CN109929016A - 新型多肽和利用其生产imp的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及具有输出5’‑肌苷酸的活性的新型多肽、利用所述多肽的微生物、以及利用所述微生物制备5’‑肌苷酸的方法。

Description

新型多肽和利用其生产IMP的方法
技术领域
本公开内容涉及具有输出5’-肌苷酸(IMP)活性的新型蛋白质变体、使用该多肽的微生物以及使用该微生物制备IMP的方法。
背景技术
5’-肌苷酸(以下称为IMP)，是一种核酸物质，是核酸代谢途径的中间体，并且用于许多领域如食品、药品和各种医疗应用等。特别地，IMP与5’-鸟嘌呤单磷酸(以下称为GMP)一起被广泛用作食品调味品添加剂或食品。虽然已知IMP本身具有牛肉味道，但也已知的是其增强了谷氨酸一钠(MSG)的风味；因此，IMP作为一种基于核酸的增味调味品正引起诸多关注。
用于生产IMP的方法的例子包括对从酵母细胞提取的核糖核酸进行酶促降解的方法(日本专利公开第1614/1957号)、对通过发酵产生的肌苷进行化学磷酸化的方法(Agri.Biol.Chem.，36，1511，等)、以及培养可以直接产生IMP的微生物并在培养液中回收IMP的方法。在这些方法中，目前最常用的方法是使用能够直接生产IMP的微生物的方法。
同时，由于酶在工业应用中所需的活性、稳定性、光学异构体的底物特异性等方面并不总是表现出最佳的天然性能，所以已经进行了各种尝试以通过修饰它们的氨基酸序列来改进酶，以适应预期用途，等等。在这些尝试中，虽然已经应用酶的合理设计和定点诱变来改善酶功能，但在许多情况下，这些尝试显示出不利之处在于关于靶酶结构的信息不足或结构-功能相关性不明确，从而阻碍了它们的有效应用。另外，之前报道了一种通过定向进化尝试增强酶来改善酶活性的方法，该方法用于从通过酶基因随机诱变构建的修饰酶文库筛选期望性状的酶。
就此而言，本公开的发明人已经发现了参与输出IMP的活性的蛋白质，并且已经做出许多努力来增加IMP产生。结果，他们发现了具有输出IMP活性的蛋白质变体，从而完成了本公开内容。
发明内容
[技术问题]
本公开内容的一个目的是提供具有输出IMP活性的蛋白质变体。
本公开内容的另一目的是提供编码蛋白质变体的多核苷酸。
本公开内容的又一目的是提供包含所述多核苷酸的载体。
本公开内容的又一目的是提供产生IMP的微生物，其中微生物包括蛋白质变体或包含多核苷酸的载体。
本发明的又一目的是提供一种制备IMP的方法，其包括在培养基中培养微生物并从微生物或培养基中回收IMP。
[技术解决方案]
在下文中，将详细描述本公开内容。同时，本公开内容中公开的每个说明和示例性实施方案可以分别应用于其他各自的说明和示例性实施方案。即，本文中公开的各种要素的所有组合均属于本公开内容的范围内。此外，以下提供的具体描述不应限制本公开内容的范围。
为了实现上述目的，本公开内容的一个方面是提供一种具有输出IMP活性的蛋白质变体。
如本文所用的，术语“输出5’-肌苷酸(IMP)的蛋白质”是指参与IMP的胞外输出的蛋白质。对于本公开内容的目的，上述术语可与具有输出IMP的活性的蛋白质、IMP输出蛋白质、具有输出5’-肌苷酸的活性的蛋白质等互换使用；具体地，该术语可以表示为ImpE，更具体地为ImpE1和ImpE2等，但不限于此。另外，该蛋白质可以来源于棒状杆菌属的微生物，具体地来自停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但所述微生物不限于此。
例如，该蛋白质可以由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列组成，但可以包括与该蛋白质具有相同活性的任何序列而没有限制，并且本领域技术人员可以从众所周知的数据库NCBI的GenBank获得序列信息。另外，该蛋白质可以包括SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的氨基酸序列或与其具有至少80％或更高同源性的氨基酸序列，但该序列不限于此。具体而言，输出IMP的蛋白质可以包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多肽、或与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽。另外，明显的是，在本公开内容范围内可以包括具有部分序列缺失、修饰、置换或增加的氨基酸序列的任何蛋白质，只要其氨基酸序列具有上述同源性并具有对应于该蛋白质的效果即可。
另外，基于密码子简并性，明显的是，在本公开范围内还可以包括由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成的蛋白质或可以被翻译成与前述蛋白质具有同源性的蛋白质的多核苷酸。例如，多核苷酸可以由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4表示的多核苷酸序列组成。另外，在本公开范围内还可以包括但不限于以下序列：编码具有由SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列组成的蛋白质的活性的蛋白质的任何序列，其通过与可由已知基因序列制备的探针在严格条件下杂交来确定，所述探针例如与上述核苷酸序列的全部或部分的互补序列。术语“严格条件”是指其中使多核苷酸之间的特异性杂交成为可能的条件。这些条件在参考文献中具体描述(例如，J.Sambrook等，同上)。例如，条件可以包括在具有高同源性、40％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、甚至更具体地97％或更高、并且最具体地99％或更高的同源性的基因之间进行杂交，而在同源性低于上述同源性的基因之间不进行杂交；或在用于Southern杂交的60℃、1×SSC和0.1％SDS、具体地在对应于60℃、0.1×SSC和0.1％SDS和更具体地68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下的常规洗涤条件下进行一次、具体地两次或三次杂交。
杂交需要两个核酸具有互补序列，但是碱基之间的错配也是可能的，其取决于杂交的严格性。术语“互补”用于描述可互相杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。相应地，本公开内容还可以包括与整个序列互补的分离核酸片段以及基本相似的核酸序列。
具体地，可以使用包括杂交步骤的杂交条件和使用上述条件在55℃的Tm值下检测具有同源性的多核苷酸。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但是不限于此，并且可以由本领域普通技术人员根据预期目的适当地调整。
适合于多核苷酸杂交的严格性取决于多核苷酸的长度和互补性，并且相关变量在本领域中是公知的(参见Sambrook等，同上，9.50至9.51和11.7至11.8)。
