CN111139250B - 一种硫辛酸合成相关基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种硫辛酸合成相关基因及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供一种硫辛酸合成相关的基因XC_0713，基因序列如SEQ ID NO.1所示，与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列；所述基因XC_0713编码产物具有硫辛酸合成酶活性，所述基因XC_0713编码产物氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明研究了Xcc8004菌株基因组中XC_0713基因突变后，突变株不再对寄主植物致病，该硫辛酸合成酶基因(XC_0713)可作为靶点筛选黑腐病防控的药物，为十字花科植物黑腐病的防治提供新的途径。

Description

一种硫辛酸合成相关基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种硫辛酸合成相关基因及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
黄单胞菌属是植物病原菌中较大的类群，能侵染400多种植物，包括许多重要的农作物和经济作物，如水稻(白叶枯病，X.oryzae pv.oryzae)、十字花科植物(黑腐病，X.campestris pv.campestris，以下简称Xcc)、柑橘(溃疡病，X.axonopodis pv.citri)等，侵染后影响农作物和经济作物的产量和品质，造成严重的经济损失。
Xcc能侵染所有十字花科植物，包括模式植物拟南芥以及甘蓝、白菜、花椰菜、萝卜、芥菜等多种重要蔬菜，引起的十字花科植物黑腐病是一种世界性植物病害。黑腐病属于维管束病害，一旦发病，不但造成减产，而且严重影响蔬菜的品质。近年来，随着我国菜田复种指数的普遍提高，细菌性黑腐病的发病程度和发病率呈现上升趋势，严重危害我国十字花科蔬菜的生产，造成巨大的经济损失。
当前，喷洒化学农药(如叶枯宁、硫酸链霉素等)是防治黄单胞菌侵染的主要措施，但Xcc引起的十字花科黑腐病属于维管束病害，一旦发病，外源喷洒化学农药不能有效杀死病原菌，长期使用还导致农药残留，引起食品安全及生态平衡破坏等全球关注的问题。因此，为满足我国农业生产可持续性发展，迫切需要研究黄单胞菌的生理特性和致病机理，发现新的药物作用靶点，并研发高效、有针对性、绿色环保的药剂和防治方法。
硫辛酸(lipoic acid)是含有两个硫原子的八碳饱和脂肪酸，其化学名称为1,2-二硫代戊环-3-戊酸(1,2-dithiolane-3-pentanoic acid)，是一种以R型对映异构体形式低浓度存在于动植物、微生物等所有细胞中的天然物质。硫辛酸在丙酮酸脱氢酶复合体、α-酮戊二酸脱氢酶复合体，3-羟基丁酮脱氢酶复合体和甘氨酸裂解系统等多酶复合体系中对于乙酰-CoA的产生是一个必不可少的关键性含硫辅因子，是生物体内参与能量代谢、单碳循环等基本代谢酶类的辅基，有着非常重要的生理功能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，一方面提供一种硫辛酸合成相关的新基因XC_0713，另一方面通过十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_0713失活，获得基因的突变株，其不引起十字花科黑腐病，从而证实了新基因XC_0713可作为防控十字花科黑腐病药物的筛选靶点，为十字花科植物黑腐病的防治提供新的途径。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种硫辛酸合成相关的基因XC_0713，基因具有(a)或(b)所示的核苷酸序列：
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(b)具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少90％的同源性，且编码硫辛酸合成酶。
所述序列表中SEQ ID NO.1是Xcc野生菌株8004基因组中的一段序列，由1014个核苷酸组成，自5’端的第1～3位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5’端的第1012～1014位核苷酸为该基因的终止密码子TGA。
本发明是提供一种硫辛酸合成酶基因(XC_0713)，该基因的突变体(Xcc△0713)不引起十字花科黑腐病，硫辛酸合成酶(XC_0713)可作为防控十字花科黑腐病药物的筛选靶点；所述基因XC_0713编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的硫辛酸合成酶，其具有硫辛酸合成酶活性，包括337个氨基酸，分子量为36889.4道尔顿，等电点为7.86。
另一方面，本发明提供所述的基因XC_0713在防治十字花科黑腐病中的应用，所述基因XC_0713作为防治十字花科黑腐病的靶点。
本发明研究了Xcc8004菌株基因组中XC_0713基因突变后，突变株不再对十字花科寄主植物产生致病力，从而说明硫辛酸合成酶基因(XC_0713)可作为靶点筛选黑腐病防控的药物。
再一方面，本发明提供所述的基因XC_0713在构建对十字花科植物丧失致病力菌株的应用。
再一方面，本发明提供一种对十字花科植物丧失致病力的基因工程重组菌，是将十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_0713失活所得。
