BR112019013003A2 - micro-organismo do gênero corynebacterium, método para preparar monofosfato de 5?-inosina, composição para produzir monofosfato de 5?-inosina, uso da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de seq id no: 1 ou 2 e método para aumentar a exportação de monofosfato de 5?-inosina - Google Patents

micro-organismo do gênero corynebacterium, método para preparar monofosfato de 5?-inosina, composição para produzir monofosfato de 5?-inosina, uso da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de seq id no: 1 ou 2 e método para aumentar a exportação de monofosfato de 5?-inosina Download PDF

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Abstract

A presente revelação refere-se a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5?-inosina, com uma atividade intensificada de uma proteína de exportação de IMP; um método para preparar monofosfato de 5?-inosina com o uso do mesmo; uma composição para produzir monofosfato de 5?-inosina; e um método para aumentar a exportação de monofosfato de 5?-inosina.

Description

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4. A US 9506094 B2 (AJINOMOTO CO., INC.) 2016.11.29 ru ITR 11E. A PARK, SEOK HYUN =, “Metabolic engineering of Corynebacterium glutami cum 111 for L-arginine production.º , Nat. Commun., 2014, AISHA, ola) 4618. 25 4. [] 7 ES CASA 7 89 EUA, DA gs 28 2AS Ja. * OBA EDNA SE 7ANMIA: z ; : : à VENEUA TA ADA TO FASIUES SU] FA FAL ERES, EPA VEIA “AU SEN Udo) JE ADE pos Qu AN 7 EXDL ANA EA Fe TEA 727 AZ dy o)ES ola] dd des Ex “E FASAURA ME SAdES AUS AQUFASPI NA 1, cms ; : 1 T EANLEN E X SELADA] YE EO AD ES MULA 2 ATA TIA A FADA EL 59 ES x ESQ UAUL SE AS EA 2724 TV SUARFAA AES AAA EO EZOEDEEAA DAL 1, : - Le sed Ba)E Nao) de dE YO SSRADA DE ES MAEDA UI RA DE ESA EE qe SedoRf(oltsed)E Wal7) Add del ee ESSES ANN EENERETEIAA “O TRA AB, AA ES 78 FR 8 dede dE ES CUNHA] REALE EA “pg 0]FA EAANQU FA)ELA o] RA EA EL “& FAR ATSATAA FAZER FA ZA) 2A de 2 FAZIA SU] 2019 058 1528! (15.05.2019) 20194 058 1549 (15.05.2019) ISAKRA 23 2 UT AJA = es 564 Aros (35208) EITA) MT AZ 189, vas (So) V 15 (ENE, ANITA ES MM IAM = 1971797 A21299AI7T
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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM, MÉTODO PARA PREPARAR MONOFOSFATO DE 5'-INOSINA, COMPOSIÇÃO PARA PRODUZIR MONOFOSFATO DE 5'- INOSINA, USO DA PROTEÍNA QUE CONSISTE NA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE SEQ ID NO: 1 OU 2 E MÉTODO PARA AUMENTAR A EXPORTAÇÃO DE MONOFOSFATO DE 5'-INOSINA”
CAMPO DA TÉCNICA
[001] A presente revelação refere-se a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5'--inosina,y, com uma atividade intensificada de uma proteína de exportação de IMP; um método para preparar monofosfato de 5'-inosina com o uso do mesmo; uma composição para produzir monofosfato de 5'-inosina; e um método para aumentar a exportação de monofosfato de 5'-inosina.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[002] Monofosfato de 5'-Inosina (doravante denominado como “IMP'), que é um material à base de ácido nucleico, é um intermediário na via metabólica de ácido nucleico, e é usado em vários campos tais como alimentos, medicamentos, e várias aplicações médicas. Em particular, IMP é amplamente usado como aditivos de condimentação de alimentos ou alimentos, junto com monofosfato de 5'-guanina (doravante denominado como “GMP'). Embora IMP si só seja conhecido por ter um gosto de carne, o mesmo também é conhecido por intensificar o sabor de glutamato de monossódio (MSG); portanto, IMP atraiu muita atenção como uma condimentação à base de ácido nucleico temperada.
[003] Exemplos de métodos para preparar IMP incluem um método de degradação enzimática de ácido ribonucleico extraído de células de levedura (Publicação de Patente nº JP 1614/1957), um método de fosforilação química de inosina produzida por fermentação (Agri. Biol. Chem., 36, 1511, etc.), e um método de cultivo de um micro-organismo que produz diretamente IMP e recupera a IMP no meio de cultura. Dentre esses métodos, o mais amplamente usado é o método de uso de um micro-organismo com capacidade de produzir diretamente IMP.
REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA
[004] De modo a produzir IMP em alto rendimento com o uso do método de produzir diretamente IMP através da fermentação microbiana, o IMP deve ser suavemente exportado. Para realizar tal objetivo, os presentes inventores conduziram pesquisa extensiva, e estudaram proteínas de exportação envolvidas na capacidade exportação de IMP; como resultado, os mesmos identificaram IMpE1 e IMpE2, que são proteínas envolvidas na exportação de IMP. Foi confirmado que, quando as atividades de IMpE1 e IMpE2, que são as proteínas envolvidas na exportação de IMP, foram intensificados, a concentração de IMP foi aumentada, completando assim a presente revelação.
SOLUÇÃO DA TÉCNICA
[005] Um objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz IMP, com uma atividade intensificada de uma proteína de exportação de IMP.
[006] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para preparar IMP, que compreende cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente revelação em um meio.
[007] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer uma composição para produzir IMP, que compreende uma proteína na qual uma atividade da proteína de exportação de IMP da presente revelação é intensificada.
[008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para aumentar a exportação de IMP, que compreende intensificar uma atividade da proteína de exportação de IMP da presente revelação no micro-organismo do gênero Corynebacterium.
EFEITOS VANTAJOSOS
[009] Na presente revelação, IMP pode ser preparada com o uso de um micro- organismo do gênero Corynebacterium que produz IMP, com uma atividade intensificada de uma proteína de exportação de IMP.
MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO
[010] Abaixo no presente documento, a presente revelação será descrita em detalhes. Entretanto, cada descrição e modalidade revelada na presente revelação pode ser aplicada a outras descrições e modalidades, respectivamente. Ou seja, todas as combinações de vários elementos revelados na presente revelação estão dentro do escopo da presente revelação. Além disso, as descrições específicas reveladas abaixo não devem ser interpretadas como limitadoras do escopo da presente revelação.
[011] De modo a alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz IMP, com uma atividade intensificada de uma proteína de exportação de IMP.
[012] Conforme usado no presente documento, o termo “proteína de exportação de monofosfato de 5'-inosina” se refere a uma proteína envolvida na exportação extracelular de monofosfato de 5'-inosina (IMP). Para os objetivos da presente revelação, o termo acima pode ser usado de modo intercambiável com uma proteína que tem uma capacidade de exportação de IMP, uma proteína que tem uma capacidade exportação de monofosfato de 5'-inosina, uma proteína de exportação de IMP, etc., e especificamente, pode ser expressa como ImpE, mais especificamente, IMPpE1 e IMpE2, porém, sem limitação a isso. Adicionalmente, a proteína pode ser derivada de Corynebacterium sp., especificamente, Corynebacterium stationis, porém, sem limitação a isso. Por exemplo, uma proteína, que é derivada de Corynebacterium stationis e que tem uma capacidade de exportação de IMP e um efeito correspondente a isso, pode ser usada como a proteína da presente revelação.