如本文所用的，术语“同源性”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比。同源性是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性程度，并且可以表示为百分比。在本公开内容中，具有与给定氨基酸序列或多核苷酸序列相同或相似活性的同源序列可以用“同源性％”表示。从一个部分到另一个部分的序列之间的同源性可以通过本领域已知的技术来确定。例如，可以使用用于计算参数例如分数、同一性和相似性的标准软件，特别是BLAST 2.0，或者通过在Southern杂交实验中在限定的严格条件下通过比较序列来确认同源性，并且待确定的合适杂交条件在相应技术的范围内并且可以通过本领域普通技术人员已知的方法来确定(例如J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，纽约，1989；F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，纽约)。
具体而言，具有IMP输出活性的蛋白质变体可以是选自以下的至少一个氨基酸被另一个氨基酸置换的蛋白质变体：SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第164位氨基酸、SEQ IDNO：1的氨基酸中的第222位氨基酸、SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第2位氨基酸、和SEQ IDNO：2的氨基酸序列中的64位氨基酸，但氨基酸酸置换不限于此。更具体地，具有IMP输出活性的蛋白质变体可以是以下蛋白质变体：其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的164位氨基酸谷氨酸被谷氨酸之外的氨基酸置换；SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第2位氨基酸缬氨酸被缬氨酸之外的氨基酸置换；SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第64位氨基酸甘氨酸被甘氨酸之外的氨基酸置换的蛋白质变体；或由其组合产生的蛋白质变体，但氨基酸置换不限于此。
例如，具有IMP输出活性的蛋白质变体可以是其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第164位氨基酸被选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、苏氨酸和脯氨酸的氨基酸置换的蛋白质变体；或其中SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第2位氨基酸被选自由异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、组氨酸和天冬酰胺的氨基酸置换的蛋白质变体；或其中SEQ IDNO：2的氨基酸序列中的第64位氨基酸被选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸置换的蛋白质变体；或由其组合产生的蛋白质变体，但氨基酸置换不限于此。
在具体的实施方案中，具有IMP输出活性的蛋白质变体可以包括选自SEQ ID NO：141、142、145、147、149和151的氨基酸序列，或者与这些氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列，但氨基酸序列不限于此。具体而言，具有IMP输出活性的蛋白质变体可以包括与选自SEQ ID NO：141、142、145、147、149和151的氨基酸序列具有80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性的多肽。另外，明显的是，可以使用包括其中缺失、修饰、置换或增加部分氨基酸序列的氨基酸序列的任何多肽作为本公开内容的多肽，只要该氨基酸序列具有上述序列同源性并显示出对应于上述多肽的效果即可。
另外，明显的是，基于密码子简并性，在本公开内容的范围内还可以包括可翻译成由选自SEQ ID NO：141、142、145、147、149和151的氨基酸序列组成的蛋白质、或与上述蛋白质具有同源性的蛋白质的任何多核苷酸。例如，蛋白质变体可以由选自SEQ ID NO：143、144、146、148、150和152的多核苷酸序列组成。另外，基于在严格条件下与可由已知的基因序列(例如，与上述核苷酸序列的一部分或全部互补的序列)制备的探针杂交的结果，可以包括编码具有与由选自SEQ ID NO：141、142、145、147、149和151的氨基酸序列组成的蛋白质相同活性的蛋白质的任何多核苷酸序列而没有限制。
本公开内容的另一方面提供了编码蛋白质变体的多核苷酸、或含有该多核苷酸的载体。
如本文所用的，术语“多核苷酸”是指通过共价键在长链中延伸且具有长于特定长度的DNA链或RNA链的核苷酸的聚合物，并且更具体地，是指编码蛋白质变体的多核苷酸片段。
在本公开内容中，编码具有IMP输出活性的多肽的氨基酸序列的基因是impE1和impE2，并且编码它们的多核苷酸的说明已在上文描述。
在本公开内容中，编码具有IMP输出活性的蛋白质变体的多核苷酸的说明也已在上文描述。
如本文所用的，术语“载体”是指包含编码靶蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其中靶蛋白质可操作地连接至合适的控制序列，使得靶蛋白质可以表达在适当的宿主内。控制序列可以包括能够起始转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合结构域的序列、和控制转录和翻译终止的序列。在转化到合适的宿主细胞中之后，载体可以在不考虑宿主基因组的情况下复制或起作用，或者可以整合到宿主基因组自身当中。
本公开内容中使用的载体可以不做特别限制，只要载体在宿主细胞中可复制即可，并且其可以使用本领域已知的任何载体构建。载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等；作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的质粒载体。具体而言，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。
在一个实施方案中，可以使用用于插入细胞中的染色体的载体在染色体内用经修饰的多核苷酸替代编码目标蛋白质的多核苷酸。多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的方法如通过同源重组来进行，但不限于此。具体而言，还可以包括用于确认插入染色体中的选择标志物。选择标志物用于选择转化细胞，即为了确认是否已插入靶核酸，并且可以使用能够提供可选择表型如耐药性、营养需求、细胞毒剂抗性和表面蛋白的表达。在其中选择剂进行处理的情况下，只有能够表达选择标志物的细胞能够存活或表达其他表型性状，因此可以容易地选择转化的细胞。
本公开内容的又一方面提供了一种可通过包含蛋白质变体或编码蛋白质变体的多核苷酸来产生IMP的微生物。具体地，包含蛋白质变体和/或编码蛋白质变体的多核苷酸的微生物可以是通过使用含有编码蛋白质变体的多核苷酸的载体进行转化而制备的微生物，但微生物不限于此。
