WO2013168908A1 - 활성이 개선된 네우로스포라 크라사 유래의 신규한 돌연변이 엘-아라비톨 탈수소효소 - Google Patents

활성이 개선된 네우로스포라 크라사 유래의 신규한 돌연변이 엘-아라비톨 탈수소효소 Download PDF

Info

Publication number
WO2013168908A1
WO2013168908A1 PCT/KR2013/003317 KR2013003317W WO2013168908A1 WO 2013168908 A1 WO2013168908 A1 WO 2013168908A1 KR 2013003317 W KR2013003317 W KR 2013003317W WO 2013168908 A1 WO2013168908 A1 WO 2013168908A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
arabitol dehydrogenase
mutant
enzyme
present
arabitol
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/003317
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이정걸
문희정
쿠마 티와리마니쉬
김태수
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to US14/364,631 priority Critical patent/US9303278B2/en
Publication of WO2013168908A1 publication Critical patent/WO2013168908A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01012—L-Arabinitol 4-dehydrogenase (1.1.1.12)

Definitions

  • the present invention improves the enzymatic activity of L-arabitol dehydrogenase derived from Neurospora crassa using molecular dynamics and site specific mutations. More specifically, L-arabitol dehydrogenase whose enzymatic activity is improved by mutation, a nucleic acid molecule encoding the same, a vector comprising the nucleic acid molecule, a transformant comprising the vector, the L-arabitol dehydrogenase Mutants and improved L-arabitol dehydrogenases.
  • L-xylulose is a key pentose sugar that constitutes the backbone in the synthesis of L-ribonucleosides, L-oligoribonucleosides and many therapeutic agents.
  • L-nucleosides are high potential candidates that can be used as therapeutic materials because they have high stability against nucleases and the like in the body when compared to D-nucleosides.
  • L-ribose is known to be highly useful as a raw material for the manufacture of pharmaceuticals such as antiviral agents and anticancer agents, attention has recently been focused on the establishment of a high-efficiency biological manufacturing method of L-xylulose.
  • xylose and xylulose produced from hydrolysis of plant materials have disadvantages such as high price and high production cost.
  • Hydrolysis treatment of plant material results in low yield and low purity, acid and fuel used for hydrolysis must be removed by ion exchange treatment after hydrolysis treatment, and further purification is required to be suitable for food use. This ion exchange and crystallization treatment leads to an increase in production costs.
  • L-xylulose is not only present in nature in small amounts, but also difficult to commercialize due to the low stability and enzyme activity of enzymes capable of producing L-xylulose (Sullivan, R., Zhao, H. (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol., 77, 472-474). Therefore, the enzymatic production method for producing L-xylulose using a biocatalyst should ensure the stability and high activity of the enzyme.
  • the present invention has been made by the above necessity, and an object of the present invention is to use L-arabitol dehydrogenase, which acts on the bioconversion of the functional sugar L-xylulose, as a practical industrial enzyme, through site-specific mutagenesis. It is to improve the activity of the enzyme.
  • a fourth object of the present invention is to provide a recombinant ribitol dehydrogenase using recombinant E. coli transformed with the improved enzyme.
  • a fifth object of the present invention is to propose a residue that affects the activity of L-arabitol dehydrogenase using the enzyme.
  • the present invention provides a mutant in which the 58 th amino acid histidine of L-arabitol dehydrogenase of SEQ ID NO: 3 is substituted with alanine, the mutant 104 is substituted with alanine, and the 191 th amino acid isoleucine.
  • a mutant L-arabitol dehydrogenase selected from the group consisting of a mutant substituted with alanine and valine, a mutant with 282 isoleucine substituted with leucine, and a mutant with 306 amino acid glutamine substituted with alanine.
  • the enzyme is preferably derived from neurospora crassa ( Neuropora crassa ), but L- arabitol dehydrogenase prepared by chemical synthesis or genetic engineering method also the scope of protection of the present invention Included in
  • the mutant enzyme preferably has an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, and 15, but is viewed through one or more substitutions, deletions, inversions, translocations, and the like. Mutants that achieve the effect that the invention is intended to achieve are also included in the scope of the invention.
  • the present invention also provides a gene encoding the enzyme of the present invention.
  • the gene preferably has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14 and 16, but the present invention through one or more substitutions, deletions, inversions, translocations, etc. in this sequence Mutants that achieve this effect are also within the scope of the present invention.
