KR101479136B1 - 활성이 개선된 네우로스포라 크라사 유래의 신규한 돌연변이 ｌ－아라비톨 탈수소효소 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 양자역학 및 분자역학 기술과 부분 돌연변이기술을 이용하여 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래 L-아라비톨 탈수소효소의 안정성 및 효소 활성을 증가시키는 것이다. 보다 상세하게는 양자역학 및 분자역학에 기반한 스크리닝을 통해 효소 안정성에 영향을 끼치는 잔기를 찾고, 탐색된 잔기의 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 L-아라비톨 탈수소효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 돌연변이체 및 개량된 L-아라비톨 탈수소효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 분자역학 및 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래 L-아라비톨 탈수소효소의 효소 활성을 향상시키는 것이다. 보다 상세하게는 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 L-아라비톨 탈수소효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 돌연변이체 및 개량된 L-아라비톨 탈수소효소의 제조 방법에 관한 것이다.
최근 의약분야에서 L-탄수화물 및 그의 뉴클레오사이드 유도체의 사용이 크게 증가하고 있는 가운데 변형된 뉴클레오사이드는 유용한 항바이러스제로서 상당한 잠재성을 보이고 있다. L-자일룰로스는 L-리보뉴클레오사이드, L-올리고리보뉴클레오사이드 및 많은 치료용 제재의 합성에 있어서 골격을 구성하는 핵심 오탄당이다. L-뉴클레오사이드는 D-뉴클레오사이드와 비교할 때, 체내의 뉴클레아제 등의 공격으로부터 높은 안정성을 가지므로 치료용 재료로서 사용될 수 있는 잠재성이 높은 후보 물질이다. L-리보오스가 항바이러스제 및 항암제 등 의약품의 제조 원료로서 유용성이 높은 것으로 알려지면서 최근에 더욱 주목이 집중되고 있어 L-자일룰로스의 고효율 생물학적 제조방법의 확립이 요구되고 있다.
상기의 중요성 및 유용성에도 불구하고, 식물재의 가수분해로부터 생산된 자일로스 및 자일룰로스는 고가 및 높은 생산 비용 등의 단점이 있다. 식물재의 가수분해 처리는 낮은 수율 및 저순도를 초래하고, 가수분해에 사용된 산과 연료는 가수분해 처리 후 이온교환 처리에 의해 제거되어야만 하며, 식품용으로 적합하기 위해서는 추가 정제가 요구된다. 이러한 이온교환 및 결정화 처리는 생산 비용의 증가를 가져온다. 따라서, 미생물 및 그의 효소를 사용하여 L-아라비톨로부터 L-자일룰로스를 생화학적으로 생산하는 방법이 시도되고 있으며 (Suzuki, T., Tran, L. H., Yoqo, M., Idota, O., Kitamoto, N., Kawai, K., Takamizawa, K.(2005) J. Biosci. Bioeng. 100(4), 493-497), 생촉매를 사용하여 L-자일룰로스를 생산하는 효소적 생산방법은 상기 단점을 극복할 수 있을 것으로 기대된다. D-자일룰로스와 달리 L-자일룰로스는 자연계에 소량 존재할 뿐만 아니라, L-자일룰로스를 생산할 수 있는 효소의 안정성 및 효소활성이 낮아 사업화하는데 어려움이 있다 (Sullivan, R., Zhao, H. (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol., 77, 472-474). 따라서, 생촉매를 사용하여 L-자일룰로스를 생산하는 효소적 생산방법은 효소의 안정성과 높은 활성이 확보되어야 한다.