[013] A proteína pode ser composta de, por exemplo, uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, mas inclui sequências que têm a mesma atividade que aquela da proteína, e os elementos versados na técnica podem obter informações de sequência da GenBank de NCBI, um banco de dados conhecido. Adicionalmente, a proteína pode incluir uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, ou uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de homologia ou identidade com SEQ ID NO: 1 ou 2. Adicionalmente, é evidente que uma proteína que tem uma deleção, modificação, substituição, ou adição de alguma sequência pode ser usada como a proteína da presente revelação visto que a sequência de aminoácidos tem a homologia ou identidade acima e exibe um efeito correspondente ao da proteína.
[014] Ou seja, embora seja descrito como “uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de um SEQ ID NO particular" ou “uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos de um SEQ ID NO particular” na presente revelação, a proteína pode ter uma atividade que é idêntica ou correspondente ao de uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Em tal case, é obvio que quaisquer proteínas que tem uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição, substituição conservativa, ou adição em parte da sequência também pode ser usada na presente revelação. Por exemplo, no caso de ter a atividade que a mesma ou é correspondente a da proteína modificada, a mesma não exclui uma adição de uma sequência a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos, que não altera a função da proteína, uma mutação que pode ocorrer naturalmente, uma mutação silenciosa da mesma, ou uma constituição conservativa, e ainda quando a adição ou mutação de sequência está presente, a mesma pertence obviamente ao escopo da presente revelação.
[015] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” se refere a um grau de correspondência com duas dadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos, e pode ser expresso como uma porcentagem.
[016] Os termos “homologia” e “identidade” podem ser frequentemente usados de modo intercambiável entre si.
[017] A homologia ou identidade de sequência de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos conservadas pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com uma penalidade de lacuna padrão estabelecida pelo programa que é usada. Espera-se que sequências substancialmente homólogas ou idênticas são geralmente hibridizem sob estringência moderada ou alta, ao longo do comprimento inteiro ou pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, ou cerca de 90% do comprimento inteiro das sequências. Polinucleotídeos que contêm códons degenerados em vez de códons nos polipeptídeos de hibridização são também considerados.
[018] A possibilidade de quaisquer duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos terem uma homologia, similaridade, ou identidade pode ser determinada com o uso de um algoritmo de computador conhecido tal como o programa “FASTA” (Pearson et a/., (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444: com o uso de parâmetros padrão em 2444). Alternativamente, isso pode ser determinado com o uso o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), que é realizado no programa Needleman do pacote EMBOSS ((EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (versão 5.0.0 ou versões posteriores) (pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, ] MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, a homologia, similaridade, ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI).
[019] A homologia, similaridade, ou identidade das sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência, por exemplo, com o uso do programa de computador GAP (e.g., Needleman et a/., (1970), J Mol Biol.48:443) conforme publicado (por exemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482). Em resumo, o programa GAP defines a homologia, similaridade, ou identidade como o valor obtido dividindo-se o número de símbolos alinhados em similaridade (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) ao número total dos símbolos da mais curta das duas sequências. Parâmetros padrão para o programa GAP pode incluir (1) uma matriz de comparação unária (que contém um valor de 1 para identidades e O para não-identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et a/. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence e Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade de 0.10 adicional para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade de abertura de lacuna de 10 e uma penalidade de extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para lacunas de extremidade. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” se refere à relevância entre as sequências.
[020] Conforme usado no presente documento, o termo “intensificação de atividade” significa que a atividade de uma proteína é introduzida, ou que a atividade é aprimorada em comparação a uma atividade endógena ou uma atividade antes da modificação de um micro-organismo. A “introdução” da atividade significa que a atividade de uma proteína específica, que não é natural ou artificialmente inerente a um micro-organismo, aparece. A “atividade endógena” se refere à atividade de uma proteína específica originalmente possuída por uma cepa percursora antes da transformação quando um micro-organismo é transformado por variação genética causada por fatores naturais ou artificiais.
[021] Por exemplo, a intensificação de atividade pode incluir tanto intensificar a atividade introduzindo-se uma proteína de exportação de IMP exterior em uma célula hospedeira, ou aumentar a atividade de uma proteína de exportação de IMP endógena.
[022] Especificamente, na presente revelação, a intensificação de atividade pode ser conduzida pelos seguintes métodos: 1) aumentar o número de cópia de um polinucleotídeo que codifica (ou seja, codifica) a proteína; 2) modificação de uma sequência reguladora de expressão para aumentar a expressão de polinucleotídeo;
3) modificação da sequência de polinucleotídeos em um cromossomo para intensificar uma atividade da proteína; ou 4) uma combinação dos mesmos, sendo que os métodos não são limitados a isso.
[023] No método 1) acima, o aumento do número de cópia do polinucleotídeo que codifica as enzimas pode ser alcançado ligando-se de modo operável o polinucleotídeo ao vetor, ou inserindo-se o mesmo ao cromossomo da célula hospedeira, mas não é particularmente limitada a isso. Adicionalmente, em uma modalidade, o aumento do número de cópia pode ser realizado introduzindo-se um polinucleotídeo exógeno que exibe a atividade de proteína ou um polinucleotídeo de forma variante, na qual um códon é otimizado ao polinucleotídeo acima, à célula hospedeira. O polinucleotídeo exógeno pode ser usado sem limitação em sua origem ou sequência desde que o mesmo exiba as mesmas atividades de proteína/atividades de proteínas similares. Os elementos versados na técnica podem realizar a introdução selecionando-se apropriadamente um método de transformação conhecido, e uma proteína pode ser produzida pela expressão do polinucleotídeo introduzido na célula hospedeira para aumentar sua atividade. O aumento no número de cópia pode se dar de modo que o polinucleotídeo esteja presente em uma forma de tandem continuamente. Nesse caso, sequências de polinucleotídeos que codificam diferentes proteínas de exportação de IMP podem estar presentes de maneira cruzada, sequencial e repetida. Quando o polinucleotídeo está continuamente presente na forma de tandem, uma parte sobreposta pode ocorrer, porém, sem limitação a isso. Especificamente, na presente revelação, o número de cópia da sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 3, 4, ou 5 pode ser aumentado.
[024] Adicionalmente, 2) modificação de uma sequência reguladora de expressão para aumentar a expressão de polinucleotídeo pode ser realizada induzindo-se uma modificação na sequência reguladora de expressão através de deleção, inserção, substituição não-conservativa ou conservativa de uma sequência de nucleotídeos, ou uma combinação dos mesmos; ou substituindo-se a sequência reguladora de expressão por uma sequência de nucleotídeos que tem uma atividade mais forte, porém, sem limitação a isso. A sequência reguladora de expressão inclui, porém, sem limitação particular a um promotor, uma sequência operadora, uma sequência que codifica um sítio de vinculação de ribossomos, e uma sequência que regula a terminação de transcrição e translação. Especificamente, um forte promotor heterólogo em vez do promotor original pode ser ligado a montante da unidade de expressão de polinucleotídeo, e exemplos do forte promotor pode incluir um promotor de CJ7, um promotor de IysCP1, um promotor de EF-Tu, um promotor de groEL, um promotor de aceA ou aceB, etc. A taxa de expressão do polinucleotídeo que codifica a proteína pode ser aprimorada ligando-se de modo operável o promotor com o polinucleotídeo, porém, sem limitação a isso.
