CN112410352B

CN112410352B - 一种4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL及其应用

Info

Publication number: CN112410352B
Application number: CN202011243346.6A
Authority: CN
Inventors: 夏鹏国; 胡婉莹; 许玲; 郑宇婕; 李倩倩; 梁宗锁
Original assignee: HANGZHOU SANYEQING AGRICULTURAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: HANGZHOU SANYEQING AGRICULTURAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2020-11-10
Filing date: 2020-11-10
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2040-11-10
Also published as: CN112410352A

Abstract

本发明公开了一种来源于三叶青的4‑香豆酸‑辅酶A连接酶基因Th4CL及其应用，该4‑香豆酸‑辅酶A连接酶基因Th4CL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以三叶青作为生物来源设计引物对其cDNA序列进行扩增，得到了4‑香豆酸‑辅酶A连接酶基因Th4CL，该基因作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。

Description

一种4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，主要涉及一种来源于三叶青的4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL及其应用。

背景技术

随着近几年国家对中医药的高度重视，政府的大力扶持，带动了中药产业的快速发展，扩大了三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的市场需求。对三叶青抗肿瘤作用研究的不断深入，导致近年来三叶青市场价格突飞猛进，其市场需求也越来越大。

近年来，药用植物次生代谢产物合成的基因调控已成为分子生物学十分活跃的前沿研究领域，代谢产物的量和组成主要取决于生物合成关键酶以及在细胞中的表达水平。而目前三叶青的研究主要集中在种植栽培、种苗培育、化学成分的提取分离和药理药效作用等方面，对其分子水平上的研究比较少。

白藜芦醇作为因“法国悖论”而闻名的红酒中的天然成分，大量科学研究证明其具有靶向多靶点、发挥多种有益健康和治疗疾病的作用，具有极大的研究价值。白藜芦醇在植物中主要通过苯丙烷代谢途径产生，该途径以苯丙氨酸为底物，苯丙氨酸被苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)催化生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)的作用下催化形成香豆酸，香豆酸又在4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)的作用下形成4-香豆酰辅酶A(4-coumarate-CoA ligase,4CA)，最后白藜芦醇合酶(resveratrol synthase, RS)催化1分子的4CA和3分子的丙二酰辅酶A(malonly-CoA，COA)合成白藜芦醇。

目前，三叶青的全基因组还未公布，有必要通过挖掘三叶青白藜芦醇生物合成的关键酶基因，试图揭示这些关键酶基因在其生物合成途径中的表达调控情况，并希冀以此为基础获得高产量白藜芦醇。

发明内容

本发明提供了一种来源于三叶青的4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL及其应用，该4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL来源于三叶青，作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种包含所述的4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL的重组表达载体。

作为优选，表达载体为pMD19-T载体。

本发明还提供了一种包含所述4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL的基因工程菌。

所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌DH5α。

本发明还提供了一种4-香豆酸-辅酶A连接酶，所述4-香豆酸-辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为优选，所述4-香豆酸-辅酶A连接酶由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的 4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL编码获得。

本发明提供了所述的基因工程菌在生产白藜芦醇中的应用。

本发明提供了所述的4-香豆酸-辅酶A连接酶在生产白藜芦醇中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以三叶青作为生物来源设计引物对其cDNA序列进行扩增，得到了4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL，该基因作为苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，可用于生产白藜芦醇。

附图说明

图1为三叶青4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL的PCR电泳图。

图2为4-香豆酸-辅酶A连接酶Th4CL的二级结构预测；

α-螺旋：最长的竖直线；延伸链：第二长竖直线；β-转角：第三长竖直线；无规则卷曲：最短竖直线。

图3为4-香豆酸-辅酶A连接酶Th4CL的三维结构预测。

图4为4-香豆酸-辅酶A连接酶Th4CL氨基酸序列的系统进化树分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1三叶青Th4CL基因cDNA全长序列的获得

