CN116648504A - 生产腐胺的微生物和利用其生产腐胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产腐胺的微生物和利用其生产腐胺的方法。

Description

生产腐胺的微生物和利用其生产腐胺的方法
技术领域
本发明涉及生产腐胺的微生物和利用其生产腐胺的方法。
背景技术
腐胺，其是尼龙的原料，主要是通过使用石油化合物作为原料的化学方法生产的。具体来说，腐胺是通过将氰化氢加入丙烯腈中制备琥珀腈，然后再进行氢化反应生产的。这样的化学方法具有效率和经济上的可行性，但其缺点是对环境不友好。因此，由于环境法规的加强和上述原因，需要通过基于生物的途径生产替代物质。
与此相关，公开了通过转化大肠杆菌和棒状杆菌属的微生物生产高浓度腐胺的方法(Morris等人，J Biol.Chem.241:13,3129-3135,1996；WO 06/005603；WO 09/125924；Qian ZD等人,Biotechnol.Bioeng.104:4,651-662,2009；Schneider等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.88:4,859-868,2010；以及Schneider等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:17-30,2011)。此外，利用微生物生产腐胺的多种方法是已知的(US 13/992242,US 14/372000,US 14/373265,EP 2236613B1,和US 8497098 B2)。
在与腐胺生物合成途径相关的蛋白质中，argJ，即双功能鸟氨酸乙酰转移酶/N-乙酰谷氨酸合成酶，是可以进行两种物质乙酰CoA和N-乙酰鸟氨酸的转换反应的酶，并具有鸟氨酸乙酰转移酶(L-谷氨酸N-乙酰转移酶)和N-乙酰谷氨酸合成酶二者的功能，同时具有鸟氨酸乙酰转移酶和N-乙酰谷氨酸合成酶的功能。酶argJ可以减少副产品，和减轻腐胺生产的负担，因为一个酶可以对两个酶反应起媒介作用。然而，argJ的活性可能被中间代谢物例如鸟氨酸抑制(Sakanyan V,Petrosyan P,Lecocq M,Boyen A,Legrain C,Demarez M,Hallet J,GlansdorffN:Genes and enzymes of the acetyl cycle of argininebiosynthesis in Corynebacterium glutamicum:enzyme evolution in the earlysteps of the arginine pathway.Microbiology 1996,142:99-108)，导致腐胺的生物合成效率降低。
存在于谷氨酸棒状杆菌中的N-乙酰转移酶在存在乙酰CoA和谷氨酸的情况下具有生产N-乙酰-L-谷氨酸的能力。然而，据报道，该N-乙酰转移酶的特异性活性至少比argJ高9.43倍(A new type of N-acetylglutamate synthase is involved in the first stepof arginine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum."BMC genomics 2013(14)p 713)。
发明内容
[技术问题]
本发明人为提高微生物中腐胺的生产进行了深入的研究，结果证实，将来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的活性引入棒状杆菌属的微生物中导致了腐胺产量增加，从而完成了本公开内容。
[技术方案]
根据本公开内容的一个方面，提供了具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，在其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
根据本公开内容的另一个方面，提供了生产腐胺的方法，方法包括在培养基中培养具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，在其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
根据本公开内容的另仍一个方面，提供了用于生产腐胺的组合物，组合物含有具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，在其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
[优势效果]
本公开内容的具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物与现有的非改良的微生物相比，可以被培养以高产量生产腐胺，在该棒状杆菌属的微生物中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
附图说明
图1示意性地显示了在棒状杆菌属的微生物中腐胺和鸟氨酸生物合成途径(A)和在大肠杆菌中腐胺和鸟氨酸生物合成途径(B)。
图2示意性地显示了通过Coryne Ncgl2644的增强和大肠杆菌argE的引入具有提高的腐胺和鸟氨酸生产能力的棒状杆菌属的微生物中腐胺和鸟氨酸生物合成途径。
具体实施方式
本公开内容将具体描述如下。本公开内容中的每个描述和实施方式也可适用于其他描述和实施方式。也就是说，本公开内容中多种元件的所有组合都落入本公开内容的范围内。此外，本公开内容的范围不受以下具体描述的限制。
根据本公开内容的一个方面，提供了具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，在其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
如本文所用，术语“腐胺”是指由四个碳原子组成的二胺类有机化合物，其分子式为NH2(CH2)4NH2，也称为1,4-二氨基丁烷或丁二胺。
如本文所用，术语“N-乙酰转移酶”是指催化乙酰基团从乙酰-CoA向芳基胺、芳基羟胺和芳基肼转移的酶(EC 2.3.1.5)。该酶可以在没有CoA的情况下催化芳基胺之间的乙酰转移，并可以在存在乙酰CoA和谷氨酸的情况下具有生产N-乙酰-L-谷氨酸的能力。已知该酶对芳香胺具有广泛的特异性。
在本公开内容中，N-乙酰转移酶可属于GCN5相关的N-乙酰转移酶(GNAT)家族，但不限于此。
N-乙酰转移酶可以具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成、或包含SEQ ID NO:1中叙述的氨基酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:1的序列可以在已知的数据库NCBI GenBank中确认。
具体来说，N-乙酰转移酶可以具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或以上的同源性或同一性的氨基酸序列。同样明显的是，只要氨基酸序列具有这样的同源性或同一性并表现出对应于N-乙酰转移酶的功能，即使是具有在其部分进行了缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的N-乙酰转移酶也可以落入本公开内容的范围。也就是说，尽管在本公开内容中被描述为“含有如在具体序列号中叙述的氨基酸序列的蛋白质或多肽”或“由在具体序列号中叙述的氨基酸序列组成的蛋白质或多肽”，但只要该蛋白质具有与由相应序列号的氨基酸序列组成的多肽相同或相应的活性，任何在其部分进行缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列组成的蛋白质也可以在本公开内容中使用。例如，很明显，任何具有与“含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽”相同或相应活性的多肽都可以属于“含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽”。
在本公开内容中，编码N-乙酰转移酶的基因可以来源于于棒状杆菌属的菌株，并且可以具体来源于于谷氨酸棒状杆菌，但是不具体限制可以表达编码N-乙酰转移酶的基因的任何棒状杆菌属菌株。基因可包含编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列，并且更具体来说，可包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:2的核苷酸序列可以从已知的数据库GenBank中获得，并命名为Ncgl2644。含有SEQ ID NO:2核苷酸序列的基因可与含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的多核苷酸、具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的基因或多核苷酸、或由SEQ ID NO:2的核苷酸序列组成的基因或多核苷酸互换使用。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指通过核苷酸单体的共价键纵向延伸的核苷酸链聚合物，一般是指具有一定长度的DNA或RNA链，更具体来说，可以指编码变体的多核苷酸片段。当多核苷酸是能够执行功能的多核苷酸的集合体时，多核苷酸可以被描述为基因。在本公开内容中，多核苷酸和基因可以互换使用。
具体来说，由于密码子简并或考虑到其中允许多肽表达的微生物所偏好的密码子，本公开内容的多核苷酸可在其编码区在多肽的氨基酸序列不发生变化的范围内进行多种修饰。具体来说，可以不受限制地包括编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的N-乙酰转移酶的任何多核苷酸序列。
此外，可以从已知的基因序列制备的任何探针，例如，在严格条件下能与部分或全部核苷酸序列的互补序列杂交以编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的N-乙酰转移酶的任何序列，可以不受限制地包括在内。术语“严格条件”是指能够使多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这种条件在本领域是众所周知的。例如，这些条件可以包括具有高同源性或同一性的基因，例如具有至少40％，具体是至少90％，更具体是至少95％，仍更具体是至少97％，仍更具体是至少99％的同源性或同一性的基因彼此杂交，但具有较低同源性或同一性的基因不彼此杂交的条件；或典型的南方杂交(southern hybridization)的洗涤条件，即，在盐浓度和相当于60℃的温度、1×SSC和0.1％SDS，具体是60℃、0.1×SSC和0.1％SDS，更具体是68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的条件下进行一次，具体地两次或三次洗涤的条件。
杂交要求两个核酸具有互补的序列，尽管根据杂交的严格程度，核苷酸之间可能存在错配。术语“互补”是用来描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶是互补的，而胞嘧啶与鸟嘌呤是互补的。因此，本公开内容不仅可以包括基本上相似的核酸序列，还可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段。
具体来说，具有同源性或同一性的多核苷酸可使用上述杂交条件进行检测，包括在Tm值为55℃的杂交步骤。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，本领域的技术人员可以根据目的适当调整。
多核苷酸杂交的适当严格程度可能取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且其参数在本领域是众所周知的(见Sambrook等人，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相似程度，并且可以用百分比表示。术语同源性和同一性常常可以互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可由标准的比对算法确定，并可同时使用由要使用的程序建立的默认空白罚分。实质上，同源或同一序列一般可在适度或高度严格的条件下彼此全部或部分地杂交。显然，杂交还包括与含有通常密码子或考虑到多核苷酸中密码子简并的密码子的多核苷酸进行杂交。
两个多核苷酸或多肽序列之间的序列同源性、相似性或同一性可以使用本领域已知的任何计算机算法例如“FASTA”程序，使用Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444公开的默认参数来确定。另外，同源性、相似性或同一性可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定，该算法在欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS)的Needleman程序中实施(Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0或更高版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994,和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J AppliedMath 48:1073)。例如，可以使用国家生物技术信息中心数据库的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。
多核苷酸或多肽之间的同源性、相似性或同一性可以通过使用GAP计算机程序通过比较序列信息来确定，例如，Needleman等人，(1970)，J Mol Biol.48:443，例如在Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中已知的。简而言之，GAP程序将相似性定义为相似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数量，除以两个序列中较短者的符号总数。GAP程序的默认参数可以包括：(1)二元比较矩阵(包含值1代表同一性，值0代表非同一性)和Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，例如在Schwartz和Dayhoff编,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical ResearchFoundation，pp.353-358(1979)所公开的(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵)；(2)对每个空白的罚分为3.0，对每个空白中的每个符号额外罚分0.10(或空白开放罚分为10，和空白延伸罚分为0.5)；以及(3)对末端空白不罚分。