[025] Ademais, 3) modificação de uma sequência de polinucleotídeos em um cromossomo, embora sem limitação particular a isso, pode ser realizada induzindo-se uma variação na sequência reguladora de expressão através de deleção, inserção, substituição não-conservativa ou conservativa de uma sequência de polinucleotídeos, ou uma combinação dos mesmos de modo a intensificar adicionalmente a atividade da sequência de polinucleotídeos, ou substituindo-se a sequência com uma sequência de polinucleotídeos que é modificada para ter atividade mais forte.
[026] Por fim, 4) uma modificação método para intensificação por uma combinação de 1) a 3) pode ser realizada aplicando-se um ou mais métodos dentre um método de aumento do número de cópia de um polinucleotídeo que codifica a proteína, um método de modificação da sequência de polinucleotídeos para intensificar a expressão de polinucleotídeo, e um método de modificação da sequência de polinucleotídeos em um cromossomo e modificação de um polinucleotídeo exógeno que exibe a atividade de proteína ou um polinucleotídeo de forma variante, na qual um códon é otimizado.
[027] Adicionalmente, é evidente que um polinucleotídeo, que pode ser traduzido pela degeneração de códon em uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, ou em uma proteína que tem uma homologia à mesma, também pode ser incluída. Por exemplo, a proteína pode ser composta de uma sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 3, 4, ou 5. Adicionalmente, uma sequência, que codifica uma proteína que tem a atividade da proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 por hibridização sob condições estringentes com uma sonda que pode ser preparada a partir de sequências genéticas conhecidas, por exemplo, uma sequência complementar toda ou parte da sequência de nucleotídeos, pode ser incluída sem limitação. O termo “condições estringentes” se refere a condições que permitem uma hibridização específica entre polinucleotídeos. Essas condições são especificamente descritas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et a/., Sangdong). Por exemplo, as condições estringentes pode incluir condições nas quais genes que têm uma alta homologia (por exemplo., 40% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente, 97% ou mais, e com especificidade máxima, 99% ou mais) pode hibridizar entre os mesmos, enquanto genes que têm uma homologia inferior da mesma não podem hibridizar entre si; ou condições para hibridização southern convencional (isto é., condições para lavagem uma vez, e especificamente duas ou três vezes sob uma concentração de sal e temperatura correspondente a 60 ºC, 1x SSC, e 0,1% de SDS; especificamente sob 60 ºC, 0,1x SSC, e 0.1% SDS; e mais especificamente, sob 68 ºC, 0.1x SSC, e 0,1% de SDS).
[028] A hibridização precisa que dois ácidos nucleicos tenham sequências complementares, embora incompatibilidades entre bases são possíveis dependendo da severidade de hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo com capacidade de hibridizar entre si. Por exemplo, em relação a DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementar à guanina. Portanto, a presente revelação também pode incluir sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares assim como fragmentos de ácidos nucleicos isolados complementares à sequência inteira.
[029] Especificamente, um polinucleotídeo que tem uma homologia pode ser detectado com o uso de hibridização condições que inclui uma etapa de hibridização em um valor Tm de 55 ºC e com o uso das condições descritas acima. Além disso, o valor Tm pode ser 60 ºC, 63 ºC, ou 65 ºC, porém, sem limitação a isso; e podem ser adequadamente ajustados pelos elementos versados na técnica de acordo com seu objetivo.
[030] A estringência apropriada de hibridizar polinucleotídeos depende do comprimento e complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são conhecidas na técnica (por favor consultar Sambrook et a/l., supra, 9.50-9.51, 11.7-
11.8).
[031] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a um construto de DNA que contém uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica uma proteína desejada, que é ligada de modo operável a uma sequência reguladora adequada de modo que a proteína desejada seja expressa em uma célula hospedeira adequada. A sequência reguladora pode incluir um promotor com a capacidade para iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para regular a transcrição, uma sequência que codifica um local de ligação de ribossomo de MRNA adequado e uma sequência que regula a terminação de transcrição e tradução. Depois de ser transformado em uma célula hospedeira adequada, o vetor pode ser replicado ou realizar sua função independente do genoma hospedeiro, ou pode ser integrado ao genoma por si só.
[032] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado contanto que o mesmo possa ser expresso em uma célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de um vetor comumente usado incluem um plasmídeo natural ou recombinante, um cosmídeo, vírus e um bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBLA, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, e Charon21A pode ser usado como um vetor de fago ou um vetor de cosmídeo; e baseado em pBR, baseado em pUC, baseado em pBluescriptll, baseado em pGEM, baseado em pTZ, baseado em pCL, e baseado em pET pode ser usado como um vetor de plasmídeo. Especificamente, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, puC19, pBR322, pMW 118, e pCC1BAC vetores podem ser usados, mas o vetor não é limitado a isso.
[033] O vetor que pode ser usado na presente revelação não é particularmente limitado e um vetor de expressão conhecido pode ser usado. Adicionalmente, um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo pode ser inserido em um cromossomo através de um vetor para inserção de cromossomo intracelular. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por quaisquer métodos, por exemplo, por recombinação homóloga, porém, sem limitação à mesma. O vetor pode incluir adicionalmente um marcador de seleção para indicar a inserção do vetor no cromossomo. Adaptado para indicar uma célula transformada com o vetor, ou seja, se um gene-alvo é inserido ao genoma da célula hospedeira, o marcador de seleção pode fornecer à célula uma capacidade de mostrar resistência a fármaco, resistência a agente citotóxico, auxotrofia, ou expressão de fenótipo selecionável tal como a expressão de uma proteína de superfície. No ambiente em que um agente seletivo é tratado, somente as células que expressam o marcador de seleção sobrevivem ou expressam outro fenótipo, e células transformadas desse modo podem ser selecionadas.
[034] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” significa que um vetor que contém um polinucleotídeo que codifica um proteína-alvo é introduzido em uma célula hospedeira, de modo que uma proteína codificada pelo polinucleotídeo tenha capacidade de ser expressa na célula hospedeira. O polinucleotídeo transformado pode ser qualquer um independentemente da posição desde que o polipeptídeo tenha capacidade de ser expresso na célula hospedeira, independentemente de se o polinucleotídeo é inserido e posicionado no cromossomo da célula hospedeira ou posicionado em uma posição externa do cromossomo. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam uma proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido com qualquer formato desde que o polinucleotídeo tenha capacidade de ser introduzido na célula hospedeira para ser expresso. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira como uma forma de cassete de expressão, que é uma estrutura de gene que inclui todos os fatores necessários para autoexpressão. O cassete de expressão pode incluir um promotor, um sinal de terminação de transição, um sítio de ligação de ribossomo, e um sinal de terminação de translação, que pode ser ligado de modo operável ao polinucleotídeo. O cassete de expressão pode ser um vetor de expressão que realiza autorreplicação. Adicionalmente, o polinucleotídeo por si só pode ser introduzido na célula hospedeira para ser ligado de modo operável à sequência necessária para expressão na célula hospedeira, porém, sem limitação a isso. O método de transformação inclui qualquer método de introdução de um ácido nucleico em uma célula, e pode ser realizado selecionando-se uma técnica padrão adequada conhecida na técnica. Por exemplo, exemplos do método podem incluir eletroporação, fosfato de cálcio (CaPO+4), precipitação, precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, uma técnica de polietileno glicol (PEG), uma técnica de DEAE-dextrano, uma técnica de lipossoma catiônico, e uma técnica de acetato de lítio-DMSO, porém, sem limitação aos mesmos.