取三叶青新鲜植株的叶片，用锡箔纸包好，并用液氮迅速冷冻，提取总RNA，并反转录成cDNA。总RNA的提取按照TIANGEN RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(DP441)说明书进行，经1.0％琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度检测仪检测其完整性及浓度。总RNA的反转录按照Takara PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。

根据已有的转录组数据与NCBI中同科属的4CL基因序列进行BLAST分析，选取相似度最高的序列为目的基因序列，以此序列的开放阅读框序列为模板设计了多对引物，其中两对扩增引物为(Th4CL-F1：5’-ATGATTTCCATTGAAACC-3’，Th4CL-R 1：5’-TTAATTTGTCCCTGGGATCTTC-3’；Th4CL-F2：5’-ATGATTTCCATTGAAACC C-3’，Th4CL-R2：5’-TTAATTTGTCCCTGGGATC-3’)。

以三叶青cDNA为模板，利用Premix Taq(Ex Taq Version 2.0plus dye)进行P CR扩增，PCR基因扩增的总反应体系为50μL：25μL Premix Taq、2.5μL Templa te cDNA、1μLForward primer、1μL Reverse primer和22μL RNase Free dH ₂ O。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，结果表明Th4CL-F1与Th4CL-R1为可用引物，其退火温度为51℃，结果如图1所示。

将扩增产物用Tiangen TIANgel Midi Purification Kit(DP190123)试剂盒进行切胶回收，随后将回收产物连接到pMD19-T载体上并16℃孵育过夜，其连接体系为：0. 5μLpMD19-T Vector、4.5μL回收产物和5.0μL SolutionⅠ。

取5μL连接产物加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30 min，42℃热激60s，迅速放入冰中冰浴2min，加入700μL LB培养基，于37℃摇床内200rpm震荡摇菌1h，在超净台中吸取200μL涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基板上，于37℃培养箱中培养12h，挑取单克隆于LB液体培养基 (含100mg/L氨苄青霉素)中，37℃震荡摇菌5h，进行菌液PCR验证，将验证正确的送去测序，进而得到三叶青Th4CL的基因序列。

用DNAStar和DNAMAN软件对三叶青白藜芦醇生物合成途径中4-香豆酸辅酶A 连接酶Th4CL的氨基酸序列进行分析。Th4CL基因的开放阅读框(ORF)序列有171 6bp，编码571个氨基酸，其中强碱性氨基酸(K,R)751个，强酸性氨基酸(D,E) 62个，疏水性氨基酸(Hydrophobic Amino Acids)(A,I,L,F,W,V)215个，极性氨基酸(Polar Amino Acids)(N,C,Q,S,T,Y)137个。使用ExPASy在线软件(h ttps://web.expasy.org/compute_pi/)预测其分子量为61493.73Daltons，等电点(pI)为 5.74，表明该蛋白为酸性蛋白。

此外，通过SMART在线软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测结果显示，该蛋白没有跨膜结构域(transmembrane domains)，但有一个低拷贝区域(lowcomplexity)，位于预测氨基酸序列的302～322aa，还含有Ad cyc g-alpha(Adenylatecycl ase G-alpha binding domain,腺苷酸环化酶G-α结合域)和TECPR(Beta propellerrepeats in Physarum polycephalum tectonins,Limulus lectin L-6and animalhypotheti cal proteins,β推进器在多头藻门结构蛋白、鲎凝集素L-6和动物假设蛋白中重复)结构域，分别位于预测氨基酸序列的3～45aa和236～270aa。

实施例2Th4CL的二级结构和三级结构预测以及进化树分析

利用在线软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage＝npsa _sopma.html)对白藜芦醇生物合成途径中Th4CL蛋白的二级结构进行预测，结果如图2所示，该蛋白由30.47％的α-螺旋(Alpha helix)，18.56％的延伸链(Extended strand)，7.88％的β-转角(Beta turn)和43.08％的无规则卷曲(Random coil)构成，说明无规则卷曲结构是蛋白Th4CL二级结构的骨架。

