CN116590292A - 一种靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的crispr-cas9 RNP复合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的crispr‑cas9RNP复合物及应用，属于基因工程领域。本发明通过构建Cas9和sgRNA共表达质粒，经原核表达纯化出重组Cas9RNPs复合物，通过电穿孔法将重组Cas9RNPs复合物导入微口膜壳绦虫似囊尾蚴体内对DAZ基因进行编辑，结果显示，重组Cas9RNPs复合物具有体外编辑DAZ基因的活性，这对抑制微口膜壳绦虫生长发育奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的crispr-cas9 RNP复合物及应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御外源质粒和噬菌体入侵的获得性免疫系统，经改造后已成为一种新型的基因组编辑工具，因其具有操作简单、成本低、切割效率高等优点被广泛应用于多种动物、植物及微生物等的基因组编辑。应用CRISPR/Cas9系统，在进行基因编辑的基础上可分析和验证基因功能、研究遗传育种及筛选药物靶点和疫苗分子等，以达到减弱病原微生物致病性，增强动植物的抗病性，治疗遗传性疾病、病毒性感染以及肿瘤等的目的。
Shen等使用CRISPR/Cas9来破坏弓形虫I型RH虫体的尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)基因，UPRT的丢失导致对氟尿嘧啶脱氧核苷(FUDR)的耐药性，电穿孔48h后对I型RH虫株进行FUDR筛选和测序，结果表明成功产生了UPRT突变。You等报道了通过将CRISPR/Cas9与单链寡核苷酸(ssODNs)结合，电穿孔转染实验感染小鼠肝脏中提取的虫卵，成功地编辑了曼氏血吸虫的乙酰胆碱酯酶(AChE)基因。CRISPR介导的编辑，除了将Cas9和sgRNA质粒转染进入生物体内，使其内源性表达发生编辑作用外，还可通过在体外生成Cas9/sgRNARNP复合物来实现。Soares等将纯化的重组金黄色葡萄球菌Cas9蛋白(SaCas9)和体外转录sgRNAs在体外进行组装后，经电穿孔导入克氏锥虫的不同生命周期阶段内，对报告基因和内源性基因进行了高效的基因组编辑。Qiao等提出了一种通过共表达Cas9和靶向特异性sgRNA从大肠杆菌直接生产Cas9 RNPs的简化方法。微口膜壳绦虫也称短膜壳绦虫，该虫主要寄生于鼠类，亦可寄生于人体，引起微小膜壳绦虫病，因此抑制虫体生长发育是防治微小膜壳绦虫的关键，而目前鲜有利用CRISPR/Cas9破坏虫体生长发育的方法相关的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的crispr-cas9 RNP复合物及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该重组Cas9 RNPs复合物导入微口膜壳绦虫体内可以实现对DAZ基因的编辑。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1-2所示的任一条序列。
本发明还提供一种靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的crispr-cas9 RNP复合物，包括通过构建Cas9和sgRNA共表达质粒，经原核表达纯化以获取重组Cas9 RNPs复合物；其中，所述sgRNA是针对DAZ基因不同靶点设计，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。
优选的是，两条所述sgRNA分别与pold-Cas9-g2载体连接共表达Cas9和sgRNA，构建重组质粒。
优选的是，将所述重组质粒转化至TOP10感受态细胞进行原核表达。
本发明还提供一种构建靶向敲除DAZ基因的微口膜壳绦虫突变体的方法，将所述的crispr-cas9 RNP复合物导入微口膜壳绦虫对DAZ基因进行编辑，获得微口膜壳绦虫突变体。
本发明还提供所述的sgRNA、所述的crispr-cas9 RNP复合物在制备抑制微口膜壳绦虫生长发育的产品中的应用。
本发明还提供所述的sgRNA、所述的crispr-cas9 RNP复合物在构建微口膜壳绦虫突变体中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过构建Cas9和sgRNA共表达质粒，经原核表达纯化出重组Cas9 RNPs复合物，通过电穿孔法将重组Cas9 RNPs复合物导入微口膜壳绦虫似囊尾蚴体内对DAZ基因进行编辑，结果发现所得重组Cas9 RNPs复合物均具有识别并切割DAZ基因靶序列的活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DAZ基因序列(A)、sgRNA序列(B)与重组质粒(C)的示意图；