[035] Adicionalmente, o termo “ligado de modo operável” se refere a uma conexão funcional entre uma sequência promotora, que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo da presente revelação e a sequência de polinucleotídeos. A ligação operável pode ser preparada com o uso de uma técnica de recombinação de gene conhecida na técnica, e clivagem de DNA específica de sítio e ligação pode ser realizada com o uso de uma enzima de restrição e ligase conhecidas na técnica, porém, sem limitação a isso.
[036] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz IMP” se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem capacidades de produzir IMP através de sua forma nativa ou uma variação. Especificamente, na presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz IMP pode ser um micro-organismo que tem capacidades aprimoradas de -produzir IMP inserindo-se um gene relacionado ao mecanismo de produção de uma cepa nativa por si só ou IMP exógeno, ou intensificando-se ou atenuando-se a atividade de um gene endógeno. Mais especificamente, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz IMP pode ser um micro-organismo no qual capacidades de produzir IMP são aprimoradas em comparação a de uma cepa percursora antes da transformação ou um micro- organismo não-modificado.
[037] Na presente revelação, “o micro-organismo do gênero Corynebacterium” pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis, etc., porém, sem limitação aos mesmos. Mais especificamente, na presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium stationis. Um exemplo específico do micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium stationis no qual as capacidades de produzir IMP são aprimoradas intensificando-se a atividade de uma proteína que tem uma função de exportar IMP ao exterior da célula, porém, sem limitação a isso.
[038] Outro aspecto da presente revelação fornece um método para preparar IMP, que compreende cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium com uma atividade intensificada da proteína de exportação de IMP em um meio.
[039] Especificamente, o método da presente revelação pode incluir adicionalmente uma etapa de recuperar IMP do micro-organismo ou meio.
[040] No método, o cultivo o micro-organismo pode ser realizado por cultura de lote, cultura contínua, e cultura de lote alimentado conhecidas na técnica. Ademais, assim como para as condições de cultura, pH adequado (isto é, pH de 5a 9, especificamente pH 6 a 8, e com máxima especificidade, pH 6,8) pode ser mantido com o uso de um composto químico básico (isto é, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ou amônia) ou um composto químico ácido (isto é, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Adicionalmente, uma condição aeróbica pode ser mantida introduzindo-se oxigênio ou uma mistura de gás que contém oxigênio a uma cultura. A temperatura de cultura pode ser mantida a 20 ºC a 45 ºC, e especificamente, a 25 ºC a 40 ºC. Além disso, o tempo de cultura pode ser cerca de 10 a 160 horas. No entanto, as condições de cultura não são limitadas a isso. O IMP produzido pela cultura acima pode ser excretado a um meio de cultura ou pode permanecer dentro da célula.
[041] Ademais, o meio para cultivo pode compreender açúcar e carboidrato (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido, e celulose), óleo e gordura (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim, e óleo de coco), ácido graxo (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico), álcool (por exemplo, glicerol e etanol), e ácido orgânico (por exemplo, ácido acético) individualmente ou em combinação como uma fonte de carbono, mas o meio não é limitado aos mesmos. Adicionalmente, o meio para cultivar pode compreender um composto orgânico que contêm nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, solução de milho, farinha de soja, e ureia), ou um composto inorgânico (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato ou amônio, carbonato de amônio, e nitrato de amônio) individualmente ou em combinação como uma fonte de nitrogênio, mas o meio não é limitado aos mesmos. Adicionalmente, o meio para cultivar pode compreender fosfato de di-hidrogênio de potássio, fosfato de hidrogênio de dipotássio ou um sal que contém sódio correspondente aos mesmos individualmente ou em combinação como uma fonte fosforosa, mas o meio não é limitado a isso. Adicionalmente, o meio pode compreender outras substâncias de simulação de proliferação essenciais incluindo sais de metal (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas.
[042] O método da presente revelação para recuperar o IMP produzido a partir do método de cultivo acima pode coletar IMP desejado do meio de cultura com o uso de um método adequado conhecido na técnica de acordo com o método de cultivo. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC, etc. podem ser usados, e o IMP desejado pode ser recuperados de um meio ou um micro-organismo com o uso de um método adequado conhecido na técnica.
[043] Adicionalmente, o método de recuperação acima pode incluir um processo de purificação, e pode ser realizado com o uso de um método adequado conhecido na técnica. Portanto, o IMP recuperado pode estar em uma forma purificada ou um caldo fermentado microbiano que contém IMP.
[044] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece uma composição para produzir IMP, que compreende a proteína da presente revelação, que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2, ou um polinucleotídeo que codifica os mesmos.
[045] A composição da presente revelação pode incluir adicionalmente, sem limitação, uma constituição com capacidade de operar o polinucleotídeo. Adicionalmente, na composição da presente revelação, o polinucleotídeo pode estar em uma forma incluída dentro de um vetor de modo que um gene ligado de modo operável com a célula hospedeira introduzida pode ser expressa.
[046] Adicionalmente, a composição pode incluir adicionalmente quaisquer excipientes adequados convencionalmente usados na composição para produzir IMP. Tais excipientes podem ser, por exemplo, conservantes, umidificantes, agentes de suspensão, tampões, agentes de estabilização, ou agentes isotônicos, mas não são limitados aos mesmos.
[047] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece o uso da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 para aumentar a produção de IMP no micro-organismo do gênero Corynebacterium.
[048] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para aumentar a exportação de IMP, que compreende intensificar uma atividade da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 no micro- organismo do gênero Corynebacterium.
[049] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece o uso da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 para aumentar a exportação de IMP no micro-organismo do gênero Corynebacterium.
[050] Os termos “proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2”, “intensificação”, e “micro-organismo do gênero Corynebacterium” são conforme descritos acima.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES
[051] Abaixo no presente documento, a presente revelação será descrita em detalhes com modalidades exemplificativas anexas. Entretanto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação.
EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE BIBLIOTECA DE DNA GENÔMICO
[052] Uma biblioteca de DNA genômico de Corynebacterium stationis ATCC6872 foi produzida de modo a identificar a proteína de membrana de Corynebacterium, que é envolvida na exportação de IMP.
[053] Em seguida, visto que a cepa de tipo selvagem do gênero Corynebacterium não pode produzir IMP ou produz uma quantidade muito pequena de IMP, a cepa CJI0323 derivada de ATCC6872 que tem capacidades de produzir IMP foi produzida para confirmar as capacidades de produzir IMP. A biblioteca de DNA genômico da ATCC6872 foi transformada na cepa CJI0323 produzida, e então triagem foi realizada para a proteína de membrana de tipo selvagem envolvida na exportação de IMP. Experimentos específicos se dão conforme a seguir.
