BR122021012602B1

BR122021012602B1 - Variante de proteína que exporta monofosfato de 5-inosina, polinucleotídeo, vetor, microrganismo do gênero corynebacterium que produz monofosfato de 5-inosina e método para preparar monofosfato de 5-inosina

Info

Publication number: BR122021012602B1
Application number: BR122021012602-0A
Authority: BR
Inventors: Jung Gun Kwon; Min Ji Baek; Ji Hye Lee; Nara KWON; Ju Jeong Kim; Jin Ah Rho; Jin Man Cho
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2022-04-19
Also published as: KR101916611B1; CA3071038C; MY191029A; WO2019117673A2; US20200377557A1; SG10201913726PA; EP3674312A4; MX2020001903A; CA3048392C; BR112019011994A2; CN110248955A; BR112019011994B1; ZA201903356B; MX2019006804A; WO2019117673A3; CN109929016A; US11299521B2; RU2725193C1; CN110343150A; CA3071038A1

Abstract

A presente revelação refere-se a um polipeptídeo inovador que tem uma atividade de exportação de inosina-5- monofosfato, a um micro-organismo que compreende o mesmo, um método para preparar inosina-5-monofosfato com o uso do mesmo e a um método para aumentar a exportação de inosina-5-monofosfato.

Description

[CAMPO DA TÉCNICA]

[001] A presente revelação refere-se a uma variante de proteína inovadora que tem uma atividade de exportação de inosina-5-monofosfato (IMP), a um microorganismo que compreende a mesma e a um método para preparar IMP e um método para aumentar a exportação de IMP com o uso da mesma.

[ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[002] Inosina-5'-monofosfato (doravante, IMP), um material de ácido nucleico, é um intermediário da trajetória metabólica do ácido nucleico e é usado em muitos campos, tais como alimentos, medicamentos, várias aplicações médicas, etc. Em particular, IMP é amplamente usado como um aditivo para condimentos alimentares ou alimentos, juntamente com guanina-5'-monofosfato (doravante, GMP). Embora o próprio IMP seja conhecido por fornecer um sabor de carne, o mesmo é conhecido por intensificar o aroma de ácido glutâmico monossódico (MSG) e, assim, atrai a atenção como um condimento à base de ácido nucleico intensificador de sabor.

[003] Exemplos de métodos para produzir IMP incluem um método para degradar enzimaticamente ácido ribonucleico extraído de células de levedura (publicação de patente no JP 1614/1957), um método para fosforilar quimicamente inosina produzida por fermentação (Agri. Biol. Chem., 36, 1.511, etc.), um método para cultivar micro-organismos que podem produzir diretamente IMP e recuperar IMP no caldo de cultura, etc. Entre esses, o método mais frequentemente usado atualmente é um método que usa micro-organismos com capacidade para produzir diretamente IMP.

[004] Entretanto, visto que enzimas nem sempre exibem propriedades ideais na natureza em relação à atividade, estabilidade, especificidade de substrato para isômeros ópticos, etc. necessárias em aplicações industriais, várias tentativas foram feitas para aprimorar enzimas de modo a se adequarem ao uso pretendido por modificação de suas sequências de aminoácidos, etc. Entre essas, embora o projeto racional e a mutagênese sítio-dirigida de enzimas tenham sido aplicados para aprimorar a função enzimática, em muitos casos, essas tentativas mostraram-se desvantajosas pelo fato de que as informações sobre a estrutura de enzimas-alvo não são suficientes ou a correlação entre estrutura e função não está clara, impedindo, assim, sua aplicação eficaz. Adicionalmente, um método para aprimorar a atividade enzimática com a intenção de intensificar as enzimas através de evolução dirigida, que se trata de triar enzimas de traços desejados a partir de uma biblioteca de enzimas modificadas construídas através de mutagênese aleatória de genes enzimáticos, foi anteriormente relatado.

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA DA TÉCNICA]

[005] A fim de produzir IMP em alto rendimento com o uso do método para produzir diretamente IMP através de fermentação microbiana, o IMP deve ser suavemente exportado. Para alcançar esse objetivo, os inventores da presente revelação constataram a proteína envolvida na atividade de exportação de IMP também realizaram muitos esforços para aumentar a produção de IMP. Como resultado, constataram variantes de proteína que têm a atividade de exportação de IMP, concluindo, assim, a presente revelação.

[SOLUÇÃO DA TÉCNICA]

[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer uma variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP.

[007] Um outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína da presente revelação.

[008] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um vetor que inclui o polinucleotídeo da presente revelação.

[009] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um microorganismo que produz IMP, incluindo a variante de proteína e o vetor da presente revelação.

[010] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para preparar IMP que inclui cultivar o micro-organismo da presente revelação em um meio.

[011] Ainda um outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para aumentar a exportação de IMP que inclui intensificar a atividade da variante de proteína da presente revelação, que tem a atividade de exportação de IMP.

[EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO]

[012] O IMP pode ser produzido em alto rendimento cultivando-se um microorganismo do gênero Corynebacterium que produz IMP com o uso da variante de proteína da presente revelação, que tem capacidade para exportar IMP.

[MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO]

[013] A presente revelação será descrita em detalhes a seguir. Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a outras respectivas explicações e modalidades exemplificativas. Ou seja, todas as combinações de vários fatores revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Adicionalmente, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante.

[014] Para alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de IMP.

[015] Conforme usado no presente documento, o termo “uma proteína que exporta inosina-5'-monofosfato (IMP)” se refere a uma proteína envolvida na exportação extracelular de IMP. Para o propósito da presente revelação, o termo pode ser usado intercambiavelmente com uma proteína que tem uma atividade de exportação de IMP, uma proteína de exportação de IMP, uma proteína que tem uma atividade de exportação de inosina-5-monofosfato, uma proteína exportadora de inosina-5-monofosfato, etc.; especificamente, a proteína pode ser expressa como ImpE e, mais especificamente, pode ser expressa como ImpE1 ou ImpE2, mas não se limita a esses. Adicionalmente, a proteína pode ser derivada de um microorganismo do gênero Corynebacterium e, especificamente, de Corynebacterium stationis, mas o micro-organismo não se limita a esses.

[016] A proteína, por exemplo, pode consistir na sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, mas qualquer sequência que tenha a mesma atividade que a proteína pode ser incluída sem limitação, e uma pessoa versada na técnica pode obter informações de sequência a partir do GenBank do NCBI, um banco de dados bem conhecido. Adicionalmente, a proteína pode incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia ou identidade com a sequência de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Adicionalmente, é óbvio que qualquer proteína que tenha uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição em parte da sequência também pode ser incluída no escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha uma homologia ou identidade descrita acima e tenha um efeito correspondente àquele da proteína.

[017] Ou seja, embora descrita como “uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO específica” ou “uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO específica” na presente revelação, a proteína pode ter uma atividade que é idêntica ou correspondente àquela de uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Em tal caso, é óbvio que quaisquer proteínas que tenham uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição, substituição conservadora ou adição em parte da sequência também podem ser usadas na presente revelação. Por exemplo, no caso de ter a atividade igual ou correspondente àquela da proteína modificada, isso não exclui uma adição de uma sequência a montante da sequência de aminoácidos que não altere a função da proteína, uma mutação que pode ocorrer naturalmente, uma mutação silenciosa da mesma ou uma constituição conservadora, e mesmo quando a adição ou mutação de sequência está presente, a mesma obviamente pertence ao escopo da presente revelação.

[018] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” se refere a um grau de compatibilidade com duas determinadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos e pode ser expresso como uma porcentagem.