通过采用现代分子生物学技术对十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004进行定向改造，使得敲除十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_0713，获得对十字花科植物丧失致病力的基因工程重组菌，其对寄主植物十字花科无致病力，证实了硫辛酸合成相关的关键基因，即硫辛酸合成酶基因(XC_0713)，可作为抗菌药物作用靶点，用于新型抗黑腐病药物改造。
进一步地，所述失活的方式为敲除基因XC_0713的全部或部分编码框。
进一步地，所述的对十字花科植物丧失致病力的基因工程重组菌，由包括如下步骤的方法构建得到：
(1)构建基因敲除重组质粒；
(2)将步骤(1)获得的重组质粒转化E.coli S17-1感受态细胞，获得转化子；
(3)采用接合转移方式将重组质粒导入至十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004中，通过卡那霉素和利福平抗性培养基筛选，获得第一次重组菌；
(4)将pSRK-EclplA质粒导入至步骤(3)得到的第一次重组菌中，用复制平板法筛选第二次重组菌；
(5)PCR法验证步骤(4)中得到的第二次重组菌，将扩增片段测序，确认需要敲除的基因XC_0713已被删除，成功删除基因XC_0713的第二次重组菌，即为对十字花科植物丧失致病力的基因工程重组菌。
进一步地，所述步骤(1)为：以十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004的基因组为模板，利用PCR法分别扩增XC_0713基因的上游片段和下游片段，其中，上游片段的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，下游片段的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；然后采用融合PCR法，以扩增后XC_0713基因的上、下游片段为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6为引物，继续扩增，获得扩增片段P1P4；再将扩增片段P1P4酶切后连入自杀质粒pK18mobsacB中，获得阻断质粒，即为重组质粒。
进一步地，步骤(4)中，所述复制平板法筛选第二次重组菌为：在含有庆大霉素的NYG液体培养基中震荡培养过夜后，涂布于含有庆大霉素、利福平和NYG平板，培养获得单菌落；然后将单菌落对应接种到含有庆大霉素、卡那霉素、利福平的NYG平板以及含庆大霉素和利福平的NYG平板上，筛选获得第二次重组菌。
进一步地，步骤(5)中，PCR验证引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；验证PCR的程序包括如下：①95℃预变性10min；②95℃变性1min；③56℃退火30s；④72℃延伸2min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明研究了Xcc8004菌株基因组中XC_0713基因突变后，突变株不再对十字花科寄主植物致病，该硫辛酸合成酶基因(XC_0713)可作为靶点筛选黑腐病防控的药物，为十字花科植物黑腐病的防治提供新的途径；
(2)通过采用现代分子生物学技术对十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004进行定向改造，使得敲除十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_0713，获得对十字花科植物丧失致病力的基因工程重组菌，其对寄主植物十字花科无致病力，证实了硫辛酸合成相关的关键基因，即硫辛酸合成酶基因(XC_0713)，可作为抗菌药物作用靶点，用于新型抗黑腐病药物改造。
附图说明
图1为本发明实施例4对XC_0713基因敲除突变株XccYH2的验证结果图。
图2本发明对XC_0713基因突变株XccYH2的致病性检测结果图，其中，图2(a)为侵染叶片观察；图2(b)为侵染叶片病斑长度测定。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例为基因敲除重组质粒的构建，旨在获得重组质粒，从而达到构建对十字花科丧失致病力的基因工程重组菌的目的。
XC_0713基因敲除重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
(1)分别设计XC_0713基因上游片段的PCR引物对P1-F和P2-R，以及XC_0713基因下游片段的PCR引物对P3-F和P4-R；
(2)以十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004的总DNA为模板，分别PCR扩增XC_0713基因上游片段和XC_0713基因下游片段；
(3)采用融合PCR法，以步骤(2)中获得的XC_0713基因上游片段和下游片段为模板，以P1-F和P4-R为引物，扩增获得P1P4片段；
(4)先将步骤(3)中获得的P1P4片段酶切，然后将酶切片段连入pK18mobsacB中，测序正确的重组质粒即为用于基因敲除的阻断质粒pYYH-1。
对上述步骤需要说明的是，P1-F的基因序列如SEQ ID NO.3所示，P2-R的基因序列如SEQ ID NO.4所示，P3-F的基因序列如SEQ ID NO.5所示，P4-R的基因序列如SEQ ID NO.6所示，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司合成。