如本文所用的，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中而由此使得能够在宿主细胞中表达由该多核苷酸编码的蛋白质的过程。对于转化的多核苷酸，是否被插入宿主细胞的染色体并位于其中或位于染色体外部并不重要，只要可以在宿主细胞中表达转化的多核苷酸即可。另外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式插入，只要多核苷酸能够被引入宿主细胞并在其中表达即可。例如，可以将多核苷酸以表达盒的形式引入宿主细胞中，所述表达盒是包括自我表达所需的全部必要要素的基因构建体。表达盒通常可以包括与多核苷酸可操作连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以为可自我复制表达载体的形式。另外，可以将多核苷酸原样引入宿主细胞中并且可操作地连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列，但不限于此。
另外，如本文所用的，术语“可操作地连接”是指起始和介导编码靶蛋白的多核苷酸即本公开内容的缀合物的转录的启动子序列与以上基因序列之间的功能性连接。
如本文所用的，术语“产生IMP的微生物”是指天然能够产生IMP的微生物；或其亲本菌株不能天然地能够产生和/或输出IMP但对其引入了产生或输出IMP的能力的微生物。在本公开内容中，产生IMP的微生物可与具有输出IMP活性的微生物互换使用。
产生IMP的微生物是细胞或微生物，其包括具有输出IMP活性的蛋白质变体或编码该蛋白质变体的多核苷酸，或者用含有编码该蛋白质变体的多核苷酸的载体转化并由此能够表达该蛋白质变体。为了本公开的目的，宿主细胞或微生物可以是任何微生物，其包括因此能够产生IMP的蛋白质变体。例如，微生物可以是埃希氏菌属(Escherichia)的微生物、沙雷氏菌属(Serratia)的微生物、欧文氏菌属(Erwinia)的微生物、肠杆菌属(Enterobacteria)的微生物、沙门氏菌属(Salmonella)的微生物、链霉菌属(Streptomyces)的微生物、假单胞菌属(Pseudomonas)的微生物、短杆菌属(Brevibacterium)的微生物、棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物等，并且具体地为棒状杆菌属的微生物。
如本文所用的，术语“产生IMP的棒状杆菌属的微生物”是指天然能够产生IMP或通过修饰能够产生IMP的棒状杆菌属的微生物。具体而言，如本文所用的，能够产生IMP的棒状杆菌属微生物是指能够产生IMP的棒状杆菌属的微生物的天然菌株；或具有增强的产生IMP能力的棒状杆菌属的微生物，其通过插入与IMP产生相关的基因或通过增强或减弱与IMP产生有关的内源基因来制备。更具体而言，在本公开内容中，能够产生IMP的棒状杆菌属微生物是指通过包含具有输出IMP的活性的蛋白质变体或编码该蛋白质变体的多核苷酸、或通过用含有编码蛋白质变体的多核苷酸的载体转化而具有提高的产生IMP的能力的棒状杆菌属的微生物。“具有增强的产生IMP能力的棒状杆菌属的微生物”是指与其在转化前的亲本菌株或未经修饰的棒状杆菌属的微生物相比具有提高的产生IMP的能力的棒状杆菌属的微生物。“未经修饰的棒状杆菌属的微生物”是指棒状杆菌属的微生物的天然类型、不含有能够输出IMP的蛋白质变体的棒状杆菌属微生物或未用包含编码能够输出IMP的蛋白质变体的多核苷酸的载体转化的棒状杆菌属的微生物。
在本公开内容中，“棒状杆菌属的微生物”具体指谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、Corynebacterium efficiens、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)，但微生物不一定限于此。
本公开内容的又一方面提供了用于制备IMP的方法，其包括在培养基中培养产生IMP的棒状杆菌属的微生物，以及从培养的微生物或培养基中回收IMP。
在上述方法中，微生物的培养可以以本领域已知的分批方法、连续方法、分批补料方法等进行，但培养方法不特别限于此。具体而言，对于培养条件，可以将培养物的pH调节至合适的pH(例如，pH 5至9，具体地pH 6至8，并且最具体地利用适当的碱性化合物(例如氢氧化钠、钾氢氧化物或氨水)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)，并且可以通过向培养物中引入氧气或含氧气的气体混合物来维持培养物的需氧条件。培养温度通常可以在20℃至45℃、和具体地25℃至40℃的温度范围内约10至160小时，但培养条件不限于此。通过上述培养产生的IMP可以被分泌到培养物中或可以被保留在细胞中。
另外，待用于培养基中的碳源的实例可以包括糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)；油和脂肪(例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)；脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)；和有机酸(例如乙酸)，但是不限于此。这些碳源可以单独或以组合方式使用，但是不限于此。待用于培养基中的氮源的实例可以包括含氮有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、豆粕粉和尿素)；或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等。这些氮源可以单独或以组合方式使用，但是不限于此。待用于培养基的磷源的实例可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、对应的含钠盐等，但是不限于此。另外，在培养基中可以包含作为必要生长促进物质的金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等。
在本公开内容中，用于回收在培养步骤中产生的IMP的方法可以通过使用本领域已知的适当方法从培养液中收集IMP来进行。例如，可以使用诸如离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等的方法，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养物或培养的微生物中回收期望的IMP。
此外，回收可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的适当方法进行。因此，待回收的IMP可以是纯化形式或含有IMP的微生物发酵液。
[本发明的有利效果]
通过使用能够输出IMP的蛋白质变体培养产生IMP的棒状杆菌属的微生物，可以以高产率生产IMP。
具体实施方式
在下文中，将通过示例性实施方案来详细描述本公开内容。然而，对于本领域的普通技术人员而言，明显的是，提供这些示例性实施方案仅仅是为了说明的目的，而无意于限制本公开内容的范围。
实施例1：发现IMP输出蛋白质
制备停滞棒杆菌ATCC6872的基因组DNA文库以识别参与IMP输出的棒状杆菌的膜蛋白。然后，由于棒状杆菌的野生型菌株不能产生IMP，或者即使它产生IMP也只产生少量的IMP，所以制备来自ATCC6872菌株的能够产生IMP的菌株，称为CJI0323，以用于识别产生IMP的能力。使用ATCC6872菌株的基因组DNA文库对制备的CJI0323菌株进行参与IMP输出的膜蛋白的筛选。实验的具体细节如下。
实施例1-1：选择产生IMP的菌株CJI0323