[019] Os termos “homologia” e “identidade” podem frequentemente ser usados intercambiavelmente entre si.

[020] A homologia ou identidade de sequência de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos conservadas pode ser determinada por algoritmos-padrão de alinhamento e pode ser usada com uma penalidade por lacuna padrão estabelecida pelo programa a ser usado. Espera-se que sequências substancialmente homólogas ou idênticas hibridizem sob estringência moderada ou alta ao longo de todo o comprimento ou pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% de todo o comprimento das sequências. Polinucleotídeos que contêm códons degenerados na hibridização de polipeptídeos também são considerados.

[021] A possibilidade de quaisquer duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos terem uma homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada com o uso de um algoritmo de computador conhecido, tal como o programa “FASTA” (Pearson et al., (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2.444: com o uso dos parâmetros padrão em 2.444). Alternativamente, a mesma pode ser determinada com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453), que é executado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou versões posteriores) (pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994 e [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1.073). Por exemplo, a homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW do Centro Nacional para Informações Biotecnológicas (NCBI).

[022] A homologia, similaridade ou identidade de sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência com o uso, por exemplo, do programa de computador GAP (por exemplo, Needleman et al., (1970), J Mol Biol. 48: 443) conforme publicado (por exemplo, Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482). Em resumo, o programa GAP define a homologia, similaridade ou identidade como o valor obtido dividindo-se o número de símbolos alinhados de modo similar (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número total dos símbolos na menor das duas sequências. Parâmetros-padrão para o programa GAP podem incluir (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6.745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, edições, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353 a 358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade por abertura de lacuna de 10 e uma penalidade por extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para lacunas finais. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” se refere à relevância entre sequências. Especificamente, a variante de proteína da presente revelação que tem a atividade de exportação de IMP pode ser aquela na qual pelo menos um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste no 164° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, no 222° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, no 2° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e no 64° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é substituído por um outro aminoácido, mas não se limita a isso.

[023] Por exemplo, na variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP, o 164° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é substituído por lisina, arginina, asparagina, glicina, treonina ou prolina; o 2° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é substituído por isoleucina, fenilalanina, metionina, ácido glutâmico, histidina ou asparagina; ou o 64° aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 é substituído por ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, cisteína, isoleucina ou fenilalanina, mas não se limita a esses.

[024] Como um exemplo específico, a variante de proteína que tem a atividade de exportação de IMP pode ser uma proteína que tem a sequência de aminoácidos que consiste na SEQ ID NO: 141, 142, 145, 147, 149 ou 151, uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos codificada pelo polinucleotídeo de SEQ ID NO: 153 ou 154 ou uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia com a mesma de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Além disso, é evidente que uma proteína que tem uma deleção, modificação, substituição ou adição de alguma sequência pode ser usada como a proteína da presente revelação, desde que seja uma proteína que tem a sequência de aminoácidos com a homologia acima e exiba um efeito correspondente ao da proteína.

[025] Um outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína ou um vetor que inclui o polinucleotídeo.

[026] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo” se refere a um polímero de nucleotídeos que é estendido em uma cadeia longa por ligações covalentes e tem uma fita de DNA ou uma fita de RNA mais longa que um determinado comprimento e, mais especificamente, se refere a um fragmento de polinucleotídeo que codifica a variante de proteína.

[027] É evidente que um polinucleotídeo que pode ser traduzido por degenerescência de códon em uma proteína que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, 142, 145, 147, 149 ou 151, uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos codificada pelo polinucleotídeo de SEQ ID NO: 153 ou 154 ou em uma proteína que tem uma homologia com o mesmo também pode ser incluído como o polinucleotídeo da presente revelação. Por exemplo, o polinucleotídeo da presente revelação pode ser um polinucleotídeo que tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 143, 144, 146, 148, 150, 152, 153 ou 154 e, mais especificamente, pode ser um polinucleotídeo composto por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 143, 144, 146, 148, 150, 152, 153 ou 154. Além disso, uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína que tem a atividade da proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141, 142, 145, 147, 149 ou 151 ou uma sequência de aminoácidos codificada por um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 153 ou 154 por hibridização sob condições estringentes com uma sonda que pode ser preparada a partir de sequências de genes conhecidas, por exemplo, uma sequência complementar à totalidade ou parte da sequência de nucleotídeos, pode ser incluída sem limitação.

[028] O termo “condições estringentes” se refere a condições sob as quais a hibridização específica entre polinucleotídeos é possível. Tais condições são especificamente descritas em referências (por exemplo, J. Sambrook et al., supra). Por exemplo, as condições podem incluir a realização de hibridização entre genes que têm uma alta homologia, uma homologia de 40% ou superior, especificamente, 90% ou superior, mais especificamente, 95% ou superior, ainda mais especificamente, 97% ou superior e, com a máxima especificidade, 99% ou superior, enquanto não realiza a hibridização entre genes que têm uma homologia inferior às homologias acima; ou a realização de hibridização uma vez, especificamente, duas ou três vezes, sob condições de lavagem convencionais para hibridização de southern de 60 °C, 1 x SSC e SDS a 0,1%, especificamente, a uma concentração de sal e temperatura correspondentes a 60 °C, 0,1x SSC e SDS a 0,1% e, mais especificamente, 68 °C, 0,1x SSC e SDS a 0,1%.

[029] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos tenham uma sequência complementar, embora disparidades entre bases possam ser possíveis, dependendo da estringência da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas mutuamente hibridizáveis. Por exemplo, em relação ao DNA, adenosina é complementar à timina, e citosina é complementar à guanina. Consequentemente, a presente revelação também pode incluir fragmentos de ácido nucleico isolados complementares a toda a sequência, bem como sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares.

[030] Especificamente, polinucleotídeos que têm uma homologia podem ser detectados em um valor de Tm de 55 °C com o uso de condições de hibridização que incluem uma etapa de hibridização e com o uso das condições descritas acima. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não é limitado a esses, e pode ser apropriadamente ajustado por um indivíduo de habilidade comum na técnica de acordo com o propósito pretendido.

[031] A estringência adequada para a hibridização de polinucleotídeos depende do comprimento e da complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis relacionadas são bem conhecidos na técnica (consultar Sambrook et al., supra, 9.50 a 9.51 e 11.7 a 11.8).

[032] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” se refere a um construto de DNA que inclui a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo, em que a proteína-alvo é ligada operacionalmente a uma sequência de controle adequada, de modo que a proteína-alvo possa ser expressa em um hospedeiro apropriado. A sequência de controle pode incluir um promotor com capacidade para iniciar a transcrição, qualquer sequência operadora para controlar a transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação a ribossoma mRNA apropriado e uma sequência que controla a terminação de transcrição e tradução. O vetor, após ser transformado em uma célula hospedeira adequada, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode ser integrado ao próprio genoma hospedeiro.

[033] O vetor usado na presente revelação pode não ser particularmente limitado desde que o vetor seja replicável na célula hospedeira, e o mesmo pode ser construído com o uso de qualquer vetor conhecido na técnica. Os exemplos do vetor podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados; e como um vetor de plasmídeo, aqueles com base em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. podem ser usados. Especificamente, vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etc. podem ser usados.