  • the present invention provides a recombinant vector comprising the gene of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing the mutant enzyme of the present invention comprising the step of expressing the enzyme of the present invention by producing a transformant by transforming the recombinant vector of the present invention into a microorganism.
  • the present invention can be used to improve the productivity of L- arabitol to L-xylulose using the mutant of the present invention.
  • the present invention provides a basis for identifying activity determinants of dehydrogenases by presenting important residues that can regulate the enzymatic activity of the L-arabitol dehydrogenase of the present invention.
  • the present invention also provides a highly active L-arabitol dehydrogenase using the mutant L-arabitol dehydrogenase of the present invention, which can be used to efficiently produce L-xylulose.
  • SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, and 16 show the nucleotide sequences of the mutated L-arabitol dehydrogenase gene of the present invention, and SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, and 15 encode the genes. Amino acid sequence is indicated. As described above, as long as the polypeptide having the amino acid sequence has L-arabitol dehydrogenase activity, there may be a variation in deletion, substitution, addition or the like of several amino acids.
  • the gene of the present invention includes a degenerate isomer that encodes the same polypeptide which differs only in degenerate codons, in addition to those having a nucleotide sequence encoding the amino acids represented by SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14 and 16. .
  • mutations such as deletions, substitutions, and additions can be introduced by site mutation introduction methods (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, p. 811, 1994) and the like.
  • the transformed microorganism of the present invention is obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host suitable for the expression vector used when producing the recombinant vector.
  • a host suitable for the expression vector used when producing the recombinant vector for example, when a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector according to the present invention is capable of autonomous replication in the host, and at the same time, a promoter, DNA containing L-Arabitol dehydrogenase gene, transcription termination sequence, and the like. It is preferable to have a structure necessary for the expression of.
  • pET-28a was used as the expression vector used in the present invention, any expression vector satisfying the above requirements can be used.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in the host.
  • Derived promoters can be used.
  • the above-described calcium chloride method, electroporation method and the like can be used as a method of introducing recombinant DNA into bacteria.
  • Recombinant vectors also contain fragments with various functions for suppressing, amplifying, and inducing expression, markers for selection of transformants, resistance genes for antibiotics, or genes encoding signals for secretion out of cells. It is also possible to have additional back.
  • Preparation of the mutated L-arabitol dehydrogenase according to the present invention is carried out as follows.
  • a transformant obtained by transforming a host with a recombinant vector having a gene encoding a mutated enzyme is cultured, and a L-arabitol dehydrogenase, a gene product, is produced and accumulated in a culture (culture medium or culture supernatant), This is done by obtaining L-arabitol dehydrogenase from the culture.
  • any conventional method used for culturing a host may be used.
  • a promoter when culturing a microorganism transformed using an inducible expression vector, a promoter may be added to the medium suitable for the type of promoter.
  • IPTG isopropyl-D-thiogalactopyranoside
  • kanamycin is mentioned as an inducer.
  • Acquisition and purification of the mutated L-arabitol dehydrogenase is performed by centrifugation of cells or supernatants from the obtained culture, followed by cell disruption, extraction, affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration, and the like. Can be performed alone or in combination as appropriate.
  • Confirmation that the obtained purified substance is the target enzyme can be performed by a conventional method, for example, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, western blotting or the like.
  • the gene of L-Arabitol dehydrogenase was cloned from the neurospora krasa in order to secure a high activity enzyme and to suggest some residues that play an important role in the activity of the enzyme. By presenting residues that play an important role in high activity, it was found that it could provide a basis for the identification of high activity determinants. Mutant enzymes obtained by mutating residues that play an important role in enzyme activity can be used to increase the activity of converting L-arabitol to L-xylulose.