在本公开内容的实施方式中，本公开内容的变体可具有八氢番茄红素去饱和酶的活性。此外，与具有八氢番茄红素去饱和酶活性的野生型多肽相比，本公开内容的变体可具有增加5'-肌苷一磷酸(IMP)生产能力的活性。
如本文所用，术语“八氢番茄红素去饱和酶”是这样的多肽，它在称为多反式途径的生化途径中将无色的15-顺式八氢番茄红素转换为鲜红色的番茄红素。具体来说，本公开内容的八氢番茄红素去饱和酶可与八氢番茄红素去饱和酶或CrtI互换使用。在本公开内容中，八氢番茄红素去饱和酶的序列可以从已知的数据库NCBI GenBank中获得。具体来说，八氢番茄红素去饱和酶可以是具有crtI编码的八氢番茄红素去饱和酶的多肽，但不限于此。
如本文所用，术语“乙酰鸟氨酸脱乙酰酶”是指通过介导乙酰鸟氨酸的水解来介导生产乙酸和鸟氨酸所涉及的反应的酶(EC 3.5.1.16)。在本公开内容中，乙酰鸟氨酸脱乙酰酶可以是argE，但不限于此。
argE可以具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列、由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成、或含有SEQ ID NO:3中叙述的氨基酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:3的序列可以在已知数据库NCBI GenBank中确认。
在本公开内容中，编码argE的基因可以来源于细菌，并且具体来说，可以来源于大肠杆菌，但任何可以表达编码argE的基因的菌株都不受具体限制。基因可包含编码SEQ IDNO:3的氨基酸序列的核苷酸序列，更具体地，可包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:4的核苷酸序列可以从已知的数据库GenBank中获得。
在本公开内容中，具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物可以具有来源于棒状杆菌属的菌株的双功能鸟氨酸乙酰转移酶/N-乙酰谷氨酸合成酶(argJ)的弱化活性，但不限于此。
如本文所用，术语“双功能鸟氨酸乙酰转移酶/N-乙酰谷氨酸合成酶”是指能进行乙酰-CoA和N-乙酰鸟氨酸两种物质的转换反应的酶，并且该酶具有鸟氨酸乙酰转移酶(L-谷氨酸N-乙酰转移酶(EC 2.3.1.35))和N-乙酰谷氨酸合成酶(EC2.3.1.1)二者的功能。鸟氨酸乙酰转移酶将N2-乙酰-L-鸟氨酸和L-谷氨酸转化为L-鸟氨酸，而N-乙酰谷氨酸合成酶催化从谷氨酸和乙酰CoA生产N-乙酰谷氨酸。在本公开内容中，双功能鸟氨酸乙酰转移酶/N-乙酰谷氨酸合成酶可以是argJ，但不限于此。
ArgJ可以减少副产品，并减轻腐胺生产的负担，因为一个酶在两个酶促反应中起媒介作用。然而，argJ的活性可被代谢中间产物例如鸟氨酸抑制，导致腐胺的生物合成效率降低。
ArgJ可以具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列、由SEQ ID NO:5或SEQID NO:7的氨基酸序列组成、或含有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中叙述的氨基酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的序列可以在已知数据库NCBI GenBank中确认。
在本公开内容中，编码argJ的基因可以来源于棒状杆菌属的菌株，具体来说，可以来源于谷氨酸棒状杆菌，但可以表达编码argJ的基因的棒状杆菌属的任何菌株并不具体限制。具体来说，编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的基因可以来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869，但不限于此。基因可包含编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的核苷酸序列，更具体地，可包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:6的核苷酸序列可以从已知的数据库GenBank中获得。
此外，编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的基因可以来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，但不限于此。基因可包含编码SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核苷酸序列，更具体地，可包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，但不限于此。SEQ ID NO:8的核苷酸序列可以从已知的数据库GenBank中获得。
如本文所用，术语“具有生产腐胺能力的微生物”是指天然具有生产腐胺能力的微生物或通过将生产腐胺能力赋予没有生产腐胺能力的亲本菌株而获得的微生物。具体来说，微生物是生产腐胺的微生物，在其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的argE的活性，但不限于此。
具体来说，“生产腐胺的微生物”包括所有的野生型微生物或天然或人工转基因的微生物。更具体地，生产腐胺的微生物可以是其中由于插入外源基因或增强或弱化固有基因的活性而使具体机制弱化或增强的微生物，其中微生物可以具有基因突变或增强的腐胺生产活性以生产目标腐胺。
具体来说，术语“引入”活性是指微生物原本不具备的基因在该微生物中表达，并因此微生物表现出具体蛋白的活性，或表现出与固有活性或修饰前的活性相比，相应蛋白的活性增加或增强。例如，该术语可表示将编码具体蛋白的多核苷酸引入微生物的染色体中，或将含有编码具体蛋白的多核苷酸的载体引入微生物中，从而表现出具体蛋白的活性。
如本文所用，术语多肽活性的活性“增强”是指多肽的活性与固有活性相比增加。增强可与术语例如活化、上调、过表达和增加互换使用。具体地，活化、增强、上调、过表达和增加可包括表现出原来不具备的活性或表现出与固有活性或修饰前的活性相比提高的活性二者。“固有活性”是指性状改变前的亲本菌株或非修饰的微生物因自然或人为因素造成的遗传变异而改变性状时，原本拥有的具体多肽的活性。该术语可与“修饰前的活性”互换使用。与固有活性相比，多肽的活性被“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”的事实是指与性状改变前的亲本菌株或非修饰的微生物原本拥有的具体多肽的活性和/或浓度(表达水平)相比，多肽的活性得到了提高。
增强可通过引入外源性多肽或增强内源性多肽的活性和/或浓度(表达水平)来实现。多肽活性的增强可以通过相应多肽的活性程度或表达水平的增加，或由相应多肽生产的产物的数量的增加来检查。
为了增强多肽的活性，可以采用本领域内众所周知的多种方法，只要与修饰前的微生物相比，目标多肽的活性可以增强，方法就不受限制。具体来说，可以采用本领域技术人员众所周知的遗传工程和/或蛋白质工程，这些都是分子生物学的常规方法，但该方法不限于此(例如，Sitnicka等人,Functional Analysis of Genes.Advances in CellBiology.2010,Vol.2.1-16；Sambrook等人,Molecular Cloning 2012；等等)。
具体来说，本公开内容的多肽的增强可以指：
1)编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数增加；
2)用具有强活性的序列替换染色体上编码多肽的基因表达控制区；
3)修饰编码多肽的基因转录本的起始密码子或5'-UTR区域的核苷酸序列；
4)修饰多肽的氨基酸序列以增强多肽的活性；
5)修饰编码多肽的多核苷酸序列以增强多肽的活性(例如，修饰多肽基因的多核苷酸序列以编码修饰后的多肽以增强多肽的活性)；
6)引入表现多肽活性的外源性多肽或编码多肽的外源性多核苷酸；
7)对编码多肽的多核苷酸进行密码子优化；
8)对通过分析多肽的三级结构而选择的暴露区域进行修饰或化学修饰；或
9)选自第1)至第8)项的两个或更多的组合，但不具体限于此。
更具体地，上述项目的描述如下。
上述第1)项中编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数的增加可以通过将载体引入宿主细胞中来实现，该载体与编码相应多肽的多核苷酸可操作地连接，并且可以独立于宿主进行复制和功能。可选地，也可以通过将编码相应多肽的多核苷酸的一个或多个拷贝引入宿主细胞的染色体来实现增加。引入染色体可通过将能够将多核苷酸插入宿主细胞中的染色体的载体引入宿主细胞来进行，但不限于此。该载体如上所述。
第2)项中用具有强活性的序列替换染色体上编码多肽的基因表达控制区可以是，例如，通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在序列上发生修饰，或用具有更强活性的序列替换，以便进一步增强表达控制区的活性。表达控制区可以包括但不具体限于启动子、操作子序列、编码核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译终止的序列等等。例如，替换可以是用强启动子替换原启动子，但不限于此。
已知的强启动子的例子可包括CJ1至CJ7启动子(US 7662943 B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(US 10584338 B2)、O2启动子(US 10273491 B2)、tkt启动子、yccA启动子等，但不限于此。
对第3)项中编码多肽的基因转录本的起始密码子或5'-UTR区域的核苷酸序列的修饰可以是，例如，用编码多肽表达率更高的另一个起始密码子而不是内源性起始密码子的核苷酸序列取代，但不限于此。
第4)和5)项中的氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是在多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列中通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合对序列发生修饰，或用修饰后具有更强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列，或用修改后具有增加活性的氨基酸序列或多核苷酸序列替换，以增强多肽的活性，但不限于此。具体来说，可以通过同源重组将多核苷酸插入染色体来进行替换，但不限于此。所用的载体可进一步包括用于检查染色体插入的选择标记。该选择标记如上所述。
第6)项中引入表现出多肽活性的外源性多肽可以是将编码表现出与该多肽相同/相似活性的多肽的外源性多核苷酸引入宿主细胞。外源性多核苷酸不限于其来源或序列，只要外源性多核苷酸表现出与多核苷酸相同/相似的活性。引入可以通过本领域技术人员适当选择的任何已知的转化方法进行，引入的多核苷酸在宿主细胞中表达，从而生产多肽，并且其活性可以增强。
第7)项中编码多肽的多核苷酸的密码子优化可以是内源性多核苷酸的密码子优化，以便在宿主细胞中增加其转录或翻译，或外源性多核苷酸的密码子优化，以便在宿主细胞中进行优化地转录或翻译。
第8)项中通过分析多肽的三级结构而选择的暴露区域的修饰或化学修饰可以是，例如，将待分析的多肽的序列信息与存储已知蛋白质的序列信息的数据库进行比较，以根据序列的相似性确定模板蛋白候选者，并在确定的候选者的基础上确定结构，来对待修饰或化学修饰的暴露区域进行修饰或化学修饰。
多肽活性的这种增强可以指相应多肽的活性或浓度或表达水平相对于在野生型微生物菌株或修饰前的微生物菌株中表达的多肽的活性或浓度增加，或者指由相应多肽生产的产品的数量增加，但不限于此。
本公开内容的微生物中部分或全部多核苷酸的修饰可通过以下方式诱导：(a)使用载体在微生物中进行染色体插入的同源重组或使用工程化的核酸酶(例如CRISPR-Cas9)进行基因组编辑和/或(b)用光，例如紫外线和辐射，和/或化学品处理，但不限于此。修饰部分或全部的基因的方法可以包括通过DNA重组技术的方法。例如，通过将含有与目标基因同源的核苷酸序列的核苷酸序列或载体引入微生物，以引起同源重组，可以删除部分或全部的基因。引入的核苷酸序列或载体可以包含显性选择标记，但不限于此。
蛋白质活性的这种增强可以指与野生型微生物菌株或修饰前的微生物菌株中表达的蛋白质的活性或浓度相比，相应蛋白质的活性或浓度增加，但不限于此。如本文所用，术语“修饰前的菌株”或“修饰前的微生物”不排除含有可能在微生物中自然发生的突变的菌株，并且是指原生菌株本身或由于人工因素造成的基因突变而改变性状之前的菌株。在本公开内容中，性状改变可以是引入来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的argE的活性。“修饰前的菌株”或“修饰前的微生物”可与“非突变菌株”、“非修饰菌株”、“非突变微生物”、“非修饰的微生物”或“参考微生物”互换使用。
在本公开内容中，只要参考微生物生产腐胺，参考微生物就没有具体限制，与野生型微生物相比，具有增强的生产腐胺能力的变异菌株也包括在内，而没有限制。其实例可包括野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、野生型菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13869，或在其中将一种或多种遗传修饰添加到上述菌株中以便增强腐胺生物合成途径的菌株，但不限于此。
例如，一个或多个遗传修饰可以是选自以下的任何一个或多个遗传修饰：增强腐胺生物合成途径中的基因；过表达腐胺操作子的活性；提高腐胺的前体的供应和效率；提高腐胺的输出；以及弱化竞争途径中的基因、腐胺操作子定向途径中的调节子或腐胺输入体基因(importer gene)以及腐胺输入(importer)和裂解基因的活性，但不限于此。