[034] Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo pode ser substituído por um polinucleotídeo modificado dentro do cromossomo com o uso de um vetor para a inserção no cromossomo em uma célula. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada com o uso de um método conhecido na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga, mas não se limita ao mesmo. Em particular, um marcador de seleção para confirmar a inserção no cromossomo pode ser adicionalmente incluído. O marcador de seleção é usado para seleção de uma célula transformada, isto é, para confirmar se o ácido nucleico-alvo foi inserido, e marcadores com capacidade para fornecer fenótipos selecionáveis, tais como resistência ao fármaco, requisito de nutrientes, resistência a agentes citotóxicos e expressão de proteínas de superfície, podem ser usados. Sob as circunstâncias em que agentes seletivos são tratados, apenas as células com capacidade para expressar os marcadores de seleção podem sobreviver ou expressar outros traços fenotípicos e, assim, as células transformadas podem ser facilmente selecionadas.

[035] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornecer um microorganismo que produz IMP que inclui a variante de proteína da presente revelação, o polinucleotídeo da presente revelação que codifica a variante de proteína ou o vetor da presente revelação. Especificamente, o micro-organismo que inclui a variante de proteína e/ou um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína pode ser um micro-organismo preparado por transformação com o uso de um vetor que contém o polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, mas o micro-organismo não se limita a isso.

[036] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” se refere a um processo para introduzir um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira, possibilitando, assim, a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. Para o polinucleotídeo transformado, não importa se o mesmo é inserido no cromossomo da célula hospedeira e localizado no mesmo ou localizado fora do cromossomo, desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser inserido em qualquer forma desde que possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é um construto genético que inclui todos os elementos essenciais necessários para autoexpressão. O cassete de expressão pode incluir convencionalmente um promotor ligado operacionalmente ao polinucleotídeo, a um sinal de terminação de transcrição, a um domínio de ligação ao ribossoma e a um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira como tal e é ligado operacionalmente a uma sequência essencial para sua expressão na célula hospedeira, porém não se limita a isso.

[037] Adicionalmente, conforme usado no presente documento, o termo “ligado operacionalmente” se refere a uma ligação funcional entre uma sequência promotora, que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo, isto é, um conjugado da presente revelação, e a sequência de genes acima.

[038] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo produtor de IMP” se refere a um micro-organismo que tem capacidade natural para produzir IMP; ou um micro-organismo introduziu uma capacidade para produzir ou exportar IMP, cuja cepa parental não tem capacidade natural para produzir e/ou exportar IMP que é, na presente revelação, o micro-organismo que produz IMP que pode ser usado intercambiavelmente com um micro-organismo que tem uma atividade de exportação de IMP.

[039] O micro-organismo produtor de IMP é uma célula ou micro-organismo que inclui uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de IMP ou um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, ou que é transformado com um vetor que contém o polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, e tem, assim, capacidade para expressar a variante de proteína. Para o propósito da presente revelação, a célula hospedeira do micro-organismo produtor de IMP ou microorganismo pode ser qualquer micro-organismo que inclua a variante de proteína com, assim, capacidade para produzir IMP. Por exemplo, o micro-organismo pode ser um micro-organismo do gênero Escherichia, um micro-organismo do gênero Serratia, um micro-organismo do gênero Erwinia, um micro-organismo do gênero Enterobacteria, um micro-organismo do gênero Salmonella, um micro-organismo do gênero Streptomyces, um micro-organismo do gênero Pseudomonas, um micro-organismo do gênero Brevibacterium, um micro-organismo do gênero Corynebacterium, etc., e especificamente, um micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[040] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo produtor de IMP do gênero Corynebacterium” se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem capacidade natural para produzir IMP ou capacidade para produzir IMP por modificação. Especificamente, conforme usado no presente documento, o micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade para produzir IMP se refere a uma cepa nativa do micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade para produzir IMP; ou um micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidades intensificadas para produzir IMP preparado inserindo-se um gene associado à produção de IMP ou intensificando-se ou atenuando-se o gene endógeno associado à produção de IMP. Mais especificamente, na presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidade para produzir IMP se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem capacidades aprimoradas para produzir IMP, incluindo-se uma variante de proteína que tem uma atividade de exportação de IMP ou um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, ou sendo transformado com um vetor que contém o polinucleotídeo que codifica a variante de proteína. O “micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidades intensificadas para produzir IMP” se refere a um micro-organismo do gênero Corynebacterium com capacidades aprimoradas para produzir IMP em comparação com aquele de sua cepa parental antes da transformação ou aquele de um micro-organismo não modificado do gênero Corynebacterium. O “micro-organismo não modificado do gênero Corynebacterium” se refere a um tipo nativo do micro-organismo do gênero Corynebacterium, a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que não contém a variante de proteína com capacidade para exportar IMP ou a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que não é transformado com um vetor que contém um polinucleotídeo que codifica a variante de proteína com capacidade para exportar IMP.

[041] Em uma modalidade da presente revelação, o micro-organismo da presente revelação pode ser um micro-organismo do gênero Corynebacterium no qual uma atividade de adenilossuccinato sintetase e/ou IMP desidrogenase é adicionalmente atenuada.

[042] Na presente revelação, “um micro-organismo do gênero Corynebacterium” se refere especificamente a Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis, etc., mas o micro-organismo não necessariamente se limita a esses.

[043] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece um método para preparar IMP que inclui cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium em um meio.

[044] Especificamente, o método da presente revelação pode adicionalmente incluir uma etapa de recuperar IMP a partir do micro-organismo ou do meio.

[045] No método acima, o cultivo do micro-organismo pode ser realizado em um processo em batelada, processo contínuo, processo em batelada alimentada, etc. conhecidos na técnica, mas o processo de cultivo não é particularmente limitado a esses. Em particular, em relação às condições de cultivo, o pH da cultura pode ser ajustado para um pH adequado (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente, pH 6 a 8 e, com a máxima especificidade, com um composto básico apropriado (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico), e a condição aeróbica da cultura pode ser mantida introduzindo-se oxigênio ou uma mistura de gás contendo oxigênio na cultura. A temperatura de cultivo pode geralmente estar na faixa de 20 °C a 45 °C e, especificamente, 25 °C a 40 °C, por cerca de 10 a 160 horas, mas as condições de cultivo não se limitam a essas. O IMP produzido pelo cultivo acima pode ser secretado na cultura ou pode ser retido nas células.

[046] Adicionalmente, exemplos das fontes de carbono a serem usadas no meio de cultura podem incluir açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaços, amido e celulose); óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco); ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico); álcoois (por exemplo, glicerol e etanol); e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), mas não se limitam a esses. Essas fontes de carbono podem ser usadas isoladamente ou em combinação, mas não se limitam a isso. Exemplos das fontes de nitrogênio a serem usadas no meio de cultura podem incluir compostos orgânicos que contêm nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, milhocina, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio), etc. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas isoladamente ou em combinação, mas não se limitam a isso. Exemplos das fontes de fósforo a serem usadas no meio de cultura podem incluir fosfato di-hidrogênio de potássio, fosfato hidrogênio de dipotássio, sais que contêm sódio correspondentes, etc., mas não se limitam a esses. Adicionalmente, sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos, vitaminas, etc., que são materiais promotores de crescimento essenciais, podem estar contidos no meio.

[047] Na presente revelação, o método para recuperar o IMP produzido na etapa de cultivo pode ser realizado coletando-se o IMP do caldo de cultura com o uso de um método apropriado conhecido na técnica. Por exemplo, métodos, tais como centrifugação, filtração, cromatografia de troca iônica, cristalização, HPLC, etc., podem ser usados, e o IMP desejado pode ser recuperado de uma cultura ou microorganismo cultivado com o uso de um método apropriado conhecido na técnica.

