CN116218894A - 一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统、其构建方法及应用 - Google Patents
一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统、其构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统、其构建方法及应用，属于基因工程技术领域，构建方法包括以下步骤：1)筛选能够在少动鞘氨醇单胞菌中稳定复制表达的载体；2)用载体的复制子片段替换质粒plv‑dCas9‑sgRNA的复制子片段，获得重组质粒pBBR1‑dCas9‑sgRNA，即CRISPRi系统；3)确定目的基因并设计sgRNA，验证CRISPRi系统的抑制效率。该CRISPRi系统包括携带sgRNA表达盒和dCas9基因的表达载体，所述载体携带氯霉素抗性。本发明构建成功的CRISPRi系统通过电转化的方法转化到少动鞘氨醇单胞菌中可以实现对菌株的遗传操作。
Description
技术领域
本发明涉及CRISPRi系统的构建，尤其是少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建，属于基因工程技术领域。
背景技术
少动鞘氨醇单胞菌在有氧发酵的条件下可以产生胞外多糖——结冷胶。近年来，利用生物技术研究开发的微生物多糖以其安全无毒、理化性质优良等特性越来越受到食品、制药和化妆品等诸多行业的关注，与植物胶以及动物胶相比，微生物多糖的生产周期短，不受资源、季节、地域等条件的影响和限制，可以大批量工业化生产。作为一种新型微生物多糖，其用途非常广泛，作为增稠剂、凝结剂、悬浮剂和成膜剂等应用到食品、医药、化工等多个领域，与其他同类产品相比具有用量少、性能稳定、凝结度高、凝胶透亮等优点。
少动鞘氨醇单胞菌不仅具有较高的经济价值，对于保护环境也具有潜在的应用价值，鞘氨醇单胞菌属有非常强的代谢能力，可以降解芳香族化合物。因此，对于少动鞘氨醇单胞菌的研究非常有意义，随着对少动鞘氨醇单胞菌的生理学和结冷胶生物合成途径的深入了解，通过基因工程和代谢工程提高结冷胶产量是一种有效途径。由于常见的质粒在鞘氨醇单胞菌中不兼容，导致常见的质粒的复制子在少动鞘氨醇单胞菌中无法复制，所以无法实现通过质粒将外源基因或CRISPRi系统导入到少动鞘氨醇单胞菌并使其在体内正常复制。因此寻找能够在少动鞘氨醇单胞菌中正常复制的复制子是对少动鞘氨醇单胞菌进行遗传操作的关键。
CRISPRi系统作为一种简单高效的基因调控技术，是通过导入核酸内切酶活性缺失的dCas9蛋白和与靶序列互补配对的sgRNA来抑制目的基因的表达。相比于原本的Cas9蛋白，dCas9蛋白仍旧可以在sgRNA的介导下结合在特定的靶位点，但是失去了剪切DNA双链的功能，故不会造成DNA的损伤，对细菌的正常复制不造成任何影响；CRISPRi系统在原核生物中的应用包括对必须基因的功能探究、药物靶点的筛选、代谢工程的调控等。不造成DNA损伤、无需引入外源修复系统并且依旧可以改变相关基因的表达，CRISPRi干扰技术是优于传统CRISPR/Cas9编辑技术的第一选择。
发明内容
本发明提供一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统及其构建方法，以实现对少动鞘氨醇单胞菌菌株关键基因的遗传操纵。
本发明的技术方案为：一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，包括以下步骤：
1)筛选能够在少动鞘氨醇单胞菌中稳定复制表达的载体；
2)用载体的复制子片段替换质粒plv-dCas9-sgRNA的复制子片段，获得重组质粒，即CRISPRi系统；
3)确定目的基因并设计sgRNA，验证CRISPRi系统的抑制效率。
进一步的，所述少动鞘氨醇单胞菌为菌株ATCC 31461。
进一步的，步骤1)所述载体为pBBR1MCS，优选购自于上海林渊生物科技有限公司。
进一步的，步骤2)获得重组质粒的方法为酶切-连接方法；步骤2)中所述质粒plv-dCas9-sgRNA具有编码氯霉素的抗性基因，包括dCas9基因和sgRNA转录框。