  • K m value for the substrate of NcLAD H58A which is a variant of residues that play an important role in activity using the neurospora Krasa-derived L-arabitol dehydrogenase (NcLAD) obtained in the present invention, is 6.57 mM, k cat value 3220 min -1 , K m value for the substrate of NcLAD P104A is 3 mM, k cat value is 1320 min -1 , K m value for the substrate of NcLAD I191A is 48.1 mM, and k cat value is 4780 min -1 K m value for the substrate of NcLAD I191V is 6.07 mM, k cat value is 3940 min -1 , K m value for the substrate of NcLAD I282L is 5.7 mM, k cat value is 3790 min -1 , NcLAD Q306A The K m value for the substrate is 6.0 mM and the k cat value is 1820 min ⁇ 1
  • L-arabitol dehydrogenase variants exhibiting high activity in the present invention were able to increase the binding activity to the substrate and at the same time increase the activity of the enzyme. This overcomes the problem of low enzymatic activity of the existing L-arabitol dehydrogenase, thereby making it useful for economic production of L-xylulose from sugar mixtures.
  • L-xylulose produced by L-arabitol dehydrogenase has a medicinal useful value such as an antiviral agent, but has disadvantages such as instability and low enzymatic activity of the enzyme.
  • the present invention is to increase the ability of the substrate to bind to the enzyme by mutating a residue that plays an important role in the activity of L- arabitol dehydrogenase derived from Neurospora crassa ( Neuropora crassa ) In developing an improved enzyme.
  • 1 A and B are SDS-polyacrylamide gel electrophoresis images of wild type L-arabitol dehydrogenase and high activity variants NcLAD H58A, P104A, I191A, I191V, I282L and NcLAD Q306A derived from the neurospora Krasa strain to be.
  • 3 is a graph of kinetic parameters of wild type NcLAD enzyme.
  • 5 is a graph of kinetic parameters for NcLAD Q306A variants.
  • Neuurospor Krasa (ATCC 10333, US standard strain culture storage, US) was incubated at 24 °C, centrifuged (8000 g, 10 minutes) to obtain the cells. Genomic DNA was isolated from the obtained cells, and primer NcLAD F-5'-GTA GCT ACG TCA GAA TTC CAT GGC TTC TAG CGC TTC using nucleotide sequence of gene encoding L-arabitol dehydrogenase C-3 '(SEQ ID NO: 1) NcLAD R-5'-GCT GAT TCT GCG GCC GCT TA C TCC AGA CTC TGG ATC-3' (SEQ ID NO: 2) was prepared and PCR was performed.
  • the nucleotide sequence was analyzed by inserting a PCR product, that is, a gene containing L-arabitol dehydrogenase amplified in Zymonas mobilis into a pGEM T-easy vector (SEQ ID NO: 4).
  • the recombinant strain prepared in Example 2 was inoculated in LB medium and incubated at 37 ° C. for 24 hours to confirm the protein expressed in the SDS-PAGE gel (FIG. 1).
  • the recombinant strain culture solution was centrifuged (8000xg, 10 minutes) to collect only the cells, and sonicated to break the cell wall of E. coli, 20,000 The precipitate was removed by centrifugation at xg for 20 minutes to obtain a supernatant. The precipitate was removed by centrifugation at 20,000xg for 20 minutes to obtain a supernatant, and finally, purified by separating the recombinant L-arabitol dehydrogenase by column chromatography using a Ni-NTA Super flow column (GE Healthcare, UK). It was.
  • Example 4-1 Identification of residues that play an important role in activity
  • Quantum Mechanics of Discovery Studio 3.1 and Meterials Studio 6.0 (Accelrys Inc. San Diego, CA, USA) to search for residues that play an important role in high activity using L-arabitol dehydrogenase purely isolated in Example 3 (Quantum mechanics) / molecular mechanics method was used.
  • the binding energy (Kcal / mol) of the mutant in which residues at the substrate binding site of the enzyme were replaced with alanine was compared with the binding energy of the wild enzyme. It is known that the lower the binding energy is, the stronger the binding force is.
  • H58A, P104A, I191A, I191V, I282L, and Q306A mutase had lower binding energy than wild enzymes, and H58 P104, I191, I282, and Q306 residues were selected as target residues for mutation.
  • Example 4-1 histidine, the 58th residue, was substituted with alanine, proline, the 104th residue, with alanine, and the 191th residue, iso, among the residues of the substrate binding site.
  • Leucine was replaced with alanine and valine, 282th residue isoleucine with leucine, and 306th residue glutamine with alanine.
  • the variants were constructed using a site-directed mutagenesis kit (Stratagene, USA). As shown in Table 2, the Q306A variant, the H58A variant, the I191V variant, and the I282L variant showed increased activity at the same time as the binding force to the substrate increased. could know.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 양자역학 및 분자역학 기술과 부분 돌연변이기술을 이용하여 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래 L-아라비톨 탈수소효소의 안정성 및 효소 활성을 증가시키는 것이다. 보다 상세하게는 양자역학 및 분자역학에 기반한 스크리닝을 통해 효소 안정성에 영향을 끼치는 잔기를 찾고, 탐색된 잔기의 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 L-아라비톨 탈수소효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 돌연변이체 및 개량된 L-아라비톨 탈수소효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