관련특허로 대한민국특허공개번호 제1020010049616호 'D-아라비톨, D-자일룰로스 및 자일리톨의 생산방법'는 메츠크니코위아(Metschnikowia) 속에 속하고 D-아라비톨 생산능을 갖는 미생물을 주요 탄소원으로서 사카라이드를 함유하는 배지에서 통기 조건하에 배양함으로써 배지 중에서 D-아라비톨을 생산함을 포함하는 D-아라비톨의 생산방법이 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 기능성 당인 L-자일룰로스의 생물전환에 작용하는 L-아라비톨 탈수소효소를 실제 산업용 효소로 활용하기 위해서 부위특이적 돌연변이법을 통하여 효소의 활성을 개량하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 상기 개량된 L-아라비톨 탈수소효소 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 개량된 유전자가 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 개량된 효소가 형질전환된 재조합 대장균을 이용한 재조합 리비톨 탈수소효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 상기 효소를 이용하여 L-아라비톨 탈수소효소의 활성에 영향을 미치는 잔기를 제시하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3의 L-아라비톨 탈수소효소의 58번째 아미노산 히스티딘이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 104번째 아미노산 프롤린이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 191번째 아미노산 이소루신이 알라닌과 발린으로 치환된 돌연변이체, 282번째 이소루신이 류신으로 치환된 돌연변이체, 306번째 아미노산 글루타민이 알라닌으로 치환된 돌연변이체로 구성된 군으로부터 선택된 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소는 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 유래된 것이 바람직하나 화학합성법이나 유전공학적인 방법에 의하여 제조된 L-아라비톨 탈수소효소도 본 발명의 보호범위에 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 돌연변이 효소는 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 및 15 의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14 및 16 의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하여 상기 본 발명의 효소를 발현하는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 돌연변이체 효소의 제조방법을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 돌연변이체를 이용하여 L-아라비톨부터 L-자일룰로스로의 생산성을 향상시키는데 이용할 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 본 발명의 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 효소 활성을 조절할 수 있는 중요 잔기를 제시함으로써, 탈수소효소의 활성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 고활성 L-아라비톨 탈수소효소를 제공하고 이는 L-자일룰로스를 효율적으로 생산하는데 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
서열번호 6, 8, 10, 12, 14 및 16은 본 발명의 변이된 L-아라비톨 탈수소효소 유전자의 염기서열을, 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 및 15은 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 L-아라비톨 탈수소효소 활성을 가지는 한, 수 개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 또한 본 발명의 유전자는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14 및 16으로 표시되는 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여, 축중 코돈에 있어서만 상이한 동일 폴리펩티드를 코딩하는 축중 이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.
본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명에 관한 재조합벡터는 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, L-아라비톨 탈수소효소 유전자를 함유하는 DNA, 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET-28a를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.
프로모터는, 숙주 속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 재조합 DNA의 세균내로의 도입방법으로서는 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.
또한 재조합벡터에는 발현의 억제, 증폭, 유도를 위한 각종의 기능을 가진 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자 또는 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 추가로 가진 것도 가능하다.
본 발명에 관한 변이된 L-아라비톨 탈수소효소의 제조는 다음과 같이 수행한다. 변이된 효소를 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터로 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물 (배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 L-아라비톨 탈수소효소를 생성 및 축적시켜, 배양물로부터 L-아라비톨 탈수소효소를 취득함으로써 행하여진다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
또한 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면 이소프로필--D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 카나마이신을 유도물질로서 들 수 있다.
변이된 L-아라비톨 탈수소효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물로부터 균체 또는 상청액을 원심분리하여 회수한 후, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.
얻게 된 정제물질이 목적 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴 블로팅 등에 의해 행할 수 있다.
또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 L-아라비톨 탈수소효소의 생산과 균체 내에의 축적 및 균체로부터의 L-아라비톨 탈수소효소의 회수는 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 고활성 효소를 확보하고 효소의 활성에 중요한 역할을 하는 몇몇 잔기를 제시하고자 네우로스포라 크라사로부터 L-아라비톨 탈수소효소의 유전자를 클로닝하였다. 높은 활성에 중요한 역할을 하는 잔기들을 제시함으로써, 고활성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공할 수 있음을 확인하였다. 효소 활성에 중요 역할을 하는 잔기를 돌연변이하여 얻어진 돌연변이 효소를 사용하여 L-아라비톨로부터 L-자일룰로스로 전환시키는 활성을 증가시킬 수 있었다.