进一步的，所述sgRNA转录框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，sgRNA包括三部分:与靶序列互补配对的长20bp的RNA，与dCas9结合的长42bp的发夹结构，以及长40bp的终止子。
进一步的，步骤3)所述目的基因为phaC基因，所述phaC基因为编码PHB聚合酶的基因，phaC基因是少动鞘氨醇单胞菌中PHB合成途径中的关键基因。
进一步的，步骤3)中验证CRISPRi系统的抑制效率的方法为：以phaC基因为目的基因，设计sgRNA，构建重组质粒plv-dCas9-phaCn，将CRISPRi系统转化到少动鞘氨醇单胞菌中，通过RT-qPCR测定目的基因phaC的转录水平，验证CRISPRi系统的抑制效率。
进一步的，验证CRISPRi系统的抑制效率时根据所选目的基因进行sgRNA设计的原则如下：(1)选择目的基因正义链CCN后的序列，序列长度为20nt，(2)所选的20nt序列为靠近基因转录起始密码子ATG区的序列，(3)所选的sgRNA序列没有特殊的结构，比如没有茎环结构。
一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统，由上述构建方法得到，且所述系统包括携带sgRNA表达盒和dCas9基因的表达载体，所述载体携带氯霉素抗性。
一种上述的少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的应用，所述CRISPRi系统用于研究少动鞘氨醇单胞菌的必需基因的功能、调控或抑制少动鞘氨醇单胞菌的代谢过程。如利用本发明的CRISPRi系统抑制少动鞘氨醇单胞菌中PHB合成途径中的关键基因phaC的转录水平等。
本发明一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统、其构建方法及应用技术方案的有益效果为：
本发明构建的CRISPRi系统可用于研究少动鞘氨醇单胞菌的必需基因的功能，以及调控或抑制少动鞘氨醇单胞菌的代谢过程。
本发明的CRISPRi系统的优点在于1)可以调控少动鞘氨醇单胞菌的代谢通路；2)与传统的基因敲除和诱变育种相比，本发明CRISPRi系统的优势更为明显，靶向性强并且对细菌生长的损伤小。
附图说明
图1表示CRISPRi系统重组质粒的构建流程；
图2表示质粒pBBR1转化到少动鞘氨醇单胞菌中的电泳图；
图3表示重组质粒pBBR1-dCas9-sgRNA测序结果；
图4表示重组质粒pBBR1-dCas9-phaCn测序结果；
图5表示重组质粒pBBR1-dCas9-sgRNA和重组质粒pBBR1-dCas9-phaCn转化到少动鞘氨醇单胞菌中的电泳图；
图6表示RT-qPCR的熔解峰曲线分析；
图7表示CRISPRi技术对phaC基因的抑制效率。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明的一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统、其构建方法及应用的技术方案包括以下几个步骤：
(一)选择一种可以在少动鞘氨醇单胞菌中稳定复制和表达的质粒，并电转化到少动鞘氨醇单胞菌中验证其载体是否能够在菌体复制，首先确定CRISPRi系统的复制子部分。
(二)设计引物扩增pBBR1质粒的复制子片段，并且通过酶切连接的方法替换掉plv-dCas9-sgRNA的复制子片段，构建新的重组质粒，即为CRISPRi系统，重组质粒的构建过程如图1所示。
(三)确定目的基因并设计sgRNA，验证CRISPRi系统的抑制效率，具体的如可选取phaC基因，通过RT-qPCR测定CRISPRi系统的抑制效率，设计相应的gRNA，通过CRISPRi系统抑制该基因的转录，从而调控少动鞘氨醇单胞菌的代谢过程。
在上述发明中，制备少动鞘氨醇单胞菌感受态细胞的制备方法是：少动鞘氨醇单胞菌在种子培养基中30℃培养至OD600＝0.5，离心收集，用电转缓冲液重悬两次，加入100μl电转缓冲液于-80℃保存。具体地，电转缓冲液的成分包含：甘油、吐温80、双蒸水，0.22μm过膜除菌。优选的，电转化采用的电击条件是电压1.8Kv-2.5Kv，脉冲时间1-4ms。
验证CRISPRi系统的抑制效率步骤中，选取的phaC基因编码的蛋白为PHB聚合酶，是少动鞘氨醇单胞菌PHB合成途径中的关键酶，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