EXEMPLO 1-1: SELEÇÃO DE CEPA DE PRODUÇÃO DE IMP, CJI0323
[054] ATCC6872 (107 células/ml a 10º células/ml) foi suspensa em um tampão de fosfato (pH 7,0) ou em um tampão de citrato (pH 5,5) de modo a preparar uma cepa de produção de IMP derivada de ATCC6872, e então mutação foi induzida por tratamento de UV. Os resultantes foram lavados duas vezes com 0,85% de solução salina, e então diluídos e manchados em um meio que contém uma concentração apropriada de uma substância para ser resistente a um meio mínimo que contém 1,7% de ágar. Em seguida, colônias foram obtidas. Cada colônia foi cultivada em um meio nutriente e cultivada em um meio de semente por 24 horas. Após 3 a 4 dias de cultivo em um meio de fermentação, colônias com a maior quantidade de IMP acumulada no meio de cultura foram selecionadas. De modo a produzir uma cepa de produção de IMP de alta concentração, e fornecer auxotrofia de adenina, vazamento de guanina,
suscetibilidade de lisozima, resistência a 3,4-di-hidroprolina, resistência a estreptomicina, resistência a azetidina resistência a ácido carboxílico, resistência a tiaprolina, resistência a azaserina, resistência a sulfaguanidina, resistência a norvalina, e resistência a trimetoprim, os procedimentos acima foram realizados sequencialmente para cada substância. CJI0323, que é resistente às substâncias acima e tem excelentes capacidades de produzir IMP, foi selecionada por último. À tabela 1 abaixo mostra a resistência de ATCC6872 em comparação a de CJI0323. TABELA 1 Propriedades ATCC6872 CJI0323 Vazamento de Guanina Auxotrofia vazante Suscetibilidade de Lisozima 80 pg/ml 8 ug/ml Resistência a 3,4-Di-
1.000 pg/ml 3.500 pg/ml idroprolina Resistência a Streptomicina 500 pg/ml 2.000 pg/ml Resistência a ácido mg/ml 30 mg/ml carboxílico de azetidina Resistência a Tiaprolina 10 po/ml 100 po/ml Resistência a Azaserina 25 po/ml! 100 po/ml Resistência a Sulfaguanidina 50 pg/ml 200 po/ml Resistência a Norvalina 0,2 mg/ml 2 mg/ml Resistência a Trimetoprim 20 pg/ml 100 po/ml
[055] As composições dos meios são as seguintes: - Meio mínimo: 2% de glicose, 0,3% de sulfato de sódio, 0,1% de KH2SO., 0,3% de K2HPO2, 0,3% de sulfato de magnésio, cloreto de cálcio (10 mg/l), sulfato de ferro (10 mg/I), sulfato de zinco (1 mg/l), cloreto de manganês (3,6 mg/I), |-cisteína (20 mg/l), pantotenato de cálcio (10 mg/l), cloridrato de tiamina (5 mg/l), biotina (30 upg/1), adenina (20 mg/l), guanina (20 mg/l), pH 7,3 - meio nutriente: 1% de peptona, 1% de molho de carne, 0,25% de cloreto de sódio, 1% de extrato de levedura, 2% de ágar, pH 7,2 - Meio de semente: 1% de glicose, 1% de peptona, 1% de molho de carne, 1% de extrato de levedura, 0,25% de cloreto de sódio, adenina (100 mg/l), guanina (100 mg/I), pH 7,5 - Meio de fermentação: 0,1% glutamato de sódio, 1% de cloreto de amônio, 1,2% de sulfato de magnésio, 0,01% de cloreto de cálcio, sulfato de ferro (20 mg/l), sulfato de manganês (20 mg/l), sulfato de zinco (20 mg/l), sulfato de cobre (5 mg/l), |- cisteína (23 mg/l), alanina (24 mg/l), ácido nicotínico (8 mg/l), biotina (45 ug/l), cloridrato de tiamina (5 mg/I), adenina (30 mg/1), 1,9% de ácido fosfórico (85%), 2,55% de glicose, 1,45% de frutose EXEMPLO 1-2: EXPERIMENTO DE CJI0323 TITULAÇÃO DE
FERMENTAÇÃO
[056] O meio de semente (2 ml) foi dispensado em tubos de teste (18 mm de diâmetro), que foram então autoclavados e, cada um, inoculados com ATCC6872 e CJI0323. Em seguida, os resultantes foram cultivados com agitação a 30 ºC por 24 horas, e então usados como soluções de cultura de semente. O meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em frascos Erlenmeyer (250 ml) e autoclavados a 121 ºC por minutos. Em seguida, cada solução de cultura de semente (2 ml) foi inoculada à mesma, e então os resultantes foram cultivados por 3 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, uma temperatura de 30 ºC, e um pH de 7,5.
[057] Após o cultivo, a quantidade de IMP produzido foi medida com o uso de HPLC (SHIMAZDU LC20A), e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 2 abaixo.
TABELA 2
Tee EXEMPLO 1-3: CONSTATAÇÃO DE PROTEÍNA DE EXPORTAÇÃO
[058] As condições triagem que mostra inibição de proliferação da cepa CJ/0323 foram estabelecidas adicionando-se adicionalmente IMP no meio mínimo suplementado com 1,7% de ágar. ATCC6872, o plasmídeo de biblioteca genômica, foi transformado na cepa CJI0323 com o uso de eletroporação (van der Rest et al. 1999). Foram selecionadas colônias nas quais a diminuição na proliferação foi liberada sob as condições de meio suplementadas com um excesso de IMP. Plasmídeos foram obtidos a partir das colônias selecionadas e analisadas por técnicas de sequenciamento. A partir do supracitado, um tipo de proteína de membrana envolvida em liberar a diminuição de proliferação foi identificado sob a condição de adição de IMP em excesso.
[059] O um tipo da proteína de membrana de Corynebacterium foi identificada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 (GenBank de NCBI: NZ CP014279, WP 066795121, transportador de MFS). A proteína de membrana é conhecida como o transportador de MFS, mas sua função específica não foi confirmada, e além disso, sua função relacionada à exportação de IMP é ainda desconhecida. Na presente revelação, a proteína de membrana foi nomeada IMpE2(WT).
EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE IMPE1 E IMPE2 EXEMPLO 2-1: CONFIRMAÇÃO DE IMPE1 E IMPE2
[060] De modo a examinar a função da proteína de membrana IMpE2, a estrutura de gene de SEQ ID NO: 5 foi identificada em NCBI (GenBank de NCBI: NZ CP014279, WP 066795121, transportador de MFS). Foi confirmado que SEQ ID NO: 5 (impE2) foi sobreposta com a porção inicial de 7 bb do ORF de um gene, que é localizado a montante de impE2 (GenBank de NCBI: NZ CP014279, WP 066795119, regulador transcripcional). A função da proteína codificada pelo gene ou do gene correspondente localizado a montante de impE2 não foi confirmada; na presente revelação, tal proteína foi nomeada IMpE1(WT) (a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4).
EXEMPLO 2-2: PREPARAÇÃO DE VETORES DEFICIENTES DE IMPE1 OU IMPE2
[061] De modo a determinar se a capacidade exportação de IMP é reduzida quando IMpE1 ou IMpE2, que é envolvido em liberar a diminuição de proliferação por IMP e que foi identificada através de Exemplos 1 e 2-1, foi deletada, tentou-se a preparação de vetores deficientes para cada gene.
[062] Os fragmentos de gene para construir os vetores foram obtidos por PCR com o uso de ATCC6872, o DNA genômico, como modelo.
[063] Especificamente, os iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7 e os iniciadores de SEQ ID NOS: 8 e 9 foram usados para PCR for impE1; e os iniciadores de SEQ ID NOS: 10 e 11 e os iniciadores de SEQ ID NOS: 12 e 13 foram usados para PCR para impE2 (Tabela 3).