增强腐胺生物合成途径中的基因的遗传修饰可以是，例如，将来源于野生型大肠杆菌W3110的编码鸟氨酸脱羧酶(ODC)的基因(speC)引入染色体，但不限于此。
过表达腐胺操作子的活性的遗传修饰可以是，例如，取代编码从谷氨酸合成鸟氨酸涉及的酶的argCJBD基因簇的启动子，但不限于此。
提高腐胺的输出并弱化竞争途径中的基因、腐胺操作子定向途径中的调节子或腐胺输入体基因以及腐胺输入和裂解基因的活性的遗传修饰可以是，例如，缺失染色体中编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶的基因(argF)和编码涉及腐胺输出的谷氨酸输出体的基因(NCgl1221)；或定义为组蛋白乙酰转移酶HPA2和相关乙酰转移酶的NCgl1469蛋白的活性失活，但不限于此。
具有一种或多种遗传修饰的菌株可以是，例如，具有生产腐胺的能力的CC01-0064菌株，其中：在ATCC13032中，缺失了编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶的基因(argF)和编码染色体中涉及谷氨酸输出的谷氨酸输出体的基因(NCgl1221)；将来源于野生型大肠杆菌W3110的编码鸟氨酸脱羧酶(ODC)的基因(speC)引入到染色体中；和编码涉及从谷氨酸合成鸟氨酸的酶的argCJBD基因簇的启动子被取代(KCCM11138P，韩国专利公开号2012-0064046)或CC01-0063菌株，其中定义为组蛋白乙酰转移酶HPA2和相关乙酰转移酶的NCgl1469蛋白的活性在CC01-0064菌株中失活(KCCM11240P，韩国专利公开号10-2013-0082478)，但不限于此。
可选地，生产腐胺的微生物可以具有来源于棒状杆菌属的菌株的argJ的弱化活性，但不限于此。
如本文所用，术语蛋白质的“弱化”具有包括与固有活性相比，所有的活性降低或没有活性的概念。弱化可与失活、不足、下调、减少、降低、衰减等等可交换使用。
弱化也可以包括：由于编码多肽的多核苷酸的突变等等，多肽本身的活性与原微生物所拥有的多肽的活性相比降低或消除的情况；由于编码多肽的多核苷酸基因的表达受到抑制或翻译成多肽受到抑制，细胞中多肽的全部活性和/或浓度(表达水平)与原生菌株相比较低的情况；未达到多核苷酸的表达的情况；和/或尽管有多核苷酸的表达，但多肽无活性的情况。“固有活性”是指当自然或人为因素引起的基因突变导致性状改变时，修饰前的亲本菌株或野生型或未修饰的微生物原本拥有的具体多肽的活性。该术语可与“修饰前的活性”互换使用。与其固有活性相比，多肽的活性的“失活、不足、减少、下调、降低或衰减”是指与转化前的亲本菌株或非修饰的微生物原本拥有的具体多肽的活性相比，多肽的活性降低。
多肽活性的弱化可以通过本领域已知的任何方法进行，但不限于此，可以通过应用本领域众所周知的多种方法来实现(例如，Nakashima N等人,Bacterial cellularengineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2):2773-2793；和Sambrook等人,Molecular Cloning 2012，等等)。
在本公开内容中，待作为弱化目标的蛋白质，即目标蛋白，可以是argJ，但不限于此。
1)缺失编码多肽的基因的部分或全部；
2)修饰表达控制区(或表达控制序列)，以降低编码多肽的基因的表达；
3)修饰构成多肽的氨基酸序列(如氨基酸序列中至少一个氨基酸的缺失/取代/添加)，以消除或弱化多肽的活性；
4)修饰编码多核苷酸的基因序列，以消除或弱化多肽的活性(例如，在多肽基因的核酸核苷酸序列中至少一个核酸核苷酸的缺失/取代/添加，以便编码修饰后的多肽，以消除或弱化多肽的活性)；
5)修饰编码多肽的基因转录本的起始密码子或5'-UTR区域的核苷酸序列；
6)引入与编码多肽的基因转录本互补结合的反义寡核苷酸(例如反义RNA)；
7)在编码多肽的基因的Shine-Dalgarno序列之前添加与Shine-Dalgarno序列互补的序列，以便形成使核糖体无法附着的二级结构；
8)在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3’端添加要进行逆转录的启动子(逆转录工程化，RTE)；或
9)选自第1)至第8)项的两种或更多的组合，但不对其具体限制。
例如，如下描述这些。
第1)项中编码多肽的基因的部分或全部的删除可以是消除染色体中编码内源性目标蛋白的多核苷酸的全部，用缺失一些核苷酸的多核苷酸替换，或用标记基因替换。
第2)项中对表达控制区(或表达控制序列)的修饰可以是通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在表达控制区(或表达控制序列)上发生突变，或用具有较弱活性的序列替换。表达控制区包括启动子、操作子序列、编码核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列，但不限于此。
第5)项中编码多肽的基因转录本的起始密码子或3'-UTR区域的核苷酸序列的修饰可以是，例如，用编码另一个具有较高的多肽表达率的起始密码子而不是内源性起始密码子的核苷酸序列取代，但不限于此。
第4)和5)项中的氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是在多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列中通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在序列上发生修饰，或用修饰为活性较弱的氨基酸序列或多核苷酸序列或用修饰为活性小的氨基酸序列或多核苷酸序列替换，以弱化多肽的活性，但不限于此。例如，可以通过将突变引入多核苷酸序列以形成终止密码子来抑制或弱化基因的表达。
第6)项中引入与编码多肽的基因转录本互补结合的反义寡核苷酸(如反义RNA)，例如可以参考文献[Weintraub，H.等人,Antisense-RNAas a molecular tool forgenetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986]。
在Shine-Dalgarno序列之前添加与编码多肽的基因的Shine-Dalgarno序列互补的序列，以便形成二级结构，使第7)项中的核糖体无法附着，这可能是使mRNA翻译无法进行或降低其翻译率。
第8)项中在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3’端添加要逆转录的启动子(逆转录工程化，RTE)可能是使反义核苷酸与编码多肽的基因转录本互补，从而弱化多肽的活性。
生产腐胺的微生物可以是任何能够通过由上述方法引入来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的argE的活性来生产腐胺的微生物。为了本公开内容的目的，生产腐胺的微生物是具有增加的生产目标腐胺的能力的微生物，其中通过上述方法引入来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的argE的活性，并且来源于棒状杆菌属的菌株的argJ的活性被弱化，和微生物可以是基因修饰的微生物或重组微生物，但不限于此。在本公开内容中，“生产腐胺的微生物”可与“产生腐胺的微生物”或“具有生产腐胺能力的微生物”互换使用。
微生物的实例可包括属于棒状杆菌属、埃希氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗维登斯菌属和短杆菌属的微生物，具体来说，可以是棒状杆菌属的微生物。
更具体地，棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌、克氏棒状杆菌(corynebacterium crudilactis)、沙漠棒杆菌(corynebacterium deserti)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、奇棒状杆菌(Corynebacterium singular)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、污染棒状杆菌(Corynebacteriumpollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Cxorynebacterium imitans)、睾丸棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)、微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)，并且可以是谷氨酸棒状杆菌，以及属于棒状杆菌属的任何微生物可以不受限制地包括在内。
根据本公开内容的另一个方面，提供了生产腐胺的方法，方法包括在培养基中培养具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，将来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性引入其中。N-乙酰转移酶、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶、腐胺和微生物如上所述。
棒状杆菌属的微生物可能具有来源于棒状杆菌属的菌株的双功能鸟氨酸乙酰转移酶/N-乙酰谷氨酸合成酶(argJ)的弱化的活性，但不限于此。
方法可由本领域技术人员在本领域已知的优化培养条件和酶活性条件下轻松确定。具体来说，培养微生物的步骤没有具体限制，但步骤可以通过已知的分批培养方法、连续培养方法、补料分批培养方法等等进行。培养的条件可以没有具体限制，但是可以使用碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(如磷酸或硫酸)来获得调整到适当的pH值(如pH 5至pH 9，具体为pH 6至pH 8，和最具体为pH 6.8)，并且可以通过向培养物引入氧气或含氧气体混合物来维持好氧状态。培养的温度可维持在20至45℃，具体是25至40℃，和培养可进行约10至160小时，但不限于此。通过培养生产的腐胺可以释放到培养基中，也可以留在细胞中。
此外，在被使用的用于培养的培养基中，作为碳源，可单独或组合使用糖和碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇类(例如甘油和乙醇)、有机酸(例如乙酸)等等，但碳源不限于此。作为氮源，可单独或组合使用含氮的有机化合物(例如蛋白胨、酵母提取物、肉类提取物、麦芽提取物、玉米蒸馏液、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等等，但氮源不限于此。作为磷源，可单独或以混合物使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、与其对应的含钠盐等等，但磷源不限于此。此外，培养基还可以包含其他金属盐(如硫酸镁或硫酸铁)和促进生长的必需物质，例如氨基酸和维生素。
方法可进一步包括在培养步骤后从培养的培养基或微生物中回收腐胺，但不限于此。
至于回收培养步骤中生产的腐胺的方法，可以根据培养方法，使用本领域已知的适当方法从培养物中回收目标腐胺。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱法、结晶、HPLC等等，并且可以通过使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中回收目标腐胺。
回收腐胺的方法可进一步包括纯化步骤。纯化步骤可通过使用本领域已知的适当方法进行。因此，回收腐胺可以具有纯化的形式，或可以是含有腐胺的微生物发酵液。
根据本公开内容的另一个方面，提供了用于生产腐胺的组合物，组合物含有具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，在其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
N-乙酰转移酶、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶、腐胺和微生物如上所述。
棒状杆菌属的微生物可以具有来源于棒状杆菌属的菌株的双功能鸟氨酸乙酰转移酶/N-乙酰谷氨酸合成酶(argJ)的弱化活性，但不限于此。
用于生产腐胺的组合物可以包括但不限于能够引入来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性的成分(element)。具体来说，成分可以是包含在载体中的形式，以便表达与其中引入该成分的宿主细胞可操作地连接的基因，并且该形式如上所述。
来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，这在上文中已描述。
来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶可包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与其具有至少为90％序列同一性的氨基酸序列，这在上文中已描述。
本公开内容的组合物可进一步包含通常用于生产氨基酸的组合物的任何适当的赋形剂，赋形剂的实例可以是防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。
根据本公开内容的另一个方面，提供了组合物用于生产腐胺的用途。
根据本公开的另一个方面，提供了具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物用于生产腐胺的用途，其中来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性被引入微生物中。
实施例
下面，将参照示例性实施方式详细描述本公开的内容。然而，对于本领域的技术人员显而易见的是，提供这些示例性实施方式只是为了说明目的，而不是为了限制本公开内容的范围。
实施例1：Coryne来源的argJ基因增强的菌株的生产腐胺能力
1-1.制备具有在基于ATCC13032的产腐胺菌株的转座子基因中增强的ATCC13869 来源的argJ的菌株