验证CRISPRi系统的抑制效率步骤中，sgRNA的设计原则为：1)应选择目的基因正义链CCN后的序列，序列长度为20nt；2)所选的20nt序列尽可能的靠近基因转录起始密码子ATG区；3)所选的sgRNA序列没有特殊的结构，比如没有茎环结构。
优选的，构建能够在少动鞘氨醇单胞菌中稳定复制的CRISPRi系统包括以下几个步骤：
1.选择一种可以在少动鞘氨醇单胞菌中稳定复制和表达的质粒
a.制备少动鞘氨醇单胞菌感受态细胞。
b.将质粒pBBR1电转化到少动鞘氨醇单胞菌感受态细胞中，加入种子培养基后复苏培养2-4h后，涂布到10μg/ml CH的YM培养基上，30℃培养24-72h。
c.挑取平板上的单菌落，设计引物扩增复制子片段通过菌落PCR验证质粒是否电转化到少动鞘氨醇单胞菌中。
2.用pBBR1质粒的复制子替换plv-dCas9-sgRNA的复制子片段，质粒pBBR1复制子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
a.以pBBR1质粒为模板，oriv-F/R为引物，PCR扩增复制子片段，纯化，回收目的基因。
b.酶切质粒plv-dCas9-sgRNA、复制子片段，将复制子片段连接到plv-dCas9-sgRNA质粒上，转化到E.coli TOP10后，用氯霉素(25μg/ml)筛选重组子。
c.将筛选出的重组子提取质粒，测序验证。
3.重组质粒电转化到少动鞘氨醇单胞菌中验证
a.按照上述的电转化方法，将重组质粒电转到少动鞘氨醇单胞菌中，涂布到10μg/ml CH的YM平板上，30℃静置培养24-72h.
b.挑取单菌落，设计引物dCas9-F/R通过菌落PCR验证重组质粒是否成功转化到少动鞘氨醇单胞菌中。
在另一具体实施方案中，设计相应的gRNA插入到CRISPRi系统，验证CRISPRi的抑制效率。具体的可以通过如下方法进行验证，具体的，包括以下步骤：
1.针对phaC基因设计3条gRNA，分别为phaC1、phaC2、phaC3，对应的sgRNA序列如SEQ ID NO.3/4/5所示。
2.将合成的3条sgRNA插入到重组质粒pBBR1-dCas9-sgRNA中“spacer”位置，构建重组质粒pBBR1-dCas9-phaCn。
3.将重组质粒pBBR1-dCas9-phaCn电转到少动鞘氨醇单胞菌中，并通过RT-qPCR测定目的基因的转录水平，从而验证CRISPRi系统的验证效率。
实施例1
一、实验材料
1.实验菌株：
少动鞘氨醇单胞菌S.paucimobilisATCC31461来自河北师范大学实验室所保藏的菌株。
大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞购自北京博迈德生物公司。
2.实验质粒：
质粒pBBR1-MCS1购自上海林渊生物科技有限公司。
质粒plv-dCas9-sgRNA来自河北师范大学实验室所保藏的菌株。
3.主要试剂如表1所示。
表1
4.下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠；
LB固体培养基：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂糖；
YM培养基：酵母浸粉、麦芽浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖；
YM固体培养基：酵母浸粉、麦芽浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖、琼脂糖；
种子培养基：蔗糖、酵母膏、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁。5.表2所述为实施例中所用的引物
表2
F：上游引物R：下游引物。下划线表示酶切位点序列。
二、实验方法
(一)筛选出能够在少动鞘氨醇单胞菌中稳定复制表达的载体
1.制备少动鞘氨醇单胞菌的感受态细胞
1-1.从-80℃冰箱中取出保藏的少动鞘氨醇单胞菌ATCC31461,接种到YM培养基中，30℃，180rpm震荡培养16h,活化菌体。
1-2.取步骤1的菌液接种到种子培养基中，同样条件下，培养至OD600吸光值在0.5左右。
1-3.在无菌超净台中将菌液收集到离心管内，4℃/8000rpm离心10min，弃上清，收集细胞；