[048] Adicionalmente, a recuperação pode incluir um processo de purificação e pode ser realizada com o uso de um método apropriado conhecido na técnica. Assim, o IMP a ser recuperado pode estar em uma forma purificada ou um caldo de fermentação de micro-organismo que contém IMP.

[049] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece uma composição para produzir IMP, incluindo a variante de proteína da presente revelação, que tem a atividade de exportação de IMP, ou um polinucleotídeo que codifica a mesma.

[050] A composição da presente revelação pode incluir, ainda, sem limitação, uma constituição com capacidade para operar o polinucleotídeo. Na composição da presente revelação, o polinucleotídeo pode estar em uma forma incluída em um vetor para expressar um gene operacionalmente ligado na célula hospedeira introduzida.

[051] Adicionalmente, a composição pode incluir, ainda, quaisquer excipientes adequados convencionalmente usados na composição para produzir IMP. Tais excipientes podem ser, por exemplo, conservantes, umectantes, agentes de suspensão, tampões, agentes estabilizadores ou agentes isotônicos, mas não se limitam a esses.

[052] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece o uso da proteína da presente revelação para aumentar a produção de IMP no micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[053] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece um método para aumentar a exportação de IMP que inclui intensificar a atividade da variante de proteína, que tem a atividade de exportação de IMP, no micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[054] Os termos “proteína que tem a atividade de exportação de IMP”, “intensificação” e “micro-organismo do gênero Corynebacterium” são conforme descritos acima.

[055] Ainda um outro aspecto da presente revelação fornece o uso da proteína da presente revelação para aumentar a exportação de IMP no micro-organismo do gênero Corynebacterium.

[DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE]

[056] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes através de modalidades exemplificativas. Entretanto, deve ser óbvio para uma pessoa de habilidade comum na técnica que essas modalidades exemplificativas são fornecidas com o propósito apenas de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da presente revelação.

EXEMPLO 1: CONSTATAÇÃO DE PROTEÍNAS DE EXPORTAÇÃO DE IMP

[057] Uma biblioteca de DNA genômico de ATCC6872 de Corynebacterium stationis foi preparada para a identificação de proteínas de membrana de Corynebacterium envolvidas na exportação de IMP. Então, visto que a cepa do tipo selvagem de Corynebacterium não pode produzir IMP, ou mesmo que produza IMP, produz apenas uma pequena quantidade do mesmo, uma cepa chamada CJI0323, que tem capacidade para produzir IMP, derivada da cepa ATCC6872, foi preparada para a identificação da capacidade para produzir IMP. A cepa CJI0323 preparada foi submetida a triagem de proteínas de membrana envolvidas na exportação de IMP com o uso da biblioteca de DNA genômico da cepa ATCC6872. Os detalhes específicos do experimento são os seguintes.

EXEMPLO 1-1: SELEÇÃO DE CEPA PRODUTORA DE IMP, CJI0323

[058] As células de ATCC6872 foram suspensas em um tampão de fosfato (pH 7,0) ou tampão de citrato (pH 5,5) a uma concentração de 107 células/ml a 108 células/ml para preparar uma cepa produtora de IMP derivada de ATCC6872, e as células foram submetidas a tratamento UV para induzir a mutação. As células resultantes foram lavadas duas vezes com uma solução salina a 0,85% e, então, diluídas e transferidas para placas em um meio, que foi preparado adicionando-se um material fornecedor de resistência a uma concentração apropriada a um meio mínimo que contém ágar a 1,7%, e colônias foram obtidas depois disso. Cada colônia foi cultivada em um meio nutriente e cultivada em um meio de semeadura por 24 horas. Após o cultivo das colônias por 3 a 4 dias em um meio de fermentação, a colônia com a maior capacidade para produzir IMP acumulado no meio de cultura foi selecionada. No curso de preparação de uma cepa com capacidade para produzir IMP em alta concentração, a fim de fornecer auxotrofia adenina, vazamento de guanina, suscetibilidade a lisozima, resistência à 3,4-di-hidroprolina, resistência à estreptomicina, resistência a ácido carboxílico de azetidina, resistência à tiaprolina, resistência à azaserina, resistência à sulfaguanidina, resistência à norvalina e resistência a trimetoprim, os procedimentos acima foram realizados sequencialmente para cada material. Como resultado, CJI0323, que mostrou resistência aos materiais acima e excelentes capacidades para produzir IMP, foi finalmente selecionado. O grau de resistência entre ATCC6872 e CJI0323 foi comparado e os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.[TABELA 1]

- Meio mínimo: glicose a 2%, sulfato de sódio a 0,3%, KH2SO4 a 0,1%, K2HPO4 a 0,3%, sulfato de magnésio a 0,3%, cloreto de cálcio (10 mg/l), sulfato de ferro (10 mg/l), sulfato de zinco (1 mg/l), cloreto de manganês (3,6 mg/l), L-cisteína (20 mg/l), pantotenato de cálcio (10 mg/l), cloridrato de tiamina (5 mg/l), biotina (30 μg/l), adenina (20 mg/l), guanina (20 mg/l), pH 7,3 - Meio nutriente: peptona a 1%, suco de carne a 1%, cloreto de sódio a 0,25%, extrato de levedura a 1%, ágar a 2%, pH 7,2 - Meio de semeadura: glicose a 1%, peptona a 1%, suco de carne a 1%, extrato de levedura a 1%, cloreto de sódio a 0,25%, adenina (100 mg/l), guanina (100 mg/l), pH 7,5 - Meio de fermentação: glutamato de sódio a 0,1%, cloreto de amônio a 1%, sulfato de magnésio a 1,2%, cloreto de cálcio a 0,01%, sulfato de ferro (20 mg/l), sulfato de manganês (20 mg/l), sulfato de zinco (20 mg/l), sulfato de cobre (5 mg/l), L- cisteína (23 mg/l), alanina (24 mg/l), ácido nicotínico (8 mg/l), biotina (45 μg/l), cloridrato de tiamina (5 mg/l), adenina (30 mg/l), ácido fosfórico a 1,9% (85%), glicose a 2,55%, frutose a 1,45%

EXEMPLO 1-2: EXPERIMENTOS NO TÍTULO DE FERMENTAÇÃO DE CJI0323

[059] O meio de semeadura (2 ml) foi dispensado em tubos de teste (diâmetro: 18 mm) que foram, então, submetidos à autoclave, e cada um inoculado com ATCC6872 e CJI0323. Depois disso, os resultantes foram cultivados sob agitação a 30 °C por 24 horas e, então, usados como uma solução de cultura de sementes. O meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em frascos de Erlenmeyer (250 ml) para agitação, submetido à autoclave a 121 °C por 15 minutos, e a solução de cultura de sementes (2 ml) foi inoculada e cultivada por 3 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, 30 °C e um pH de 7,5.

[060] Após a conclusão da cultura, a quantidade de IMP produzido foi medida por HPLC (SHIMAZDU LC20A) e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 2 abaixo.

[TABELA 2]

[061] A cepa CJI0323 foi nomeada como CN01-0323 de Corynebacterium stationis. A cepa foi depositada sob o Tratado de Budapeste no Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos (KCCM - Korean Culture Center of Microorganisms) em 7 de novembro de 2017. Além disso, a cepa foi designada como Número de Acesso KCCM12151P.