为了在基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的产腐胺菌株中增强编码双功能鸟氨酸乙酰转移酶/N-乙酰谷氨酸合成酶的argJ基因，将argJ基因引入菌株的转座子基因。
作为能够通过使用棒状杆菌属微生物的转座子基因区域将基因引入染色体的转化载体，使用了pDZTn(WO 2009/125992)。此外并且作为启动子，使用了通过修饰来源于谷氨酸棒状杆菌的lysC-asd操作子基因的启动子获得的lysCP1启动子(WO 2009/096689，SEQID NO:9)。
具体来说，如下构建pDZTn载体。为了获得转座子基因，从NIH GenBank获得了源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的全核苷酸序列的转座子基因(NCBI登录号NC_003450，NCgI1021)的核苷酸序列信息，并在此信息的基础上合成了两对引物(表1，SEQ ID.NO:10至13)。
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，与SEQ ID NO:10和13的引物对一起，进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，PCR条件设定为：96℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次。
[表1]
SEQ ID NO 名称 序列
10 Tn-A-F atcctctagagtcgaccatcgctgacaccatctgcc
11 Tn-A-R gggcccactagtctcgagttcaccgcgggagccaagcc
12 Tn-B-F ctcgagactagtgggccctggattccaaggctacgcc
13 Tn-B-R atgcctgcaggtcgaccctgaatggataaggcaccg
结果，作为PCR产物，获得了两对转座子基因(Tn-A，Tn-B)，其包括大约500bp的启动子区域。Tn-A (SEQ ID NO:14)用SEQ ID NO:10和11作为引物扩增，Tn-B(SEQ ID NO:15)用SEQ ID NO:12和13作为引物扩增。使用BD In-Fusion试剂盒(BD)将扩增产物克隆到先前用SalI限制性酶处理过的pDZ载体中，从而得到pDZTn载体。在引物构建期间人工插入的多个限制性酶识别位点被包含在两个扩增产物之间。
lysCP1启动子按如下制备。用CA01-0135菌株(WO 2009-096689，KCCM10919P)的染色体DNA作为模板，与以下SEQ ID NO:16和17的引物一起，进行PCR，该菌株是通过用含有lysCP1启动子的载体转化谷氨酸棒状杆菌KFCC10881获得的。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，PCR条件设定为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次。
所用引物的序列在下表2中示出。
[表2]
结果，得到了lysCP1启动子区域(SEQ ID NO:9)作为PCR产物。
为了获得argJ基因，在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869来源的argJ基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的基础上，制备了用于获得argJ开放阅读框(ORF)同源重组片段的SEQ IDNO:18和19的引物对。
使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，与SEQ ID NO:18和19的引物对一起，进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，PCR条件设定为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒，循环30次。
所用引物的序列在下表3中示出。
[表3]
SEQ ID NO 名称 序列
18 argJ_F GTTCCACATGGCCAAAAAAGGCATTAC
19 argJ_R TTCTTTTTAAGAGCTGTACGCGGAGTTGATCTCC
结果，约为1.2kb的argJ基因片段被扩增为PCR产物。这些片段在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，洗脱和纯化出所需大小的条带。
用限制性酶Xhol处理先前制备的pDZTn载体，并使用HD克隆试剂盒(Clontech)将上述获得的各自PCR产物(lysCP1启动子区域和argJ基因片段)融合克隆到载体中，然后将所得质粒命名为pDZTn-lysCP1-argJ。
然后，将构建的质粒pDZTn-lysCP1-argJ通过电穿孔引入CC01-0163菌株(US9677099，KCCM11240P)中以获得转化体，其中菌株是通过缺失NCgl1469蛋白的活性获得的，该蛋白被定义为在具有生产腐胺的能力的CC01-0064菌株(US 9890404,KCCM11138P)中的组蛋白乙酰转移酶HPA2和相关乙酰转移酶，该菌株是通过缺失编码鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)的基因和编码涉及谷氨酸输出的谷氨酸输出体的基因(NCgl1221)，将编码来源于野生型大肠杆菌3110菌株的鸟氨酸脱羧酶(ODC)的基因(speC)引入染色体，并替换了编码野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中涉及从谷氨酸合成鸟氨酸的酶的ArgCJBD基因簇的启动子来获得的。将转化体在含有25μg/ml卡那霉素和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚啉-D-半乳糖苷)的BHIS平板培养基(脑心浸出液37g/l,山梨醇91g/l，和琼脂2％)上进行铺板和培养，以形成菌落。通过从这样形成的菌落中选择白色的菌落，选择其中引入质粒pDZTn-lysCP1-argJ的转化株。
将选定的菌株在CM培养基(葡萄糖(10g/L)，聚蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L)，牛肉提取物(5g/L)，NaCl(2.5g/L)，尿素(2g/L)，和pH6.8)中30℃下振荡，培养8小时。随后，将每个细胞培养物从10-4到10-10进行连续稀释，然后在含有X-gal的固体培养基上进行铺板和培养，以形成菌落。通过选择在形成的菌落中出现频率相对较低的白色菌落，通过二次杂交最终选择了引入编码argJ的基因的菌株。
通过使用引物对SEQ ID NO:18和19对最终选择的菌株进行PCR，以确认引入了编码argJ的基因，并将谷氨酸棒状杆菌突变株命名为CC01-0163Tn:lysCP1-argJ。
1-2.评估Coryne来源的argJ基因增强的基于Coryne菌株生产腐胺的能力
为了研究在生产腐胺的菌株中增强来源于棒状杆菌的argJ基因时对腐胺生产的影响，对实施例1-1中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株进行了腐胺生产能力的比较。
具体来说，将实施例1-1中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株(CC01-0163Tn:lysCP1-argJ)平铺在含有1mM精氨酸的CM平板培养基(1％葡萄糖，1％聚蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％牛肉提取物，0.25％NaCl，0.2％尿素，100μl的50％NaOH，2％琼脂，pH6.8，基于1L)上，在30℃培养24小时。
将如此培养的每个菌株的大约一个铂环接种在25ml的滴定培养基中(8％葡萄糖，0.25％大豆蛋白，0.50％玉米浆固体，4％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.15％尿素，100μg的生物素，3mg的盐酸硫胺素，3mg的泛酸钙，3mg的烟酰胺，5％CaCO3，基于1L)，然后在30℃和200rpm下摇动培养98小时。然后，在培养每个菌株的培养基中加入1mM精氨酸。测量每个培养物生产的腐胺浓度，并且结果在下表4中示出。
[表4]
菌株名称 腐胺(g/L)
CC01-0163 11.7
CC01-0163Tn:lysCP1-argJ 12.4
结果，如表4所示，在其中棒状杆菌来源的argJ增强的谷氨酸棒状杆菌突变株中，腐胺产量增加了6％。
实施例2：将大肠杆菌来源的argA和argE引入生产腐胺的菌株中及其生产腐胺能 力
2-1.通过将大肠杆菌来源的argA和argE共同引入基于ATCC13032的生产腐胺的菌 株的转座子基因来制备菌株
为了研究当将编码大肠杆菌来源的N-乙酰谷氨酸合成酶的argA和编码大肠杆菌来源的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的argE插入到基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的生产腐胺的菌株(CC01-0163)中时是否提高了生产腐胺能力，将argA和argE引入菌株的转座子基因中。
为此，制备了SEQ ID NO:21和22的引物对，用于从大肠杆菌来源的argA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)中获得argAORF区域的同源重组片段，以及制备了SEQ ID NO:23和24的引物对，用于从argE基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)中获得argE ORF区域的同源重组片段。
引物的序列在表5中示出。
[表5]
使用KCCM10919P菌株的染色体作为模板，与SEQ ID NO:16和17的引物对一起，通过PCR获得lysCP1启动子区域，方法与实施例1-1相同。
为了获得argA基因，以大肠杆菌W3110菌株的染色体为模板，与SEQ ID NO:21和22的引物对一起，进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，PCR条件设定为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，循环30次。
结果，扩增出约1.6kb的argA基因片段作为PCR产物，并通过与实施例1-1相同的方法将片段与lysCP1启动子区域一起融合克隆到实施例1-1中制备的pDZTn载体中。所得到的质粒被命名为pDZTn-lysCP1-argA。
用限制性酶Xhol处理实施例1-1中制备的pDZTn载体，通过与实施例1-1相同的方法将上述获得的各自的PCR产物(lysCP1启动子区域和argA基因片段)融合克隆到载体中，然后将所得质粒命名为pDZTn-lysCP1-argA。
为了获得argE基因，通过上述相同的方法以大肠杆菌W3110菌株的染色体为模板，与SEQ ID NO:23和24的引物对一起进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，PCR条件设定为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，循环30次。
结果，扩增出约1.4kb的argE基因片段作为PCR产物，并通过与实施例1-1相同的方法将片段与先前获得的lysCP1启动子区域一起融合克隆到实施例1-1中制备的pDZTn载体中。所得到的质粒被命名为pDZTn-lysCP1-argE。
然后，通过电泳将质粒pDZTn-lysCP1-argA引入CC01-0163以得到转化株，并通过与实施例1-1相同的方法选择其中引入质粒pDZTn-lysCP1-argA的转化株。
对选择的菌株进行二次杂交，以最终选择其中引入编码argA的基因的菌株。使用引物对SEQ ID NO:21和22对最终选择的菌株进行PCR，以确认引入了编码argA的基因，并将谷氨酸棒状杆菌突变株命名为CC01-0163 Tn：lysCP1-argA。
为了将argE引入已制备的其中引入argA的谷氨酸棒状杆菌突变株中，通过上述相同的方法将先前构建的pDZTn-lysCP1-argE转化到CC01-0163Tn:lysCP1-argA中，并对最终选择的菌株以及SEQ ID NO:23和24的引物对一起进行PCR，以确认argE被引入转座子中。
这样选择的谷氨酸棒状杆菌突变株被称为CC01-0163 Tn:lysCP1-argA Tn:lysCP1-argE。
2-2.评估其中引入大肠杆菌来源的argA和argE的棒状杆菌属的产腐胺菌株的生 产腐胺能力
为了研究将大肠杆菌来源的argA和argE引入产腐胺菌株对生产腐胺的影响，对实施例2-1中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株进行了生产腐胺能力的比较。
通过与实施例1-2相同的方法将实施例2-1中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株(CC01-0163 Tn:lysCP1-argA Tn:lysCP1-argE)和亲本菌株(CC01-0163)每个进行培养，并测量每个培养物生产的腐胺的浓度。结果在下表6中示出。
[表6]
菌株名称 腐胺(g/L)
CC01-0163 12.2
CC01-0163Tn:lysCP1-argATn:lysCP1-argE 13.4
结果，如表6所示，在其中引入大肠杆菌来源的argA和argE基因的谷氨酸突变株中，腐胺生产增加了9.8％。
实施例3：Coryne来源的Ncgl2644基因增强的菌株的生产腐胺能力
3-1.制备其中将ATCC13869来源的Ncgl2644引入基于ATCC13032的产腐胺菌株的 转座子基因中的菌株
为了研究当编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869来源的GCN5相关N-乙酰转移酶(GNAT)家族N-乙酰转移酶的Ncgl2644基因在基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的产腐胺菌株(CC01-0163)中得到增强时是否能提高生产腐胺能力，在菌株的转座子基因中将Ncgl2644引入并增强。