활성이 개선된 네우로스포라 크라사 유래의 신규한 돌연변이 엘-아라비톨 탈수소효소
본 발명은 분자역학 및 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래 L-아라비톨 탈수소효소의 효소 활성을 향상시키는 것이다. 보다 상세하게는 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 L-아라비톨 탈수소효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 돌연변이체 및 개량된 L-아라비톨 탈수소효소의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 의약분야에서 L-탄수화물 및 그의 뉴클레오사이드 유도체의 사용이 크게 증가하고 있는 가운데 변형된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. L-자일룰로스는 L-리보뉴클레오사이드, L-올리고리보뉴클레오사이드 및 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 핵심 오탄당이다. L-뉴클레오사이드는 D-뉴클레오사이드와 비교할 때, 체내의 뉴클레아제 등의 공격으로부터 높은 안정성을 가지므로 치료용 재료로서 사용될 수 있는 잠재성이 높은 후보 물질이다. L-리보오스가 항바이러스제 및 항암제 등 의약품의 제조 원료로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 최근에 더욱 주목이 집중되고 있어 L-자일룰로스의 고효율 생물학적 제조방법의 확립이 요구되고 있다.
상기의 중요성 및 유용성에도 불구하고, 식물재의 가수분해로부터 생산된 자일로스 및 자일룰로스는 고가 및 높은 생산 비용 등의 단점이 있다. 식물재의 가수분해 처리는 낮은 수율 및 저순도를 초래하고, 가수분해에 사용된 산과 연료는 가수분해 처리 후 이온교환 처리에 의해 제거되어야만 하며, 식품용으로 적합하기 위해서는 추가 정제가 요구된다. 이러한 이온교환 및 결정화 처리는 생산 비용의 증가를 가져온다. 따라서, 미생물 및 그의 효소를 사용하여 L-아라비톨로부터 L-자일룰로스를 생화학적으로 생산하는 방법이 시도되고 있으며 (Suzuki, T., Tran, L. H., Yoqo, M., Idota, O., Kitamoto, N., Kawai, K., Takamizawa, K.(2005) J. Biosci. Bioeng. 100(4), 493-497), 생촉매를 사용하여 L-자일룰로스를 생산하는 효소적 생산방법은 상기 단점을 극복할 수 있을 것으로 기대된다. D-자일룰로스와 달리 L-자일룰로스는 자연계에 소량 존재할 뿐만 아니라, L-자일룰로스를 생산할 수 있는 효소의 안정성 및 효소활성이 낮아 사업화하는데 어려움이 있다 (Sullivan, R., Zhao, H. (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol., 77, 472-474). 따라서, 생촉매를 사용하여 L-자일룰로스를 생산하는 효소적 생산방법은 효소의 안정성과 높은 활성이 확보되어야 한다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 기능성 당인 L-자일룰로스의 생물전환에 작용하는 L-아라비톨 탈수소효소를 실제 산업용 효소로 활용하기 위해서 부위특이적 돌연변이법을 통하여 효소의 활성을 개량하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 개량된 L-아라비톨 탈수소효소 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 개량된 유전자가 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 개량된 효소가 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 리비톨 탈수소효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 L-아라비톨 탈수소효소의 활성에 영향을 미치는 잔기를 제시하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3의 L-아라비톨 탈수소효소의 58번째 아미노산 히스티딘이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 104번째 아미노산 프롤린이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 191번째 아미노산 이소루신이 알라닌과 발린으로 치환된 돌연변이체, 282번째 이소루신이 류신으로 치환된 돌연변이체, 및 306번째 아미노산 글루타민이 알라닌으로 치환된 돌연변이체로 구성된 군으로부터 선택된 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소는 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 유래된 것이 바람직하나 화학합성법이나 유전공학적인 방법에 의하여 제조된 L-아라비톨 탈수소효소도 본 발명의 보호범위에 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 돌연변이 효소는 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 및 15 의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14 및 16 의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하여 상기 본 발명의 효소를 발현하는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 돌연변이체 효소의 제조방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 돌연변이체를 이용하여 L-아라비톨부터 L-자일룰로스로의 생산성을 향상시키는데 이용할 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 본 발명의 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 효소 활성을 조절할 수 있는 중요 잔기를 제시함으로써, 탈수소효소의 활성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 고활성 L-아라비톨 탈수소효소를 제공하고 이는 L-자일룰로스를 효율적으로 생산하는데 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