图2为重组Cas9 RNP-133155复合物和重组Cas9 RNP-283305复合物的诱导表达；M：蛋白分子质量标准；1：未诱导的pCold-Cas9-133155/TOP10；2：诱导后的pCold-Cas9-133155/TOP10；3：未诱导的pCold-Cas9-283305/TOP10；4：诱导后的pCold-Cas9-283305/TOP10；
图3为重组Cas9 RNP-133155复合物(A)和重组Cas9 RNP-283305复合物(B)的纯化与浓缩；A图中，M：蛋白分子质量标准；1：超声裂解后的上清；2：超声裂解后的沉淀；3：蛋白洗脱液；4：蛋白浓缩液；B图中，M：蛋白分子质量标准；1：超声裂解后的沉淀；2：超声裂解后的上清；3：蛋白洗脱液；4：蛋白浓缩液；
图4为重组Cas9 RNP-133155复合物(A)和重组Cas9 RNP-283305复合物(B)的体外切割活性检测结果；A图中，M：DNA分子质量标准；1～4：PCR扩增DAZ基因靶序列；5～6：重组Cas9 RNP-133155复合物+DAZ基因靶序列；7：DAZ基因靶序列(阴性对照)；B图中，M：DNA分子质量标准；1～2：重组Cas9 RNP-283305复合物+DAZ基因靶序列；3：DAZ基因靶序列(阴性对照)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、试验材料
pold-Cas9-g2载体由石河子大学皮文辉老师惠赠，pmaxGFP质粒由新疆农垦科学院提供；感染微口膜壳绦虫幼虫(似囊尾蚴)的面粉甲虫从英国自然历史博物馆达尔文中心Peter Olson博士的实验室引进，并在本实验室成功饲养；7～8周龄BALB/c小鼠，购自新疆医科大学实验中心。
2、试验方法
2.1sgRNA序列的设计与合成及重组质粒的构建
根据WormBase中微口膜壳绦虫DAZ基因序列(登录号为：HmN_000202400)，利用sgRNA在线设计软件http://crispr.dbcls.jp/设计2条针对DAZ基因不同靶点的sgRNA序列，sgRNA序列信息见表1，下划线部分为PAM区，将2条sgRNA序列分别与pCold-Cas9-g2载体相连，构建重组表达质粒pCold-Cas9-133155和pCold-Cas9-283305，并转化至TOP10感受态细胞，由上海生工生物工程有限公司完成。
表1sgRNA序列信息
2.2重组质粒的诱导表达
将构建成功的重组甘油菌pCold-Cas9-133155/TOP10和pCold-Cas9-283305/TOP10吹打混匀，用接种环蘸取少量菌液，采用平板划线法接种于含Amp抗性的NZY固体培养基，置于37℃恒温培养箱中倒置培养12h；次日挑取单菌落接种于含Amp抗性NZY液体培养基，以37℃180r/min振荡培养12h，保菌后，将剩余菌液接种于含Amp抗性NZY液体培养基，以37℃180r/min振荡培养至菌液OD600nm达到0.6～0.8时，将培养瓶置于冰上冰浴1h左右，取1mL未加IPTG菌液作为对照4℃保存备用，其余菌液中加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，16℃诱导培养20h后取1mL菌液4℃保存备用。
将上述收集的1mL未诱导菌液和1mL诱导后菌液以8000r/min离心3min，弃掉多余上清后重悬菌体沉淀，加入蛋白示踪上样缓冲液，吹打混匀后于100℃沸水煮10min，吸取20μL样品进行SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达。
2.3重组蛋白的纯化与浓缩
2.3.1菌体裂解
根据2.2实验操作对重组菌pCold-Cas9-133155/TOP10和pCold-Cas9-283305/TOP10进行大量诱导表达，获得400mL的重组蛋白菌液，然后进行菌体裂解。可溶性蛋白的裂解、纯化与浓缩方法具体步骤如下：
(1)将400mL重组蛋白菌液以4℃8000r/min离心10min收菌至50mL离心管中，弃去上清液保留菌体沉淀，重复操作直至菌体沉淀全部收集完毕。
(2)将所有菌液沉淀合并为两管，每管加入20mL可溶性蛋白裂解液和1％的PMSF，放入4℃冰箱过夜裂解。
(3)次日将含裂解液菌体的离心管在液氮冷却5min，再置于42℃水浴锅中完全溶解，反复冻融5次。
(4)向含裂解液菌体的离心管中加入1％的PMSF，用超声破碎仪对菌体进行超声波冰浴裂解，直至菌体澄清；超声过程中探头不可触及离心管底部，超声裂解的条件是功率50W，超声裂解5s，间隙6s，90次/周期，超声裂解1.5h。
(5)将超声裂解后的菌体以4℃12000r/min离心30min，收集裂解后的上清和沉淀；将上清冰浴10min后进行纯化。