EXEMPLO 1-3: CONSTATAÇÃO DE PROTEÍNAS EXPORTADORAS

[062] As condições de triagem que mostram a inibição de crescimento da cepa CJI0323 foram estabelecidas adicionando-se, ainda, IMP ao meio mínimo contendo ágar a 1,7%. Os plasmídeos da biblioteca genômica da cepa ATCC6872 foram transformados na cepa CJI0323 por eletroporação (van der Rest et al. 1999), e as colônias nas quais a inibição de crescimento foi liberada sob as condições de meio suplementadas com uma quantidade em excesso de IMP foram selecionadas. Os plasmídeos foram obtidos a partir das colônias selecionadas e analisados por uma técnica de sequenciamento. Como resultado, um tipo de proteína de membrana envolvida na liberação da inibição de crescimento foi identificado sob a condição em que uma quantidade em excesso de IMP foi adicionada.

[063] O um tipo de proteína de membrana proveniente de Corynebacterium foi identificado com base na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, transportador MFS). A proteína de membrana é conhecida como o transportador MFS, mas sua função específica não foi confirmada e, além disso, sua função em relação à exportação de IMP ainda é desconhecida. Na presente revelação, a proteína de membrana foi nomeada ImpE2(WT).

EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE ImpE1 E ImpE2 EXEMPLO 2-1: CONFIRMAÇÃO DE impE1 E impE2

[064] A fim de examinar as funções da proteína de membrana, ImpE2, a estrutura de gene de SEQ ID NO: 4 foi confirmada no NCBI (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795121, transportador MFS). Como resultado, confirmou-se que a porção de partida de 7 bp do ORF de SEQ ID NO: 4 (impE2) se sobrepõe em 7 bp com um gene diferente (NCBI GenBank: NZ_CP014279, WP_066795119, regulador transcricional), que está localizado a montante de impE2. Visto que as funções do gene localizado a montante de impE2 e a proteína codificada pelo gene não foram confirmadas, na presente revelação, a proteína foi nomeada ImpE1(WT) (a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3).

EXEMPLO 2-2: PREPARAÇÃO DE VETOR DEFICIENTE DE impE1 OU impE2

[065] A fim de confirmar se a deleção de ImpE1 ou ImpE2, que estão envolvidos na liberação da inibição de crescimento causada por IMP conforme identificado nos Exemplos 1 e 2-1, em uma cepa produtora de IMP pode reduzir sua capacidade de exportação de IMP, foram feitas tentativas para preparar vetores deficientes em cada um dos genes.

[066] Os fragmentos de gene para preparar os vetores foram obtidos por PCR com o uso do DNA genômico da cepa ATCC6872 como um modelo.

[067] Especificamente, a PCR para impE1 foi realizada com o uso de iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 6 e iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8; e a PCR para impE2 foi realizada com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10 e iniciadores de SEQ ID NOS: 11 e 12 (Tabela 3).[TABELA 3]

[068] Em particular, os iniciadores usados foram preparados com base nas informações sobre um gene de Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ_CP014279) registrado no NIH GenBank e nas sequências de nucleotídeos adjacentes ao mesmo.

[069] PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 25 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 52 °C por 30 minutos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos.

[070] A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de dois fragmentos do gene impE1, que foram amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 6 e dos iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8, como modelos, e como resultado, um modelo de polinucleotídeo (1,8 kbp) foi obtido. O fragmento de gene obtido foi clonado em um vetor linearizado pDZ (patente coreana no 10-0924065 e publicação de patente internacional no 2008-033001), que foi digerido com a enzima de restrição (Xba I) e ligado com o uso de ligase T4 e, assim, o vetor pDZ-ΔimpEI foi preparado. Adicionalmente, a reação em cadeia de polimerase de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento do gene impE2, amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10, e dois fragmentos do gene impE2, amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 11 e 12, como modelos, e como resultado, um modelo de polinucleotídeo (1,7 kbp) foi obtido. O fragmento de gene obtido foi digerido com enzimas de restrição, XbaI e SpeI. O fragmento de gene foi clonado com o uso de ligase T4 em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com a enzima de restrição (Xba I) e, assim, o vetor pDZ-Δ impE2 foi preparado.

EXEMPLO 2-3: PREPARAÇÃO DE VETORES DEFICIENTES DE INTEGRAÇÃO DE impE1 E impE2

[071] Visto que os genes impE1 e impE2, que codificam proteínas envolvidas na liberação da inibição de crescimento causada por IMP, são sobrepostos, há uma necessidade de regular ambos os genes simultaneamente. Portanto, foram feitas tentativas para preparar um vetor no quanto tanto impE1 quanto impE2 sejam deficientes.

[072] Para a PCR dos genes impE1 e impE2, iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 13 e iniciadores de SEQ ID NOS: 14 e 12 foram usados. Os iniciadores usados foram preparados com base nas informações sobre um gene de Corynebacterium stationis (ATCC6872) (NCBI Genbank: NZ_CP014279) registrado no NIH GenBank e nas sequências de nucleotídeos adjacentes ao mesmo. PCR de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento do gene impE1, amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 13, e dois fragmentos do gene impE2, amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 14 e 12, como modelos, e como resultado, um modelo de polinucleotídeo (2,0 kbp) foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com XbaI e SpeI, respectivamente. Os fragmentos de gene foram clonados com o uso de ligase T4 em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com a enzima de restrição (Xba I) e, assim, o vetor pDZ-Δ impE1E2 foi preparado.

EXEMPLO 2-4: PREPARAÇÃO DE CEPAS DEFICIENTES DE impE1 E impE2

[073] Os dois tipos de plasmídeos preparados no Exemplo 2-2 e um tipo de plasmídeo preparado no Exemplo 2-3 foram, cada um, transformado na cepa CJI0323 por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545). As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A deficiência genética nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso dos pares de iniciadores de SEQ ID NOS: 5 e 8, SEQ ID NOS: 9 e 12 e SEQ ID NOS: 5 e 12.

[074] As cepas selecionadas foram nomeadas CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 e CJI0323_ΔimpE1E2. Adicionalmente, as capacidades para produzir IMP dessas cepas foram avaliadas.

[075] O meio de semeadura (2 ml) foi dispensado em tubos de teste (diâmetro: 18 mm) que foram, então, submetidos à autoclave, cada um inoculado com CJI0323, CJI0323_ΔimpE1, CJI0323_ΔimpE2 e CJI0323_ΔimpE1E2, cultivados sob agitação a 30 °C por 24 horas e usados como soluções de cultura de sementes. O meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em frascos de Erlenmeyer (250 ml) para agitação e submetido à autoclave a 121 °C por 15 minutos. Então, a solução de cultura de sementes (2 ml) foi inoculada e o resultante foi cultivado por 3 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, 30 °C e um pH de 7,5.

[076] Após a conclusão da cultura, a quantidade of IMP produzido foi medida por HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 4 abaixo.

[077] A quantidade de IMP acumulada em cada cepa foi comparada com aquela da cepa parental, CJI0323 de Corynebacterium stationis. Como resultado, constatou- se que, conforme mostrado na Tabela 4 acima, as concentrações de IMP das cepas CJI0323_ΔimpEI, CJI0323_ΔimpE2 e CJI0323_ΔimpE1E2foram reduzidas em cerca de 8 g/l sob as mesmas condições em comparação com a cepa parental, confirmando que ImpE1 e ImpE2 são proteínas envolvidas na exportação de IMP.

EXEMPLO 3: CONFIRMAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS DE impE1 E impE2 DE CEPA PRODUTORA DE IMP, CJI0323

[078] No caso da cepa CJI0323 que produz IMP em alta concentração no Exemplo 1, é possível que a cepa tenha uma capacidade aprimorada de exportação de IMP de modo a produzir IMP em alta concentração. Consequentemente, foi feita uma tentativa para confirmar a presença de qualquer mutação em impE1 e impE2 da cepa CJI0323.