为此，制备了SEQ ID NO:25和26的引物对，用于从棒状杆菌来源的基因Ncgl2644的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)中获得Ncgl2644 ORF区域的同源重组片段。
引物的序列在表7中示出。
[表7]
为了获得Ncgl2644基因，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13869菌株的染色体作为模板，与SEQ ID NO:25和26的引物对一起进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，PCR条件设定为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次。结果，约1kb的Ncgl2644基因片段被扩增为PCR产物，通过与实施例1-1相同的方法将这些片段与实施例2-1中获得的lysCP1启动子区域一起融合克隆到实施例1-1中制备的pDZTn载体中。所得的质粒被命名为pDZTn-lysCP1-Ncgl2644。
然后，通过电泳将质粒pDZTn-lysCP1-Ncgl2644引入CC01-0163，以得到转化株，并通过与实施例1-1相同的方法选择其中引入质粒pDZTn-lysCP1-Ncgl2644的转化株。
对所选的菌株进行二次杂交，以最终选择其中引入编码Ncgl2644基因的菌株。通过使用引物对SEQ ID NO:25和26对最终选择的菌株进行PCR，以确认引入了编码Ncgl2644的基因，并将谷氨酸棒状杆菌突变株命名为CC01-0163Tn:lysCP1-Ncgl2644。
3-2.评估其中增强了Coryne来源的Ncgl2644的棒状杆菌属产腐胺菌株的生产腐 胺能力
为了研究当在产腐胺菌株中来源于棒状杆菌的Ncgl2644基因增强时对生产腐胺的影响，对实施例3-1中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株进行了生产腐胺能力的比较。
具体来说，通过与实施例1-2相同的方法将实施例3-1中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株(CC01-0163)和亲本菌株(CC01-0163)每个进行培养，并测量每个培养物中生产的腐胺的浓度。结果在下表8中示出。
[表8]
菌株名称 腐胺(g/L)
CC01-0163 12.0
CC01-0163Tn:lysCP1-Ncgl2644 10.1
结果，如表8所示，当棒状杆菌来源的Ncgl2644被增强时，生产腐胺能力降低。这可能是由于乙酰谷氨酸的浓度增加导致生物合成途径出现瓶颈，乙酰谷氨酸是生产腐胺途径中的中间代谢物。因此，Ncgl2644对腐胺生产的影响是通过以下其他实施例来评估的。
实施例4：argJ基因缺失和Ncgl2644增强的菌株的生产腐胺能力
4-1.制备其中在基于ATCC13032的产腐胺菌株中缺失argJ的菌株
制备其中在基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的产腐胺菌株中缺失谷氨酸棒状杆菌ATCC13032来源的argJ基因的菌株(CC01-0163)。
为此，制备了SEQ ID NO:27和28的引物对，用于获得argJ的N端区域的同源重组片段，以及SEQ ID NO:29和30的引物对，用于从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032来源的argJ基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)获得argJ的C端区域的同源重组片段。
引物的序列在表9中示出。
[表9]
SEQ ID NO 名称 序列
27 argJ_N_F CGGGATCCCACGCCTGTCTGGTCGC
28 argJ_N_R ACGCGTCGACGGATCTAAAGCGGCGCTTC
29 argJ_C_F ACGCGTCGACTCCGGCGCTGACATTGATGTCC
30 argJ_C_R CTAGTCTAGAGAGCTGCACCAGGTAGACG
为了获得argJ的C端区域和N端区域的同源重组片段，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板，与SEQ ID NO:27和28的引物对和SEQ ID NO:29和30的引物对一起进行PCR。使用PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶，PCR条件设定为：95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环30次。结果，N端区域和C端区域的PCR片段分别被扩增为PCR产物，将片段在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，洗脱并纯化所需大小的条带。
用限制性酶BamHI和SalI处理所得的N端区域的片段，和用限制性酶SalI和XbaI处理所得的C端区域的片段。将处理的片段克隆到用限制性酶BamHI和XbaI处理的pDZ载体中，以构建pDZ-1'argJ(K/O)质粒。
将构建的质粒pDZ-1'argJ(K/O)通过电泳引入谷氨酸棒状杆菌CC01-0163中，以得到转化体，通过与实施例1-1相同的方法选择引入pDZ-1'NCglargJ(K/O)的菌株。
最后从所选的菌株中选择通过缺失编码argJ的基因而弱化腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株，并将这种具有弱化腐胺输出能力的谷氨酸棒状杆菌突变株命名为CC01-0163△argJ。
通过与实施例3-1相同的方法将Ncgl2644基因转化到已制备的CC01-0163△argJ菌株中，以制备CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644菌株。
4-2.评估其中缺失Coryne来源的argJ和增强Ncgl2644的棒状杆菌属的产腐胺菌 株的生产腐胺能力
为了研究当在产腐胺菌株中缺失棒状杆菌来源的argJ基因和增强棒状杆菌来源的Ncgl2644基因时对生产腐胺的影响，对实施例4-1中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株进行了生产腐胺能力的比较。
具体来说，通过与实施例1-2相同的方法各自培养谷氨酸棒状杆菌突变株(CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644)和亲本菌株(CC01-0163△argJ)，并测量每个培养物生产的腐胺浓度。结果显示在下表10中示出。
[表10]
菌株名称 腐胺(g/L)
CC01-0163△argJ 0.1
CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 0.3
结果，如表10所示，argJ缺失的菌株难以具有生产腐胺的能力，即使引入了能够生成乙酰谷氨酸的Ncgl2644，但由于缺乏能够对引入后生成的中间代谢物乙酰鸟氨酸进行脱乙酰的酶，腐胺的生产很低。因此，通过额外的工作实施例评估了Ncgl2644和argE共同增强的菌株的生产腐胺能力。
实施例5：Coryne来源的Ncgl2644基因增强的菌株和大肠杆菌来源的argE基因引 入的菌株的生产腐胺能力
5-1.从基于ATCC13032的产腐胺菌株中制备Ncgl2644基因增强的菌株
在实施例3-1制备的CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644菌株和实施例4-1制备的CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644菌株中，引入了能够对乙酰鸟氨酸进行脱乙酰的编码大肠杆菌W3110来源的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的argE。
具体来说，通过与实施例2-1相同的方法将实施例2-1中构建的pDZTn-lysCP1-argE质粒转化到CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644菌株和CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644菌株中，以获得转化体，并通过与实施例1-1相同的方法选择其中引入pDZTn-lysCP1-argE质粒的转化株。
最后从选择的菌株中选择引入argE的谷氨酸棒状杆菌菌株，并制备了所制备的谷氨酸棒状杆菌菌株CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE和CC01-0163△argJTn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE。CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE被命名为谷氨酸棒状杆菌CC01-1425。谷氨酸棒状杆菌CC01-1425(CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE)于2020年7月24日被保藏(KCCM12774P)。
5-2.评估其中增强了Ncgl2644基因和argE的棒状杆菌属的产腐胺菌株的生产腐 胺能力
为了研究当在产腐胺菌株中增强了棒状杆菌来源的Ncgl2644和棒状杆菌来源的argE时对生产腐胺的影响，对实施例5-1中制备的谷氨酸棒状杆菌突变株进行了生产腐胺能力的比较。
具体来说，通过与实施例1-2相同的方法各自培养谷氨酸棒状杆菌突变株(CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE和CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644Tn:lysCP1-argE)和亲本菌株(CC01-0163)，并测量了每个培养物生产的腐胺浓度。结果在下表11中示出。
[表11]
菌株名称 腐胺(g/L)
CC01-0163 12.0
CC01-0163Tn:lysCP1-Ncgl2644Tn:lysCP1-argE 15.7
CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644Tn:lysCP1-argE 16.4
如表11所示，与CC01-0163菌株相比，共同引入Ncgl2644和argE导致了腐胺生产的明显提高。具体地，与CC01-0163菌株相比，消除了argJ活性的CC01-0163△argJ Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE菌株显示了生产腐胺能力提高了36.6％，并且与消除了argJ活性的菌株相比，保留argJ活性的CC01-0163Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE菌株显示出低的生产腐胺能力，但与CC01-0163菌株相比，生产腐胺能力仅提高30.8％。此外，与其中共同引入表现出与Ncgl2644相似功能的大肠杆菌来源的argA和argE的谷氨酸棒状杆菌突变株相比，保留argJ活性的CC01-0163 Tn:lysCP1-Ncgl2644 Tn:lysCP1-argE菌株显示出明显更高的腐胺生产能力(表6)。
通过本实施例的结果证实了，与不缺失argJ或缺失argJ并引入表现出与Ncgl2644功能相似的大肠杆菌来源的argA和argE相比，缺失argJ和共同表达Ncgl2644和argE导致了更显著的生产腐胺能力。
如上所叙述，本公开内容所涉及领域的技术人员将能够理解，本公开内容可以在不脱离其技术精神或基本特征的情况下以其他具体形式体现出来。因此，上面描述的示例性实施方式应被理解为是示例性的，而不是限制本公开内容。本公开范围应理解为，从权利要求书及其等同物的定义和范围中得出的所有变化或修改都落入本公开内容的范围。
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约国际表格
原始保藏接收证明由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出至：CJ第一制糖株式会社
大韩民国首尔市中区东湖路330号
CJ第一制糖中心邮政编号100-400
1如果第6.4(d)条适用，该日期是获得国际保藏机构资格的日期。
表格BP/4(仅一页)。
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 生产腐胺的微生物和利用其生产腐胺的方法
<130> OPA21055-PCT
<150> KR 10-2020-0101894
<151> 2020-08-13
<160> 30
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 335
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌GNAT家族N-乙酰转移酶
<400> 1
Met Thr Pro Ser Leu Pro Arg Phe Arg Ser Gln Lys Pro Ala Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Val Ala Arg Arg Arg Ile Pro Gly Ala Asn Val His Trp
20 25 30
Thr Asp Ala Ile Gly His Val Ile Gly Val Asp Pro Leu Val Val Arg
35 40 45
Pro Gln Ser Val Gly Gly Met Pro Ser Asp Ala Glu Glu Ile Val Ile
50 55 60
Pro Asp Asp Gln Leu Glu Val Ile Lys Ile Leu Ser Pro Arg Thr Ile
65 70 75 80
Arg Asn Ser Asp Ile Arg Ala Val Glu Val Ala Thr Ala Lys Ala Phe
85 90 95
Pro Gly Leu Val Asn Glu Trp His Asp Gly Trp Leu Leu Arg Ala Gly
100 105 110
Asp Gly Ile Ala Glu Arg Ser Asn Ser Ala Ser Pro Leu Gly Pro Ser