利用在线软件SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)对白藜芦醇生物合成途径中Th4CL蛋白的三维结构进行预测，使用方法为X-ray，分别率为结果如图3所示。使用的模板编号为5bsm.1.A，序列的一致性(Seq Identity)为66.60％，寡核苷酸的状态(Oligo-state)为Monomer(单体)，序列与模板序列的相似度(Seq similarity)为0.50，覆盖范围(Coverage)为0.94，对所预测序列的描述为4-香豆酸辅酶A连接酶2，这与所克隆的基因相吻合。

4-香豆酸辅酶A连接酶在许多物种中被克隆和分析。通过软件Clustal X和MEGA6.0对Th4CL的氨基酸序列和NCBI数据库中其他植物中该基因的氨基酸序列进行多序列比对并构建进化树，具体物种及蛋白序列号见表1。根据进化树结果表明 (图4)，三叶青单独归为一组，说明与三叶青同科同属的其他物种未有相关研究，急需进一步深入探究。

表1构建基因Th4CL进化树的核苷酸序列

实施例3 Th4CL基因的功能验证

对Th4CL基因的cDNA序列和质粒载体pCMBIA1301序列上酶切位点的分布情况进行分析，设计带有SmaⅠ、XbaⅠ酶切位点的PCR引物(上游引物：TCCCCCGGGATGATTTCCATTGAAACC；下游引物：GCTCTAGATTAATTTGTCCCTGGGATCTTC)，用于构建过表达载体。

以三叶青cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系同上，扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，用试剂盒对与目的基因一致的DNA片段进行纯化回收。将纯化回收产物与质粒pCMBIA1301在37℃下进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后再纯化回收。纯化回收后的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，16℃孵育过夜，其连接体系为：2μL质粒载体片段、6μL目的基因片段、1μL T4连接酶和1μL T4 ligase buffer。

将连接产物转化大肠杆菌DH5α，随后进行涂板和筛选。在含Kan的LB固体平板上挑取单菌落摇菌培养，菌液PCR进行酶切验证阳性克隆，验证成功后测序。然后将阳性重组质粒经LB(Kan抗性)液体培养基培养提取质粒，质粒提取按照质粒小提试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行。

用空载体与重组质粒分别转化发根农杆菌ATCC15834感受态细胞，菌液PCR鉴定及酶切鉴定筛选出阳性克隆。将筛选出的阳性克隆浸染三叶青幼苗，提取抗性植株的基因组DNA，基因组DNA的提取按照CTAB法进行。PCR鉴定过表达植株，PCR 反应体系同上所述，其PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，对克隆得到的条带纯化回收，测序验证。

取200μL阳性克隆的菌液于LB(Kan抗性)液体培养基中37℃振荡培养，当菌液达到对数增长期(OD₆₀₀＝0.5)时，加入IPTG对重组蛋白进行诱导表达，IPTG的浓度为0.4mmol/L，适宜的诱导时间为2h。利用高效液相色谱法测定继代培养2个月的基因转化和野生型三叶青幼苗中白藜芦醇的积累量，并通过Bradford法对4-香豆酸辅酶A连接酶进行体外酶活检测。

与野生型相比，过表达Th4CL的转基因幼苗中Th4CL的相对表达量升高了，白藜芦醇的含量也相对升高，这与预期的结果一致。

序列表

<110> 杭州三叶青农业科技有限公司

<120> 一种4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1716

<212> DNA

<213> 三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)