将ATCC6872以107个细胞/mL至108个细胞/mL的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液(pH 7.0)或柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中来制备源自ATCC6872的产生IMP的菌株，然后对细胞进行UV处理来诱导突变。用0.85％的盐水溶液将所得细胞洗涤两次，然后稀释并涂布在培养基上，之后获得菌落，所述培养基是通过向包含1.7％琼脂的基本培养基添加适当浓度的提供抗性的物质来制备的。将每个菌落在营养培养基中培养并在种子培养基中培养24小时。菌落在发酵培养基中培养3至4天后，选择具有最高的在培养基中累积产生IMP的能力的菌落。在制备能够以高浓度产生IMP的菌株的过程中，为了提供腺嘌呤营养缺陷型、鸟嘌呤渗漏、溶菌酶易感性、3，4-二氢脯氨酸抗性、链霉素抗性、氮杂环丁烷羧酸抗性、硫代脯氨酸抗性、重氮丝氨酸抗性、磺胺脒抗性、正缬氨酸抗性和甲氧苄氨嘧啶抗性，对每种物质依次进行上述程序。结果，最终选择了对上述物质有抗性并且具有优良的产生IMP能力的CJI0323。下表1显示了ATCC6872与CJI0323的抗性程度的比较和结果。
[表1]
性能 ATCC6872 CJI0323
腺嘌呤营养缺陷型 非营养缺陷型 营养缺陷型
鸟嘌呤渗漏 非营养缺陷型 渗漏缺陷型
溶菌酶易感性 80μg/mL 8μg/mL
3，4-二氢脯氨酸抗性 1000μg/mL 3500μg/mL
链霉素抗性 500μg/mL 2000μg/mL
氮杂环丁烷羧酸抗性 5mg/mL 30mg/mL
硫代脯氨酸抗性 10μg/mL 100μg/mL
重氮丝氨酸抗性 25μg/mL 100μg/mL
磺胺脒抗性 50μg/mL 200μg/mL
正缬氨酸抗性 0.2mg/mL 2mg/mL
甲氧苄氨嘧啶抗性 20μg/mL 100μg/mL
-基本培养基：2％葡萄糖、0.3％硫酸钠、0.1％KH2SO4、0.3％K2HPO4、0.3％硫酸镁、氯化钙(10mg/L)、硫酸铁(10mg/L)、硫酸锌(1mg/L)、氯化锰(3.6mg/L)、L-半胱氨酸(20mg/L)、泛酸钙(10mg/L)、盐酸硫胺素(5mg/L)、生物素(30μg/L)、腺嘌呤(20mg/L)、鸟嘌呤(20mg/L)，pH 7.3
-营养培养基：1％蛋白胨、1％肉汁、0.25％氯化钠、1％酵母提取物、2％琼脂，pH7.2
-种子培养基：1％葡萄糖、1％蛋白胨、1％肉汁、1％酵母提取物、0.25％氯化钠、腺嘌呤(100mg/L)、鸟嘌呤(100mg/L)，pH 7.5
-发酵培养基：0.1％谷氨酸钠、1％氯化铵、1.2％硫酸镁、0.01％氯化钙、硫酸铁(20mg/L)、硫酸锰(20mg/L)、硫酸锌(20mg/L)、硫酸铜(5mg/L)、L-半胱氨酸(23mg/L)、丙氨酸(24mg/L)、烟酸(8mg/L)、生物素(45μg/L)、盐酸硫胺素(5mg/L)、腺嘌呤(30mg/L)、1.9％磷酸(85％)、2.55％葡萄糖、1.45％果糖
实施例1-2：CJI0323发酵效价的实验
将种子培养基(2mL)分配到试管(直径：18mm)中，然后对其高压蒸汽灭菌并各自用ATCC6872和CJI0323接种。之后，将产物在30℃振荡培养24小时，然后将其用作种子培养液。将发酵培养基(29mL)分配到锥形烧瓶(250mL)中进行振摇，在121℃高压蒸汽灭菌15分钟，将种子培养液(2mL)接种到其中且培养3天。培养条件设定为170转每分、30℃和pH 7.5。
在培养完成后，使用HPLC(SHIMAZDU LC20A)测量产生的IMP的量，培养结果示于下表2中。
[表2]
菌株 IMP(g/L)
ATCC6872 0
CJI0323 9.52
实施例1-3：发现输出蛋白
通过在包含1.7％琼脂的基本培养基中另外添加IMP来确定表现出菌株CJI0323生长抑制的筛选条件。通过电穿孔(van der Rest等，1999)将ATCC6872菌株的基因组文库质粒转化到菌株CJI0323中，并且选择其中在补充有过量IMP的培养基条件下解除生长抑制的菌落。从选择的菌落获得质粒并通过测序技术进行分析。结果，在其中添加过量IMP的条件下，识别了一种参与解除生长抑制的膜蛋白。
一种来自棒状杆菌属的膜蛋白被识别为SEQ ID NO：2的氨基酸序列和SEQ ID NO：4的核苷酸序列(NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS转运蛋白)。该膜蛋白被称为MFS转运蛋白，但其特定功能尚未被确认，并且其在IMP输出方面的功能仍然未知。在本公开内容中，将该膜蛋白命名为ImpE2(WT)。
实施例2：识别ImpE1和ImpE2
实施例2-1：确认impE1和impE2
为了检查膜蛋白ImpE2的功能，在NCBI(NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS转运蛋白)中确认了SEQ ID NO：4的基因结构。结果，确认了SEQ ID NO：4(impE2)的ORF的7bp起始部分与位于impE2(NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795119，转录调节子)上游的不同基因有7bp重叠。由于尚未确认位于impE2上游的基因和由该基因编码的蛋白质的功能，所以在本公开内容中，将这样的蛋白质命名为ImpE1(WT)(SEQ ID NO：1的氨基酸序列和SEQ ID NO：3的核苷酸序列)。
实施例2-2：制备impE1-或impE2缺陷型载体
为了确认在产生IMP的菌株中参与解除由实施例1和2-1中识别的IMP导致的生长抑制的ImpE1或ImpE2缺失是否可以降低其IMP输出能力，尝试制备每个基因的缺陷型载体。
使用ATCC6872菌株的基因组DNA作为模板通过PCR来获得用于制备载体的基因片段。
具体地，使用SEQ ID NO：5和6的引物以及SEQ ID NO：7和8的引物对impE1进行PCR；使用SEQ ID NO：9和10的引物以及SEQ ID NO：11和12的引物对impE2进行PCR(表3)。
[表3]
特别地，基于在NIH GenBank登记的停滞棒杆菌(ATCC6872)基因(NCBI Genbank：NZ_CP014279)上的信息和与其相邻的核苷酸序列来制备所使用的引物。
PCR按如下进行：在94℃进行初始变性5分钟；进行25次循环，每个循环由94℃变性30秒、52℃退火30分钟、和72℃聚合1分钟组成；以及在72℃最后聚合5分钟。
使用利用SEQ ID NO：5和6的引物以及SEQ ID NO：7和8的引物扩增的impE1基因的两个片段作为模板来进行重叠PCR，结果获得多核苷酸模板(1.8kbp)。将所得基因片段克隆到用限制性内切酶(XbaI)消化的线性化pDZ载体(韩国专利第10-0924065号和国际专利公开第2008-033001号)中，使用T4连接酶进行连接，由此制备pDZ-ΔimpE1载体。另外，使用利用SEQ ID NO：9和10的引物扩增的impE2基因片段和利用SEQ ID NO：11和12的引物扩增的impE2基因的两个片段作为模板进行重叠聚合酶链式反应，结果获得多核苷酸模板(1.7kbp)。将所得基因片段用限制性内切酶XbaI和SpeI消化。利用T4连接酶将基因片段克隆到已经用限制性内切酶(XbaI)消化的线性化pDZ载体中，由此制备pDZ-ΔimpE2载体。