서열번호 6, 8, 10, 12, 14 및 16은 본 발명의 변이된 L-아라비톨 탈수소효소 유전자의 염기서열을, 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 및 15은 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 L-아라비톨 탈수소효소 활성을 가지는 한, 수 개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 또한 본 발명의 유전자는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14 및 16으로 표시되는 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여, 축중 코돈에 있어서만 상이한 동일 폴리펩티드를 코딩하는 축중 이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.
본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명에 관한 재조합벡터는 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, L-아라비톨 탈수소효소 유전자를 함유하는 DNA, 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET-28a를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.
프로모터는, 숙주 속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 재조합 DNA의 세균내로의 도입방법으로서는 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.
또한 재조합벡터에는 발현의 억제, 증폭, 유도를 위한 각종의 기능을 가진 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자 또는 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 추가로 가진 것도 가능하다.
본 발명에 관한 변이된 L-아라비톨 탈수소효소의 제조는 다음과 같이 수행한다. 변이된 효소를 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터로 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물 (배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 L-아라비톨 탈수소효소를 생성 및 축적시켜, 배양물로부터 L-아라비톨 탈수소효소를 취득함으로써 행하여진다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
또한 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면 이소프로필--D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 카나마이신을 유도물질로서 들 수 있다.
변이된 L-아라비톨 탈수소효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물로부터 균체 또는 상청액을 원심분리하여 회수한 후, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.
얻게 된 정제물질이 목적 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴 블로팅 등에 의해 행할 수 있다.
또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 L-아라비톨 탈수소효소의 생산과 균체 내에의 축적 및 균체로부터의 L-아라비톨 탈수소효소의 회수는 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 고활성 효소를 확보하고 효소의 활성에 중요한 역할을 하는 몇몇 잔기를 제시하고자 네우로스포라 크라사로부터 L-아라비톨 탈수소효소의 유전자를 클로닝하였다. 높은 활성에 중요한 역할을 하는 잔기들을 제시함으로써, 고활성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공할 수 있음을 확인하였다. 효소 활성에 중요 역할을 하는 잔기를 돌연변이하여 얻어진 돌연변이 효소를 사용하여 L-아라비톨로부터 L-자일룰로스로 전환시키는 활성을 증가시킬 수 있었다.
본 발명에서 얻어진 네우로스포라 크라사 유래 L-아라비톨 탈수소효소(NcLAD)를 이용하여 활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 치환한 변이체인 NcLAD H58A의 기질에 대한 Km 값은 6.57 mM, k cat 값은 3220 min-1, NcLAD P104A의 기질에 대한 Km 값은 3 mM, k cat 값은 1320 min-1이고, NcLAD I191A의 기질에 대한 Km 값은 48.1 mM, k cat 값은 4780 min-1이고, NcLAD I191V의 기질에 대한 Km 값은 6.07 mM, k cat 값은 3940 min-1이고, NcLAD I282L의 기질에 대한 Km 값은 5.7 mM, k cat 값은 3790 min-1, NcLAD Q306A의 기질에 대한 Km 값은 6.0 mM, k cat 값은 1820 min-1이다.
본 발명에서 고활성을 나타내는 여러 L-아라비톨 탈수소효소 변이체를 이용하여 기질에 대한 결합력을 증가시킴과 동시에 효소의 활성을 증가시킬 수 있었다. 이는 기존의 L-아라비톨 탈수소효소의 낮은 효소활성 문제점을 극복함으로써, 당 혼합물로부터 L-자일룰로스의 경제적인 생산에 유용하게 적용될 것이다.
L-아라비톨 탈수소효소에 의해 생성되는 L-자일룰로스는 항바이러스제 등 의약학적으로 유용한 가치를 가지고 있지만, 해당 효소의 불안정성과 낮은 효소활성이라는 단점을 가지고 있다.
따라서 본 발명은 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래의 L-아라비톨 탈수소효소의 활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 돌연변이 시킴으로써 기질이 효소에 결합하는 능력을 증가시킴과 동시에 효소의 활성이 증가된 개량된 효소를 개발함에 있다. 또한 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 돌연변이체 및 개량된 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 효율적으로 L-자일룰로스를 제조할 수 있다.
도 1 A, B은 네우로스포라 크라사 균주로부터 유래된 야생형 L-아라비톨 탈수소효소 및 고활성 변이체인 NcLAD H58A, P104A, I191A, I191V, I282L 및 NcLAD Q306A의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 사진이다.