1-4.在无菌超净工作台上用预冷的电转缓冲液重悬细胞三次，最后加入100μl电转缓冲液后放-80℃保存。
2、将质粒pBBR1电转到少动鞘氨醇单胞菌中。
2-1.取100ng质粒pBBR1加入到少动鞘氨醇单胞菌感受态细胞中，吹吸混匀，使质粒和感受态细胞混合均匀。
2-2.将上述步骤的体系转移到电击杯中，冰上预冷10min,用电转仪进行电击，电压2.5Kv、时间4ms。
2-3.完成上述步骤后，立即向电击杯中加入1ml种子培养基，吹吸混匀。将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，30℃，200rpm振荡培养2h。
2-4.将上述步骤的菌液涂布于含有10μg/ml氯霉素的YM固体培养基平板，30℃培养72h。
2-5.菌落PCR验证
随机挑选生长出来的单克隆，加入到20μl的无菌水中制成菌悬液。设计引物扩增复制子片段，验证转化结果。
引物如下：
oriv-F:CCCAACAGCGATTCGTCC
oriv-R:ACGCAGTCCAGAGAAATC
PCR体系：
PCR反应条件：
Step1:94℃预变性3min
Step2:95℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸20s,循环35次
Step3:72℃延伸10min。
配制1％的琼脂糖凝胶，电泳检测。
2-6.将菌落PCR验证正确的单克隆提取质粒后，琼脂糖凝胶电泳，验证是否转化成功。
经实验验证，电转化质粒pBBR1到少动鞘氨醇单胞菌后的转化结果可以看出有明显的单菌落长出，经菌落PCR验证后，结果如图2所示，8号单菌落未扩增出目的片段说明为假阳性菌落，1-7、9、10都能扩增出复制子的片段为阳性克隆，说明质粒pBBR1可以在少动鞘氨单胞菌ATCC31461中稳定复制和表达。
(二)构建重组质粒pBBR-dCas9-sgRNA
1、扩增pBBR1质粒复制子部分
1-1.以质粒pBBR1为模板，设计引物扩增复制子部分。
引物如下：
Oriv-SpeI-F:ACTAGTTAGGTTGCCCATTTTCGCCAG
Oriv-NgoMIV-R:TGAATCCGTTAGCGAGGTGC
反应体系：
PCR程序：
Step1:94℃预变性3min
Step2:95℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸1min30s,循环35次
Step3:72℃延伸10min。
1-2.琼脂糖凝胶电泳验证后，回收目的片段，根据marker,用刀片切下1879pb处的条带，用omega的胶回收试剂盒回收DNA，回收产物送公司测序，测序结果与模板比对，测序结果如图3所示，与模板序列一致，说明pBBR1质粒复制子部分扩增成功。
2、复制子片段与质粒plv-dCas9-sgRNA的酶切与回收
2-1.从4℃冰箱中取出保藏的E.coli(plv-dCas9-sgRNA),接种到LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养16h,提取质粒plv-dCas9-sgRNA。
2-2.载体plv-dCas9-sgRNA的酶切线性化
用限制性内切酶SpeⅠ/NgoMⅣ双酶切质粒plv-dCas9-sgRNA，酶切产物凝胶电泳，切胶回收目的序列。
酶切体系：
37℃，酶切2h,80℃20min热失活
2-3.复制子片段的双酶切
用限制性内切酶SpeⅠ/NgoMⅣ双酶切复制子片段，酶切产物凝胶电泳，切胶回收目的序列。
酶切体系：
37℃，酶切2h,80℃20min热失活
3、质粒plv-dCas9-sgRNA与复制子片段连接
连接体系：
16℃过夜连接。
4、连接产物转化到E.coli Top10细胞
(1)取连接产物置于冰预冷的1.5mL离心管中；
(2)将冻存的感受态细胞置冰浴中融化，轻轻振动离心管使之成为均匀悬液，取100μL加入步骤1离心管中；
(3)轻轻振动离心管混匀，不可剧烈振荡，冰浴中静置20～30min；
(4)42℃水浴中热击60～90s，避免振动离心管；
(5)迅速将管子移入冰浴中，冷却2～5min；
(6)加入已37℃预热的盛有900μL的1.5mL离心管中，37℃，160～225rpm孵育45min～1.5h；
(7)4000r离心1min，倒掉大部分上清，保留约100μL化转混合物，用无菌玻璃涂布棒涂布于整个25μg/ml氯霉素的LB抗性培养基表面.