实施例2-3：制备impE1和impE2整合-缺陷型载体
由于编码参与解除由IMP导致的生长抑制的蛋白质的impE1和impE2基因重叠，因此需要同时调节两种基因。因此，尝试制备其中impE1和impE2均缺失的载体。
对于impE1和impE2基因的PCR，使用了SEQ ID NO：5和13的引物以及SEQ ID NO：14和12的引物。基于在NIH GenBank登记的停滞棒杆菌(ATCC6872)(NCBI Genbank：NZ_CP014279)的基因上的信息和与其相邻的碱基序列来制备所使用的引物。使用利用SEQ IDNO：5和13的引物扩增的impE1基因的片段和利用SEQ ID NO：14和12的引物扩增的impE2基因的两个片段作为模板进行重叠PCR，结果获得多核苷酸模板(2.0kbp)。将所得基因片段分别用XbaI和SpeI消化。使用T4连接酶将基因片段克隆到已用限制性内切酶(XbaI)消化的线性化pDZ载体中，从而制备pDZ-ΔimpE1E2载体。
实施例2-4：制备impE1-和impE2-缺陷型菌株
通过电穿孔(利用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541至545)将在实施例2-2中制备的两种质粒和在实施例2-3中制备的一种质粒分别转化到CJI0323菌株中。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入染色体中的菌株。对所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：5和8、SEQ ID NO：9和12、以及SEQID NO：5和12的引物对进行PCR来确认最终转化的菌株中的遗传缺陷。
将所选择的菌株命名为CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2。另外，评价了这些菌株产生IMP的能力。
将种子培养基(2mL)中分配到试管(直径：18mm)中，然后将其高压蒸汽灭菌，每个试管用CJI0323、CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2、和CJI0323_ΔimpE1E2接种，在30℃下振荡培养24小时，并将其用作种子培养溶液。将发酵培养基(29mL)分配到锥形烧瓶(250mL)中振荡并在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。然后，对其接种种子培养液(2mL)并将产物培养3天。培养条件设定为170转每分、30℃和pH7.5。
在培养完成后，通过HPLC测量产生的IMP的量，培养结果示于下表4中。
[表4]
菌株 IMP(g/L)
CJI0323 9.52
CJI0323_ΔimpE1 1.92
CJI0323_ΔimpE2 1.88
CJI0323_ΔimpE1E2 1.80
将每种菌株中累积的IMP量与亲本菌株停滞棒杆菌CJI0323进行比较。结果发现，如上表4所示，与亲本菌株相比，在相同条件下，菌株CJI0323_ΔimpE1、CJI0323_ΔimpE2和CJI0323_ΔimpE1E2的IMP浓度降低约8g/L，其确认ImpE1和ImpE2是参与IMP输出的蛋白质。
实施例3：确认产生IMP的菌株CJI0323的impE1和impE2的核苷酸序列
在实施例1中产生高浓度IMP的CJI0323菌株的情况下，该菌株可能具有提高的IMP输出能力，从而以高浓度产生IMP。因此，尝试确认CJI0323菌株的impE1和impE2中存在任何突变。
通过聚合酶链式反应(以下称为“PCR”)扩增CJI0323菌株的染色体DNA。具体而言，首先，通过使用CJI0323菌株的染色体DNA作为模板与SEQ ID NO：15和16(表5)的引物进行PCR，所述PCR由28个如下循环组成：94℃变性1分钟、58℃退火30秒、和72℃聚合2分钟；由此扩增约2.8kbp的片段。
[表5]
SEQ ID NO 引物 序列(5’至3’)
15 impE1E2 seqF GAACGGAGTCATCTCCTTTGC
16 impE1E2 seqR CCAAACGCTCTGCAAGAAACTG
在使用相同的引物分析核苷酸序列后，确认了与野生型菌株ATCC6872的核苷酸序列相比，impE1基因的第490位核苷酸(即，g)被‘a’置换。该置换表明存在其中ImpE1蛋白(即谷氨酸)的第164位氨基酸被赖氨酸置换的修饰。
另外，确认了impE2基因的第4位核苷酸(即g)被′a′置换(这意味着impE1基因的第666位核苷酸(即g)被‘a’置换)，并且impE1基因的第191位核苷酸(即g)被‘a’置换。这些置换表明存在如下修饰：其中ImpE2蛋白的第2个氨基酸(即缬氨酸)，其对应于ImpE1蛋白的第222个氨基酸，被异亮氨酸置换；并且ImpE2蛋白的第64位氨基酸(即甘氨酸)被谷氨酸置换。
将CJI0323菌株的impE1基因命名为impE1_CJI0323(SEQ ID NO：143)将其蛋白质命名为ImpE1_CJI0323(SEQ ID NO：141)，而将CJI0323菌株的impE2基因命名为impE2_CJI0323(SEQ ID NO：144)并且将其蛋白质命名为ImpE2_CJI0323(SEQ ID NO：142)。
实施例4：恢复impE1和impE2中的修饰
实施例4-1：制备用于恢复impE1或impE2中的修饰的载体
在实施例3中，检查了产生IMP的菌株CJI0323的impE1和impE2中存在的任何修饰。结果确认了impE1具有一处修饰，impE2具有两处修饰。由于CJI0323菌株以高浓度产生IMP，所以非常可能的是该修饰是可以提高输出IMP能力的修饰。因此，在无修改的情况下将突变的impE1和impE2恢复至天然的野生型ImpE之后，进行以下实验以确认每个修饰是否实际赋予了IMP输出能力。
为了制备恢复载体，使用停滞棒杆菌ATCC6872作为模板来进行PCR。
用限制性内切酶XbaI处理利用SEQ ID NO：17和18的引物扩增的impE1impE2基因片段，并将其克隆到pDZ载体上的XbaI限制性内切酶位点上，由此制备pDZ-impE1E2(WT)。
实施例4-2：制备在impE1或impE2中具有单一修饰的载体
使用天然野生型菌株停滞棒杆菌ATCC6872作为模板以及SEQ ID NO：19和20的引物和SEQ ID NO：21的引物制备ImpE1基因中具有单个E164K修饰的载体和22。使用利用SEQID NO：19和20的引物扩增的E164K-1基因片段和利用SEQ ID NO：21和22的引物扩增的两个E164K-2基因片段进行重叠PCR，由此获得具有1.8kbp多核苷酸的模板。将获得的基因片段用XbaI消化并用T4连接酶克隆到已经用XbaI消化过的线性化pDZ载体中，由此制备pDZ-impE1(E164K)载体。
使用ATCC6872菌株作为模板以及SEQ ID NO：19和23的引物以及SEQ ID NO：24和22的引物制备在ImpE2基因中具有单个V2I修饰的载体。使用利用SEQ ID NO：19和23的引物扩增的V2I-1基因片段和利用SEQ ID NO：24和22的引物扩增的两个V2I-2基因片段进行重叠PCR，由此获得具有1.8kbp多核苷酸的模板。将获得的基因片段用XbaI消化并使用T4连接酶克隆到已经用XbaI消化的线性化pDZ载体中，由此制备pDZ-impE2(V2I)载体。