도 2는 분자역학적(molecular mechanics) 기반으로 분석된 NcLAD의 기질이 결합하는 활성부위에 대한 컴퓨터 분석.
도 3은 야생형 NcLAD 효소의 동역학적 매개변수 그래프.
도 4는 NcLAD P104A 변이체의 대한 동역학적 매개변수 그래프.
도 5는 NcLAD Q306A 변이체의 대한 동역학적 매개변수 그래프.
이하, 본 발명을 다음의 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: L-아라비톨 탈수소효소의 유전자 클로닝
네우로스포라 크라사 (ATCC 10333, 미국표준균주배양수록보존소, 미국)를 24℃에서 배양하고, 원심분리(8000 g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 네우로스포라 크라사의 L-아라비톨 탈수소효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 NcLAD F-5'-GTA GCT ACG TCA GAA TTC CAT GGC TTC TAG CGC TTC C-3' (서열번호 1) NcLAD R-5'-GCT GAT TCT GCG GCC GCT TAC TCC AGA CTC TGG ATC-3'(서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 자이모모나스 모빌리스에서 증폭된 L-아라비톨 탈수소효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다 (서열번호 4).
실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
실시예 1에 따른 L-아라비톨 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 이용하여 전기 L-아라비톨 탈수소효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET-28a(Novagen, 독일)의 EcoRI과 NotI 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다.
실시예 3: 재조합 L-아라비톨 탈수소효소의 발현 및 순수 분리
상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 1).
상기 실시예 3의 방법으로 발현시킨 재조합 L-아라비톨 탈수소효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000xg, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA Super flow 컬럼 (GE Healthcare, 영국)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 재조합 L-아라비톨 탈수소효소를 순수 분리하였다.
실시예 4: 고활성을 가진 L-아라비톨 탈수소효소의 변이체 제작
실시예 4-1: 활성에 중요 역할을 하는 잔기의 확인
상기 실시예 3에서 순수 분리한 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 고활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 탐색하기 위해 Discovery Studio 3.1과 Meterials Studio 6.0 (Accelrys Inc. San Diego, CA, 미국)의 양자역학(Quantum mechanics)/분자역학(molecular mechanics) 방법을 사용하였다. 도 2와 같이 효소의 기질 결합부위의 잔기들을 알라닌으로 치환한 돌연변이체의 결합에너지(Kcal/mol)를 야생 효소의 결합에너지와 비교하였다. 결합에너지는 그 값이 낮을수록 결합력이 강한 것으로 알려져 있다. 표 1과 같이, H58A, P104A, I191A, I191V, I282L, Q306A 변이효소가 야생 효소보다 결합에너지가 낮았으며, H58 P104, I191, I282, Q306잔기를 돌연변이를 위한 목적 잔기로 선정하였다.
표 1
효소 A+B (효소 기질복합체) A(기질) B (효소) BEQM(Hartree) 결합에너지(Kcal/mol)
WT -12815.40 -569.62 -12245.7189 -0.062 -39.0
P104A -12738.67 -569.62 -12168.9862 -0.065 -40.75
L165A -13544.17 -569.52 -12974.8792 0.225 141.3
I191A -12628.70 -569.62 -12059.0203 -0.066 -41.9
Q306A -12608.94 -569.62 -12039.2535 -0.068 -42.8
Y307A -13544.17 -569.31 -12974.8792 0.025 15.9
R308A -13544.17 -569.61 -12974.5622 0.008156 5.1
Y309A -13544.17 -569.22 -12974.8792 0.005156 3.2
H58A -12592.10017 -569.622357 -12022.38216 -0.095657 -60.1
I191V -12698.57709 -569.613965 -12128.84528 -0.117849 -74.0
I282L -12698.42002 -569.623466 -12128.71014 -0.086416 -54.2
실시예 4-2: H58A, P104A, I191A, I191V, I282L, Q306A 변이체의 동역학적 매개변수
상기 실시 예 4-1에서와 같이 기질 결합부위의 잔기 중 돌연변이 시에 낮은 결합에너지를 나타낸 잔기인 58번째 잔기인 히스티딘을 알라닌으로, 104번째 잔기인 프롤린을 알라닌으로 치환하였고, 191번째 잔기인 이소루신을 알라닌과 발린으로, 282번째 잔기인 이소루신을 류신으로, 306번째 잔기인 글루타민이 알라닌으로 치환하였다. 해당 변이체를 site-directed mutagenesis kit (Stratagene, 미국)를 이용하여 제작하였으며, 표 2에 나타난 바와 같이 Q306A 변이체, H58A 변이체, I191V 변이체 및 I282L 변이체가 기질에 대한 결합력이 증가하면서 동시에 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다.
표 2
효소 Km kcat(min-1)
조효소 (μM) 기질 (mM)
NcLADWT 0.9 16.3 1600
P104A 0.9 3.0 1320
L165A ND ND ND
Q306A 1.5 6.0 1820
Y307A ND ND ND
R308A ND ND ND
Y309A ND ND ND
H58A 1.2 6.57 3220
I191A 1.4 48.1 4780
I191V 1.3 6.07 3940
I282L 1.7 5.7 3790