(6)将Ni琼脂糖凝胶填料混匀后加入亲和层析柱，室温静置10min，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出；向装填好的柱中加入5倍柱体积的ddH2O将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的可溶性蛋白A液平衡柱子，平衡结束后即可上样。
(7)将所得的蛋白溶液(5mL/柱)上柱，关Ni柱，冰浴10min后打开底部的出液口使液体自然流出。
(8)使用10倍柱体积的可溶性蛋白A液洗柱。
(9)使用5倍柱体积的可溶性蛋白B液洗脱蛋白，前6～8滴液体不要，收集剩余蛋白洗脱液，先放入4℃冰箱保存。
(10)重复上述步骤，直至所有蛋白溶液全部纯化完毕。
(11)纯化完成后，依次使用3倍柱体积的0.5M NaOH和5倍柱体积的ddH2O洗柱；最后加3倍柱体积20％乙醇封柱，置于4℃冰箱保存。
(12)将超滤管用0.1M的NaOH清洗，再用ddH2O进行二次清洗。
(13)向超滤管中添加适量蛋白洗脱液，以3000r/min离心3～5min，重复操作直至蛋白洗脱液全部浓缩完毕。
(14)在浓缩后的液体中加入储存液至原来的体积，以3000r/min离心3～5min，进行缓冲液交换及脱盐等，重复操作3次。
(15)回收浓缩后的蛋白，将蛋白以500μL的量分装至1.5mL无酶离心管中，-80℃保存，使用bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
(16)超滤管使用完成后，用0.1M的NaOH浸泡10min，再用ddH2O清洗3遍，然后用ddH2O浸泡室温保存。
2.3.2重组蛋白的纯化
使用His-Ni柱亲和层析法对冰浴后的蛋白进行纯化，具体步骤同上“可溶性蛋白的裂解、纯化与浓缩方法”的纯化过程。
2.3.3重组蛋白的超滤浓缩
使用超滤管对纯化后收集的蛋白洗脱液进行浓缩，具体步骤同上“可溶性蛋白的裂解、纯化与浓缩方法”的浓缩步骤；回收浓缩后的蛋白，分装保存后使用bradford蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)测定蛋白浓度，具体步骤参见bradford蛋白定量试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书。
2.4重组蛋白的体外切割活性检测
2.4.1DNA的提取
根据微量样品基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)公司)说明书中的方法提取似囊尾蚴的DNA，具体步骤参见微量样品基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)公司)说明书。
2.4.2引物的设计与合成
根据WormBase中微口膜壳绦虫DAZ基因序列(登录号为：HmN_000202400)，利用引物设计软件Premier Premier 5.0设计DAZ基因靶序列的特异性引物，引物序列信息见表2，引物交由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
表2引物序列信息
2.4.3DAZ基因靶序列的扩增与纯化
以2.4.1所得似囊尾蚴DNA为模板，使用2.4.2设计的引物DAZ-F2和DAZ-R2经PCR扩增DAZ基因靶序列，反应体系见表3，将各反应成分混匀后，反应程序见表4。4℃条件下保存样品，使用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit(美国OMEGA公司)对PCR产物直接进行回收纯化，具体步骤参见E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit PCR产物直接回收试剂盒(美国OMEGA公司)说明书。
表3PCR反应体系
表4PCR反应程序
2.4.4重组蛋白对DAZ基因靶序列的切割
将重组Cas9 RNP-133155复合物和Cas9 RNP-283305复合物分别与纯化的DAZ基因靶序列共孵育，反应体系：10×NEB buffer 3.1 1μL，Cas9 RNP 400ng，纯化的DAZ基因靶序列400ng，若未满10μL则补ddH2O至10μL；反应条件：37℃50min，85℃10min；经2％凝胶电泳检测重组Cas9 RNP-133155复合物和Cas9 RNP-283305复合物的体外切割活性。
2.5重组蛋白的导入与鉴定
2.5.1重组蛋白的导入
解剖感染微口膜壳绦虫幼虫(似囊尾蚴)的面粉甲虫，获取成熟的似囊尾蚴，每管约150个似囊尾蚴，用含1％双抗的PBS缓冲液清洗2～3次后，室温保存备用。
将收集的似囊尾蚴用Opti-MEM培养基(美国GIBCO公司)清洗3次，并将重组蛋白、pmaxGFP质粒及似囊尾蚴混匀后加入电转杯中，通过电穿孔法将重组Cas9 RNP复合物和pmaxGFP质粒导入似囊尾蚴体内，试验分为Cas9 RNP-133155、Cas9 RNP-283305试验组和空白对照组。电穿孔参数为：方波、125V、20ms、4mm电击杯，脉冲1次；体系为：重组Cas9 RNP复合物20μL，pmaxGFP质粒1μL，每150μLOpti-MEM培养基中含150个似囊尾蚴。电穿孔后将似囊尾蚴置于细胞培养皿中，加入1mL含有10％胎牛血清、1％双抗的RPMI 1640培养基，置于37℃恒温培养箱中培养48h后，使用激光共聚焦显微镜观察重组Cas9 RNP复合物和pmaxGFP质粒的导入情况。
