KR101613013B1 - 활성화 에너지 기반의 신규 효소 스크리닝 방법 및 그 방법을 이용한 활성이 개선된 다중돌연변이 l-아라비톨 탈수소효소 - Google Patents

활성화 에너지 기반의 신규 효소 스크리닝 방법 및 그 방법을 이용한 활성이 개선된 다중돌연변이 l-아라비톨 탈수소효소 Download PDF

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Abstract

본 발명은 활성화 에너지 기반의 인실리코 신규 효소 스크리닝법에 의해 활성에 영향을 미치는 잔기를 선별하고, 고활성 효소를 초고속으로 스크리닝하는 기술에 관한 것이다. 일례로 신규 인실리코 스크리닝법에 의한 스크리닝에 이은 실험적 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래 L-아라비톨 탈수소효소의 효소 활성을 향상시켰으며, 본 발명은 에너지 기반의 신규 효소 스크리닝법, 선택된 잔기를 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 L-아라비톨 탈수소효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 돌연변이체 및 개량된 L-아라비톨 탈수소효소를 이용한 L-자일룰로스의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

활성화 에너지 기반의 신규 효소 스크리닝 방법 및 그 방법을 이용한 활성이 개선된 다중돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소{Free energy of activation based novel screening method of enzymes and A multiple mutant of L-arabitol dehydrogenase improved in its activity using the method}
본 발명은 활성화 에너지 기반의 인실리코 신규 효소 스크리닝법에 의해 활성에 영향을 미치는 잔기를 선별하고, 고활성 효소를 초고속으로 스크리닝하는 기술에 관한 것이다. 일례로 신규 인실리코 스크리닝법에 의한 스크리닝에 이은 실험적 부위 특이적 돌연변이를 이용하여 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래 L-아라비톨 탈수소효소의 효소 활성을 향상시켰으며, 본 발명은 에너지 기반의 신규 효소 스크리닝법, 선택된 잔기를 돌연변이에 의해 효소활성이 개량된 L-아라비톨 탈수소효소, 이를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질전환체, 상기 L-아라비톨 탈수소효소의 돌연변이체 및 개량된 L-아라비톨 탈수소효소를 이용한 L-자일룰로스의 제조 방법에 관한 것이다.
과거에는 효소를 설계하기보다는 목적에 부합되는 효소를 방대한 생태계로부터 발견하는데 주력하였으나 자연계에서 발굴한 효소를 실제 목적에 바로 이용하기에는 여러 가지 제약이 따른다. 즉, 분리한 효소의 기질특이성, 리간드와의 친화성, 비활성, pH 및 열 안정성 등이 실제 의약용이나 산업적으로 사용하기에는 많은 한계점을 나타낸다. 이를 해결하기 위해 목적에 맞는 특성이나 새로운 기능을 지닌 단백질을 설계하기 위해 이성적 설계와 방향적 진화의 두 가지 핵심 방향으로 단백질 공학 연구가 진행되고 있으나, 각각 신기능성 단백질 설계의 불가능과 효소 변이가 기질 결합부위 혹은 활성 부위에 제한된 기법이라는 한계가 있다.
이러한 문제점을 극복하고 체계적인 효소 활성 및 특이성의 분자기반 규명을 위해, 본 발명에서는 융합 이성적 설계 기법을 도입하여 효소의 활성 결정 인자를 규명하고자 한다. 이성적 설계 기법은 효소의 구조 정보에 기반하여 용이하게 원하는 특성의 효소를 제작할 수 있는 기법으로서 방향적 진화에 비해 매우 효율적인 기법으로 알려져 있다. 그러나 현존 이성적 설계 기법은 방향적 진화와 같이 전체 효소 구조를 변형시키고, 스크리닝 하는 것이 아니라 대부분 효소 활성부위 혹은 기질 결합 부위에 한정된 기법이라는 단점을 가지고 있다. 이를 극복하고자 본 발명에서 도입하고자 하는 것이 양자역학 기반 융합 이성적 설계 기법으로서, 활성부위 뿐만아니라 단백질 전체의 돌연변이와 스크리닝을 양자역학 기반 인실리코 스크리닝 시스템을 통해 초고속정량적으로 수행하며, 기술 확립 시 단백질공학 전반에 원천기반기술로 사용 가능할 것이다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 활성화 에너지 기반의 신규 효소 스크리닝법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 모델 효소인 L-아라비톨 탈수소효소의 활성을 향상시키는 잔기를 선별하고 고활성 효소를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 효소 단백질 구조를 기반으로 양자역학(Quantum mechanics) 및 분자역학(molecular mechanics) 방법을 사용하여 인실리코 상에서 효소 활성 부위 내부 및 외부의 잔기들을 치환한 돌연변이체의 효소 반응에 대한 활성화 에너지 (Kcal/mol)를 계산하여 그 값이 야생효소에 비해 감소한 경우에 그 효소를 활성이 증가한 효소로 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소는 L-아라비톨 탈수소효소인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의하여 스크리닝된 돌연변이체 효소를 제공한다.