TABELA 3 : Iniciador Sequência (5' a 3') NO: | 6 | meets? | corerasacAGAMGCTAMGCOGETEA es eee 7 iMpE1 kop-2
TT as iMpE1 kop-3
ACC | 9 imeetoa | coretaATAGTTOGEAGTOCACTE
CTTGGAGAAAATTTCCTACCATTCCAGTCCTTTC e [em 12 iMpE2 kop-3
AAT | es 14 iMpE1E2 kop-2
TT rena it iMpE1E2 kop-3
AAT
[064] Os iniciadores usados foram produzidos com base em informações acerca do gene Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ CP014279) registrado no GenBank de NIH e as sequências de nucleotídeos adjacentes ao mesmo.
[065] PCR foi conduzido com desnaturação a 94 ºC por 5 minutos, seguido por repetição do ciclo 25 vezes incluindo a desnaturação a 94 “C por 30 segundos, anelamento a 52 “C por 3 minutos, e polimerização a 72 ºC por 1 minuto, e então polimerização a 72 ºC por 5 minutos. A reação em cadeia de polimerase sobreposta foi realizada com o uso de dois fragmentos do gene impE71, que foi intensificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7 e dos iniciadores de SEQ ID NOS: 8 e 9, como modelo. Como resultado, um modelo de polinucleotídeo (1,8 kbp) foi obtido. O fragmento de gene obtido foi digerido com uma enzima de restrição, Xbal. pDZ- AimMpE1 foi preparado com o uso do vetor pDZ (Documento de Patente nº KR 10- 0924065 e Publicação de Patente Internacional nº 2008-033001), que foi obtido ingerindo-se o fragmento de gene com a enzima de restrição, Xbal, com o uso de T4 ligase. Adicionalmente, a reação em cadeia de polimerase sobreposta foi conduzida com o uso de um fragmento do gene impE?2, intensificado pelos iniciadores de SEQ ID NOS: 10 e 11 e dois fragmentos do gene impE2? intensificados pelos iniciadores de SEQ ID NOS: 12 e 13 como modelos, e um modelo de polinucleotídeo (1,7 kbp) foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com enzimas de restrição,
Xbal e spel. Os fragmentos de gene foram clonados com o uso de T4 ligase no vetor pDZ, que foi digerido com a enzima de restrição, Xbal, e então pDZ-AimpE2 foi preparado.
EXEMPLO 2-3: PREPARAÇÃO DE VETORES DEFICIENTES DE IMPE1- E IMPE2
[066] Visto que os genes impE1 e impE2, que codificam proteínas envolvidas em liberar a diminuição de proliferação por IMP, são sobrepostas, há uma necessidade de regular ambos os genes simultaneamente. Portanto, tentativas foram realizadas para preparar um vetor no qual tanto impE1 quanto impE2 são deficientes.
[067] Para PCR de impE1 e impE2, os iniciadores de SEQ ID NOS: 6e 14 e os iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 13 foram usados. Os iniciadores usados foram produzidos com base em informações acerca do gene Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ CP014279) registrado no GenBank de NIH e as sequências de nucleotídeos adjacentes ao mesmo. A reação em cadeia de polimerase sobreposta foi conduzida com o uso de um fragmento do gene impE71, intensificado pelos iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 14 e dois fragmentos do gene impE2 intensificados pelos iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 13 como modelos, e um modelo de polinucleotídeo (2.0 kbp) foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com Xbal e spel, respectivamente. Os fragmentos de gene foram clonados com o uso de T4 ligase no vetor pDZ, que foi digerido com a enzima de restrição, Xbal, e então pDZ-AimpE1E2 foi preparado.
EXEMPLO 2-4: PREPARAÇÃO DE CEPAS DEFICIENTES DE IMPE1- E IMPE2
[068] Os dois plasmídeos preparados no Exemplo 2-2 e o um plasmídeo preparado no Exemplo 2-3 foram, cada um, transformados em CJ/0323 por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545). As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. O defeito de gene nas cepas finalmente transformadas foi determinado realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 9, SEQ ID NOS: 10 e 13, e SEQ ID NOS: 6 e 13.
[069] As cepas selecionadas foram nomeadas CJIO323 AimpE1, CJI0323 AimpE2, e CJIO323 AIMpE1E2. Adicionalmente, as capacidades de produzir IMP das cepas acima foram avaliadas.
[070] O meio de semente (2 ml) foi dispensado em tubos de teste (18 mm de diâmetro), que foram então autoclavados e, cada um, inoculados com CJI0323, CJI0323 AimpE1, CJI0O323 AimpE2, e CJIO323 AIMpE1IE2. Em seguida, os resultantes foram cultivados com agitação a 30º C por 24 horas, e então usados como soluções de cultura de semente. O meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em frascos Erlenmeyer (250 ml) usados para agitação e autoclavados a 121 ºC por 15 minutos. Em seguida, cada solução de cultura de semente (2 ml) foi inoculada à mesma, e os resultantes foram cultivados por 3 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, uma temperatura de 30 ºC, e um pH de 7,5.
[071] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzida foi medida por HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 4 abaixo.
TABELA 4 me (o) O eae rw
[072] A quantidade de IMP acumulado em cada cepa foi comparada com a da cepa percursora, Corynebacterium stationis CJI0323. Como resultado, foi constatado que, conforme mostrado na Tabela 4 acima, as concentrações de IMP das cepas, CJI0323 AiIMPpE1, CJIO0323 AimpE2, e CJIO0323 AIMpE1E2, foram reduzidos em cerca de 8 dg/l sob as mesmas condições em comparação à cepa percursora, confirmando que IMpE1 e IMpE2 são proteínas envolvidas na exportação de IMP.
EXEMPLO 3: INTENSIFICAÇÃO DE /MPE1 E IMPEZ2 de tipo selvagem
[073] A cepa de tipo selvagem do gênero Corynebacterium não pode produzir IMP ou produz uma quantidade muito pequena de IMP. Portanto, in CJI0323, que é a cepa que produz IMP, a proteína ImMpE foi submetida a knockout e então restaurada introduzindo-se a proteína de tipo selvagem, IMpE, e além disso, a atividade de ImpE foi intensificada; confirmando assim que a capacidade de expor IMP foi aumentada pela intensificação do ImMpE de tipo selvagem. A intensificação da atividade de proteína foi alcançada com o uso de um método de “aumento do número de cópia” e um método de intensificação de um promotor, entre métodos de intensificação.
EXEMPLO 3-1: PREPARAÇÃO DE VETOR INTRODUZIDO POR IMPE1- E /'MPE2 DE TIPO SELVAGEM
[074] De modo a preparar a cepa na qual ImpE de tipo selvagem é introduzido, os fragmentos de gene para preparar o vetor foram obtidos através de PCR com o uso de ATCC6872 DNA genômico como modelo. Para PCR de impE1 e impE2de tipo selvagem, iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 13 foram usados. Os fragmentos inteiros do gene impE1-impE2 de tipo selvagem, que foi intensificado pelos iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 13, foram tratados com as enzimas de restrição, Xbal e Spel, e então clonados no sítio de enzima de restrição Xbal do vetor pDZ para preparar pDZ- imMpE1E2(WT).