使用ATCC6872菌株作为模板以及SEQ ID NO：19和25的引物以及SEQ ID NO：26和22的引物制备在ImpE2基因中具有单个G64E修饰的载体。使用利用SEQ ID NO：19和25的引物扩增的G64E-1基因片段和利用SEQ ID NO：26和22的引物扩增的两个G64E-2基因片段进行重叠PCR，由此获得具有1.8kbp多核苷酸的模板。将获得的基因片段用XbaI消化并使用T4连接酶将其克隆到已经用XbaI消化的线性化pDZ载体中，由此制备pDZ-impE2(G64E)载体。
[表6]
SEQ ID 引物 序列(5′至3′)
NO
17 impE1E2 WTF GCTCTAGAGAACGGAGTCATCTCCTTTGC
18 impE1E2 WTR GCTCTAGACCAAACGCTCTGCAAGAAACTG
19 impE1 164K-1 GCTCTAGACTTGGATGACCTGGTGGAAAA
20 impE1 164K-2 CTGGGGCGCGTTGTTTTTCAGGATGCTCCCGAAGACG
21 impE1 164K-3 AACAACGCGCCCCAGAATTGG
22 impE1 164K-4 GCTCTAGAAATAGTTGGGGAAGTCCACTC
23 impE2 V2I-2 TGGAGTTTTTAGCTATCATTCCAGTCCTTTCGTGTAA
24 impE2 V2I-3 TAGCTAAAAACTCCACCCCAA
25 impE2 G64E-2 CCGAAAATCATCTGCTCCAAAGAGCTCATCAGCATGG
26 impE2 G64E-3 GCAGATGATTTTCGGTTCCGC
实施例4-3：恢复impE1、impE2修饰和制备单一修饰的菌株
通过电穿孔(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541至545中公开的转化方法)将实施例4-1中制备的质粒转化到CJI0323菌株中。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入染色体中的菌株。使所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：15和16的引物对进行PCR、然后进行核苷酸测序分析来确认最终转化菌株中修饰的恢复。将制备的菌株命名为CJI0323_impE1E2(WT)。
通过电穿孔(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541至545中公开的转化方法)将实施例4-2中制备的三种质粒各自转化到CJI0323_impE1E2(WT)菌株中。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入染色体中的菌株。使所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：15和16的引物对进行PCR、然后进行核苷酸测序分析来确认在最终转化的菌株中引入了修饰。将所选择的菌株命名为CJI0323_impEl(E164K)、CJI0323_impE2(V2I)和CJI0323_impE2(G64E)。
实施例4-4：制备impE1-和impE2-整合-修饰的菌株
通过电穿孔(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541至545中公开的转化方法)将实施例4-2中制备的pDZ-impE2(V2I)和pDZ-impE2(G64E)质粒转化到CJI0323_impE1(E164K)菌株中。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入染色体中的菌株。使所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：15和16的引物对进行PCR、然后进行核苷酸测序分析来确认在最终转化的菌株中引入了修饰。将制备的菌株命名为CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I)和CJI0323_impE1(164K)_impE2(G64E)。
通过电穿孔(使用Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541至545中公开的转化方法)将pDZ-impE2(G64E)质粒转化到CJI0323_impE2(V2I)菌株中。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入到染色体中的菌株。使所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：15和16的引物对进行PCR、然后进行核苷酸测序分析来确认在最终转化的菌株中引入了修饰。将所选择的菌株命名为CJI0323_impE2(V2I)(G64E)。
实施例4-5：评价具有impE1、impE2修饰的菌株
将种子培养基(2mL)分配到试管中(直径：18mm)，然后高压蒸汽灭菌，将每个试管接种CJI0323_impE1E2(WT)、CJI0323_impE1(E164K)、CJI0323_impE2(V2I)、CJI0323_impE2(G64E)、CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I)、CJI0323_impE1(E164K)_impE2(G64E)、和CJI0323_impE2(V2I)(G64E)，在30℃下振荡培养24小时，并用作种子培养液。将发酵培养基(29mL)分配到锥形烧瓶(250mL)中振荡并在121℃高压蒸汽灭菌15分钟。然后，向其接种种子培养液(2mL)并将产物培养3天。培养条件设定为170转每分、30℃、pH 7.5。
在培养完成后，通过HPLC测量产生的IMP的量，并且将培养结果示于下表7中。
[表7]
菌株 IMP(g/L)
CJI0323 9.52
CJI0323_impE1E2(WT) 2.32
CJI0323_impE1(E164K) 2.57
CJI0323_impE2(V2I) 3.11
CJI0323_impE2(G64E) 3.27
CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I) 4.24
CJI0323_impE1(E164K)_impE2(G64E) 6.27
CJI0323_impE2(V2I)(G64E) 7.35
如上所示，确认了三种修饰中的每一种都参与了IMP输出，并且整合两种或更多种修饰表现出IMP输出能力提高。特别地，已经确认，与野生型菌株(ImpE1和ImpE2)相比，其中整合了三种修饰的CJI0323菌株具有最大的IMP输出能力。因此，在不产生IMP或仅产生少量IMP的棒状杆菌属微生物中，由于本公开内容的ImpE蛋白质的修饰所引起的IMP产生量的增加可被解释为非常有意义。
实施例5：用另一种氨基酸置换impE1、impE2修饰中的氨基酸
实施例5-1：制备用于在impE1、impE2修饰中置换性插入氨基酸的载体