步骤(2)中的PCR反应体系如表1所示。PCR扩增程序为：①95℃预变性10min；②95℃变性50s；③56℃退火30s；④72℃延伸1.5min；。将PCR产物置于4℃条件下保存。扩增后的XC_0713基因上游片断P1P2约700bp，下游片断P3P4约700bp。
步骤(3)中融合PCR扩增程序为：①95℃预变性10min；②95℃变性1min；③56℃退火30s；④72℃延伸2min 15s。将PCR产物置于4℃条件下保存。融合PCR的反应体系详见表2。
表1为实施例1中步骤(2)中的PCR反应体系(50μl扩增体系)
试剂 用量(μl)
Xcc8004的总DNA 1
正向引物 1
反向引物 1
dNTP 2
DMSO 5
50％甘油 5
10×DNA聚合酶缓冲液 5
DNA聚合酶pfu 1
双蒸水 29
总体系 50
表2为实施例1中步骤(3)中的融合PCR反应体系
Figure BDA0002355205370000061
Figure BDA0002355205370000071
步骤(4)中用于酶切的酶为EcoRI和HindIII(限制性内切酶、连接酶等试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司)，酶切温度为37℃，酶切时间为4h。具体的酶切反应体系详见下表3：
表3为实施例1中步骤(4)中的酶切反应体系
试剂 用量(μl)
扩增获得P1P4片段 60
10×酶切buffer 10
EcoRI 2
HindIII 2
双蒸水 26
总体系 100
步骤(4)中酶切后的片段连入pK18mobsacB中，连接温度为16℃，连接时间为12h。具体的连接体系详见表4：
表4为为实施例中步骤(4)中的连接反应体系
试剂 用量(μl)
酶切后片段 10
酶切后载体 5
10×连接酶buffer 2
DNA连接酶 1
双蒸水 2
总体系 20
步骤(4)中pYYH-1序列经生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司测序正确。
实施例2
本实施例为第一次重组菌株的构建，旨在获得第一次重组菌株XccYH1，从而达到构建对十字花科丧失致病力的基因工程重组菌的目的。
第一次重组菌株XccYH1的构建，包括如下步骤：
(1)利用CaCl2诱导法制备大肠杆菌(E.coli)S17-1感受态，3μl质粒pYYH-1加入100μl E.coli S17-1感受态后冰浴30min后，42℃热激120s，加入1ml无抗LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L)37℃培养1h后，涂布于含有卡那霉素(Km，30μg/ml)LB平板，获得转化子E.coli S17-1/pYYH-1；
(2)利用接合转移方式将阻断质粒pYYH-1导入野生菌株Xcc8004，具体操作步骤为：将供体菌E.coli S17-1/pYYH-1在5ml液体LB培养基中37℃震荡培养过夜，将受体菌Xcc8004在NYG(蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，甘油20g/L)液体培养中30℃震荡培养过夜，离心收集两种菌体，混合与1ml NYG培养基中，并洗涤两次，重悬于0.1ml NYG中，并将菌悬液滴与无抗NYG固体培养基上，晾干，正置培养48h，用无菌水洗涤菌苔，稀释一定浓度后涂布于含有卡那霉素(Km，30μg/ml)和利福平(Rif，50μg/ml)NYG平板上，30℃倒置培养48h，获得的单菌落为第一次重组菌株XccYH1。
实施例3
本实施例验证实施例2获得的第一次重组菌株XccYH1，是否敲除XC_0713基因，获得了突变株，具体操作步骤如下：
(1)将实施例2获得的第一次重组菌株XccYH1在无抗NYG液体培养基中30℃震荡培养过夜后，涂布于含有利福平(Rif，50μg/ml)和10％蔗糖的NYG平板，30℃培养48h后获得单菌落。
(2)将步骤(1)的单菌落对应接种到含有卡那霉素(Km，30μg/ml)、利福平(Rif，50μg/ml)NYG平板以及利福平(Rif，50μg/ml)NYG平板上(复制平板法)，筛选获得卡那霉素敏感菌落；
(3)设计XC_0713基因上游片段的PCR引物对P5-F和XC_0713基因下游片段的PCR引物对P6-F；利用PCR法对筛选卡那霉素敏感克隆。
上述实施例中，步骤(3)中PCR反应体系如表5所示，PCR扩增程序为：①95℃预变性10min；②95℃变性1min；③56℃退火30s；④72℃延伸2min；将PCR产物置于4℃条件下保存。
表5为实施例3中步骤(3)中的PCR反应体系
试剂 用量(μl)
卡那霉素敏感菌总DNA 1
正向引物 1
反向引物 1
dNTP 1
DMSO 2
50％甘油 2
10×DNA聚合酶缓冲液 2
DNA聚合酶Taq 1
双蒸水 9
总体系 20
实施3的验证结果表明：对筛选卡那霉素敏感克隆，多次尝试都无法获得扩增出约1.4kb的菌落，说明XC_0713是十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004生长的必需基因，无法直接获得基因敲除突变株。
实施例4
本实施例为大肠杆菌lplA替换后XC_0713基因敲除突变株的构建