[079] O DNA cromossômico da cepa CJI0323 foi amplificado por reação em cadeia de polimerase (doravante, “PCR”). Especificamente, primeiro, a PCR foi realizada por meio de repetição de 28 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 1 minuto, anelamento a 58 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 2 minutos com o uso do DNA cromossômico da cepa CJI0323 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16 (Tabela 5) e, assim, um fragmento de cerca de 2,8 kbp foi amplificado.[TABELA 5]

[080] Após a análise da sequência de nucleotídeos com o uso dos mesmos iniciadores, confirmou-se que o 490° nucleotídeo do gene impEI (isto é, g) foi substituído por “a”, em comparação com a sequência de nucleotídeos da cepa do tipo selvagem, ATCC6872. Essa substituição indica que houve uma modificação na qual o 164° aminoácido da proteína de ImpE1 (isto é, ácido glutâmico) foi substituído por lisina.

[081] Adicionalmente, confirmou-se que o 4° nucleotídeo do gene impE2 (isto é, g) foi substituído por “a” (isso significa que o 666° nucleotídeo do gene impE1 (isto é, g) foi substituído por “a”) e o 181° nucleotídeo do gene impE1 (isto é, g) foi substituído por “a”. Essas substituições indicam que houve modificações em que o 2° aminoácido da proteína de ImpE2 (isto é, valina), que corresponde ao 222° aminoácido da proteína de ImpE1, foi substituído por isoleucina; e o 64° aminoácido da proteína de ImpE2 (isto é, glicina) foi substituído por ácido glutâmico.

[082] O nucleotídeo de impE1 da cepa CJI0323 foi nomeado impE1_CJI0323 (SEQ ID NO: 143) e a proteína do mesmo foi nomeada ImpE1_CJI0323 (SEQ ID NO: 141), enquanto o nucleotídeo de impE2 da cepa CJI0323 foi nomeado impE2_CJI0323 (SEQ ID NO: 144) e a proteína do mesmo foi nomeada ImpE2_CJI0323 (SEQ ID NO: 142).

EXEMPLO 4: RECUPERAÇÃO DE MODIFICAÇÕES EM impE1 E ImpE2 EXEMPLO 4-1: PREPARAÇÃO DE VETORES PARA RECUPERAR MODIFICAÇÕES EM impE1 OU impE2

[083] No Exemplo 3, a presença de qualquer modificação em impE1 e impE2 da cepa produtora de IMP CJI0323 foi examinada. Como resultado, confirmou-se que impE1 tinha uma modificação e impE2 tinha duas modificações. Visto que a cepa CJI0323 produz IMP em uma alta concentração, é altamente provável que a modificação seja uma que possa aprimorar a capacidade para exportar IMP. Consequentemente, após recuperação do impE1 e do impE2 mutados para o ImpE do tipo selvagem nativo sem modificação, o experimento a seguir foi realizado para confirmar se cada modificação realmente confere a capacidade para exportação de IMP.

[084] Para preparar um vetor de recuperação, a PCR foi realizada com o uso de ATCC6872 de Corynebacterium stationis como um modelo.

[085] O fragmento de gene impE1impE2 amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 17 e 18 foi tratado com uma enzima de restrição, XbaI, e clonado no sítio de restrição de XbaI no vetor pDZ e, assim, o pDZ-impE1E2(WT) foi preparado.

EXEMPLO 4-2: PREPARAÇÃO DE VETORES COM MODIFICAÇÃO ÚNICA EM impE1 OU impE2

[086] Um vetor com uma única modificação E164K no gene ImpE1 foi preparado com o uso da cepa do tipo selvagem nativa, ATCC6872 de Corynebacterium stationis, como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 19 e 20 e iniciadores de SEQ ID NOS: 21 e 22. A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento de gene E164K-1 amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 19 e 20 e dois fragmentos de gene E164K-2 amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 21 e 22 e, assim, um modelo com uma polinucleotídeo de 1,8 kbp foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com XbaI e clonados em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido diferido com XbaI, com o uso de ligase T4 e, assim, o vetor pDZ-impE1(E164K) foi preparado.

[087] Um vetor com uma única modificação V2I no gene ImpE2 foi preparado com o uso da cepa ATCC6872 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 19 e 23 e iniciadores de SEQ ID NOS: 24 e 22. A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento de gene V2I-1 amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 19 e 23 e dois fragmentos de gene V2I-2 amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 24 e 22 e, assim, um modelo com uma polinucleotídeo de 1,8 kbp foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com XbaI e clonados em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido diferido com XbaI, com o uso de ligase T4 e, assim, o vetor pDZ-impE2(V2I) foi preparado.

[088] Um vetor com uma única modificação G64E no gene ImpE2 foi preparado com o uso da cepa ATCC6872 como um modelo juntamente com os iniciadores de SEQ ID NOS: 19 e 25 e iniciadores de SEQ ID NOS: 26 e 22. A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de um fragmento de gene G64E-1 amplificado com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 19 e 25 e dois fragmentos de gene G64E-2 amplificados com o uso dos iniciadores de SEQ ID NOS: 26 e 22 e, assim, um modelo com uma polinucleotídeo de 1,8 kbp foi obtido. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com XbaI e clonados em um vetor linearizado pDZ, que já tinha sido diferido com XbaI, com o uso de ligase T4 e, assim, o vetor pDZ-impE2(G64E) foi preparado.[TABELA 6]

EXEMPLO 4-3: RECUPERAÇÃO DE MODIFICAÇÕES DE impE1, impE2 E PREPARAÇÃO DE CEPAS COM MODIFICAÇÃO ÚNICA

[089] O plasmídeo preparado no Exemplo 4-1 foi transformado na cepa CJI0323 por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545). As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A recuperação da modificação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos. A cepa preparada foi chamada CJI0323_impE1E2(WT).

[090] Os três tipos de plasmídeos preparados no Exemplo 4-2 foram transformados na cepa CJI0323_impE1E2(WT) por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545). As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução da modificação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos. As cepas selecionadas foram nomeadas CJI0323_impE1(E164K), CJI0323_impE2(V2I) e CJI0323_impE2(G64E).

[091] As cepas CJI0323_impE1(E164K) de Corynebacterium stationis, CJI0323_impE2(V2I) de Corynebacterium stationis e CJI0323_impE2(G64E) de Corynebacterium stationis foram depositadas sob o Tratado de Budapeste no Centro Coreano de Cultura de Micro-organismos (KCCM) em 2 de novembro de 2018. Além disso, as cepas foram designadas com Números de Acesso KCCM12359P, KCCM12360P e KCCM12361P, respectivamente.

EXEMPLO 4-4: PREPARAÇÃO DE CEPAS MODIFICADAS POR INTEGRAÇÃO DE impE1 E impE2

[092] Os plasmídeos pDZ-impE2(V2I) e pDZ-impE2(G64E) preparados no Exemplo 4-2 foram transformados na cepa CJI0323_impE1(E164K) por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545). As cepas nas quais os vetores foram inseridos no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução da modificação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos. As cepas preparadas foram nomeadas CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I) e CJI0323_impE1(164K)_impE2(G64E).

[093] O plasmídeo pDZ-impE2(G64E) foi transformado na cepa CJI0323_impE2(V2I) por eletroporação (com o uso do método de transformação revelado em Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 a 545). As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução da modificação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos. A cepa selecionada foi nomeada CJI0323_impE2(V2I)(G64E).