为了确认在上述结果中识别的具有增强的IMP产生能力的三种代表性修饰(即impE1(E164K)、impE2(V2I)、和impE2(G64E))的位置重要性，制备了用于引入修饰的载体(例如，用另一种氨基酸置换impE1的氨基酸序列中的第164位氨基酸、impE2的氨基酸序列中的第2位氨基酸和impE2的氨基酸序列中的第64位氨基酸置的修饰)。
首先，制备用于引入ImpE1(E164K)修饰的载体的程序如下。
基于报道的多核苷酸序列，分离停滞棒杆菌CJI0323的染色体基因，并且通过使用停滞棒杆菌CJI0323的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：27的引物和SEQ ID NO：28至45中的每一个之间的引物对进行PCR来获得基因片段。通过如下进行PCR：在94℃初始变性5分钟；由以下组成的20个循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分钟；并在72℃最终聚合5分钟。结果，获得了18种0.7kbp的多核苷酸。然后，分离停滞棒杆菌CJI0323的染色体基因，并通过使用停滞棒杆菌CJI0323的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：46的引物和SEQ ID NO：47至64中的每一个之间的引物对进行PCR来获得基因片段。通过如下进行PCR：在94℃初始变性5分钟；由以下组成的20个循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分钟；并在72℃最终聚合5分钟。结果，获得18种0.7kbp的多核苷酸。
使用从上述结果获得的两个片段作为模板进行重叠PCR，由此获得18种待用作模板的1.4kbp多核苷酸。将获得的基因片段用限制性内切酶SpeI消化，连接到已经用限制性内切酶XbaI消化的线性化pDZ载体，将其转化到E.coli DH5α中，并将转化子涂布在包含卡那霉素(25mg/L)的固体LB培养基上。
下表8中显示了用于制备载体的引物的序列信息。
[表8]
在通过PCR选择用其中插入了目标基因的载体转化的菌落后，使用常规已知的质粒提取方法获得质粒。关于所得质粒的信息在下表9中显示。
[表9]
编号 质粒
1 pDZ-impE1 164R
2 pDZ-impE1 164H
3 pDZ-impE1 164D
4 pDZ-impE1 164S
5 pDZ-impE1 164T
6 pDZ-impE1 164N
7 pDZ-impE1 164Q
8 pDZ-impE1 164C
9 pDZ-impE1 164G
10 pDZ-impE1 164P
11 pDZ-impE1 164A
12 pDZ-impE1 164V
13 pDZ-impE1 164I
14 pDZ-impE1 164L
15 pDZ-impE1 164M
16 pDZ-impE1 164F
17 pDZ-impE1 164Y
18 pDZ-impE1 164W
其次，制备用于引入ImpE2(V2I)的载体的程序如下。
基于所报道的多核苷酸序列，分离停滞棒杆菌CJI0323的染色体基因，并且通过使用停滞棒杆菌CJI0323的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：65的引物和SEQ ID NO：66至83中每一个之间的引物对进行PCR来获得基因片段。通过以下进行PCR：在94℃初始变性5分钟；由以下组成的20个循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分钟；以及在72℃最终聚合5分钟。结果，获得18种0.7kbp多核苷酸。然后，分离停滞棒杆菌CJI0323的染色体基因，并使用停滞棒杆菌CJI0323的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：84的引物和SEQ IDNO：85至102中每一个之间的引物对进行PCR。通过以下进行PCR：在94℃初始变性5分钟；由以下组成的20个循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分钟；以及在72℃最终聚合5分钟。结果，获得18种0.7kbp多核苷酸。
使用从上述结果获得的两个片段作为模板进行重叠PCR，从而获得18种待用作模板的1.4kbp多核苷酸。将获得的基因片段用限制性内切酶XbaI消化，与已经用限制性内切酶XbaI消化的线性化pDZ载体连接，转化到E.coliDH5α中，并将转化子涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的固体LB培养基上。
下表10中显示了关于用于制备载体的引物的序列信息。
在通过PCR选择用其中插入了目标基因的载体转化的菌落后，使用常规已知的质粒提取方法获得质粒。关于所得质粒的信息在下表11中示出。
[表11]
编号 质粒
1 pDZ-impE2 2R
2 pDZ-impE2 2H
3 pDZ-impE2 2K
4 pDZ-impE2 2D
5 pDZ-impE2 2E
6 pDZ-impE2 2S
7 pDZ-impE2 2T
8 pDZ-impE2 2N
9 pDZ-impE2 2Q
10 pDZ-impE2 2C
11 pDZ-impE2 2G
12 pDZ-impE2 2P
13 pDZ-impE2 2A
14 pDZ-impE2 2L
15 pDZ-impE2 2M
16 pDZ-impE2 2F
17 pDZ-impE2 2Y
18 pDZ-impE2 2W
最后，制备用于引入ImpE2(G64E)的载体的程序如下。
基于所报道的多核苷酸序列，分离停滞棒杆菌CJI0323的染色体基因，并且通过使用停滞棒杆菌CJI0323的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104的引物至121中每一个之间的引物对进行PCR来获得基因片段。通过以下进行PCR：在94℃初始变性5分钟；由以下组成的20个循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分钟；以及在72℃最终聚合5分钟。结果，获得18种1kbp多核苷酸。然后，分离停滞棒杆菌CJI0323的染色体基因，并使用停滞棒杆菌CJI0323的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：85至102中每一个的引物之间的引物对进行PCR。通过以下进行PCR：在94℃初始变性5分钟；由以下组成的20个循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃聚合1分钟；以及在72℃最终聚合5分钟。结果，获得18种1kbp多核苷酸。
使用从上述结果获得的两个片段作为模板进行重叠PCR，由此获得18种待用作模板的2kbp多核苷酸。将获得的基因片段用限制性内切酶XbaI消化，与已经用限制性内切酶XbaI消化的线性化pDZ载体连接，转化到E.coli DH5α中，并将转化子涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的固体LB培养基上。
下表12中显示了关于用于制备载体的引物的序列信息。
[表12]
在通过PCR选择用其中插入了目标基因的载体转化的菌落后，使用常规已知的质粒提取方法获得质粒。关于所得质粒的信息在下表13中示出。
[表13]
编号 质粒
1 pDZ-impE2 64R
2 pDZ-impE2 64H