由于大肠杆菌硫辛酸蛋白连接酶LplA(EcLplA)功能已有报道，可催化菌体利用外源添加的硫辛酸(Morris T W,Reed K E,Cronan J E,Jr.Lipoic acid metabolism inEscherichia coli:the lplA and lipB genes define redundant pathways forligation of lipoyl groups to apoprotein.J Bacteriol,1995,177(1):1-10.)。
大肠杆菌lplA替换后XC_0713基因敲除突变株的构建，包括如下步骤：
(1)将pSRK-EclplA质粒导入至实施例2得到的第一次重组菌株XccYH1中，用复制平板法筛选第二次重组菌：将pSRK-EclplA质粒导入到一次重组菌株XccYH1中，并在含有庆大霉素(Gm，10μg/ml)的NYG液体培养基中30℃震荡培养过夜后，涂布于含有庆大霉素(Gm，10μg/ml)、利福平(Rif，50μg/ml)和10％蔗糖的NYG平板，30℃培养48h后获得单菌落；然后将这些单菌落对应接种到含有庆大霉素(Gm，10μg/ml)、卡那霉素(Km，30μg/ml)、利福平(Rif，50μg/ml)NYG平板以及庆大霉素(Gm，10μg/ml)、利福平(Rif，50μg/ml)NYG平板上(复制平板法)，筛选获得卡那霉素敏感菌落，即为第二次重组菌。
(2)PCR法验证步骤(1)中得到的第二次重组菌(卡那霉素敏感菌落)，将扩增片段测序，确认需要敲除的基因XC_0713已被删除，成功删除基因XC_0713的第二次重组菌，即为对十字花科丧失致病力的基因工程重组菌：设计XC_0713基因上游片段的PCR引物对P5-F和XC_0713基因下游片段的PCR引物对P6-F，利用PCR法对筛选卡那霉素敏感克隆。
上述实施例中，步骤(2)中PCR反应体系如表6所示，PCR扩增程序为：①95℃预变性10min；②95℃变性1min；③56℃退火30s；④72℃延伸2min；将PCR产物置于4℃条件下保存。
表6为实施例4中步骤(2)中的PCR反应体系
试剂 用量(μl)
卡那霉素敏感菌总DNA 1
正向引物 1
反向引物 1
dNTP 1
DMSO 2
50％甘油 2
10×DNA聚合酶缓冲液 2
DNA聚合酶Taq 1
双蒸水 9
总体系 20
实施4的验证结果表明：获得扩增出约1.4kb的菌落，如图1所示，图1中的1表示阴性对照；图1中的2表示突变株XccYH2；图1中的M表示DNA marker DL2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp，100bp)。将扩增片段送生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司测序，证明XC_0713基因被删除，获得该基因敲除突变株XccYH2。
实施例5
本实施例为基因敲除突变株XccYH2的植物致病性分析
Xcc菌株的植物致病性分析参考文献进行(Dow J M,Crossman L,Findlay K,etal.Biofilm dispersal in Xanthomonas campestris is controlled by cell-cellsignaling and is required for full virulence to plants.Proc Natl Acad SciUSA,2003,100(19):10995-11000.)。利用剪叶法，分别将野生菌Xcc8004和突变株XccYH2接种到甘蓝叶片中，培养2周后，观察实验结果，如图2所示。
结果显示野生菌Xcc8004能显著引起叶片病斑，而突变株XccYH2侵染叶片没有明显病斑(如图2a所示)。统计叶片病斑长度，结果显示野生菌Xcc8004引起的病斑长度为6.9mm，而突变株XccYH2引起的病斑长度仅为0.3mm(图2b)，说明XC_0713敲除后突变株的致病力几乎丧失，该基因可作为黑腐病防控的靶点，用于新型抗菌药物开发。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东食品药品职业学院
<120> 一种硫辛酸合成相关基因及其应用
<130> 2019
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1014
<212> DNA
<213> 十字花科黑腐病菌（X. campestris pv. campestris）
<400> 1
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agcccgccgg acgtgttcaa ccacaacatt gaaaccgtgc cggacctgta cccgaacgtg 660
cgccccggtg ccgattacca gtggtcgctg acgctgctgc agcgcttcaa ggcgcagcac 720
ccgaccatcg ccacgaagtc cggcatcatg ctcggcctgg gcgaaacgat ggagcaggtg 780
caggtcaccc tgcgcgacct gcgtgcgcac gatgtggaca tgatcacgat cggccaatac 840
ctgcagccca cgccgcacca ccacccggtg atgcgctact ggacgccgga ggaatacaag 900
gcgctggagg agtacggcaa tgcgctgggc ttcagccacg tggcgtccgg cccgatggtg 960
cgttcctcgt accacgccga ccgccaggct gccggtgccg gcgtcgccgc ctga 1014
<210> 2
<211> 336
<212> PRT
<213> 十字花科黑腐病菌（X. campestris pv. campestris）