본 발명에서 얻어진 네우로스포라 크라사 유래 L-아라비톨 탈수소효소(NcLAD)를 이용하여 활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 치환한 변이체인 NcLAD H58A의 기질에 대한 Km 값은 6.57 mM, k cat 값은 3220 min-1, NcLAD P104A의 기질에 대한 Km 값은 3 mM, k cat 값은 1320 min-1이고, NcLAD I191A의 기질에 대한 Km 값은 48.1 mM, k cat 값은 4780 min-1이고, NcLAD I191V의 기질에 대한 Km 값은 6.07 mM, k cat 값은 3940 min-1이고, NcLAD I282L의 기질에 대한 Km 값은 5.7 mM, k cat 값은 3790 min-1, NcLAD Q306A의 기질에 대한 Km 값은 6.0 mM, k cat 값은 1820 min-1이다.
본 발명에서 고활성을 나타내는 여러 L-아라비톨 탈수소효소 변이체를 이용하여 기질에 대한 결합력을 증가시킴과 동시에 효소의 활성을 증가시킬 수 있었다. 이는 기존의 L-아라비톨 탈수소효소의 낮은 효소활성 문제점을 극복함으로써, 당 혼합물로부터 L-자일룰로스의 경제적인 생산에 유용하게 적용될 것이다.
L-아라비톨 탈수소효소에 의해 생성되는 L-자일룰로스는 항바이러스제 등 의약학적으로 유용한 가치를 가지고 있지만, 해당 효소의 불안정성과 낮은 효소활성이라는 단점을 가지고 있다.
따라서 본 발명은 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래의 L-아라비톨 탈수소효소의 활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 돌연변이 시킴으로써 기질이 효소에 결합하는 능력을 증가시킴과 동시에 효소의 활성이 증가된 개량된 효소를 개발함에 있다. 또한 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 돌연변이체 및 개량된 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 효율적으로 L-자일룰로스를 제조할 수 있다.
도 1 A, B은 네우로스포라 크라사 균주로부터 유래된 야생형 L-아라비톨 탈수소효소 및 고활성 변이체인 NcLAD H58A, P104A, I191A, I191V, I282L 및 NcLAD Q306A의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 사진이다.
도 2는 분자역학적(molecular mechanics) 기반으로 분석된 NcLAD의 기질이 결합하는 활성부위에 대한 컴퓨터 분석.
도 3은 야생형 NcLAD 효소의 동역학적 매개변수 그래프.
도 4는 NcLAD P104A 변이체의 대한 동역학적 매개변수 그래프.
도 5는 NcLAD Q306A 변이체의 대한 동역학적 매개변수 그래프.
도 2는 분자역학적(molecular mechanics) 기반으로 분석된 NcLAD의 기질이 결합하는 활성부위에 대한 컴퓨터 분석.
도 3은 야생형 NcLAD 효소의 동역학적 매개변수 그래프.
도 4는 NcLAD P104A 변이체의 대한 동역학적 매개변수 그래프.
도 5는 NcLAD Q306A 변이체의 대한 동역학적 매개변수 그래프.
이하, 본 발명을 다음의 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: L-아라비톨 탈수소효소의 유전자 클로닝
네우로스포라 크라사 (ATCC 10333, 미국표준균주배양수록보존소, 미국)를 24℃에서 배양하고, 원심분리(8000 g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 네우로스포라 크라사의 L-아라비톨 탈수소효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 NcLAD F-5'-GTA GCT ACG TCA GAA TTC CAT GGC TTC TAG CGC TTC C-3' (서열번호 1) NcLAD R-5'-GCT GAT TCT GCG GCC GCT TAC TCC AGA CTC TGG ATC-3'(서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 자이모모나스 모빌리스에서 증폭된 L-아라비톨 탈수소효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다 (서열번호 4).
실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
실시예 1에 따른 L-아라비톨 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 이용하여 전기 L-아라비톨 탈수소효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET-28a(Novagen, 독일)의 EcoRI과 NotI 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다.
실시예 3: 재조합 L-아라비톨 탈수소효소의 발현 및 순수 분리
상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 1).
