WO2015190633A1 - 활성이 개선된 대장균 유래의 돌연변이 당 이성질화 효소 및 그를 이용한 l-굴로스의 생산 - Google Patents

활성이 개선된 대장균 유래의 돌연변이 당 이성질화 효소 및 그를 이용한 l-굴로스의 생산 Download PDF

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enzyme
gulose
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sugar
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이정걸
싱델찬드라수잔
이정임
김태수
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건국대학교 산학협력단
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)

Definitions

  • the present invention utilizes molecular dynamics and site-specific mutations to enhance the enzymatic activity of Escherichia coli O157: H7 derived sugar isomerase. More specifically, sugar isomerization enzymes having improved enzymatic activity by mutation, nucleic acid molecules encoding the same, vectors comprising the nucleic acid molecules, transformants comprising the vectors, mutants and improvement of the sugar isomerization enzymes It relates to a method for producing L-gulose using a sugar isomerase.
  • L-gulose is a key pentose sugar that constitutes the backbone in the synthesis of L-ribonucleosides, L-oligoribonucleosides and many therapeutic agents.
  • L-nucleosides are high potential candidates that can be used as therapeutic materials because they have high stability against nucleases and the like in the body when compared to D-nucleosides.
  • L-gulose is known to be highly useful as a raw material for the preparation of pharmaceuticals such as antiviral agents and antibiotics, attention has recently been focused on the establishment of a high-efficiency biological manufacturing method of L-gulose.
  • L-gulose is present in nature in a small amount, as well as the stability and conversion efficiency of the enzyme capable of producing L-gulose is difficult to commercialize. Therefore, the enzymatic production method for producing L-gulose using a biocatalyst should ensure the stability and high activity of the enzyme.
  • An object of the present invention is to improve the activity of enzymes through site-specific mutagenesis in order to utilize the sugar isomerization enzyme acting on the bioconversion of the functional sugar L-gulose as an actual industrial enzyme.
  • a second object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising the improved sugar isomerase gene.
  • a fourth object of the present invention is to provide a recombinant sugar isomerase using recombinant E. coli transformed with the improved enzyme.
  • a fifth object of the present invention is to propose residues that affect the activity of sugar isomerase using the enzyme.
  • the present invention provides a mutant in which one or more amino acids of the 56 th amino acid, 92 th amino acid and 112 th amino acid of the sugar isomerase of SEQ ID NO: 3 are substituted.
  • mutant 56 th amino acid trionine is substituted with methionine
  • 92 th amino acid methionine is substituted with leucine
  • 112 amino acid isoleucine is preferably substituted with cysteine, but is not limited thereto.
  • the enzyme is preferably Escherichia coli O157: H7 ( Esherichia coli O157: H7) derived from the sugar isomerization enzyme prepared by chemical synthesis or genetic engineering method also within the scope of the present invention Included.
  • the mutant enzyme preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11 or 13, but the present invention through one or more substitutions, deletions, inversions, translocations, etc. in this sequence Mutants that achieve the effect to be achieved are also within the scope of the present invention.
  • the present invention also provides a gene encoding the enzyme of the present invention.
  • the gene preferably has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 or 14 but the present invention is achieved through one or more substitutions, deletions, inversions, translocations, etc. in this sequence Mutants that achieve the desired effect are also within the scope of the present invention.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the gene of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing the mutant enzyme of the present invention comprising the step of expressing the enzyme of the present invention by producing a transformant by transforming the recombinant vector of the present invention into a microorganism.
  • the present invention provides a method for improving productivity from L-sorbose to L-gulose using the mutant of the present invention.
  • the present invention provides a composition for producing L-gulose comprising the mutant of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a basis for identifying activity determinants of sugar isomerase by presenting several residues that play an important role in enzyme activity using the sugar isomerase of the present invention.
  • the present invention also provides a high activity sugar isomerase using the mutant sugar isomerase of the present invention, which can be used to efficiently produce L-gulose.
  • SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, and 14 represent the nucleotide sequences of the mutated sugar isomerase genes of the present invention
  • SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, and 13 represent amino acid sequences encoded by the genes.