Claims (9)

  1. 서열번호 3의 L-아라비톨 탈수소효소의 58번째 아미노산 히스티딘이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 104번째 아미노산 프롤린이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 191번째 이소루신이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 191번째 이소루신이 발린으로 치환된 돌연변이체, 282번째 이소루신이 류신으로 치환된 돌연변이체, 및 306번째 글루타민이 알라닌으로 치환된 돌연변이체 군으로부터 선택된 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 효소는 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래 L-아라비톨 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 돌연변이체 효소는 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 또는 15의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소.
  4. 제 1항의 효소를 코딩하는 유전자.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  6. 제 4항 또는 제 5항의 유전자를 포함하는 재조합벡터.
  7. 제6항의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하고 제1항의 효소를 발현하는 단계를 포함하는 제1항의 돌연변이체 효소의 제조방법.
  8. 제 1항의 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 L-자일룰로스를 제조하는 방법.
  9. 제 1항의 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 유효성분으로 포함하는 L-자일룰로스 제조용 조성물.
PCT/KR2013/003317 2012-05-10 2013-04-18 활성이 개선된 네우로스포라 크라사 유래의 신규한 돌연변이 엘-아라비톨 탈수소효소 WO2013168908A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/364,631 US9303278B2 (en) 2012-05-10 2013-04-18 Mutant L-arabitol dehydrogenase derived from neurospora crassa with enhanced activity