115 120 125
Val Gly Phe Glu Pro Val Pro Met Glu Asp Ile Ser Arg Phe Tyr Ala
130 135 140
Arg His Asp Leu Pro Val Lys Leu His Ile Pro Glu Arg Ile Gly Arg
145 150 155 160
Pro Ala Gln Lys Val Ile Asp Ala Asp Pro Gln Lys Trp Val Met Gly
165 170 175
Pro Glu Ile Leu Val Met Thr Lys Ser Leu Asp His Val Glu Ser His
180 185 190
Glu Leu Pro Gly Gly Leu Glu Phe Ser Val Asp Lys Gln Pro Asp Gln
195 200 205
Glu Trp Leu Gly Met Tyr His Phe Arg Gly Gln Ala Leu Pro Ala His
210 215 220
Ala Leu Glu Leu Leu Arg Thr Gln Ile Glu Gly Arg Met Gly Phe Gly
225 230 235 240
Arg Leu Thr Thr Pro Ala Gly Gln Thr Val Ala Ile Thr Arg Ala Thr
245 250 255
Ile Thr Ala Ala Glu Glu Arg Ile Phe Leu Gly Tyr Ser Ala Val Glu
260 265 270
Val Asp Pro Ala Phe Arg Arg Gln Gly Leu Gly Thr Ala Leu Gly Ser
275 280 285
Arg Ile Gln Glu Trp Gly Ala Glu Gln His Ala Gln Glu Ala Tyr Leu
290 295 300
Gln Val Val Ala His Asn Glu Ala Gly Ile Gly Leu Tyr Gln Lys Leu
305 310 315 320
Gly Phe Ser Glu His His Arg His Arg Tyr Ala Glu Arg Lys Phe
325 330 335
<210> 2
<211> 1008
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌GNAT家族N-乙酰转移酶(Ncgl2644)
<400> 2
atgacgccta gtcttccccg tttccgcagc cagaaacctg ccgtcggcga tcgtgttgtt 60
gcacgtcgcc ggattcctgg tgccaatgtg cattggacag atgccattgg ccatgtgatt 120
ggggtggatc cgttggtggt tcgcccgcag tcggttggtg ggatgccgtc ggatgcggaa 180
gaaattgtca ttcctgatga tcagcttgag gtgattaaga ttttgtcgcc gcgcaccatt 240
aggaattcgg atattcgtgc ggtggaggtt gccacggcga aggcctttcc ggggctggtc 300
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cggttttacg caaggcacga tctccccgtg aagctgcaca ttccggagcg gattggtcgg 480
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agcgtcgata agcagcctga ccaggagtgg ctgggcatgt accatttccg cggacaggcg 660
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gggttcagtg aacaccaccg acaccggtac gccgaacgga aattctaa 1008
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<211> 408
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 大肠杆菌argE
<400> 3
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Gln Ser Lys Ala Gly Val Arg Gln Val Pro Ser Thr Glu Gly Gln Trp
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Lys Leu Leu His Leu Leu Lys Glu Gln Leu Glu Glu Met Gly Leu Ile
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Asn Val Thr Leu Ser Glu Lys Gly Thr Leu Met Ala Thr Leu Pro Ala
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Asn Val Pro Gly Asp Ile Pro Ala Ile Gly Phe Ile Ser His Val Asp
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Asn Tyr Arg Gly Gly Asp Ile Ala Leu Gly Ile Gly Asp Glu Val Leu
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Ile Ala Glu Ile Met Thr Ala Leu Ala Val Leu Gln Gln Lys Lys Ile
145 150 155 160
Pro His Gly Asp Ile Arg Val Ala Phe Thr Pro Asp Glu Glu Val Gly
165 170 175
Lys Gly Ala Lys His Phe Asp Val Asp Ala Phe Asp Ala Arg Trp Ala
180 185 190
Tyr Thr Val Asp Gly Gly Gly Val Gly Glu Leu Glu Phe Glu Asn Phe
195 200 205
Asn Ala Ala Ser Val Asn Ile Lys Ile Val Gly Asn Asn Val His Pro
210 215 220
Gly Thr Ala Lys Gly Val Met Val Asn Ala Leu Ser Leu Ala Ala Arg
225 230 235 240
Ile His Ala Glu Val Pro Ala Asp Glu Ser Pro Glu Met Thr Glu Gly
245 250 255
Tyr Glu Gly Phe Tyr His Leu Ala Ser Met Lys Gly Thr Val Glu Arg
260 265 270
Ala Asp Met His Tyr Ile Ile Arg Asp Phe Asp Arg Lys Gln Phe Glu
275 280 285
Ala Arg Lys Arg Lys Met Met Glu Ile Ala Lys Lys Val Gly Lys Gly
290 295 300
Leu His Pro Asp Cys Tyr Ile Glu Leu Val Ile Glu Asp Ser Tyr Tyr
305 310 315 320
Asn Met Arg Glu Lys Val Val Glu His Pro His Ile Leu Asp Ile Ala
325 330 335
Gln Gln Ala Met Arg Asp Cys Asp Ile Glu Pro Glu Leu Lys Pro Ile
340 345 350
Arg Gly Gly Thr Asp Gly Ala Gln Leu Ser Phe Met Gly Leu Pro Cys
355 360 365
Pro Asn Leu Phe Thr Gly Gly Tyr Asn Tyr His Gly Lys His Glu Phe
370 375 380
Val Thr Leu Glu Gly Met Glu Lys Ala Val Gln Val Ile Val Arg Ile
385 390 395 400
Ala Glu Leu Thr Ala Gln Arg Lys
405
<210> 4
<211> 1227
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 大肠杆菌argE
<400> 4
atggataaac tacttgagcg atttttgaac tacgtgtctc tggataccca atcaaaagca 60
ggggtgagac aggttcccag cacggaaggc caatggaagt tattgcatct gctgaaagag 120
cagctcgaag agatggggct tatcaatgtg accttaagtg agaagggcac tttgatggcg 180
acgttaccgg ctaacgtccc tggcgatatc ccggcgattg gctttatttc tcatgtggat 240
acctcaccgg attgcagcgg caaaaatgtg aatccgcaaa ttgttgaaaa ctatcgcggt 300
ggcgatattg cgctgggtat cggcgatgaa gttttatcac cggttatgtt cccggtgctg 360
catcagctac tgggtcagac gctgattacc accgatggta aaaccttgtt aggtgccgat 420
gacaaagcag gtattgcaga aatcatgacc gcgctggcgg tattgcaaca gaaaaaaatt 480
ccgcatggtg atattcgcgt cgcctttacc ccggatgaag aagtgggcaa aggggcgaaa 540
cattttgatg ttgacgcctt cgatgcccgc tgggcttaca ctgttgatgg tggtggcgta 600
ggcgaactgg agtttgaaaa cttcaacgcc gcgtcggtca atatcaaaat tgtcggtaac 660
aatgttcatc cgggcacggc gaaaggagtg atggtaaatg cgctgtcgct ggcggcacgt 720
attcatgcgg aagttccggc ggatgaaagc ccggaaatga cagaaggcta tgaaggtttc 780
tatcatctgg cgagcatgaa aggcaccgtt gaacgggccg atatgcacta catcatccgt 840
gatttcgacc gtaaacagtt tgaagcgcgt aaacgtaaaa tgatggagat cgccaaaaaa 900
gtgggcaaag ggttacatcc tgattgctac attgaactgg tgattgaaga cagttactac 960
aatatgcgcg agaaagtggt tgagcatccg catattctcg atatcgccca gcaggcgatg 1020
cgcgattgcg atattgaacc ggaactgaaa ccgatccgcg gtggtaccga cggcgcgcag 1080
ttgtcgttta tgggattacc gtgcccgaac ctgttcactg gcggttacaa ctatcatggt 1140
aagcatgagt ttgtgactct ggaaggtatg gaaaaagcgg tgcaggtgat cgtccgtatt 1200
gccgagttaa cggcgcaacg gaagtaa 1227
<210> 5
<211> 388
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌13869 argJ
<400> 5
Met Ala Lys Lys Gly Ile Thr Ala Pro Lys Gly Phe Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Thr Thr Ala Gly Ile Lys Ala Ser Gly Asn Pro Asp Met Ala Leu Val
20 25 30
Val Asn Gln Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Val Phe Thr Arg Asn
35 40 45
Arg Val Phe Ala Ala Pro Val Lys Val Ser Arg Glu Asn Val Ala Asp
50 55 60
Gly Gln Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Ala Gly Asn Ala Asn Ala Cys
65 70 75 80
Asn Gly Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Arg Glu Ser Val Ser His Leu
85 90 95
Ala Gln Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ser Asp Ile Gly Val Cys Ser Thr
100 105 110
Gly Leu Ile Gly Glu Leu Leu Pro Met Asp Lys Leu Asn Thr Gly Ile
115 120 125
Asp Gln Leu Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Asp Asn Gly Ala Ala Ala
130 135 140
Ala Lys Ala Ile Met Thr Thr Asp Thr Val Asp Lys Glu Thr Val Val