  • the gene of the present invention includes a degenerate isomer that encodes the same polypeptide which differs only in degenerate codons, in addition to having a nucleotide sequence encoding the amino acids represented by SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11 and 13.
  • mutations such as deletions, substitutions, and additions can be introduced by site mutation introduction methods (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, p. 811, 1994) and the like.
  • the transformed microorganism of the present invention is obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host suitable for the expression vector used when producing the recombinant vector.
  • a host suitable for the expression vector used when producing the recombinant vector for example, when a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector according to the present invention can autonomously replicate in the host, and at the same time, express a DNA containing a promoter, a sugar isomerase gene, a transcription termination sequence, or the like. It is preferable to have a configuration necessary for.
  • pET-28a was used as the expression vector used in the present invention, any expression vector satisfying the above requirements can be used.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in the host, for example, in E. coli or phage such as trp promoter, trc promoter, tac promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter, T3 promoter and the like. Derived promoters can be used.
  • a method of introducing recombinant DNA into bacteria the above-described calcium chloride method, electroporation method and the like can be used.
  • Recombinant vectors also contain fragments with various functions for suppressing, amplifying, and inducing expression, markers for selection of transformants, resistance genes for antibiotics, or genes encoding signals for secretion out of cells. It is also possible to have additional back.
  • Preparation of the modified sugar isomerase according to the present invention is carried out as follows.
  • a transformant obtained by transforming a host with a recombinant vector having a gene encoding a mutated enzyme is cultured, and a sugar isomerase is generated and accumulated as a gene product in a culture (culture cell or culture supernatant) and cultured. This is done by obtaining a sugar isomerase from the compound.
  • any conventional method used for culturing a host may be used.
  • a promoter when culturing a microorganism transformed using an inducible expression vector, a promoter may be added to the medium suitable for the type of promoter.
  • IPTG isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
  • kanamycin is mentioned as an inducer.
  • Acquisition and purification of the mutated sugar isomerase is carried out by centrifugation of the cells or supernatants from the culture obtained, followed by cell disruption, extraction, affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration, or the like. It can carry out by combining suitably.
  • Confirmation that the obtained purified substance is the target enzyme can be performed by a conventional method, for example, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, western blotting or the like.
  • the culture of the transformant using the microorganism as a host, the production of the sugar isomerase by the transformant, the accumulation in the cells and the recovery of the sugar isomerase from the cells are not limited to the above methods.
  • the gene of the sugar isomerase was cloned from E. coli O157: H7 in order to secure a high activity enzyme and to suggest some residues that play an important role in the activity of the enzyme.
  • Recombinant strains with the inserted genes present several residues that play an important role in high activity and increase the activity of recombinant strains producing L-gulose from L-sorbose using mutant enzymes obtained by mutating the residues. You can.
  • the binding activity to the substrate may be increased while increasing the activity of the enzyme. This overcomes the problem of low enzymatic activity of existing sugar isomerase enzymes, which would be useful for the economic production of L-gulose from sugar mixtures.
  • L-gulose produced by sugar isomerization enzyme has a medicinal useful value such as an antiviral agent, but has disadvantages of instability and low enzymatic activity of the enzyme.
  • the present invention is to increase the ability of the substrate to bind to the enzyme by mutating residues that play an important role in the activity of E. coli O157: H7 ( Esherichia coli O157: H7 ) derived from sugar isomerase enzymes In developing an improved enzyme.
  • L-gulose can be efficiently produced using the mutants of the sugar isomerase and the improved sugar isomerase.
  • Figure 1 is a SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of wild-type sugar isomerase and high activity variants EcSI, I112C, T56M, M92L, I112C T56M and I112C T56M M92L derived from E. coli O157: H7 strain.
  • 5 is a graph of kinetic parameters for the EcSI I112C T56M variant.
  • FIG. 7 is a diagram showing the production of L-gulose by time period obtained through reaction under optimized conditions of E. coli O157: H7-derived sugar isomerase.