(8)将平皿置37℃中先正置培养30min，后倒置培养过夜。
5、菌落PCR验证
随机挑选单克隆，提取质粒，设计测序引物，测序验证重组质粒pBBR1-dCas9-sgRNA是否连接成功。
CX-sg-F:TGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAG
CX-oriv-F:TGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAG
(9)将提取的质粒送生物公司测序，测序结果SEQ ID NO.7显示重组质粒pBBR1-dCas9-sgRNA构建成功，即CRISPRi系统构建成功。
(三)CRISPRi系统的抑制效率验证
1、构建重组质粒pBBR1-dCas9-phaCn
1-1.设计sgRNA序列。根据少动鞘氨醇单胞菌ATCC31461的已知基因phaC,设计三条对应的sgRNA，分别为phaC1、phaC2、phaC3，在sgRNA前加入酶切位点BspQI。将引物序列送生物公司进行合成，引物的合成量均为100nmol,纯化方式为PAGE。
1-2.gRNA退火形成粘性末端
将合成的引物粉末离心后，用无菌去离子水配制成100pmol/μl的引物母液，在无菌PCR管中加入以下成分：
PCR程序：
Step1:37℃30min
Step2:95℃5min
Step3:5℃/min降至25℃。
退火产物为含粘性末端的双链结构，在-20℃保存。
1-3.载体pBBR1-dCas9-sgRNA的酶切线性化
将重组质粒用限制性内切酶BspQI单酶切线性化。酶切产物凝胶电泳后，胶回收线性化片段。
酶切体系：
50℃反应1.5h，80℃热失活20min。
1-4.连接产物转化到E.coli Top10
(1)取连接产物置于冰预冷的1.5mL离心管中；
(2)将冻存的感受态细胞置冰浴中融化，轻轻振动离心管使之成为均匀悬液，取100μL加入步骤1离心管中；
(3)轻轻振动离心管混匀，不可剧烈振荡，冰浴中静置20～30min；
(4)42℃水浴中热击60～90s，避免振动离心管；
(5)迅速将管子移入冰浴中，冷却2～5min；
(6)加入已37℃预热的盛有900μL的1.5mL离心管中，37℃，160～225rpm孵育45min～1.5h；
(7)4000r离心1min，倒掉大部分上清，保留约100μL化转混合物，用无菌玻璃涂布棒涂布于整个25μg/ml氯霉素的LB抗性培养基表面.
(8)将平皿置37℃中先正置培养30min，后倒置培养过夜。
1-5菌落PCR验证
第二天挑取抗性培养基表面生长的单菌落用于菌落PCR的验证。菌落PCR的引物分别为特异性引物BspQI-phaCn-F和载体pBBR1-dCas9-sgRNA骨架上的引物sgRNA-R。PCR体系和程序如下：
PCR体系：
PCR反应条件：
Step1:94℃预变性3min
Step2:95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸20s,循环35次
Step3:72℃延伸10min。
1％琼脂糖凝胶电泳检测
1-6.测序验证
选择条带正确的单菌落过夜培养，次日提取质粒，以载体pBBR1-dCas9-sgRNA骨架上的sgRNA-R为引物送生物公司测序，测序结果(SEQ ID NO.8/9/10)与目的序列比对结果如图4所示，表示质粒pBBR1-dCas9-phaCn构建成功(n＝1,2,3)。
2、将重组质粒pBBR-dCas9-sgRNA和重组质粒pBBR-dCas9-phaCn转化到少动鞘氨醇单胞菌中
2-1.制备少动鞘氨醇单胞菌感受态细胞
(1)从-80℃冰箱中取出保藏的少动鞘氨醇单胞菌ATCC31461,接种到YM培养基中，30℃，180rpm震荡培养16h,活化菌体。
(2)取步骤1的菌液接种到种子培养基中，同样条件下，培养至OD600吸光值在0.5左右。
(3)在无菌超净台中将菌液收集到离心管内，4℃/8000rpm离心10min，弃上清，收集细胞。
(4)在无菌超净工作台上用预冷的电转缓冲液重悬细胞三次，最后加入100μl电转缓冲液后放-80℃保存。
2-2.将重组质粒pBBR-dCas9-sgRNA和pBBR1-dCas9-phaCn电转到少动鞘氨醇单胞菌中。
(1).取100ng质粒pBBR-dCas9-sgRNA/pBBR1-dCas9-phaCn加入到少动鞘氨醇单胞菌感受态细胞中，吹吸混匀，使质粒和感受态细胞混合均匀。
(2).将上述步骤的体系转移到电击杯中，冰上预冷10min,用电转仪进行电击，电压2.5Kv、时间4ms。
(3).完成上述步骤后，立即向电击杯中加入1ml种子培养基，吹吸混匀。将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，30℃，200rpm振荡培养2h.