145 150 155 160
Phe Ala Asp Gly Trp Thr Val Gly Gly Met Gly Lys Gly Val Gly Met
165 170 175
Met Ala Pro Ser Leu Ala Thr Met Leu Val Cys Leu Thr Thr Asp Ala
180 185 190
Ser Val Thr Gln Glu Met Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Ala Thr Ala
195 200 205
Val Thr Phe Asp Thr Leu Asp Ile Asp Gly Ser Thr Ser Thr Asn Asp
210 215 220
Thr Val Phe Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Thr Pro Thr Gln
225 230 235 240
Asp Glu Leu Asn Asp Ala Val Tyr Ala Ala Cys Ser Asp Ile Ala Ala
245 250 255
Lys Leu Gln Ala Asp Ala Glu Gly Val Thr Lys Arg Val Ala Val Thr
260 265 270
Val Val Gly Thr Thr Asn Asn Glu Gln Ala Ile Asn Ala Ala Arg Thr
275 280 285
Val Ala Arg Asp Asn Leu Phe Lys Cys Ala Met Phe Gly Ser Asp Pro
290 295 300
Asn Trp Gly Arg Val Leu Ala Ala Val Gly Met Ala Asp Ala Asp Met
305 310 315 320
Glu Pro Glu Lys Ile Ser Val Phe Phe Asn Asp Gln Ala Val Cys Leu
325 330 335
Asp Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Arg Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala
340 345 350
Asp Ile Asp Val Arg Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Glu Gly Gln Ala
355 360 365
Thr Val Arg Thr Thr Asp Leu Ser Phe Ser Tyr Val Glu Ile Asn Ser
370 375 380
Ala Tyr Ser Ser
385
<210> 6
<211> 1167
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌13869 argJ
<400> 6
atggccaaaa aaggcattac cgcgccgaaa ggcttcgttg cttctgcaac gaccgcgggt 60
attaaagctt ctggcaatcc tgacatggcg ttggtggtta accagggtcc agagttttcc 120
gcagcggccg tgtttacacg caaccgagtt ttcgcagcgc ctgtgaaggt gagccgggag 180
aacgttgctg atggccagat cagggctgtt ttgtacaacg ctggtaatgc taatgcgtgt 240
aatggtctgc agggtgagaa ggatgctcgt gagtctgttt ctcatctagc tcaaaatttg 300
ggcttggagg attccgatat tggtgtgtgt tccactggtc ttattggtga gttgcttccg 360
atggataagc tcaatacagg tattgatcag ctgaccgctg agggcgcttt gggtgacaat 420
ggtgcagctg ctgccaaggc gatcatgacc actgacacgg tggataagga aaccgtcgtg 480
tttgctgatg gttggactgt cggcggaatg ggcaagggcg tgggcatgat ggcgccgtct 540
cttgccacca tgctggtctg cttgaccact gatgcatccg ttactcagga aatggctcag 600
attgcgctgg ctaatgctac ggccgttacg tttgacaccc tggatattga tggatcaacc 660
tccaccaatg acaccgtgtt cctgctggca tctggcgcta gcggaatcac cccaactcag 720
gatgaactca acgatgcggt gtacgcagct tgttctgata tcgcagcgaa gcttcaggct 780
gatgcagagg gggtgaccaa gcgcgttgct gtgacagtgg tgggaaccac caacaacgag 840
caggcgatca atgcggctcg cacggttgct cgtgacaatt tgttcaagtg cgcaatgttt 900
ggatctgatc caaactgggg tcgcgtgttg gctgcagtcg gcatggctga tgctgatatg 960
gaaccagaga agatttctgt gttcttcaat gatcaagcag tatgccttga ttccactggc 1020
gctcctggtg ctcgtgaggt ggatctttcc ggcgctgaca ttgatgtccg aattgatttg 1080
ggcaccagtg gggaaggcca ggcaacagtt cgaaccactg acctgagctt ctcctacgtg 1140
gagatcaact ccgcgtacag ctcttaa 1167
<210> 7
<211> 388
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌13032 argJ
<400> 7
Met Ala Glu Lys Gly Ile Thr Ala Pro Lys Gly Phe Val Ala Ser Ala
1 5 10 15
Thr Thr Ala Gly Ile Lys Ala Ser Gly Asn Pro Asp Met Ala Leu Val
20 25 30
Val Asn Gln Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Val Phe Thr Arg Asn
35 40 45
Arg Val Phe Ala Ala Pro Val Lys Val Ser Arg Glu Asn Val Ala Asp
50 55 60
Gly Gln Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Ala Gly Asn Ala Asn Ala Cys
65 70 75 80
Asn Gly Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Arg Glu Ser Val Ser His Leu
85 90 95
Ala Gln Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ser Asp Ile Gly Val Cys Ser Thr
100 105 110
Gly Leu Ile Gly Glu Leu Leu Pro Met Asp Lys Leu Asn Ala Gly Ile
115 120 125
Asp Gln Leu Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Asp Asn Gly Ala Ala Ala
130 135 140
Ala Lys Ala Ile Met Thr Thr Asp Thr Val Asp Lys Glu Thr Val Val
145 150 155 160
Phe Ala Asp Gly Trp Thr Val Gly Gly Met Gly Lys Gly Val Gly Met
165 170 175
Met Ala Pro Ser Leu Ala Thr Met Leu Val Cys Leu Thr Thr Asp Ala
180 185 190
Ser Val Thr Gln Glu Met Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Ala Thr Ala
195 200 205
Val Thr Phe Asp Thr Leu Asp Ile Asp Gly Ser Thr Ser Thr Asn Asp
210 215 220
Thr Val Phe Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Thr Pro Thr Gln
225 230 235 240
Asp Glu Leu Asn Asp Ala Val Tyr Ala Ala Cys Ser Asp Ile Ala Ala
245 250 255
Lys Leu Gln Ala Asp Ala Glu Gly Val Thr Lys Arg Val Ala Val Thr
260 265 270
Val Val Gly Thr Thr Asn Asn Glu Gln Ala Ile Asn Ala Ala Arg Thr
275 280 285
Val Ala Arg Asp Asn Leu Phe Lys Cys Ala Met Phe Gly Ser Asp Pro
290 295 300
Asn Trp Gly Arg Val Leu Ala Ala Val Gly Met Ala Asp Ala Asp Met
305 310 315 320
Glu Pro Glu Lys Ile Ser Val Phe Phe Asn Gly Gln Ala Val Cys Leu
325 330 335
Asp Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Arg Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala
340 345 350
Asp Ile Asp Val Arg Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Glu Gly Gln Ala
355 360 365
Thr Val Arg Thr Thr Asp Leu Ser Phe Ser Tyr Val Glu Ile Asn Ser
370 375 380
Ala Tyr Ser Ser
385
<210> 8
<211> 1167
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 谷氨酸棒状杆菌13032 argJ
<400> 8
atggcagaaa aaggcattac cgcgccgaaa ggcttcgttg cttctgcaac gaccgcgggt 60
attaaagctt ctggcaatcc tgacatggcg ttggtggtta accagggtcc agagttttcc 120
gcagcggccg tgtttacacg taaccgagtt ttcgcagcgc ctgtgaaggt gagccgagag 180
aacgttgctg atggccagat cagggctgtt ttgtacaacg ctggtaatgc taatgcgtgt 240
aatggtctgc agggtgagaa ggatgctcgt gagtctgttt ctcatctagc tcaaaatttg 300
ggcttggagg attccgatat tggtgtgtgt tccactggtc ttattggtga gttgcttccg 360
atggataagc tcaatgcagg tattgatcag ctgaccgctg agggcgcttt gggtgacaat 420
ggtgcagctg ctgccaaggc gatcatgacc actgacacgg tggataagga aaccgtcgtg 480
tttgctgatg gttggactgt cggcggaatg ggcaagggcg tgggcatgat ggcgccgtct 540
cttgccacca tgctggtctg cttgaccact gatgcatccg ttactcagga aatggctcag 600
atcgcgctgg ctaatgctac ggccgttacg tttgacaccc tggatattga tggatcaacc 660
tccaccaatg acaccgtgtt cctgctggca tctggcgcta gcggaatcac cccaactcag 720
gatgaactca acgatgcggt gtacgcagct tgttctgata tcgcagcgaa gcttcaggct 780
gatgcagagg gtgtgaccaa gcgcgttgct gtgacagtgg tgggaaccac caacaacgag 840
caggcgatta atgcggctcg cactgttgct cgtgacaatt tgttcaagtg cgcaatgttt 900
ggatctgatc caaactgggg tcgcgtgttg gctgcagtcg gcatggctga tgctgatatg 960
gaaccagaga agatttctgt gttcttcaat ggtcaagcag tatgccttga ttccactggc 1020
gctcctggtg ctcgtgaggt ggatctttcc ggcgctgaca ttgatgtccg aattgatttg 1080
ggcaccagtg gggaaggcca ggcaacagtt cgaaccactg acctgagctt ctcctacgtg 1140
gagatcaact ccgcgtacag ctcttaa 1167
<210> 9
<211> 289