상기 실시예 3의 방법으로 발현시킨 재조합 L-아라비톨 탈수소효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000xg, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA Super flow 컬럼 (GE Healthcare, 영국)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 재조합 L-아라비톨 탈수소효소를 순수 분리하였다.
실시예 4: 고활성을 가진 L-아라비톨 탈수소효소의 변이체 제작
실시예 4-1: 활성에 중요 역할을 하는 잔기의 확인
상기 실시예 3에서 순수 분리한 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 고활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 탐색하기 위해 Discovery Studio 3.1과 Meterials Studio 6.0 (Accelrys Inc. San Diego, CA, 미국)의 양자역학(Quantum mechanics)/분자역학(molecular mechanics) 방법을 사용하였다. 도 2와 같이 효소의 기질 결합부위의 잔기들을 알라닌으로 치환한 돌연변이체의 결합에너지(Kcal/mol)를 야생 효소의 결합에너지와 비교하였다. 결합에너지는 그 값이 낮을수록 결합력이 강한 것으로 알려져 있다. 표 1과 같이, H58A, P104A, I191A, I191V, I282L, Q306A 변이효소가 야생 효소보다 결합에너지가 낮았으며, H58 P104, I191, I282, Q306잔기를 돌연변이를 위한 목적 잔기로 선정하였다.
| 효소 | A+B (효소 기질복합체) | A (기질) |
B (효소) |
BEQM (Hartree) |
결합에너지 (Kcal/mol) |
| WT | -12815.40 | -569.62 | -12245.7189 | -0.062 | -39.0 |
| P104A | -12738.67 | -569.62 | -12168.9862 | -0.065 | -40.75 |
| L165A | -13544.17 | -569.52 | -12974.8792 | 0.225 | 141.3 |
| I191A | -12628.70 | -569.62 | -12059.0203 | -0.066 | -41.9 |
| Q306A | -12608.94 | -569.62 | -12039.2535 | -0.068 | -42.8 |
| Y307A | -13544.17 | -569.31 | -12974.8792 | 0.025 | 15.9 |
| R308A | -13544.17 | -569.61 | -12974.5622 | 0.008156 | 5.1 |
| Y309A | -13544.17 | -569.22 | -12974.8792 | 0.005156 | 3.2 |
| H58A | -12592.10017 | -569.622357 | -12022.38216 | -0.095657 | -60.1 |
| I191V | -12698.57709 | -569.613965 | -12128.84528 | -0.117849 | -74.0 |
| I282L | -12698.42002 | -569.623466 | -12128.71014 | -0.086416 | -54.2 |
실시예
4-2:
H58A
,
P104A
,
I191A
,
I191V
,
I282L
,
Q306A
변이체의
동역학적 매개변수
상기 실시 예 4-1에서와 같이 기질 결합부위의 잔기 중 돌연변이 시에 낮은 결합에너지를 나타낸 잔기인 58번째 잔기인 히스티딘을 알라닌으로, 104번째 잔기인 프롤린을 알라닌으로 치환하였고, 191번째 잔기인 이소루신을 알라닌과 발린으로, 282번째 잔기인 이소루신을 류신으로, 306번째 잔기인 글루타민이 알라닌으로 치환하였다. 해당 변이체를 site-directed mutagenesis kit (Stratagene, 미국)를 이용하여 제작하였으며, 표 2에 나타난 바와 같이 Q306A 변이체, H58A 변이체, I191V 변이체 및 I282L 변이체가 기질에 대한 결합력이 증가하면서 동시에 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다.
| 효소 | Km | kcat (min-1) |
|
| 조효소 (μM) | 기질 (mM) | ||
| NcLADWT | 0.9 | 16.3 | 1600 |
| P104A | 0.9 | 3.0 | 1320 |
| L165A | ND | ND | ND |
| Q306A | 1.5 | 6.0 | 1820 |
| Y307A | ND | ND | ND |
| R308A | ND | ND | ND |
| Y309A | ND | ND | ND |
| H58A | 1.2 | 6.57 | 3220 |
| I191A | 1.4 | 48.1 | 4780 |
| I191V | 1.3 | 6.07 | 3940 |
| I282L | 1.7 | 5.7 | 3790 |
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp.