EXEMPLO 3-2: PREPARAÇÃO DE VETOR INTENSIFICADO COM IMPE1 DE TIPO SELVAGEM
[075] De modo a produzir o vetor intensificado com IMpE1, os fragmentos de gene para preparar o vetor foram obtidos por PCR com o uso de DNA genômico ATCC6872 como modelo. De modo a intensificar impE1, iniciadores de SEQ ID NOS: 16 e 17 que incluem cerca de 370 bp de impE1 a montante, que é considerado como uma região promotora, foram usados para intensificação. Os fragmentos de gene intensificados com impE1 foram tratados com a enzima de restrição, Xbal, e então clonados no sítio de enzima de restrição Xbal do vetor pDZ para preparar pDZ- iMpE1(WT)2-1. Em seguida, para preparar duas cópias do vetor, impE1 foi submetido a PCR com um par de iniciadores de SEQ ID NOS: 18 e 19. Cada fragmento de DNA obtido foi digerido com Notl, que é uma enzima de restrição de DNA, e clonada em pDZ-impE1(WT)2-1 digerida com a mesma enzima de restrição de DNA. O vetor preparado foi nomeado pDZ-impE1(WT) 2X. EXEMPLO 3-3: PREPARAÇÃO DE VETOR INTENSIFICADO COM IMPET1- E IMPE2 DE TIPO SELVAGEM
[076] De modo a preparar a cepa na qual tanto impE1 quanto impE2 foram intensificados, os genes integrantes de impE1 e impE2 de tipo selvagem foram intensificados por POR com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 16 e 20. Os fragmentos de gene intensificados foram tratados com Xbal, uma enzima de restrição, e então clonados no sítio de enzima de restrição Xbal do vetor pDZ para preparar pDZ-impE 1E2(WT)2-1. Em seguida, para preparar duas cópias do vetor, impE1E2 foi submetido a PCR com um par de iniciadores de SEQ ID NOS: 18 e 21. Cada fragmento de DNA obtido foi digerido com Notl, que é uma enzima de restrição de DNA, e clonado em pDZ-impE 1 E2(WT)2-1 digerido com a mesma enzima de restrição de DNA. O vetor preparado foi nomeado pDZ-impE1E2(WT) 2X. TABELA 5 Iniciador Sequência (5' a 3") NO: 17 impE1 2-2
AGTCCTTTCGT
O 18 impE1 2-3
CTCCTTTGC es se 19 iMpE1 2-4
CCTTTCGT iIMpE1E2 2-2
TGCAAGAAACTG e | 21 IMpE1E2 2-4
CCAAACGCTCTGCAAGAAACTG EXEMPLO 3-4: AVALIAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS/INTENSIFICADAS COM /MPE1- E IMPE2 DE TIPO SELVAGEM
[077] pDZ-impE1E2(WT), preparado no Exemplo 3-1, foi transformado em CJI0323 AIMpE1E?2, a cepa preparada no Exemplo 2, por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541- 545). Em seguida, as cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução de gene nas cepas finalmente transformadas foi determinada realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 13. Em seguida, a cepa preparada, CJI0323 AimpE1E2 impE1E2(WT), foi avaliada para determinar as capacidades de produzir IMP quando impE1 e impE2 de tipo selvagem foram introduzidos na cepa, CJI0323.
[078] Adicionalmente, os vetores pDZ-impE1(WT) 2X e pDZ-impE1E2(WT) 2X foram transformados na cepa CJI0O323 AimMpE1E2 impE1E2(WT) com o uso de eletroporação, e então as cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A intensificação de gene nas cepas finalmente transformadas foi determinada realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 16 e 19 e SEQID NOS: 16 e 21. CJI0323 AiMpE1E2 impE1E2(WT), CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) impE1(WT) 2X, e CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) impE1E2(WT) 2X foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 24 para obter cepas, e as capacidades de produzir IMP das cepas acima foram avaliadas. Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzida foi medida por HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 6 abaixo.
TABELA 6 Cepa IMP (9/l)
[079] A quantidade de IMP acumulado em cada cepa foi comparada com a da cepa percursora, Corynebacterium stationis CJIO323 AimMpE1E2 impE1E2(WT). Como resultado, foi constatado que, conforme mostrado na Tabela 6 acima, a concentração de IMP da cepa, na qual as atividades de IMpE1 ou IMpE1 e ImpE2 foram simultaneamente intensificadas sob as mesmas condições, foi aumentada em até 28%. Para um micro-organismo do gênero Corynebacterium, que não produz IMP ou produz uma quantidade de traço dos mesmos, o aumento na produção de IMP devido ao aumento da atividade da proteína, IMpE, pode ser interpretado como muito significativo.
[080] As cepas CJI0O323 e CJI0O323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) impE1E2(WT) 2X(CJI2236) preparadas foram nomeadas Corynebacterium stationis CN01-0323 e Corynebacterium stationis CN01-2236, respectivamente. As cepas foram depositadas sob o tratado de Budapeste ao Centro de Cultura Coreano Micro-organismos (KCCM) em 7 de novembro de 2017, e 25 de outubro de 2017, respectivamente. Adicionalmente, as cepas foram designadas como KCCM12151P e KCCM12137P, respectivamente.
EXEMPLO 3-5: PREPARAÇÃO DE VETOR INTENSIFICADO POR PROMOTOR INTENSIFICADO DE /MPE1 OU IMPE2 DE TIPO SELVAGEM
[081] Os fragmentos de gene para preparar o vetor que substitui o promotor de cada gene por um promotor intensificado foram obtidos por PCR com o uso de DNA genômico ATCC6872 como modelo.
[082] Para o promotor intensificado, um promotor Pcj7 (Publicação de Patente aberta à inspeção pública nº KR 10-0620092), que é relatado como fortemente expresso em Corynebacterium stationis, foi usado.
[083] Para PCR de impE1, cada fragmento de gene intensificado com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 22 e 13 e os iniciadores de SEQ ID NOS: 24 e 25 foi tratado com enzimas de restrição, Xbal e Ndel, e então clonado no sítio de enzima de restrição Xbal do vetor pDZ. De modo a intensificar os fragmentos de gene Pcj7, fragmentos obtidos realizando-se PCR com iniciadores de SEQ ID NOS: 30 e 31 com o uso de ATCC6872 DNA genômico como modelo foram tratados com Ndel, e o vetor preparado foi tratado com Ndel para preparar o vetor, pDZ-Pcj7 impE1(WT).