EXEMPLO 4-5: AVALIAÇÃO DE CEPAS COM MODIFICAÇÕES DE impE1, impE2

[094] O meio de semeadura (2 ml) foi dispensado em tubos de teste (diâmetro: 18 mm), que foram, então, submetidos à autoclave, cada um inoculado com CJI0323_impE1E2(WT), CJI0323_impE1(E164K), CJI0323_impE2(V2I), CJI0323_impE2(G64E), CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I),CJI0323_impE1(E164K)_impE2(G64E) e CJI0323_impE2(V2I)(G64E), cultivado sob agitação a 30 °C por 24 horas e usado como soluções de cultura de sementes. O meio de fermentação (29 ml) foi dispensado em frascos de Erlenmeyer (250 ml) para agitação e submetido à autoclave a 121 °C por 15 minutos. Então, as soluções de cultura de sementes (2 ml) foram inoculadas e os resultantes foram cultivados por 3 dias. As condições de cultura foram definidas para 170 rpm, 30 °C e um pH de 7,5.

[095] Após a conclusão da cultura, a quantidade of IMP produzido foi medida por HPLC, e os resultados da cultura são mostrados na Tabela 7 abaixo.[TABELA 7]

[096] Conforme mostrado acima, confirmou-se que, em relação a cada posição de modificação, um tipo de modificação, a integração de dois tipos de modificações e a integração de três tipos de modificações estavam todas envolvidas na exportação de IMP. Consequentemente, em um micro-organismo do gênero Corynebacterium que não produz IMP ou produz apenas uma pequena quantidade do mesmo, o aumento na quantidade de produção de IMP devido às modificações da proteína ImpE da presente revelação pode ser interpretado como sendo muito significativo.

EXEMPLO 5: SUBSTITUIÇÃO DE AMINOÁCIDOS EM MODIFICAÇÕES DE impE1, impE2 COM OUTROS AMINOÁCIDOS EXEMPLO 5-1: PREPARAÇÃO DE VETORES PARA INSERÇÃO SUBSTITUTA DE AMINOÁCIDOS EM MODIFICAÇÕES DE ImpE1, impE2

[097] Para confirmar a importância posicional dos três tipos representativos de modificações (isto é, impE1(E164K), impE2(V2I) e impE2(G64E)) com capacidades intensificadas para produzir IMP conforme identificado nos resultados acima, um vetor para introduzir modificações (por exemplo, uma modificação para substituir o 164° aminoácido na sequência de aminoácidos de impE1, o 2° aminoácido na sequência de aminoácidos de impE2 e o 64° aminoácido na sequência de aminoácidos de impE2 por um outro aminoácido) foi preparado.

[098] Primeiramente, o procedimento para preparar o vetor para a introdução da modificação de ImpE1(E164K) é o seguinte.

[099] Com base nas sequências de polinucleotídeos relatadas, os genes cromossômicos de CJI0323 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos realizando-se PCR com o uso do DNA cromossômico de CJI0323 de Corynebacterium stationis como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre o iniciador de SEQ ID NO: 27 e cada uma das SEQ ID NOS: 28 a 45. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, 18 tipos de polinucleotídeos de 0,7 kbp foram obtidos. Então, os genes cromossômicos de CJI0323 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos realizando-se PCR com o uso do DNA cromossômico de CJI0323 de Corynebacterium stationis como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre o iniciador de SEQ ID NO: 46 e cada uma das SEQ ID NOS: 47 a 64. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, 18 tipos de polinucleotídeos de 0,7 kbp foram obtidos.

[0100] A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de dois fragmentos obtidos a partir dos resultados acima como um modelo e, assim, 18 tipos de polinucleotídeos de 1,4 kbp a serem usados como modelo foram obtidos. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com uma enzima de restrição, SpeI, ligados ao vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com uma enzima de restrição, XbaI, transformados em DH5α de E. coli, e os transformados foram transferidos para placas em um meio LB sólido que contém canamicina (25 mg/l).

[0101] As informações de sequência sobre os iniciadores usados para a preparação do vetor são mostradas na Tabela 8 abaixo.[TABELA 8]

[0102] Após seleção por PCR das colônias transformadas com o vetor no qual o gene-alvo foi inserido, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido. As informações sobre os plasmídeos obtidos são mostradas na Tabela 9 abaixo.[TABELA 9]

[0103] Depois, o procedimento para preparar o vetor para a introdução do ImpE2(V2I) é o seguinte.

[0104] Com base nas sequências de polinucleotídeos relatadas, os genes cromossômicos de CJI0323 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos realizando-se PCR com o uso do DNA cromossômico de CJI0323 de Corynebacterium stationis como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre o iniciador de SEQ ID NO: 65 e cada uma das SEQ ID NOS: 66 a 83. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, 18 tipos de polinucleotídeos de 0,7 kbp foram obtidos. Então, os genes cromossômicos de CJI0323 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos realizando-se PCR com o uso do DNA cromossômico de CJI0323 de Corynebacterium stationis como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre o iniciador de SEQ ID NO: 84 e cada uma das SEQ ID NOS: 85 a 102. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, 18 tipos de polinucleotídeos de 0,7 kbp foram obtidos.

[0105] A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de dois fragmentos obtidos a partir dos resultados acima como um modelo e, assim, 18 tipos de polinucleotídeos de 1,4 kbp a serem usados como modelo foram obtidos. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com uma enzima de restrição, XbaI, ligados ao vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com uma enzima de restrição, XbaI, transformados em DH5α de E. coli, e os transformados foram transferidos para placas em um meio LB sólido que contém canamicina (25 mg/l).

[0106] As informações de sequência sobre os iniciadores usados para a preparação do vetor são mostradas na Tabela 10 abaixo.[TABELA 10]

[0107] Após seleção por PCR das colônias transformadas com o vetor no qual o gene-alvo foi inserido, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido. As informações sobre os plasmídeos obtidos são mostradas na Tabela 11 abaixo.[TABELA 11]

[0108] Por último, o procedimento para preparar o vetor para a introdução do ImpE2(G64E) é o seguinte.

[0109] Com base nas sequências de polinucleotídeos relatadas, os genes cromossômicos de CJI0323 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos realizando-se PCR com o uso do DNA cromossômico de CJI0323 de Corynebacterium stationis como um modelo de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e juntamente com pares de iniciadores entre o iniciador de SEQ ID NO: 103 e cada uma das SEQ ID NOS: 104 a 121. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, 18 tipos de polinucleotídeos de 1 kbp foram obtidos. Então, os genes cromossômicos de CJI0323 de Corynebacterium stationis foram isolados, e fragmentos de gene foram obtidos realizando-se PCR com o uso do DNA cromossômico de CJI0323 de Corynebacterium stationis como um modelo juntamente com pares de iniciadores entre o iniciador de SEQ ID NO: 84 e cada uma das SEQ ID NOS: 85 a 102. PCR foi realizada por desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos; 20 ciclos que consistem na polimerização a 72 °C por 1 minuto; e polimerização final a 72 °C por 5 minutos. Como resultado, 18 tipos de polinucleotídeos de 1 kbp foram obtidos.

[0110] A PCR de sobreposição foi realizada com o uso de dois fragmentos obtidos a partir dos resultados acima como um modelo e, assim, 18 tipos de polinucleotídeos de 2 kbp a serem usados como modelo foram obtidos. Os fragmentos de gene obtidos foram digeridos com uma enzima de restrição, XbaI, ligados ao vetor linearizado pDZ, que já tinha sido digerido com uma enzima de restrição, XbaI, transformados em DH5α de E. coli, e os transformados foram transferidos para placas em um meio LB sólido que contém canamicina (25 mg/l).