  • E. coli O157: H7 was incubated at 37 ° C. and centrifuged (8000 ⁇ g, 10 minutes) to obtain cells. Genomic DNA was isolated from the obtained cells, and the primers EcSI F-5'-GGA TCC ATG AAA CGC TCC GCT A-3 '(SEQ ID NO: 1) EcSI R-5'-GTC GAC GCG GAA CTG GCG GTA T-3 '(SEQ ID NO: 2) was prepared and PCR was performed. The nucleotide sequence was analyzed by inserting a PCR product, ie, a gene including a sugar isomerase amplified in Escherichia coli O157: H7, into a pGEM T-easy vector (SEQ ID NO: 4).
  • the recombinant strain prepared in Example 2 was inoculated in LB medium and incubated at 37 to 24 hours, and then the protein expressed in the SDS-PAGE gel was confirmed (FIG. 1).
  • the recombinant strain culture solution was centrifuged (8000xg, 10 minutes) to collect only the cells, and then subjected to sonication to break down the cell wall of Escherichia coli, and at 20,000xg. The precipitate was removed by centrifugation for 20 minutes to obtain a supernatant. Finally, column chromatography using a Ni-NTA Super flow column (GE Healthcare, UK) was performed to purely separate the recombinant sugar isomerase.
  • Example 4-1 Identification of residues that play an important role in activity
  • isoleucine which is a residue showing low binding energy energy at the time of mutation among residues of the substrate binding site, was substituted with cysteine, threonine, which was 56th residue, with methionine, and 92nd residue. Phosphorus methionine was substituted with leucine.
  • the variants were prepared using a site-directed mutagenesis kit (Stratagene, USA). As shown in Table 2, the I112C and T56M variants showed increased activity at the same time as the binding force to the substrate increased.
  • I112C T56M double variant
  • I112C T56M M92L mutant was prepared by selecting residues with the highest kinetic coefficients and metabolic turnover rate was found to increase the metabolic rate compared to the single variant.
  • Table 2 is a table of the intrinsic activity of sugar isomerase.
  • Example 5 L-gulose production at optimal conditions using E. coli O157: H7 derived sugar isomerase
  • the maximum production time of L-gulose was 90 minutes, yielding 22 g / L for EcSI, 28 g / L for the double variant I112C T56M, and I112C T56M M92L for the triple variant.
  • the production rate was 36 g / L. This final yield is very good compared to the results of the prior literature (0.9 g / L) using mannitol 1-dehydrogenase from L-sorbose to L-gulose production.

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Abstract

본 발명은 분자역학 및 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 대장균 O157:H7 (Escherichia coli O157:H7) 유래 당 이성질화 효소의 효소 활성을 향상시키는 것이다. 보다 상세하게는 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 당 이성질화 효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 당 이성질화 효소의 돌연변이체 및 개량된 당 이성질화 효소를 이용한 L-굴로스의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

활성이 개선된 대장균 유래의 돌연변이 당 이성질화 효소 및 그를 이용한 L-굴로스의 생산
본 발명은 분자역학 및 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 대장균 O157:H7 (Escherichia coli O157:H7) 유래 당 이성질화 효소의 효소 활성을 향상시키는 것이다. 보다 상세하게는 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 당 이성질화 효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 당 이성질화 효소의 돌연변이체 및 개량된 당 이성질화 효소를 이용한 L-굴로스의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 의약분야에서 L-탄수화물 및 그의 뉴클레오사이드 유도체의 사용이 크게 증가하고 있는 가운데 변형된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. L-굴로스는 L-리보뉴클레오사이드, L-올리고리보뉴클레오사이드 및 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 핵심 오탄당이다. L-뉴클레오사이드는 D-뉴클레오사이드와 비교할 때, 체내의 뉴클레아제 등의 공격으로부터 높은 안정성을 가지므로 치료용 재료로서 사용될 수 있는 잠재성이 높은 후보 물질이다. L-굴로스가 항바이러스제 및 항생제 등 의약품의 제조 원료로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 최근에 더욱 주목이 집중되고 있어 L-굴로스의 고효율 생물학적 제조방법의 확립이 요구되고 있다.