3 pDZ-impE2 64D
4 pDZ-impE2 64K
5 pDZ-impE2 64S
6 pDZ-impE2 64T
7 pDZ-impE2 64N
8 pDZ-impE2 64Q
9 pDZ-impE2 64C
10 pDZ-impE2 64P
11 pDZ-impE2 64A
12 pDZ-impE2 64V
13 pDZ-impE2 64I
14 pDZ-impE2 64L
15 pDZ-impE2 64M
16 pDZ-impE2 64F
17 pDZ-impE2 64Y
18 pDZ-impE2 64W
实施例5-2：制备其中修饰产物(ImpE1，ImpE2)位置处的氨基酸被另一氨基酸置换的菌株以及比较产生IMP的能力
将实施例5-1中制备的54种质粒转化到CJI0323菌株中。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入染色体中的菌株。使所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQ ID NO：15和16的引物对进行PCR、然后进行核苷酸测序分析来确认在最终转化的菌株中引入了修饰。根据插入的修饰的菌株名称显示在下表14中。
[表14]
以与实施例1中相同的方式进行培养并分析其产生的IMP的浓度(表15)。
[表15]具有组合引入impE1、impE2修饰(g/L)的菌株中IMP产生浓度
如上所示，与每个对照菌株相比，所有的经修饰菌株均表现出产生IMP的能力增加，并且因此确认了三个修饰位置均是对ImpE蛋白对IMP输出能力增加具有重要影响的重要位点。特别地，在其中第64位氨基酸(即甘氨酸)被另一氨基酸(即天冬氨酸)置换的情况下，与其中在第64位氨基酸中没有修饰的CJI0323_impE1(E164K)_impE2(V2I)菌株相比，输出IMP的能力增加了172％。另外，已经确认，在其中第64位氨基酸(即甘氨酸)被另一氨基酸(即天冬氨酸)置换的情况下，与作为恢复至野生型菌株的CJI0323_impE1E2(WT)菌株相比，产生IMP的能力提高了397％，并且与CJI0323菌株相比提高了20％。
实施例6：基于IMP产生菌株引入impE1、impE2修饰
实施例6-1：基于IMP产生菌株制备具有impE1、impE2修饰的菌株
为了确认引入impE1和impE2修饰的效果，制备了产生IMP的菌株，其中对应于ATCC6872菌株中IMP降解途径的腺苷酸琥珀酸合成酶和IMP脱氢酶的活性减弱。通过将编码两种酶的两个基因purA和guaB的每个核苷酸序列中的第一个碱基从‘a’变为‘t’来改变起始密码子。将ATCC6872菌株中两个基因的表达被减弱的菌株命名为CJI9088。通过电穿孔将实施例4-2中制备的pDZ-impE1(E164K)、pDZ-impE2(V2I)和pDZ-impE2(G64E)载体转化到CJI9088菌株中，并通过电穿孔将实施例5-1中制备的pDZ-impE2(G64D)转化到CJI9088_impE1(E164K)_impE2(V2I)菌株中。在含有卡那霉素(25mg/L)的培养基上选择其中载体通过重组同源序列插入染色体中的菌株。对所选择的初级菌株进行第二次交换。通过使用SEQID NO：15和16的引物对进行PCR、然后进行核苷酸测序分析来确认在最终转化的菌株中引入了修饰。
评价了所制备的菌株(即，CJI9088，CJI9088_impE1(E164K)、CJI9088_impE2(V2I)、CJI9088_impE2(G64E)、和CJI9088_impE1(E164K)_impE2(V2I)(G64D))产生IMP的能力。在培养完成后，通过HPLC测量IMP的产生量，并将结果显示在下表16中。
[表16]
菌株 IMP(g/L)
CJI9088 0.52
CJI9088_impE1(E164K) 0.84
CJI9088_impE2(V2I) 0.93
CJI9088_impE2(G64E) 1.73
CJI9088_impE1(E164K)_impE2(V2I)(G64D) 4.30
在确认培养基中累积的IMP量后，已经确认，与亲本菌株CJ9088相比，这些菌株显示出IMP产生增加至少61％，以及最大增加727％。因此，由于本公开内容的ImpE蛋白质的修饰所引起的IMP产生量的增加可以被解释为非常有意义。
根据前述内容，本公开所属领域的普通技术人员将能够理解，在不修改本公开内容的技术构思或基本特征的情况下，可以以其他具体形式来实施本公开内容。就这点而言，本文公开的示例性实施方案仅用于说明目的，而不应被解释为限制本公开内容的范围。相反，本公开内容旨在不仅覆盖示例性实施方案，而且还覆盖可包括在由所附权利要求限定的本公开内容的精神和范围内的各种替代、修改、等价物和其他实施方案。

Claims (8)

1.一种具有输出5’-肌苷酸的活性的蛋白质变体，其中选自以下的至少一个氨基酸被另一个氨基酸置换：SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第164位氨基酸、SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第2位氨基酸和SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第64位氨基酸。
2.根据权利要求1所述的蛋白质变体，其中所述蛋白质变体是：其中SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第164位氨基酸被选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、苏氨酸和脯氨酸的氨基酸置换的蛋白质变体；或其中SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第2位氨基酸被选自异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、组氨酸和天冬酰胺的氨基酸置换的蛋白质变体；或其中SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的第64位氨基酸被选自天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的氨基酸置换的蛋白质变体；或其组合。
3.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1和2中任一项所述的蛋白质变体。
4.一种载体，其包含根据权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种产生5’-肌苷酸的棒状杆菌属的微生物，其包含权利要求1所述的蛋白质变体或权利要求4所述的载体。
6.根据权利要求5所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是停滞棒杆菌。
7.一种制备5’-肌苷酸的方法，其包括：
在培养基中培养权利要求5所述的棒状杆菌属的微生物；和
从培养的微生物或培养基中回收5’-肌苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述棒状杆菌属的微生物是停滞棒杆菌。
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