[0111] As informações de sequência sobre os iniciadores usados para a preparação do vetor são mostradas na Tabela 12 abaixo.[TA BELA 12]

[0112] Após seleção por PCR das colônias transformadas com o vetor no qual o gene-alvo foi inserido, os plasmídeos foram obtidos com o uso de um método de extração de plasmídeo convencionalmente conhecido. As informações sobre os plasmídeos obtidos são mostradas na Tabela 13 abaixo.[TABELA 13]

EXEMPLO 5-2: PREPARAÇÃO DE CEPAS EM QUE AMINOÁCIDOS EM POSIÇÕES DE PRODUTOS MODIFICADOS (ImpE1, ImpE2) SÃO SUBSTITUÍDOS POR OUTROS AMINOÁCIDOS, E COMPARAÇÃO DE CAPACIDADE PARA PRODUZIR IMP

[0113] Os 54 tipos de plasmídeos preparados no Exemplo 5-1 foram transformados na cepa CJI0323. As cepas nas quais o vetor foi inserido no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução da modificação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos. Os nomes de cepa de acordo com as modificações inseridas são mostrados na Tabela 14 abaixo.[TABELA 14]

[0114] O cultivo foi realizado da mesma maneira que no Exemplo 1, e a concentração de IMP produzido do mesmo foi anali sado (Tabela 15).[TABELA 15]

[0115] Conforme mostrado acima, todas as cepas modificadas mostraram um aumento na capacidade para produzir IMP em comparação com cada uma das cepas de controle e, assim, confirmou-se que as três posições de modificação são sítios importantes que têm um efeito significativo no aumento da capacidade da proteína ImpE em relação à exportação de IMP.

EXEMPLO 6: INTRODUÇÃO DE MODIFICAÇÕES DE impE1, impE2 COM BASE EM CEPAS PRODUTORAS DE IMP EXEMPLO 6-1: PREPARAÇÃO DE CEPAS COM MODIFICAÇÕES DE impE1, impE2 COM BASE EM CEPAS PRODUTORAS DE IMP

[0116] Para confirmar o efeito de introduzir modificações de impE1 e impE2, preparou-se uma cepa produtora de IMP na qual as atividades de adenilossuccinato sintetase e IMP desidrogenase que correspondem à trajetória de degradação de IMP na cepa ATCC6872 foram atenuadas. O códon de iniciação foi alterado mudando-se a primeira base de “a” para “t” em cada sequência de nucleotídeos dos dois genes purA e guaB, que codificam as duas enzimas. A cepa na qual a expressão dos dois genes foi atenuada na cepa ATCC6872 foi nomeada CJI9088. Os vetores pDZ- impE1(E164K), pDZ-impE2(V2I) e pDZ-impE2(G64E) preparados no Exemplo 4-2 foram transformados na cepa CJI9088 por eletroporação, e o vetor pDZ-impE2(G64D) preparado no Exemplo 5-1 foi transformado na cepa CJI9088_impE1(E164K)_impE2(V2I) por eletroporação. As cepas nas quais os vetores foram inseridos no cromossomo por recombinação das sequências homólogas foram selecionadas em um meio que contém canamicina (25 mg/l). As cepas primárias selecionadas foram submetidas a um segundo cruzamento. A introdução da modificação nas cepas finalmente transformadas foi confirmada realizando-se PCR com o uso do par de iniciadores de SEQ ID NOS: 15 e 16, seguido por análise de sequenciamento de nucleotídeos.

[0117] A capacidade das cepas preparadas (isto é, CJI9088, CJI9088_impE1(E164K), CJI9088_impE2(V2I), CJI9088_impE2(G64E) e CJI9088_impE1(E164K)_impE2(V2I)(G64D)) para produzir IMP foi avaliada. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de IMP foi medida por HPLC, e os resultados são mostrados na Tabela 16 abaixo.[TABELA 16]

[0118] Após confirmar a quantidade de IMP acumulado no meio de cultura, confirmou-se que essas cepas mostraram um aumento de produção de IMP em pelo menos 61%, e um aumento máximo de 727%, em comparação com a cepa parental, CJ9088. Consequentemente, o aumento na quantidade de produção de IMP devido às modificações da proteína ImpE da presente revelação pode ser interpretado como sendo muito significativo.

[0119] A partir do que foi mencionado anteriormente, uma pessoa versada na técnica à qual a presente revelação se refere terá a capacidade para compreender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou as características essenciais da presente revelação. Nesse aspecto, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente revelação. Pelo contrário, a presente revelação é destinada a abranger não só as modalidades exemplificativas, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem estar incluídas no espírito e escopo da presente revelação conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Variante de proteína que exporta monofosfato de 5’-inosina caracterizada por, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, (i) o 2° aminoácido, (ii) o 64° aminoácido ou (iii) o 2° aminoácido e o 64° aminoácido serem, cada um, substituídos por outro aminoácido.

2. Variante de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por (i) o 2° aminoácido ser substituído por um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em isoleucina, fenilalanina, metionina, ácido glutâmico, histidina e asparagina; (ii) o 64° aminoácido ser substituído por um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em aspartato, ácido glutâmico, asparagina, cisteína, isoleucina e fenilalanina; ou (iii) o 2° aminoácido e o 64° aminoácido serem, cada um, substituídos por um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em metionina, ácido glutâmico, histidina, asparagina, aspartato, cisteína, isoleucina e fenilalanina.

3. Polinucleotídeo que codifica a variante de proteína, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado por na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 ou sua sequência degenerada, o códon consistindo em (i) 4° a 6° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica um aminoácido, selecionado dentre o grupo que consiste em lisina, arginina, asparagina, glicina, treonina e prolina, (ii) 190° a 192° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica um aminoácido, selecionado do grupo que consiste em lisina, arginina, asparagina, glicina, treonina, e prolina ou (iii) 4° a 6° e 190° a 192° nucleotídeos ser substituído por um códon que codifica um aminoácido, selecionado do grupo que consiste em metionina, ácido glutâmico, histidina, asparagina, aspartato, cisteína, isoleucina e fenilalanina.

4. Vetor recombinante caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 3.

5. Microrganismo do gênero Corynebacterium que produz monofosfato de 5’-inosina caracterizado por compreender a variante de proteína, conforme definido na reivindicação 1 ou 2; o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 3, ou o vetor, conforme definido na reivindicação 4.

6. Microrganismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender, ainda, uma variante de proteína, sendo que o 164° aminoácido de SEQ ID NO: 1 é substituído por outro aminoácido.

7. Microrganismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o 164° aminoácido de SEQ ID NO: 1 ser substituído por um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em lisina, arginina, asparagina, glicina, treonina e prolina.

8. Microrganismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 5, sendo que o microrganismo do gênero Corynebacterium é caracterizado por ser Corynebacterium stationis.

9. Microrganismo do gênero Corynebacterium, de acordo com a reivindicação 6, sendo que o microrganismo do gênero Corynebacterium é caracterizado por ser Corynebacterium stationis.

10. Método para preparar monofosfato de 5’-inosina caracterizado por compreender cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium, conforme definido na reivindicação 5, em um meio; e recuperar o monofosfato de 5’-inosina do microrganismo ou meio.

11. Método para preparar monofosfato de 5’-inosina caracterizado por compreender cultivar o microrganismo do gênero Corynebacterium, conforme definido na reivindicação 6, em um meio; e recuperar o monofosfato de 5’-inosina do microrganismo ou meio.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o microrganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium stationis.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o microrganismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium stationis.