L-굴로스는 자연계에 소량 존재할 뿐만 아니라, L-굴로스를 생산할 수 있는 효소의 안정성 및 전환효율이 낮아 사업화하는데 어려움이 있다. 따라서, 생촉매를 사용하여 L-굴로스를 생산하는 효소적 생산방법은 효소의 안정성과 높은 활성이 확보되어야 한다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허출원번호 10-1997-0018725
본 발명의 목적은 기능성 당인 L-굴로스의 생물전환에 작용하는 당 이성질화 효소를 실제 산업용 효소로 활용하기 위해서 부위특이적 돌연변이법을 통하여 효소의 활성을 개량하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 개량된 당 이성질화 효소 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 개량된 유전자가 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 개량된 효소가 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 당 이성질화 효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 당 이성질화 효소의 활성에 영향을 미치는 잔기를 제시하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3의 당 이성질화 효소의 56번째 아미노산, 92번째 아미노산 및 112번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이체를 제공한다.
여기서 상기 돌연변이체는 56번째 아미노산인 트리오닌은 메티오닌으로 치환되고, 92번째 아미노산인 메티오닌은 류신으로 치환되며, 112번째 아미노산인 아이소류신은 시스테인으로 치환되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소는 대장균 O157:H7 (Escherichia coli O157:H7) 유래된 것이 바람직하나 화학합성법이나 유전공학적인 방법에 의하여 제조된 당 이성질화 효소도 본 발명의 보호범위에 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 돌연변이 효소는 서열번호 5, 7, 9, 11 또는 13의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6, 8, 10, 12 또는 14의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하여 상기 본 발명의 효소를 발현하는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 돌연변이체 효소의 제조방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 돌연변이체를 이용하여 L-소르보스부터 L-굴로스를 생산성을 향상시키는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 L-굴로스 생산용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 본 발명의 상기 당 이성질화 효소를 이용하여 효소 활성에 중요한 역할을 수행하는 몇몇 잔기를 제시함으로써, 당 이성질화 효소의 활성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 돌연변이 당 이성질화 효소를 이용하여 고활성 당 이성질화 효소를 제공하고 이는 L-굴로스를 효율적으로 생산하는데 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
서열번호 6, 8, 10, 12 및 14는 본 발명의 변이된 당 이성질화 효소 유전자의 염기서열을, 서열번호 5, 7, 9, 11 및 13은 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 표시한다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드가 당 이성질화 효소 활성을 가지는 한, 수 개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 또한 본 발명의 유전자는 서열번호 5, 7, 9, 11및 13으로 표시되는 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여, 축중 코돈에 있어서만 상이한 동일 폴리펩티드를 코딩하는 축중 이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.
본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명에 관한 재조합벡터는 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 당 이성질화 효소 유전자를 함유하는 DNA, 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET-28a를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.
프로모터는, 숙주 속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하다, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 재조합 DNA의 세균내로의 도입방법으로서는 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.
또한 재조합벡터에는 발현의 억제, 증폭, 유도를 위한 각종의 기능을 가진 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자 또는 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 추가로 가진 것도 가능하다.
본 발명에 관한 변이된 당 이성질화 효소의 제조는 다음과 같이 수행한다. 변이된 효소를 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터로 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물 (배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 당 이성질화 효소를 생성 및 축적시켜, 배양물로부터 당 이성질화 효소를 취득함으로써 행하여진다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
또한 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 카나마이신을 유도물질로서 들 수 있다.
변이된 당 이성질화 효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물로부터 균체 또는 상청액을 원심 회수한 후, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.
얻어진 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다.