<400> 1

atgatttcca ttgaaaccca aaacccagat gtttccaacc ttgacagcaa tctatcaaat 60

atccccaaca tcaccaaaca acaaacagaa acagaagatc atattttcag atcaaaactc 120

cctgatattc ccatccccag tcacctccct ctccattcct actgcttcga aaacctctcc 180

caattctccg accggccatg cttgattgtt ggatccgcca acaaaaccta ctcattcgcc 240

gaaacccacc tcatttctcg gaaagtcggc gccggcttta cccacctcgg cctcaaacag 300

ggcgacgtcg tcatgatcct cctccaaaac tgcgccgaat tcgtcttctc cttcctcggc 360

gcttccatga tcggcgccgt caccaccacc gccaatccct tctacacttc tgccgaaatt 420

tacaaacagt taaaatcttc caaggcgaag atcgtagtca cgcaggcgct gtacgtcgac 480

aagctgcgag actttccggc ggcgaagatc ggggaagatt tcaccgtcgt caccgtcgac 540

gacccaccgg agaactgcat tcatttctct gcggtgtcgg agggggacga gggcggaatt 600

cccgaagttt cgatcgattc cggcgatgcg ttggctctgc cgttctcctc cggcacaacc 660

ggactcccga agggggtggt tctgacgcac aagagcttga tcacgagcgt cgctcagcag 720

gtcgacggga aaaaccccaa cctccatctg acgccggatg acgtcgtttt atgcgtgctg 780

ccacttttcc atatatattc cctcaacagc gttcttccct gttccctgag ggcgggtgcg 840

gcggtgctgc tgatgcagaa gttcgagatt ggagctctgt tggagctgat ccagcgtcac 900

cgcgtgtcgg tggctgccgt ggtgccgccg ctggttttag cgctggcgaa aaacccggcg 960

gtggcgagct tcgacctgag ctcaatccgg gtggttctgt ccggggcggc gccgctcggg 1020

aaggagatgg aagccgctct ccgaagccga gtgcctcagg cggtgctagg ccaggggtat 1080

ggaatgaccg aggcaggacc ggtactatcg atgtgcctag gcttcgccaa gcagccattt 1140

gcgaccaaat cgggctcgtg tggcaccgtt gtccgcaatg ctgagctcaa agtcactgac 1200

cctgagaccg gttgctccct tggctacaac caaccgggcg agatatgcat tagaggacaa 1260

caaattatga aaggatactt gaacgatccc gaggccacag cctctaccat cgacgttgac 1320

ggttggctgc acaccggtga catcggctat gttaatgatg atgaagaggt gtttatcgtg 1380

gatagagtga aagaactcat caaattcaaa ggcttccagg taccgcctgc tgagcttgaa 1440

gcccttctac tgagccaccc atcgattgct gatgcagccg ttgtcccgca aaaagacgat 1500

gctgcggggg aagttcccgt cgcgttcgtg gttcgatcga acgggttcga actcactgaa 1560

gatgcagtga aagagttcat atcgacaaag gttgtgttct acaaaagact gcacaaggtg 1620

tactttgttc atgctattcc aaaatcaccc tccggaaaaa tattaagaaa agacctcaga 1680

gctaagctag cagagaagat cccagggaca aattaa 1716

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> 三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)

<400> 2

Met Ile Ser Ile Glu Thr Gln Asn Pro Asp Val Ser Asn Leu Asp Ser

1 5 10 15

Asn Leu Ser Asn Ile Pro Asn Ile Thr Lys Gln Gln Thr Glu Thr Glu

20 25 30

Asp His Ile Phe Arg Ser Lys Leu Pro Asp Ile Pro Ile Pro Ser His

35 40 45

Leu Pro Leu His Ser Tyr Cys Phe Glu Asn Leu Ser Gln Phe Ser Asp

50 55 60

Arg Pro Cys Leu Ile Val Gly Ser Ala Asn Lys Thr Tyr Ser Phe Ala

65 70 75 80

Glu Thr His Leu Ile Ser Arg Lys Val Gly Ala Gly Phe Thr His Leu

85 90 95

Gly Leu Lys Gln Gly Asp Val Val Met Ile Leu Leu Gln Asn Cys Ala

100 105 110

Glu Phe Val Phe Ser Phe Leu Gly Ala Ser Met Ile Gly Ala Val Thr

115 120 125

Thr Thr Ala Asn Pro Phe Tyr Thr Ser Ala Glu Ile Tyr Lys Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Ser Lys Ala Lys Ile Val Val Thr Gln Ala Leu Tyr Val Asp