또 본 발명은 서열번호 3의 58번째 아미노산, 104번째 아미노산, 191번째 아미노산, 및 306번째 아미노산 중 하나 이상이 치환된 돌연변이체 효소를 제공한다. 상기 돌연변이체에서 58번째 아미노산인 히스티딘은 알라닌으로 치환되고, 191번째 아미노산인 아이소류신은 발린으로 치환되고, 306번째 아미노산인 글루타민은 알라닌으로 치환되고,104번째 아미노산인 프롤린은 알라닌으로 치환된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 돌연변이체 효소는 서열번호 3의 58번째 아미노산, 191번째 아미노산 및 306번째 아미노산이 동시에 치환된 돌연변이체 또는 서열번호 3의 58번째 아미노산, 104번째 아미노산, 191번째 아미노산, 및 306번째 아미노산이 동시에 치환된 돌연변이체인 것을 특징으로 하며, 여기서, 상기 돌연변이체에서 58번째 아미노산인 히스티딘은 알라닌으로 치환되고, 191번째 아미노산인 아이소류신은 발린으로 치환되고, 306번째 아미노산인 글루타민은 알라닌으로 치환되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 돌연변이체 효소는 서열번호 5 또는 7의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 돌연변이체 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6 또는 8의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하여 본 발명의 돌연변이체 효소를 발현하는 단계를 포함하는 본 발명의 돌연변이체 효소를 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 분자역학을 위해 Discovery Studio 3.5, 양자역학을 위해서는 Material Studio 6.0을 사용하여 인실리코 스크리닝 시스템의 핵심인 모든 돌연변이 효소 반응의 활성화 자유 에너지 값 (G+)을 확보하고, 이에 근거한 인실리코 스크리닝 시스템을 당전환효소의 개량에 최초로 도입하고자 한다. Virtual 스크리닝에 의한 정성적 인실리코 스크리닝은 많이 보고되고 있으나, 정량적으로 QM/MM 기법에 의해 모든 돌연변이 효소 반응의 활성화 자유 에너지 값을 확보하였다.
본 발명은 도 2의 흐름도에 따라 단백질 구조를 기반으로 양자역학(Quantum mechanics)/분자역학(molecular mechanics) 방법을 사용하여 기질결합부위 내외부의 잔기들을 치환한 돌연변이의 활성화 에너지 (Kcal/mol)를 계산하여 스크리닝하는 방법을 제시한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효소는 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 유래된 것이 바람직하나 화학합성법이나 유전공학적인 방법에 의하여 제조된 L-아라비톨 탈수소효소도 본 발명의 보호범위에 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 돌연변이 효소는 서열번호 5, 7의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6, 8의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전좌 등을 통하여 본 발명이 달성하고자 하는 효과를 얻는 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 본 발명의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하여 상기 본 발명의 효소를 발현하는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 돌연변이체 효소의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 도 2의 흐름도에 따라 단백질 구조를 기반으로 QM/MM 방법을 사용하여 기질결합부위 내부 및 외부의 잔기들을 치환한 돌연변이의 활성화 에너지 (Kcal/mol)를 계산하여 야생효소에 비에 그 값이 감소한 돌연변이를 정량적으로 스크리닝하는 기술로서 단백질공학 전반에 사용될 수 있는 기반기술을 제공한다.