또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 당 이성질화 효소의 생산과 균체 내에의 축적 및 균체로부터의 당 이성질화 효소의 회수는 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 고활성 효소를 확보하고 효소의 활성에 중요한 역할을 하는 몇몇 잔기를 제시하고자 대장균 O157:H7로부터 당 이성질화 효소의 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 균주가 높은 활성에 중요한 역할을 하는 몇몇 잔기를 제시하고, 해당 잔기를 돌연변이하여 얻어진 돌연변이 효소를 사용하여 재조합 균주가 L-소르보스로부터 L-굴로스를 제조하는 활성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 고활성을 나타내는 여러 당 이성질화 효소 변이체를 이용하여 기질에 대한 결합력을 증가시킴과 동시에 효소의 활성을 증가시킬 수 있었다. 이는 기존의 당 이성질화 효소의 낮은 효소활성 문제점을 극복함으로써, 당 혼합물로부터 L-굴로스의 경제적인 생산에 유용하게 적용될 것이다.
기존에 당 이성질화 효소에 의해 생성되는 L-굴로스는 항바이러스제 등 의약학적으로 유용한 가치를 가지고 있지만, 해당 효소의 불안정성과 낮은 효소활성이라는 단점을 가지고 있다.
따라서 본 발명은 대장균 O157:H7 (Escherichia coli O157:H7) 유래의 당 이성질화 효소의 활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 돌연변이 시킴으로써 기질이 효소에 결합하는 능력을 증가시킴과 동시에 효소의 활성이 증가된 개량된 효소를 개발함에 있다. 또한 상기 당 이성질화 효소의 돌연변이체 및 개량된 당 이성질화 효소를 이용하여 효율적으로 L-굴로스를 제조할 수 있다.
도 1은 대장균 O157:H7 균주로부터 유래된 야생형 당 이성질화 효소 및 고활성 변이체인 EcSI, I112C, T56M, M92L, I112C T56M 및 I112C T56M M92L의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 사진이다.
도 2-3은 분자역학적(molecular mechanics) 기반으로 분석된 EcSI의 기질이 결합하는 활성부위에 대한 컴퓨터 분석. (A) 야생형균주 (B) 삼중변이체 EcSI I112C T56M M92L
도 4는 야생형 EcSI 효소의 동역학적 매개변수 그래프.
도 5는 EcSI I112C T56M 변이체의 대한 동역학적 매개변수 그래프.
도 6은 EcSI I112C T56M M92L 변이체의 대한 동역학적 매개변수 그래프.
도 7은 대장균 O157:H7 유래의 당 이성질화 효소의 최적화된 조건에서의 반응을 통하여 얻어진 시간대 별 L-굴로스의 생산량을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기의 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 당 이성질화 효소의 유전자 클로닝
대장균 O157:H7를 37℃에서 배양하고, 원심분리(8000xg, 10분)하여 균체를 수득하였다. 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 대장균 O157:H7의 당 이성질화 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 EcSI F-5'- GGA TCC ATG AAA CGC TCC GCT A-3' (서열번호 1) EcSI R-5'-GTC GAC GCG GAA CTG GCG GTA T-3' (서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 대장균 O157:H7에서 증폭된 당 이성질화 효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다 (서열번호 4).
실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
실시예 1에 따른 당 이성질화 효소를 암호화하는 유전자를 이용하여 전기 당 이성질화 효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET-28a(Novagen, 독일)의 BamHI과 SalI 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다.
실시예 3: 재조합 당 이성질화 효소의 발현 및 순수 분리
상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 1).
상기 실시예 3의 방법으로 발현시킨 재조합 당 이성질화 효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000xg, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 최종적으로 Ni-NTA Super flow 컬럼 (GE Healthcare, 영국)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 재조합 당 이성질화 효소를 순수 분리하였다.
실시예 4: 고활성을 가진 당 이성질화 효소의 변이체 제작
실시예 4-1: 활성에 중요 역할을 하는 잔기의 확인
상기 실시예 3에서 순수 분리한 당 이성질화 효소를 이용하여 고활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 탐색하기 위해 Discovery Studio 3.1과 Meterials Studio 6.0 (Accelrys Inc. San Diego, CA, 미국)의 양자역학(Quantum mechanics)/분자역학(molecular mechanics) 방법을 사용하였다. 도 2 및 3과 같이 효소의 기질 결합부위의 잔기들을 치환한 돌연변이체의 결합에너지(Kcal/mol)를 야생 효소의 결합에너지와 비교하였다. 결합에너지는 그 값이 낮을수록 결합력이 강한 것으로 알려져 있다. 표 1과 같이, I112C, T56M, M92L 변이효소가 야생 효소보다 결합력이 낮았으며, I112 T56, M92 잔기를 돌연변이를 위한 목적 잔기로 선정하였다.
