作为模板进行重叠聚合酶链式反应，并且获得多核苷酸模板(1.7 kbp)。用限制性酶XbaI和speI消化获得的基因片段。使用T4连接酶将基因片段克隆至用限制性酶XbaI消化的pDZ载体中，且然后制备pDZ-ΔimpE2。
实施例2-3：impE1-和impE2-缺陷的载体的制备
由于编码参与释放通过IMP的生长减少的蛋白的基因impE1和impE2是重叠的，所以需要同时调节两个基因。因此，进行尝试以制备其中impE1和impE2两者均缺陷的载体。
对于impE1和impE2的PCR，使用SEQ ID NO:6和14的引物和SEQ ID NO:15和13的引物。使用的引物基于关于在NIH GenBank中登记的停滞棒杆菌(ATCC6872)基因(NCBIGenbank:NZ_CP014279)和与其相邻的核苷酸序列的信息产生。使用基因impE1的片段(其通过SEQ ID NO:6和14的引物增强)和基因impE2的两个片段(其通过SEQ ID NO:15和13的引物增强)作为模板进行重叠聚合酶链式反应，并且获得多核苷酸模板(2.0 kbp)。分别用XbaI和speI消化获得的基因片段。使用T4连接酶将基因片段克隆至用限制性酶XbaI消化的pDZ载体中，且然后制备pDZ-ΔimpE1E2。
实施例2-4：impE1-和impE2-缺陷的菌株的制备
将实施例2-2中制备的两种质粒和实施例2-3中制备的一种质粒各自通过电穿孔转化至CJI0323中(使用Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545中公开的转化方法)。在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体上的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:6和9、SEQ ID NO:10和13以及SEQ ID NO:6和13的引物对实施PCR来确定最终转化的菌株中的基因缺陷。
将选择的菌株命名为CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2。此外，评估上述菌株的产生IMP的能力。
将种子培养基(2 mL)分配至试管(18 mm直径)中，然后将其高压灭菌，并将各自用CJI0323、CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2接种。其后，将所得物在30℃下振荡培养24小时，且然后用作种子培养溶液。将发酵培养基(29 mL)分配至用于振荡的Erlenmeyer烧瓶(250 mL)中并在121℃下高压灭菌15分钟。其后，向其中接种每种种子培养溶液(2 mL)，并将所得物培养3天。培养条件被设定至170 rpm，30℃的温度，和pH 7.5。
在完成培养之后，通过HPLC测量产生的IMP的量，并且培养的结果显示于下表4中。
将每种菌株中积累的IMP量与亲本菌株停滞棒杆菌 CJI0323的IMP量进行比较。作为结果，发现，如上表4中所示，与亲本菌株相比，菌株CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2的IMP浓度在相同条件下降低约8g/L，证实了ImpE1和ImpE2是参与IMP输出的蛋白。
实施例3：野生型impE1和impE2的增强
棒杆菌属的野生型菌株不能产生IMP或产生非常少量的IMP。因此，在作为产生IMP的菌株的CJI0323中，敲除蛋白ImpE，且然后通过引入野生型蛋白ImpE来恢复，并且进一步，ImpE的活性得到增强；由此证实通过增强野生型ImpE而增加输出IMP的能力。在增强方法中，通过使用“增加拷贝数”的方法和增强启动子的方法来实现蛋白活性的增强。
实施例3-1：制备野生型impE1-和impE2-引入的载体
为了制备其中引入野生型ImpE的菌株，使用ATCC6872基因组DNA作为模板通过PCR获得用于制备载体的基因片段。对于野生型impE1和impE2的PCR，使用SEQ ID NO:6和13的引物。将通过SEQ ID NO:6和13的引物增强的野生型impE1-impE2基因的整个片段用限制性酶XbaI和SpeI处理，且然后克隆至pDZ载体的XbaI限制性酶位点中以制备pDZ-impE1E2(WT)。
实施例3-2：野生型impE1增强的载体的制备
为了产生ImpE1增强的载体，使用ATCC6872基因组DNA作为模板通过PCR获得用于制备载体的基因片段。为了增强impE1，使用包括impE1上游的约370 bp (其被认为是启动子区域)的SEQ ID NO:16和17的引物用于增强。增强的impE1基因片段用限制性酶XbaI处理，且然后克隆至pDZ载体的XbaI限制性酶位点中以制备pDZ-impE1(WT)2-1。其后，为了制备两个拷贝的载体，用SEQ ID NO:18和19的一对引物对impE1进行PCR。将每种获得的DNA片段用NotI (其为一种DNA限制性酶)消化，并克隆至用相同的DNA限制性酶消化的pDZ-impE1(WT)2-1中。将制备的载体命名为pDZ-impE1(WT) 2X。
实施例3-3：野生型impE1-和impE2-增强的载体的制备
为了制备其中impE1和impE2两者均增强的菌株，使用SEQ ID NO:16和20的引物通过PCR增强野生型impE1和impE2的整合基因。增强的基因片段用XbaI限制性酶处理，且然后克隆至pDZ载体的XbaI限制性酶位点中以制备pDZ-impE1E2(WT)2-1。其后，为了制备两个拷贝的载体，用SEQ ID NO:18和21的一对引物对impE1E2进行PCR。将每种获得的DNA片段用NotI(其为一种DNA限制性酶)消化，并克隆至用相同的DNA限制性酶消化的pDZ-impE1E2(WT)2-1中。将制备的载体命名为pDZ-impE1E2(WT) 2X。