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> lysCP1
<400> 9
ccgatgctag ggcgaaaagc acggcgagca gattgctttg cacttgattc agggtagttg 60
actaaagagt tgctcgcgaa gtagcacctg tcacttttgt ctcaaatatt aaatcgaata 120
tcaatatatg gtctgtttat tggaacgcgt cccagtggct gagacgcatc cgctaaagcc 180
ccaggaaccc tgtgcagaaa gaaaacactc ctctggctag gtagacacag tttattgtgg 240
tagagttgag cgggtaactg tcagcacgta gatcgaaagg tgcacaaag 289
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tn-A-F
<400> 10
atcctctaga gtcgaccatc gctgacacca tctgcc 36
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tn-A-R
<400> 11
gggcccacta gtctcgagtt caccgcggga gccaagcc 38
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tn-B-F
<400> 12
ctcgagacta gtgggccctg gattccaagg ctacgcc 37
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tn-B-R
<400> 13
atgcctgcag gtcgaccctg aatggataag gcaccg 36
<210> 14
<211> 510
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> Tn-A
<400> 14
gcagacgcac tcgactacac ctccacctgc ccagaatgct cccaacctgg ggtgtttcgt 60
catcacaccc accggatgct cattgattta cccatcgtcg ggtttcccac caaactgttt 120
atccgtctac ctcgctaccg ctgcaccaac cccacatgta agcaaaagta tttccaagca 180
gaactaagct gcgctgacca cggtaaaaag gtcacccacc gggtcacccg ctggatttta 240
caacgccttg ctattgaccg gatgagtgtt cacgcaaccg cgaaagcact tgggctaggg 300
tgggatttaa cctgccaact agccctcgat atgtgccgtg agctggtcta taacgatcct 360
caccatcttg atggagtgta tgtcattggg gtggatgagc ataagtggtc acataatagg 420
gctaagcatg gtgatgggtt tgtcaccgtg attgtcgata tgaccgggca tcggtatgac 480
tcacggtgtc ctgcccggtt attagatgtc 510
<210> 15
<211> 479
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> Tn-B
<400> 15
aactcattcc ttctgctcgt cgcgtgatgg atccattcca tgttgtgcgg cttgctggtg 60
acaagctcac cgcctgccgg caacgcctcc agcgggagaa ataccagcgt cgtggtttaa 120
gccaggatcc gttgtataaa aaccggaaga ccttgttgac cacgcacaag tggttgagtc 180
ctcgtcagca agaaagcttg gagcagttgt gggcgtatga caaagactac ggggcgttaa 240
agcttgcgtg gcttgcgtat caggcgatta ttgattgtta tcagatgggt aataagcgtg 300
aagcgaagaa gaaaatgcgg accattattg atcagcttcg ggtgttgaag gggccgaata 360
aggaactcgc gcagttgggt cgtagtttgt ttaaacgact tggtgatgtg ttggcgtatt 420
tcgatgttgg tgtctccaac ggtccggtcg aagcgatcaa cggacggttg gagcatttg 479
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysCP1 启动子_F
<400> 16
gaatgagttc ctcgagccga tgctagggcg aaaa 34
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> lysCP1 启动子_R
<400> 17
ctttgtgcac ctttcgatct acgtgctgac agttac 36
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argJ _F
<400> 18
gttccacatg gccaaaaaag gcattac 27
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argJ _R
<400> 19
ttctttttaa gagctgtacg cggagttgat ctcc 34
<210> 20
<211> 1332
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 大肠杆菌arg A
<400> 20
gtggtaaagg aacgtaaaac cgagttggtc gagggattcc gccattcggt tccctatatc 60
aatacccacc ggggaaaaac gtttgtcatc atgctcggcg gtgaagccat tgagcatgag 120
aatttctcca gtatcgttaa tgatatcggg ttgttgcaca gcctcggcat ccgtctggtg 180
gtggtctatg gcgcacgtcc gcagatcgac gcaaatctgg ctgcgcatca ccacgaaccg 240
ctgtatcaca agaatatacg tgtgaccgac gccaaaacac tggaactggt gaagcaggct 300
gcgggaacat tgcaactgga tattactgct cgcctgtcga tgagtctcaa taacacgccg 360
ctgcagggcg cgcatatcaa cgtcgtcagt ggcaatttta ttattgccca gccgctgggc 420
gtcgatgacg gcgtggatta ctgccatagc gggcgtatcc ggcggattga tgaagacgcg 480
atccatcgtc aactggacag cggtgcaata gtgctaatgg ggccggtcgc tgtttcagtc 540
actggcgaga gctttaacct gacctcggaa gagattgcca ctcaactggc catcaaactg 600
aaagctgaaa agatgattgg tttttgctct tcccagggcg tcactaatga cgacggtgat 660
attgtctccg aacttttccc taacgaagcg caagcgcggg tagaagccca ggaagagaaa 720
ggcgattaca actccggtac ggtgcgcttt ttgcgtggcg cagtgaaagc ctgccgcagc 780
ggcgtgcgtc gctgtcattt aatcagttat caggaagatg gcgcgctgtt gcaagagttg 840
ttctcacgcg acggtatcgg tacgcagatt gtgatggaaa gcgccgagca gattcgtcgc 900
gcaacaatca acgatattgg cggtattctg gagttgattc gcccactgga gcagcaaggt 960
attctggtac gccgttctcg cgagcagctg gagatggaaa tcgacaaatt caccattatt 1020
cagcgcgata acacgactat tgcctgcgcc gcgctctatc cgttcccgga agagaagatt 1080
ggggaaatgg cctgtgtggc agttcacccg gattaccgca gttcatcaag gggtgaagtt 1140
ctgctggaac gcattgccgc tcaggcgaag cagagcggct taagcaaatt gtttgtgctg 1200
accacgcgca gtattcactg gttccaggaa cgtggattta ccccagtgga tattgattta 1260
ctgcccgaga gcaaaaagca gttgtacaac taccagcgta aatccaaagt gttgatggcg 1320
gatttagggt aa 1332
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argA ORF_F
<400> 21
gaaaggtgca caaagatggt aaaggaacgt aaaaccg 37
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argA ORF_R
<400> 22
gcccactagt ctcgagcatg cggcgttgat tttg 34
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argE ORF_F
<400> 23
gaaaggtgca caaagatgaa aaacaaatta ccgcc 35
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argE ORF_R
<400> 24
gcccactagt ctcgaggttt gagtcactgt cggtcg 36
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl2644 ORF_F
<400> 25
gaggagatca aaacacatat gacgcctagt cttccccg 38
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ncgl2644 ORF_R
<400> 26
ttagaatttc cgttcggcgt acc 23
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argJ_N_F
<400> 27
cgggatccca cgcctgtctg gtcgc 25
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argJ_N_R
<400> 28
acgcgtcgac ggatctaaag cggcgcttc 29
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argJ_C_F
<400> 29
acgcgtcgac tccggcgctg acattgatgt cc 32
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> argJ_C_R
<400> 30
ctagtctaga gagctgcacc aggtagacg 29

Claims (13)

1.一种具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与之具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与之具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述微生物具有来源于棒状杆菌属的菌株的双功能鸟氨酸乙酰转移酶/N-乙酰谷氨酸合成酶(argJ)的弱化的活性。
5.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
6.一种生产腐胺的方法，所述方法包括在培养基中培养具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，在其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
7.根据权利要求6所述的方法，进一步包括从培养的培养基或微生物中回收腐胺。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
10.一种用于生产腐胺的组合物，所述组合物包括具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物，在其中引入了来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与之具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与之具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
13.具有生产腐胺能力的棒状杆菌属的微生物在生产腐胺中的用途，其中来源于棒状杆菌属的菌株的N-乙酰转移酶的活性和来源于大肠杆菌的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)的活性被引入所述微生物中。
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