<400> 2
Met Thr Gln Pro Ile Ala Arg Ser Ile Pro Leu Gln Val Val Ser Gly
1               5                   10                  15
Asp Thr Ala Ala Pro Ala Ser Leu Gln Thr Gly Val Lys Gln Ile Gly
            20                  25                  30
Gly Asp Lys Ile Asn Arg Ser Pro Val Gln Phe Val Asp Ala Pro Val
        35                  40                  45
Leu Arg Lys Pro Ser Trp Ile Arg Val Arg Ile Pro Ser Gly Asn Ala
    50                  55                  60
Val Gln Asn Leu Lys Ala Lys Leu Arg Glu Asn Arg Leu Val Thr Val
65                  70                  75                  80
Cys Glu Glu Ala Ser Cys Pro Asn Ile His Glu Cys Phe Ser His Gly
                85                  90                  95
Thr Ala Thr Phe Met Ile Leu Gly Glu Val Cys Thr Arg Arg Cys Ser
            100                 105                 110
Phe Cys Asp Val Ala His Gly Arg Pro Lys Pro Pro Asp Ala Ser Glu
        115                 120                 125
Pro Ala Ser Leu Ala Thr Thr Val Ala Asp Met Gly Leu Lys Tyr Val
    130                 135                 140
Val Val Thr Ser Val Asp Arg Asp Asp Leu Arg Asp Gly Gly Ala Gln
145                 150                 155                 160
His Phe Val Asp Cys Ile Ser Ala Ile Arg Ala Ser Ala Pro Lys Thr
                165                 170                 175
Arg Ile Glu Ile Leu Thr Pro Asp Phe Arg Gly Lys Gly Arg Met Asp
            180                 185                 190
Arg Ala Leu Glu Ile Leu Ala Thr Ser Pro Pro Asp Val Phe Asn His
        195                 200                 205
Asn Ile Glu Thr Val Pro Asp Leu Tyr Pro Asn Val Arg Pro Gly Ala
    210                 215                 220
Asp Tyr Gln Trp Ser Leu Thr Leu Leu Gln Arg Phe Lys Ala Gln Pro
225                 230                 235                 240
Thr Ile Ala Thr Lys Ser Gly Ile Met Leu Gly Leu Gly Glu Thr Met
                245                 250                 255
Glu Gln Val Gln Val Thr Leu Arg Asp Leu Arg Ala His Asp Val Asp
            260                 265                 270
Met Ile Thr Ile Gly Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Pro His His His Pro
        275                 280                 285
Val Met Arg Tyr Trp Thr Pro Glu Glu Tyr Lys Ala Leu Glu Glu Tyr
    290                 295                 300
Gly Asn Ala Leu Gly Phe Ser His Val Ala Ser Gly Pro Met Val Arg
305                 310                 315                 320