<120> A mutant of Neurospora crassa L-arabitol dehydrogenase improved
in activity
<160> 16
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
gtagctacgt cagaattcca tggcttctag cgcttc 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
gctgattctg cggccgctta ctccagactc tggatc 36
<210> 3
<211> 363
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 3
Met Ala Ser Ser Ala Ser Lys Thr Asn Ile Gly Val Phe Thr Asn Pro
1 5 10 15
Gln His Asp Leu Trp Ile Ser Glu Ala Ser Pro Ser Leu Glu Ser Val
20 25 30
Gln Lys Gly Glu Glu Leu Lys Glu Gly Glu Val Thr Val Ala Val Arg
35 40 45
Ser Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Val His Phe Trp Lys His Gly Cys
50 55 60
Ile Gly Pro Met Ile Val Glu Cys Asp His Val Leu Gly His Glu Ser
65 70 75 80
Ala Gly Glu Val Ile Ala Val His Pro Ser Val Lys Ser Ile Lys Val
85 90 95
Gly Asp Arg Val Ala Ile Glu Pro Gln Val Ile Cys Asn Ala Cys Glu
100 105 110
Pro Cys Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Gly Cys Glu Arg Val Asp Phe Leu
115 120 125
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130 135 140
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Met Leu Glu Pro Leu Ser Val Ala Leu Ala Gly Leu Gln Arg Ala Gly
165 170 175
Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ile Cys Gly Ala Gly Pro Ile Gly
180 185 190
Leu Ile Thr Met Leu Cys Ala Lys Ala Ala Gly Ala Cys Pro Leu Val
195 200 205
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210 215 220
Pro Glu Val Val Thr His Lys Val Glu Arg Leu Ser Ala Glu Glu Ser
225 230 235 240
Ala Lys Lys Ile Val Glu Ser Phe Gly Gly Ile Glu Pro Ala Val Ala
245 250 255
Leu Glu Cys Thr Gly Val Glu Ser Ser Ile Ala Ala Ala Ile Trp Ala
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Val Lys Phe Gly Gly Lys Val Phe Val Ile Gly Val Gly Lys Asn Glu
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<212> DNA
<213> Neurospora crassa
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tggatcagcg aggcctctcc ctctctcgag agcgtccaaa agggcgaaga gctgaaggaa 120
ggcgaggtca ctgttgccgt ccgaagcaca ggcatttgcg gatccgacgt ccacttctgg 180
aagcatggtt gcatcggccc catgatcgtc gaatgcgatc atgtcctcgg ccacgagtcg 240
gcaggcgagg tcattgctgt ccatcccagc gtcaagagca tcaaggtcgg cgacagggtt 300
gccattgagc cccaagtcat ctgcaatgcc tgcgagccct gcctgactgg ccgttacaac 360
ggatgcgagc gcgttgactt cctctctacg ccccctgtgc ccggccttct ccgccgctac 420
gttaaccacc ctgccgtgtg gtgccacaaa atcggtaaca tgtcctatga gaacggtgcc 480
atgctcgagc ccctttccgt ggcgctggcc ggtcttcaga gagccggtgt tcgtctgggc 540
gaccctgtcc tcatctgtgg tgccggcccc attggtctga tcaccatgct ctgcgccaag 600
gccgctggtg cctgccctct tgtcattacc gacattgacg aaggccgctt gaagttcgcc 660
aaggagatct gccccgaggt cgtcacccac aaggtcgagc gcctgtcggc cgaggagtcg 720
gccaagaaga tcgtcgagag ctttggtgga atcgagcccg cggtggctct cgagtgtact 780
ggtgtcgaga gcagtatcgc ggctgctatc tgggccgtca agttcggcgg caaggtgttc 840
gtcatcggcg tgggcaagaa cgagatccag attcctttca tgcgcgccag tgtgcgcgag 900
gtcgacctgc agttccagta ccgttactgc aacacttggc ccagggccat tcgcctggtc 960
gagaatggcc tcgttgacct caccaggctg gtgacgcacc gtttcccgtt ggaggatgcg 1020
ctcaaggcgt tcgagacggc gtcagacccc aagacgggtg ccatcaaggt gcagatccag 1080
agtctggagt aa 1092
<210> 5
<211> 363
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant
<400> 5
Met Ala Ser Ser Ala Ser Lys Thr Asn Ile Gly Val Phe Thr Asn Pro
1 5 10 15
Gln His Asp Leu Trp Ile Ser Glu Ala Ser Pro Ser Leu Glu Ser Val
20 25 30