实施例3-4：野生型impE1-和impE2-引入/增强的菌株的评估
将实施例3-1中制备的pDZ-impE1E2(WT)通过电穿孔(使用Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545中公开的转化方法)转化至实施例2中制备的菌株CJI0323_ΔimpE1E2中。其后，在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体上的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQID NO:6和13的引物对实施PCR来确定最终转化菌株中的基因引入。其后，评估制备的菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)以确定当将野生型impE1和impE2引入菌株CJI0323时产生IMP的能力。
此外，使用电穿孔将载体pDZ-impE1(WT) 2X和pDZ-impE1E2(WT) 2X转化至菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)中，且然后在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体上的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:16和19以及SEQ ID NO: 16和21的引物对实施PCR来确定最终转化菌株中的基因增强。将CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)、CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1(WT) 2X和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_impE1E2(WT) 2X以与实施例2-4中相同的方式培养以获得菌株，并评估上述菌株的产生IMP的能力。在完成培养之后，通过HPLC测量产生的IMP的量，并且培养的结果显示于下表6中。
将每种菌株中积累的IMP量与亲本菌株停滞棒杆菌CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)的积累的IMP量进行比较。作为结果，发现，如上表6中所示，其中ImpE1或ImpE1和ImpE2的活性在相同条件下同时增强的菌株的IMP浓度增加最多达28%。对于不产生IMP或产生痕量IMP的棒杆菌属的微生物，由于蛋白ImpE活性的增加而导致的IMP产生的增加可以被解释为非常有意义的。
制备的菌株CJI0323和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_ impE1E2(WT) 2X(CJI2236)分别被命名为停滞棒杆菌CN01-0323和停滞棒杆菌CN01-2236。所述菌株分别在2017年11月7日和2017年10月25日根据布达佩斯条约保藏至韩国微生物保藏中心(KCCM)。此外，所述菌株分别被命名为KCCM12151P和KCCM12137P。
实施例3-5：野生型impE1或impE2的增强的启动子增强的载体的制备
使用ATCC6872基因组DNA作为模板，通过PCR获得用于制备用增强的启动子替换每个基因的启动子的载体的基因片段。
对于增强的启动子，使用Pcj7启动子(韩国公开专利公开号10-0620092)，其据报道在停滞棒杆菌中强表达。
对于impE1的PCR，使用SEQ ID NO:22和13的引物以及SEQ ID NO:24和25的引物增强的每种基因片段用限制性酶XbaI和NdeI处理，且然后克隆至pDZ载体的XbaI限制性酶位点中。为了增强Pcj7基因片段，将通过用SEQ ID NO:30和31的引物使用ATCC6872基因组DNA作为模板进行PCR获得的片段用NdeI处理，且将制备的载体用NdeI处理以制备载体pDZ-Pcj7_impE1(WT)。
对于impE2的PCR，将使用SEQ ID NO:26和27的引物以及SEQ ID NO:28和29的引物增强的每种基因片段用限制性酶XbaI和NdeI处理，且然后克隆至pDZ载体的XbaI限制性酶位点中。将获得的Pcj7基因片段和制备的载体用NdeI处理以制备载体pDZ-Pcj7_impE2(WT)。
实施例3-6：其中替换野生型impE1和impE2启动子的菌株的评估
将实施例4-1中制备的两种质粒的每一种通过电穿孔(使用Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545中公开的转化方法)转化至实施例3-3中制备的菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)中。其后，在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体上的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:22和25以及SEQ ID NO: 26和27的引物对实施PCR来确定最终转化菌株中的基因增强。上面制备的两种菌株被命名为CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)。此外，基于制备的菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)，转化pDZ-Pcj7_impE2(WT)。其后，在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体上的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:26和29的引物对实施PCR来确定最终转化菌株中的基因增强。将上文制备的菌株命名为CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT)。此后，将每种制备的菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)、CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)_Pcj7/impE2(WT)以与实施例2-4中相同的方式培养，且然后评估其IMP生产力。