2.5.2鉴定
收集2.5.1中的各组似囊尾蚴，用PBS清洗3次，使用微量样品基因组DNA提取试提取各组似囊尾蚴的DNA，使用2.4.2设计的引物DAZ-F2和DAZ-R2经PCR扩增DAZ基因靶序列，并用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit对PCR产物直接进行回收纯化，具体步骤参见E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit PCR产物直接回收试剂盒(美国OMEGA公司)说明书。使用T7E1酶突变检测试剂盒(美国IDT公司埃德特(上海)生物科技有限公司)对纯化的DAZ基因靶序列进行鉴定，具体使用方法见表5，停止反应后经2％凝胶电泳检测DAZ基因是否发生突变。
表5T7E1酶突变检测程序
3结果与分析
3.1sgRNA序列的设计与合成及重组质粒的构建，具体示意图详见图1。
3.2重组蛋白的诱导表达
将构建成功的重组甘油菌pCold-Cas9-133155/TOP10和pCold-Cas9-283305/TOP10，经IPTG诱导表达后分别取未诱导菌液和诱导后菌液进行SDS-PAGE检测，结果显示在约158KDa处出现目的条带(图2)，与预期原核表达重组蛋白分子质量大小一致。
3.3重组蛋白的纯化与浓缩
将pCold-Cas9-133155/TOP10、pCold-Cas9-283305/TOP10菌体沉淀进行超声波冰浴裂解后，分别收集裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果显示重组Cas9 RNP复合物主要以可溶性形式表达；经His-Ni柱亲和层析法纯化和超滤浓缩后进行SDS-PAGE检测，结果显示获得了大小为158KDa的重组Cas9 RNP复合物(图3)，其浓度分别为2.9mg/mL和2.6mg/mL，表明纯化出浓度较高的重组Cas9 RNP复合物。
3.4重组蛋白的体外切割活性检测
以似囊尾蚴DNA为模板，经PCR扩增得到543bp的DAZ基因靶序列(图4中A)，与预期结果相符；将重组Cas9 RNP-133155复合物和重组Cas9 RNP-283305复合物分别与纯化的DAZ基因靶序列共孵育，2％凝胶电泳检测结果显示，Cas9 RNP-133155可以识别并切割DAZ基因靶序列，产生424bp和119bp的目的片段(图4中A)；Cas9 RNP-283305可以识别并切割DAZ基因靶序列，产生274bp和269bp的目的片段(图4中B)；表明重组Cas9RNP-133155复合物和重组Cas9 RNP-283305复合物均具有体外切割活性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1-2所示的任一条序列。
2.一种靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的crispr-cas9 RNP复合物，其特征在于，包括通过构建Cas9和sgRNA共表达质粒，经原核表达纯化以获取重组Cas9 RNPs复合物；其中，所述sgRNA是针对DAZ基因不同靶点设计，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示。
3.根据权利要求2所述的靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的crispr-cas9 RNP复合物，其特征在于，两条所述sgRNA分别与pold-Cas9-g2载体连接共表达Cas9和sgRNA，构建重组质粒。
4.根据权利要求3所述的靶向敲除微口膜壳绦虫DAZ基因的crispr-cas9 RNP复合物，其特征在于，将所述重组质粒转化至TOP10感受态细胞进行原核表达。
5.一种构建靶向敲除DAZ基因的微口膜壳绦虫突变体的方法，其特征在于，将如权利要求2-4任一项所述的crispr-cas9 RNP复合物导入微口膜壳绦虫对DAZ基因进行编辑，获得微口膜壳绦虫突变体。
6.根据权利要求1所述的sgRNA、权利要求2-4所述的crispr-cas9 RNP复合物在制备抑制微口膜壳绦虫生长发育的产品中的应用。
7.根据权利要求1所述的sgRNA、权利要求2-4所述的crispr-cas9 RNP复合物在构建微口膜壳绦虫突变体中的应用。
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2023
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20230815 |