(4).将上述步骤的菌液涂布于含有10μg/ml氯霉素的YM固体培养基平板，30℃培养72h.
(5).随机挑选生长出来的单克隆，设计引物扩增dCas9基因和CH片段，验证转化结果。
CH片段：
CH-F:CAACAGGAGTCCAAGCGAGC
CH-R:TCTGGAGTGAATACCACGACGA
dCas9片段：
dCas9-F:TTTGACAACGGCTCTATTCC
dCas9-R:TTCGCATTCCTTCAGTAACA
PCR体系：
PCR程序：
Step1:94℃预变性3min
Step2:5℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸30s,循环35次
Step3:72℃延伸10min。
PCR产物琼脂糖凝胶电泳，选择电转化成功的单克隆菌落。
如图5所示，少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-sgRNA)和少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-phaCn)各挑取4个单菌落，其中CH片段为374bp,dCas9片段大小为391bp。
(6).选择正确的单克隆菌落接种至含10μg/ml氯霉素的YM培养基，30℃，180rpm/min振荡培养36h,提取质粒验证转化结果，得到重组菌株少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-sgRNA)和少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-phaCn).
3、RT-qPCR验证CRISPRi系统的效率。
3-1.提取少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-phaCn)总RNA。
(1)取菌株少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-phaCn)为实验组接种至10μg/ml氯霉素的YM培养基中，取少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-sgRNA)为对照组接种至无抗的YM培养基中，30℃，180rpm,培养至稳定期。
(2)取菌液2-5ml至1.5ml离心管中，8000g、4℃离心2min，弃上清，注意不要破坏细菌沉淀；
(3)向离心管中加入1ml的RNAiso Plus溶液溶解细胞沉淀，用枪头反复吹打溶液直至裂解液中无明显沉淀；
(4)室温静置5min后，向离心管中加入200μl(1/5体积RNAiso Plus溶液)氯仿，盖紧离心管盖，涡旋振荡至混合液呈乳白色；
(5)室温静置10min,12000g、4℃离心15min，离心结束后小心取出离心管，此时离心管中分为三层：离心后分三层，上层澄清包含RNA，中层为白色蛋白，下层为粉色。
(6)取上层澄清液体加入无RNA酶的1.5mL Ep管中。
(7)加入等RNA溶液体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀8-10次，室温静置20min,看到白色絮状物。
(8)4℃，12000g离心10min。
(9)将离心后的上清使用移液枪弃掉，底部白色为RNA。
(10)加入75％的乙醇(等同RNAiso plus的体积)清洗沉淀，轻轻颠倒或倒立弹管底。
(11)移液枪去上清,室温干燥沉淀8-10min。
(12)加入适量的DEPC水溶解RNA,分装两份，一份用于测定RNA浓度，并电泳验证；另一份用于反转录。
3-2.反转录
使用诺唯赞的HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录反应。
(1)去组织DNA
模板RNA 1pg-1μg
4×gRNA wiper Mix 4μL
RNase-free ddH2O to 16μL
程序：42℃2min
(2)反转录体系
去组织DNA的反应液 16μL
5×HiScriptⅢqRT SuperMix 4μL
程序：37℃15min 85℃5s
3-3.实时荧光定量PCR
将反转录的产物cDNA为模板，采用SYBR Premix Ex Taq II染料法,在Bio-BadCFX 96Real-time PCR仪中进行qPCR。以少动鞘氨醇单胞菌的16S为内参基因，对phaC基因进行相对定量。
RT-qPCR所用引物：
RT-16S-F:ACTCCGTGCCAGCAGCCG
RT-16S-R:CACCTCTCCTGGATTCAAGCGA
RT-phaC-F:CGCCTTCGGCAAAGAAATACC
RT-phaC-R:CAACCAACCAGTCCACCCAGT
RT-qPCR反应体系：
反应程序
①预变性95℃3min
②循环反应95℃10s 60℃30s 40个循环
③融解曲线
熔解峰曲线分析如图6所示，16s内参基因与phaC基因均呈现单一峰。