在完成培养之后，通过HPLC测量产生的IMP的量，并且培养的结果显示于下表8中。
将每种菌株中积累的IMP量与亲本菌株停滞棒杆菌CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)的积累的IMP量进行比较。作为结果，发现，如上表8中所示，其中ImpE1和/或ImpE2的活性增强的菌株的IMP浓度在相同条件下增加最多达28%。
将制备的菌株CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE1(WT)和CJI0323_ΔimpE1E2_impE1E2(WT)_Pcj7/impE2(WT)在2018年11月2日根据布达佩斯条约保藏至韩国微生物保藏中心(KCCM)。此外，所述菌株分别被命名为KCCM12357P和KCCM12358P。
实施例4：基于impE1和impE2的产生IMP的菌株的增强
实施例4-1：基于impE1和impE2的产生IMP的菌株的制备
为了证实impE1和impE2的增强效果，制备产生IMP的菌株，其中对应于ATCC6872中的IMP降解途径的腺苷酸琥珀酸合成酶和IMP脱氢酶的活性得到减弱。通过在编码上述两种酶的基因purA和guaB的每个核苷酸序列中将第一碱基从‘a’改变为‘t’来改变起始密码子。将其中两种基因的表达在ATCC6872中减弱的菌株命名为CJI9088。此外，通过电穿孔将实施例3-3中制备的载体pDZ-impE1(WT) 2X和pDZ-impE1E2(WT)2X转化至菌株CJI9088中，并在含有卡那霉素(25 mg/L)的培养基上选择其中通过同源序列的重组将载体插入染色体上的菌株。对选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO:6和13的引物对实施PCR来确定最终转化菌株中的基因引入。
评估CJI9088和制备的菌株CJI9088_impE1(WT)2X和CJI9088_impE1E2(WT)2X的IMP生产力。在完成培养之后，通过HPLC测量产生IMP的能力，并且培养的结果显示于下表9中。
作为证实培养基中积累的IMP量的结果，发现产生IMP的能力与亲本菌株CJI9088的能力相比增加最多达67%。从上述结果证实，可以通过增强输出IMP的本公开的蛋白(ImpE)的活性来增加产生IMP的能力。
从前述内容，本公开所属领域的技术人员将能够理解，本公开可以以其他特定形式体现而不修改本公开的技术概念或本质特征。在这方面，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，并且不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅涵盖示例性实施方案，而且还涵盖可以包括在如由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代方案、修改、等同方案和其他实施方案。

Claims (11)

1.产生5'-肌苷一磷酸的棒杆菌属的微生物，其具有增强的由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白的活性。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述产生5'-肌苷一磷酸的棒杆菌属的微生物是停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述增强通过如下实现：1)增加编码所述氨基酸序列的多核苷酸的拷贝数；2)修饰表达调节序列以增加所述多核苷酸的表达；3)修饰染色体上的所述多核苷酸序列用于增强所述蛋白的活性；或4)其组合。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中将腺苷酸琥珀酸合成酶或IMP脱氢酶的活性进一步减弱。
5.用于制备5'-肌苷一磷酸的方法，其包括在培养基中培养权利要求1的棒杆菌属的微生物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述微生物或培养基回收5'-肌苷一磷酸。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述产生5'-肌苷一磷酸的棒杆菌属的微生物是停滞棒杆菌。
8.用于产生5'-肌苷一磷酸的组合物，其包含由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白。
9.由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白用于增加棒杆菌属的微生物的5'-肌苷一磷酸的产生的用途。
10.用于增加5'-肌苷一磷酸的输出的方法，其包括增强棒杆菌属的微生物中由SEQ IDNO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白的活性。
11.由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成的蛋白用于增加棒杆菌属的微生物的5'-肌苷一磷酸的输出的用途。
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