구체적으로 설명하면, 분자역학(MM) 실험을 위해 Discovery Studio 3.5 프로그램을 사용하였으며, 이를 통해 기질을 활성부위에 도킹시키고, 기질 주변 및 기질 주변에서 멀리 떨어져 있는 수십 개의 잔기들을 순차적으로 인실리코 상에서 알라닌으로 돌연변이시켜 다양한 돌연변이 구조를 제작한다. 이렇게 얻어진 돌연변이 구조의 활성부위에서 일어나는 효소 촉매 반응의 활성화 에너지를 양자역학(QM)을 통하여 인실리코 상에서 계산하며, 이 계산은 Materials Studio 6.0 프로그램을 사용하여 수행한다. 또한 인실리코 계산의 정확도를 높이기 위해 효소의 초기 구조는 모델이 아닌 결정 구조를 사용하여야 하며, 효소의 반응기작에 근거하여 reactant-substrate 및 product-substrate의 정확한 구조를 제공하여 QM을 수행한다. 이러한 계산을 통해 야생효소에 비해 활성화 에너지가 감소한, 즉 효소반응의 에너지 장벽이 감소하고 turn-over 속도가 증가한 효소를 고름으로써 활성이 증가한 효소를 선별한다. 이와 같이 인실리코 상에서 선별된 고활성 돌연변이 효소는 실험적으로 부위특이적 돌연변이법을 통해 돌연변이 효소를 제작한 후 발현시켜 실제 활성을 야생효소와 비교함으로써 검증과정을 거쳐 최종적으로 활성이 증가한 또는 목적 기질에 대한 특이성이 높은 효소를 선별한다. 이에 대한 더욱 상세한 설명은 Discovery Studio 3.5와 Materials Studio 6.0 (Accelrys Inc. San Diego, CA, 미국)의 매뉴얼 및 프로그램 등을 참고.
본 발명은 본 발명의 상기 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 효소 활성에 중요한 역할을 수행하는 몇몇 잔기를 제시함으로써, 탈수소효소의 활성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소를 이용하여 고활성을 갖는 L-아라비톨 탈수소효소를 제공하고 이는 L-자일룰로스를 효율적으로 생산하는데 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
서열번호 6, 8은 본 발명의 변이된 L-아라비톨 탈수소효소 유전자의 염기서열을, 서열번호 5, 7은 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 L-아라비톨 탈수소효소 활성을 가지는 한, 수 개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 또한 본 발명의 유전자는 서열번호 6, 8로 표시되는 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여, 축중 코돈에 있어서만 상이한 동일 폴리펩티드를 코딩하는 축중 이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.
본 발명에 관한 변이된 L-아라비톨 탈수소효소의 제조는 다음과 같이 수행한다. 변이된 효소를 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터로 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물 (배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 L-아라비톨 탈수소효소를 생성 및 축적시켜, 배양물로부터 L-아라비톨 탈수소효소를 취득함으로써 행하여진다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.
본 발명에서는 활성화 에너지 기반의 신규 효소 스크리닝법을 통해 효소의 활성에 중요한 역할을 하는 몇몇 잔기를 제시하고 고활성 효소를 확보하고자 네우로스포라 크라사로부터 L-아라비톨 탈수소효소의 유전자를 클로닝하였다. 전기 유전자를 삽입한 재조합 균주가 높은 활성에 중요한 역할을 하는 몇몇 잔기를 제시함으로써, 고활성 결정인자 규명에 대한 기반기술을 제공할 수 있음을 확인하였다. 효소 활성에 중요 역할을 하는 잔기를 돌연변이하여 얻어진 돌연변이 효소를 사용하여 재조합 균주가 L-아라비톨로부터 L-자일룰로스를 제조하는 활성을 증가시킬 수 있다.
L-아라비톨 탈수소효소에 의해 생성되는 L-자일룰로스는 항바이러스제 등 의약학적으로 유용한 가치를 가지고 있지만, 해당 효소의 불안정성과 낮은 효소활성이라는 단점을 가지고 있다.
따라서 본 발명은 도 2의 흐름도에 따라 단백질 구조를 기반으로 QM/MM 방법을 사용하여 기질 결합 내부 및 외부의 잔기들을 치환한 돌연변이체의 활성화 에너지 (Kcal/mol)를 계산하여 야생효소에 비에 그 값이 감소한 돌연변이를 스크리닝한다. 이를 통해 네우로스포라 크라사(Neurospora crassa) 유래의 L-아라비톨 탈수소효소의 활성에 중요한 역할을 하는 잔기를 돌연변이 시킴으로써 효소의 활성이 증가된 개량된 효소를 개발함에 있다.
도 1은 네우로스포라 크라사 균주로부터 유래된 야생형 L-아라비톨 탈수소효소 및 고활성 변이체인 H58A/I191V/Q306A (도 1의 1 레인), H58A/I191V/Q306A/P104A (도 1의 2 레인)의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 사진이다.