Gln Lys Gly Glu Glu Leu Lys Glu Gly Glu Val Thr Val Ala Val Arg
35 40 45
Ser Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Val His Phe Trp Lys His Gly Cys
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Ile Gly Pro Met Ile Val Glu Cys Asp His Val Leu Gly His Glu Ser
65 70 75 80
Ala Gly Glu Val Ile Ala Val His Pro Ser Val Lys Ser Ile Lys Val
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Gly Asp Arg Val Ala Ile Glu Ala Gln Val Ile Cys Asn Ala Cys Glu
100 105 110
Pro Cys Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Gly Cys Glu Arg Val Asp Phe Leu
115 120 125
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130 135 140
Ala Val Trp Cys His Lys Ile Gly Asn Met Ser Tyr Glu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Met Leu Glu Pro Leu Ser Val Ala Leu Ala Gly Leu Gln Arg Ala Gly
165 170 175
Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ile Cys Gly Ala Gly Pro Ile Gly
180 185 190
Leu Ile Thr Met Leu Cys Ala Lys Ala Ala Gly Ala Cys Pro Leu Val
195 200 205
Ile Thr Asp Ile Asp Glu Gly Arg Leu Lys Phe Ala Lys Glu Ile Cys
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Pro Glu Val Val Thr His Lys Val Glu Arg Leu Ser Ala Glu Glu Ser
225 230 235 240
Ala Lys Lys Ile Val Glu Ser Phe Gly Gly Ile Glu Pro Ala Val Ala
245 250 255
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260 265 270
Val Lys Phe Gly Gly Lys Val Phe Val Ile Gly Val Gly Lys Asn Glu
275 280 285
Ile Gln Ile Pro Phe Met Arg Ala Ser Val Arg Glu Val Asp Leu Gln
290 295 300
Phe Gln Tyr Arg Tyr Cys Asn Thr Trp Pro Arg Ala Ile Arg Leu Val
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Glu Asn Gly Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Val Thr His Arg Phe Pro
325 330 335
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<210> 6
<211> 1092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutant
<400> 6
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutant
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355 360
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutant
<400> 8
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<220>
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agtctggagt aa 1092
Claims (9)
- 서열번호 3의 L-아라비톨 탈수소효소의 58번째 아미노산 히스티딘이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 104번째 아미노산 프롤린이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 191번째 이소루신이 알라닌으로 치환된 돌연변이체, 191번째 이소루신이 발린으로 치환된 돌연변이체, 282번째 이소루신이 류신으로 치환된 돌연변이체, 및 306번째 글루타민이 알라닌으로 치환된 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소.
- 제 1항에 있어서, 상기 효소는 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래 L-아라비톨 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소.
- 제 1항에 있어서, 상기 돌연변이 효소는 서열번호 5, 7, 9, 11, 13 또는 15의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소.
- 제 1항의 효소를 코딩하는 유전자.
- 제 4항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제 4항의 유전자를 포함하는 재조합벡터.
- 제6항의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하고 제1항의 효소를 발현하는 단계를 포함하는 제1항의 돌연변이체 효소의 제조방법.
- 제 1항의 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 L-자일룰로스를 제조하는 방법.
- 제 1항의 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 유효성분으로 포함하는 L-자일룰로스 제조용 조성물.
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| J Mol Biol., Vol. 402, No. 1, pages 230-240 (2010.09.10.) * |
| Rutten, LUCY et al., BMC Microbiol., Vol. 9, page 166 (2009.08.12.) * |
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