Ser Ser Tyr His Ala Asp Arg Gln Ala Ala Gly Ala Gly Val Ala Ala
                325                 330                 335
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（X. campestris pv. campestris）
<400> 3
aattgaattc ggaagtgaag tggacgctgt 30
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（X. campestris pv. campestris）
<400> 4
acaccgatgc agttgggcga cggtacgggc gctca 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（X. campestris pv. campestris）
<400> 5
tgagcgcccg taccgtcgcc caactgcatc ggtgt 35
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（X. campestris pv. campestris）
<400> 6
aattaagctt agttgcttgt cgtcggct 28
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（X. campestris pv. campestris）
<400> 7
agttcgactc cgcgcatca 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（X. campestris pv. campestris）
<400> 8
gcagccagtc gttcatcacc 20

Claims (5)

1. 基因XC_0713在防治十字花科黑腐病中的应用，所述基因XC_0713作为防治十字花科黑腐病的靶点；所述基因XC_0713为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2. 基因XC_0713在构建对十字花科植物致病力降低的菌株中的应用，所述基因XC_0713为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3. 一种对十字花科植物致病力降低的基因工程重组菌，其特征在于，是将十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004基因组中的基因XC_0713敲除所得，所述基因XC_0713为如SEQID NO.1所示的核苷酸序列；
所述基因工程重组菌由包括如下步骤的方法构建得到：
（1）构建基因敲除重组质粒；
（2）将步骤（1）获得的重组质粒转化E .coli S17-1感受态细胞，获得转化子；
（3）采用接合转移方式将重组质粒导入至十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004中，通过卡那霉素和利福平抗性培养基筛选，获得第一次重组菌；
（4）将pSRK-EclplA质粒导入至步骤（3）得到的第一次重组菌中，用复制平板法筛选第二次重组菌；
（5）PCR法验证步骤（4）中得到的第二次重组菌，将扩增片段测序，确认需要敲除的基因XC_0713已被删除，成功删除基因XC_0713的第二次重组菌，即为对十字花科植物致病力降低的基因工程重组菌；
所述步骤（1）为：以十字花科黑腐病菌的野生菌株Xcc8004的基因组为模板，利用PCR法分别扩增XC_0713基因的上游片段和下游片段，其中，上游片段的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，下游片段的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；然后采用融合PCR法，以扩增后XC_0713基因的上、下游片段为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6为引物，继续扩增，获得扩增片段；再将所述扩增片段酶切后连入自杀质粒pK18mobsacB中，获得阻断质粒，即为重组质粒。
4.如权利要求3所述的对十字花科植物致病力降低的基因工程重组菌，其特征在于，步骤（4）中，所述复制平板法筛选第二次重组菌为：在含有庆大霉素的NYG液体培养基中震荡培养过夜后，涂布于含有庆大霉素、利福平和NYG平板，培养获得单菌落；然后将单菌落对应接种到含有庆大霉素、卡那霉素、利福平的NYG平板以及含庆大霉素和利福平的NYG平板上，筛选获得第二次重组菌。
5. 如权利要求3所述的对十字花科植物致病力降低的基因工程重组菌，其特征在于，步骤（5）中，PCR验证引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；验证PCR的程序包括如下：①95℃预变性10 min；②95℃变性1 min；③56℃退火30 s；④72℃延伸2 min。
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十字花科黑腐病菌中影响致病相关基因XC3814表达的基因鉴定;苏辉昭 等;《遗传》;20100115;第32卷(第1期);第81-86页 *
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