以少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-sgRNA)为对照组，少动鞘氨醇单胞菌(pBBR1-dCas9-phaCn)为实验组，每个样品重复3次试验，所得数据通过2-ΔΔCt计算得到少动鞘氨醇单胞菌中phaC基因的相对表达量，将对照组的phaC基因表达量定义为1，用来验证CRISPRi的抑制效率。结果如图7所示，与对照组相比，三条sgRNA phaC1、phaC2、phaC3对phaC基因的转录均有抑制作用，其中phaC1的抑制效果最为明显，抑制效率高达74.30％。
以上结果表明CRISPRi系统构建成功，并且能有效抑制phaC基因的表达，从而影响少动鞘氨醇单胞菌中PHB的合成，可以实现从基因层面对少动鞘氨醇单胞菌代谢途径的改造。
以上实施例只是列举少动鞘氨醇单胞菌phaC基因CRISPRi系统的构建，以及对phaC基因转录的影响。依照本发明的方法构建少动鞘氨醇单胞菌其他基因或其他代谢途径而构建的CRISPRi系统均属于本发明的范畴。在不偏离本发明的精神实质下作简单的改变和变通也属于本发明的范围。
Claims (10)
1.一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)筛选能够在少动鞘氨醇单胞菌中稳定复制表达的载体；
2)用载体的复制子片段替换质粒plv-dCas9-sgRNA的复制子片段，获得重组质粒，即CRISPRi系统；
3)确定目的基因并设计sgRNA，验证CRISPRi系统的抑制效率。
2.根据权利要求1所述的一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，其特征在于，所述少动鞘氨醇单胞菌为菌株ATCC 31461。
3.根据权利要求1所述的一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，其特征在于，步骤1)所述载体为pBBR1MCS。
4.根据权利要求1所述的一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，其特征在于，步骤2)获得重组质粒的方法为酶切-连接方法；步骤2)中所述质粒plv-dCas9-sgRNA具有编码氯霉素的抗性基因，包括dCas9基因和sgRNA转录框。
5.根据权利要求4所述的一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，其特征在于，所述sgRNA转录框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，sgRNA包括三部分:与靶序列互补配对的长20bp的RNA，与dCas9结合的长42bp的发夹结构，以及长40bp的终止子。
6.根据权利要求1所述的一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，其特征在于，步骤3)所述目的基因为phaC基因，所述phaC基因为编码PHB聚合酶的基因。
7.根据权利要求6所述的一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，其特征在于，步骤3)中验证CRISPRi系统的抑制效率的方法为：以phaC基因为目的基因，设计sgRNA，构建重组质粒plv-dCas9-phaCn，将CRISPRi系统转化到少动鞘氨醇单胞菌中，通过RT-qPCR测定目的基因phaC的转录水平，验证CRISPRi系统的抑制效率。
8.根据权利要求1或7所述的一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的构建方法，其特征在于，验证CRISPRi系统的抑制效率时根据所选目的基因进行sgRNA设计的原则如下：(1)选择目的基因正义链CCN后的序列，序列长度为20nt，(2)所选的20nt序列为靠近基因转录起始密码子ATG区的序列，(3)所选的sgRNA序列没有特殊的结构。
9.一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述构建方法得到，且所述系统包括携带sgRNA表达盒和dCas9基因的表达载体，所述载体携带氯霉素抗性。
10.一种权利要求9所述的少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi系统的应用，其特征在于，所述CRISPRi系统用于研究少动鞘氨醇单胞菌的必需基因的功能、调控或抑制少动鞘氨醇单胞菌的代谢过程。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 孙亚杰: "关键酶过表达对威兰胶合成的影响", 中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）, vol. 1, pages 006 - 287 * |
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