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20120049433 2012-05-10
KR10-2012-0049433 2012-05-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013168908A1 true WO2013168908A1 (ko) 2013-11-14

Family

ID=49550903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/003317 WO2013168908A1 (ko) 2012-05-10 2013-04-18 활성이 개선된 네우로스포라 크라사 유래의 신규한 돌연변이 엘-아라비톨 탈수소효소

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9303278B2 (ko)
KR (1) KR101479136B1 (ko)
WO (1) WO2013168908A1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001008682A (ja) 1999-06-24 2001-01-16 Ajinomoto Co Inc Ｄ−アラビトール、ｄ−キシルロース及びキシリトールの製造法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAE, BRIAN ET AL.: "Structure and engineering of L-arabinitol dehydrogenase from Neurospora crassa", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 402, 22 July 2010 (2010-07-22), pages 230 - 240 *
DE GROOT, MARCO J, L. ET AL.: "Regulation ofPentose catabolic pathway genes of Aspergillus niger", FOOD TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 45, no. 2, 2007, pages 134 - 138 *
KIM, BYONG JIN ET AL.: "Cloning, characterization, and engineering of fungal L-arabinitol dehydrogenases", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 87, no. 4, 23 April 2010 (2010-04-23), pages 1407 - 1414 *
RUTTEN, LUCY ET AL.: "A single amino acid residue(Y318F) in the L-arabitol dehydrogenase (LadA) from Aspergillus niger results in a significant increase affinitiy for D-sorbitol", BMC MICROBIOLOGY, vol. 9, 12 August 2009 (2009-08-12), pages 166 *
SULLIVAN, RYAN ET AL.: "Cloning, characterization, and mutational analysis of a highly active and stable L-arabinitol 4- dehydrogenase from Neurospora crassa", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 77, 16 October 2007 (2007-10-16), pages 845 - 852 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101479136B1 (ko) 2015-01-05
US20140370554A1 (en) 2014-12-18
US9303278B2 (en) 2016-04-05
KR20130126470A (ko) 2013-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11512301B2 (en) Composition for producing tagatose from fructose-6-phosphate and method of producing tagatose from fructose-6-phosphate using the same
CN110373397B (zh) 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
WO2015016544A1 (ko) 알돌레이즈, 알돌레이즈 돌연변이체 및 이를 이용한 타가토스 생산 방법과 생산용 조성물
CN111254129B (zh) 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用
WO2018093153A1 (ko) 신규한 d-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법
CN107858340B (zh) 高催化活性的d-果糖-6-磷酸醛缩酶a突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用
TW201842187A (zh) 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法
WO2020067649A1 (ko) 신규 과당-4-에피머화 효소 및 이를 이용한 타가토스의 제조 방법
WO2019098723A1 (ko) 신규한 d-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법
WO2021221418A1 (ko) 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법
JP2024515083A (ja) β－ニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するための酵素組成物及びその応用
TWI719140B (zh) 新型多磷酸鹽依存性葡萄糖激酶與使用其製備葡萄糖-6-磷酸的方法
CN115927513A (zh) 一种生物酶制备β-烟酰胺单核苷酸的方法
WO2013168908A1 (ko) 활성이 개선된 네우로스포라 크라사 유래의 신규한 돌연변이 엘-아라비톨 탈수소효소
WO2015190633A1 (ko) 활성이 개선된 대장균 유래의 돌연변이 당 이성질화 효소 및 그를 이용한 l-굴로스의 생산
CN115786319A (zh) 一种热稳定性提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及突变体
WO2021135796A1 (zh) D-木酮糖4-差向异构酶、其突变体及其用途
WO2021125514A1 (ko) 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법
WO2014171635A1 (ko) 신규 ｄ－솔비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－소르보스의 생산방법
WO2014171636A1 (ko) 신규 리비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－리불로스의 생산방법
WO2021086035A1 (ko) 프럭토오스 6-포스페이트 4-에피머화 효소 및 이의 용도
CN114958890B (zh) 构建稳定遗传的水杨酸生物合成的基因工程菌株的方法及其应用
WO2023090495A1 (ko) 열 안정성이 우수한 알룰로스 에피머화 효소 변이체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 알룰로스의 제조방법
CN112867793B (zh) 新型果糖-c4-差向异构酶及使用其制备塔格糖的方法
KR101479135B1 (ko) 아스페르기루스 플라버스 유래 솔비톨 탈수소화효소와 ｎａｄｈ 산화효소와의 커플링에 의한 ｌ－자일룰로스의 생산

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13787851

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14364631

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13787851

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1