145 150 155 160

Lys Leu Arg Asp Phe Pro Ala Ala Lys Ile Gly Glu Asp Phe Thr Val

165 170 175

Val Thr Val Asp Asp Pro Pro Glu Asn Cys Ile His Phe Ser Ala Val

180 185 190

Ser Glu Gly Asp Glu Gly Gly Ile Pro Glu Val Ser Ile Asp Ser Gly

195 200 205

Asp Ala Leu Ala Leu Pro Phe Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys

210 215 220

Gly Val Val Leu Thr His Lys Ser Leu Ile Thr Ser Val Ala Gln Gln

225 230 235 240

Val Asp Gly Lys Asn Pro Asn Leu His Leu Thr Pro Asp Asp Val Val

245 250 255

Leu Cys Val Leu Pro Leu Phe His Ile Tyr Ser Leu Asn Ser Val Leu

260 265 270

Pro Cys Ser Leu Arg Ala Gly Ala Ala Val Leu Leu Met Gln Lys Phe

275 280 285

Glu Ile Gly Ala Leu Leu Glu Leu Ile Gln Arg His Arg Val Ser Val

290 295 300

Ala Ala Val Val Pro Pro Leu Val Leu Ala Leu Ala Lys Asn Pro Ala

305 310 315 320

Val Ala Ser Phe Asp Leu Ser Ser Ile Arg Val Val Leu Ser Gly Ala

325 330 335

Ala Pro Leu Gly Lys Glu Met Glu Ala Ala Leu Arg Ser Arg Val Pro

340 345 350

Gln Ala Val Leu Gly Gln Gly Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Pro Val

355 360 365

Leu Ser Met Cys Leu Gly Phe Ala Lys Gln Pro Phe Ala Thr Lys Ser

370 375 380

Gly Ser Cys Gly Thr Val Val Arg Asn Ala Glu Leu Lys Val Thr Asp

385 390 395 400

Pro Glu Thr Gly Cys Ser Leu Gly Tyr Asn Gln Pro Gly Glu Ile Cys

405 410 415

Ile Arg Gly Gln Gln Ile Met Lys Gly Tyr Leu Asn Asp Pro Glu Ala

420 425 430

Thr Ala Ser Thr Ile Asp Val Asp Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile

435 440 445

Gly Tyr Val Asn Asp Asp Glu Glu Val Phe Ile Val Asp Arg Val Lys

450 455 460

Glu Leu Ile Lys Phe Lys Gly Phe Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu

465 470 475 480

Ala Leu Leu Leu Ser His Pro Ser Ile Ala Asp Ala Ala Val Val Pro

485 490 495

Gln Lys Asp Asp Ala Ala Gly Glu Val Pro Val Ala Phe Val Val Arg

500 505 510

Ser Asn Gly Phe Glu Leu Thr Glu Asp Ala Val Lys Glu Phe Ile Ser

515 520 525

Thr Lys Val Val Phe Tyr Lys Arg Leu His Lys Val Tyr Phe Val His

530 535 540

Ala Ile Pro Lys Ser Pro Ser Gly Lys Ile Leu Arg Lys Asp Leu Arg

545 550 555 560

Ala Lys Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gly Thr Asn

565 570

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatttcca ttgaaacc 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaatttgtc cctgggatct tc 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatttcca ttgaaaccc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttaatttgtc cctgggatc 19

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcccccggga tgatttccat tgaaacc 27

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctctagatt aatttgtccc tgggatcttc 30

Claims

1.一种4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种包含权利要求1所述的4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL的重组表达载体。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，表达载体为pMD19-T载体。

4.一种包含权利要求1所述的4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL的基因工程菌。

5.一种4-香豆酸-辅酶A连接酶，其特征在于，所述4-香豆酸-辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求5所述的4-香豆酸-辅酶A连接酶，其特征在于，由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的4-香豆酸-辅酶A连接酶基因Th4CL编码获得。

7.如权利要求4所述的基因工程菌在生产白藜芦醇中的应用。

8.如权利要求5或6任一项所述的4-香豆酸-辅酶A连接酶在生产白藜芦醇中的应用。