표 1
효소 결합에너지(Kcal/mol)
WT -188
I112C -194
T56M -192
M92L -189
실시예 4-2: I112C, T56M, M92L 변이체의 동역학적 매개변수
상기 실시 예 4-1에서와 같이 기질 결합부위의 잔기 중 돌연변이 시에 낮은 결합에너지 에너지를 나타낸 잔기인 112번째 잔기인 아이소류신을 시스테인으로, 56번째 잔기인 트레오닌을 메티오닌으로 치환하였고, 92번째 잔기인 메티오닌을 류신으로 치환하였다. 해당 변이체를 site-directed mutagenesis kit (Stratagene, 미국)를 이용하여 제작하였으며, 표 2에 나타난 바와 같이 I112C 변이체와 T56M 변이체가 기질에 대한 결합력이 증가하면서 동시에 활성이 증가하는 것을 알 수 있다. 또한 가장 동역학 계수가 높은 잔기를 선별하여 이중변이체인 I112C T56M와 삼중변이체인 I112C T56M M92L 돌연변이체를 제작하고 대사회전율을 확인한 결과 단일 변이체에 비하여 대사회전율이 증가함을 알 수 있다. 표 2는 당 이성질화 효소의 고유 활성도에 대한 표이다.
표 2
효소 Km (mM) kcat (S-1) kcat/Km (mM-1S-1)
EcSI 133 84 0.63
I112C 95 88 0.92
T56M 118 101 0.85
M92L 149 105 0.70
I112C T56M 94 144 1.53
I112C T56M M92L 107 245 2.28
실시예 5: 대장균 O157:H7 유래 당 이성질화 효소를 이용한 최적 조건에서의 L-굴로스 생산
당 이성질화 효소를 이용한 최대 L-굴로스 생산을 위하여 최적 조건에서 이성화 반응을 수행하였다. 0.2 M glycin-NaOH pH 8 buffer에서 반응을 진행하였고, 10 mg의 당 이성질화 효소, 40℃, 기질인 L-소르보스 74 g/L의 존재 하에 200 rpm으로 교반배양하여 L-굴로스 생산 실험을 수행하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, L-굴로스의 최대 생산 시간은 90분이었으며 EcSI의 경우 22 g/L의 생산량을 보였으며, 이중변이체인 I112C T56M에서는 28 g/L, 삼중변이체인 I112C T56M M92L에서는 36 g/L의 생산율을 보였다. 이러한 최종 수율은 L-소르보스부터 L-굴로스 생산에서 만니톨 1-탈수소효소를 사용한 선행문헌의 결과 (0.9 g/L)에 비해 매우 우수한 수치이다.

Claims (9)

  1. 서열번호 3의 당 이성질화 효소의 56번째 아미노산, 92번째 아미노산 및 112번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이체: 상기 돌연변이체에서 56번째 아미노산인 트리오닌은 메티오닌으로 치환되고, 92번째 아미노산인 메티오닌은 류신으로 치환되며, 112번째 아미노산인 아이소류신은 시스테인으로 치환됨.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 효소는 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) 유래 당 이성질화 효소인 것을 특징으로 하는 돌연변이체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 돌연변이 효소는 서열번호 5, 7, 9, 11 또는 13의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 돌연변이체.
  4. 제 1항의 돌연변이체 효소를 코딩하는 유전자.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6, 8, 10, 12 또는 14의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  6. 제 4항 또는 제 5항의 유전자를 포함하는 재조합벡터.
  7. 제 6항의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하여 제1항의 효소를 발현하는 단계를 포함하는 제1항의 돌연변이체 효소의 제조방법.
  8. 제 1항의 돌연변이체를 이용하여 L-소르보스부터 L-굴로스 생산성을 향상하는 방법.
  9. 제 1항의 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 L-굴로스 생산용 조성물.
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