[084] Para PCR de impE2, cada fragmento de gene intensificado com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 26 e 27 e os iniciadores de SEQ ID NOS: 28 e 29 foi tratado com enzimas de restrição, Xbal e Ndel, e então clonado no sítio de enzima de restrição Xbal do vetor pDZ. Os fragmentos de gene de Pcj7 obtidos e o vetor preparado foram tratados com Ndel para preparar o vetor, pDZ-Pcj7 impE2(WT). TABELA 7 Iniciador Sequência (5' a 3') NO: E e 22 impE1 Pcj7-1 ce e 23 impE1 Pcj7-2
AAGTTT em 24 impE1 Pcj7-3
GTT
Pd A
GCTCTAGATTGCATGCTGTGCAAGAAGT 26 impE2 Pcj7-1
T
GGAATTCCATATGCTACCATTCCAGTCC 27 impE2 Pcj7-2
TTTCGT
GGAATTCCATATGGTAGCTAAAAACTCC 28 impE2 Pcj7-3
ACC
GCTCTAGAAATAGTTGGGGAAGTCCACT 29 impE2 Pcj7-4 Cc
GGAATTCCATATGTCCCAGCGCTACTAA Pcj7 F
TAGG
GGAATTCCATATGGAGTGTTTCCTTTCG 31 Pcj7 R
TTGGG EXEMPLO 3-6: AVALIAÇÃO DE CEPA NA QUAL PROMOTORES DE IMPE1 E IMPE2 DE TIPO SELVAGEM SÃO SUBSTITUÍDOS
[085] Cada um dos dois plasmídeos preparados no Exemplo 4-1, foi transformado em CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT), a cepa preparada no Exemplo 3-3, por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545). Em seguida, as cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/I). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A intensificação de gene nas cepas finalmente transformadas foi determinada realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 22 e 25 e SEQ ID NOS: 26 e 27. As duas cepas preparadas acima foram nomeadas CJI0323 AiMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE1(WT) e
CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE2(WT). Adicionalmente, com base na cepa preparada, CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE1(WT), —pDZ- Pcj7 impE2(WT) foi transformada. Em seguida, a cepa na qual o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foi selecionada em um meio que contém canamicina (25 mg/l). A cepa primária selecionada foi submetida a um segundo cruzamento. A intensificação de gene na cepa finalmente transformada foi determinada realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 26 e 29. A cepa preparada acima foi nomeada CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE1(WT) Pcj7/impE2(WT). Em seguida, cada das cepas preparadas, CJIO0323 AiMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE1(WT), CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE2(WT), e CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE1(WT) Pcj7/impE2(WT), foi cultivada da mesma maneira que no Exemplo 2-4, e então as produtividades de IMP das mesmas foram avaliadas.
[086] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzida foi medida por HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 8 abaixo.
TABELA 8 oem remate e | ) 2,97
[087] A quantidade de IMP acumulado em cada cepa foi comparada com a da cepa percursora, Corynebacterium stationis CJIO323 AiMpE1E2 impE1E2(WT). Como resultado, foi constatado que, conforme mostrado na Tabela 8 acima, as concentrações de IMP das cepas, nas quais as atividades de IMpE1 e/ou IMpE2 foram intensificadas, foram aumentadas em até 28% sob as mesmas condições.
[088] As cepas preparadas CJI0323 AiMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE1(WT) e CJI0323 AIMpE1E2 impE1E2(WT) Pcj7/impE2(WT) foram depositadas sob o tratado de Budapeste ao Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM) em 2 de novembro de 2018. Adicionalmente, as cepas foram designadas como KCCM12357P e KCCM12358P, respectivamente.
EXEMPLO 4: A INTENSIFICAÇÃO DE /MPE1 E IMPE2 BASEADOS EM
CEPA DE PRODUÇÃO DE IMP EXEMPLO 4-1: PREPARAÇÃO DE IMPE1 E IMPE2 BASEADOS EM
CEPA DE PRODUÇÃO DE IMP
[089] De modo a confirmar os efeitos de intensificação de impE1 e impE2, cepas de produção de IMP foram preparadas nas quais as atividades de adenilosuccinato sintetase e IMP deidrogenase, que correspondem à via de degradação de IMP em ATCC6872, foram atenuadas. O códon de iniciação foi mudado mudando-se a primeira base de 'a' a t em cada sequência de nucleotídeos dos genes purA e guaB que codificam as duas enzimas acima. A cepa na qual as expressões dos dois genes foram atenuadas em ATCC6872 foi nomeada CJI9088. Os vetores pDZ-impE1(WT) 2X e pDZ-impE1E2(WT)2X, preparados no Exemplo 3-3, foram transformados na cepa CJ/9088 por eletroporação, e as cepas nas quais os vetores foram inseridos no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução de gene nas cepas finalmente transformadas foi determinada realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 13.
[090] As produtividades de IMP de CJI9088 e as cepas preparadas, CJI9088 impE1I(WT)2X e CJI9088 impE1IE2(WT)2X, foram avaliadas. Após a conclusão da cultura, as capacidades de produzir IMP foi medida por HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 9 abaixo.
TABELA 9
[091] Como resultado de confirmar a quantidade de IMP acumulada no meio, foi constatado que as capacidades de produzir IMP foram aumentadas em até 67% em comparação as da cepa percursora, CJI9088. A partir dos resultados acima, foi confirmado que as capacidades de produzir IMP podem ser aumentadas intensificando-se a atividade da proteína (IMpE) da presente revelação, que exporta IMP.
[092] A partir do que foi mencionado anteriormente, os elementos versados na técnica a quem a presente revelação se refere terão a capacidade de entender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente revelação. Nesse aspecto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação. Pelo contrário, a presente revelação é destinada a abranger não só as modalidades exemplificativas, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes, e outras modalidades que podem estar incluídas dentro do espírito e escopo da presente revelação conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (11)

REIVINDICAÇÕES
1. Micro-organismo do gênero Corynebacterium caracterizado por produzir monofosfato de 5"'-inosina, com uma atividade intensificada de uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2.
2. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5'-inosina ser Corynebacterium stationis.
3. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a intensificação ser alcançada 1) aumentando-se o número de cópia de um polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos; 2) modificando-se uma sequência reguladora de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo; 3) modificando-se a sequência de polinucleotíideos em um cromossomo para intensificar uma atividade da proteína; ou 4) uma combinação dos mesmos.
4. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma atividade de adenilosuccinato sintetase ou IMP deidrogenase ser adicionalmente atenuada.
5. Método para preparar monofosfato de 5'-inosina, caracterizado por compreender cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 1, em um meio.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que o método é caracterizado por compreender adicionalmente recuperar monofosfato de 5"-inosina do micro-organismo ou meio.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o micro- organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5'-inosina ser Corynebacterium stationis.
8. Composição para produzir monofosfato de 5'-inosina, caracterizado por compreender uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2.
9. Uso da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 1 ou 2 caracterizado por ser para aumentar a produção de monofosfato de 5'- inosina do micro-organismo do gênero Corynebacterium.
10. Método para aumentar a exportação de monofosfato de 5'-inosina, caracterizado por compreender intensificar uma atividade da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 no micro-organismo do gênero Corynebacterium.
11. Uso da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 2 caracterizado por ser para aumentar a exportação de monofosfato de 5'- inosina do micro-organismo do gênero Corynebacterium.
Resumo da Patente de Invenção para “MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM, MÉTODO PARA PREPARAR MONOFOSFATO DE 5'- INOSINA, COMPOSIÇÃO PARA PRODUZIR MONOFOSFATO DE 5'-INOSINA,
USO DA PROTEÍNA QUE CONSISTE NA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DE SEQ ID NO: 1 OU 2 E MÉTODO PARA AUMENTAR A EXPORTAÇÃO DE MONOFOSFATO DE 5'-INOSINA” A presente revelação refere-se a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5'--inosinay, com uma atividade intensificada de uma proteína de exportação de IMP; um método para preparar monofosfato de 5'-inosina com o uso do mesmo; uma composição para produzir monofosfato de 5'-inosina; e um método para aumentar a exportação de monofosfato de 5"-inosina.
Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas.
Código de Controle Campo 1 Campo 2 Outras Informações: - Nome do Arquivo: PX 34.1 OPA18596-Sequence Listing - PORT .txt - Data de Geração do Código: 03/01/2020 - Hora de Geração do Código: 20:35:10 - Código de Controle: - Campo 1: 3C9F8CD24941680A - Campo 2: 6DB7DB2103531A29
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