도 2는 활성화 에너지 기반 정량적 스크리닝의 모식도.
이하, 본 발명을 다음의 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: L-아라비톨 탈수소효소의 유전자 클로닝
네우로스포라 크라사 (ATCC 10333, 미국표준균주배양수록보존소, 미국)를 24에서 배양하고, 원심분리(8000 g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 네우로스포라 크라사의 L-아라비톨 탈수소효소를 암호화하는 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머 NcLAD F-5'-GTA GCT ACG TCA GAA TTC CAT GGC TTC TAG CGC TTC C-3' (서열번호 1) NcLAD R-5'-GCT GAT TCT GCG GCC GCT TAC TCC AGA CTC TGG ATC-3'(서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 증폭된 L-아라비톨 탈수소효소를 포함한 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다 (서열번호 4).
실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조
실시예 1에 따른 L-아라비톨 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 이용하여 전기 L-아라비톨 탈수소효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET-28a(Novagen, 독일)의 EcoRI과 NotI 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다.
실시예 3: 재조합 L-아라비톨 탈수소효소의 발현 및 순수 분리
상기 실시예 2에서 재조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 37에서 24시간 동안 배양한 다음 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 1).
상기 실시예 3의 방법으로 발현시킨 재조합 L-아라비톨 탈수소효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000xg, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 20,000xg에서 20분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA Super flow 컬럼 (GE Healthcare, 영국)을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 재조합 L-아라비톨 탈수소효소를 순수 분리하였다.
실시예 4: 고활성을 가진 L-아라비톨 탈수소효소의 변이체 제작을 위한 QM/MM 기반의 타깃 잔기 스크리닝
도 3의 흐름도에 따라 Discovery Studio 3.5와 Materials Studio 6.0 (Accelrys Inc. San Diego, CA, 미국)의 양자역학(Quantum mechanics)/분자역학(molecular mechanics) 방법을 사용하여 활성 부위 내부 및 외부의 잔기들을 치환한 돌연변이체의 활성화 에너지 (Kcal/mol)를 계산하여 스크리닝 하였다. 효소의 기질 결합부위의 잔기들이 치환된 돌연변이체의 활성화 에너지 (Kcal/mol)를 야생 효소의 활성화 에너지와 비교하였다. 활성화 에너지 값이 낮으면 효소 반응의 에너지 장벽이 낮아져 효소의 대사회전율이 좋아질 것으로 예상된다.
효소 활성화 자유 에너지
(Kcal/mol)
WT -47
P104A -49
L165A 13
I191A -62
Q306A -51
Y307A 8
R308A -3
Y309A -5
H58A -68
I191V -82
I282L -20
실시예 5: 고활성을 가진 L-아라비톨 탈수소효소의 변이체 제작
실시예 5-1: H58A/I191V/Q306A, H58A/I191V/Q306A/P104A 변이체의 동역학적 매개변수
상기 실시 예에서와 같이 잔기 중 돌연변이 시에 낮은 활성화 에너지를 나타낸 잔기인 58번째 잔기인 히스티딘을 알라닌으로, 104번째 잔기인 프롤린을 알라닌으로 치환하였고, 191번째 잔기인 이소루신을 알라닌과 발린으로, 282번째 잔기인 이소루신을 류신으로, 306번째 잔기인 글루타민이 알라닌으로 치환하였다. 해당 변이체를 site-directed mutagenesis kit (Stratagene, 미국)를 이용하여 제작하였으며, 표 2에 나타난 바와 같이 H58A/I191V/Q306A와 H58A/I191V/Q306A/P104A 변이체는 대사회전율이 크게 증가함을 알 수 있었다.
효소 Km kcat
(min-1)		 kcat/Km
(mM-1min-1)
기질 (mM)
NcLADWT 16.3 1240 76
H58A/I191V/Q306A 7.6 9954 1310
H58A/I191V/Q306A/P104A 7.9 13530 1713
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Free energy of activation based novel screening method of enzymes and A multiple mutant of L-arabitol dehydrogenase improved in its activity using the method <130> HY140612 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gtagctacgt cagaattcca tggcttctag cgcttcc 37 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gctgattctg cggccgctta ctccagactc tggatc 36 <210> 3 <211> 363 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 3 Met Ala Ser Ser Ala Ser Lys Thr Asn Ile Gly Val Phe Thr Asn Pro 1 5 10 15 Gln His Asp Leu Trp Ile Ser Glu Ala Ser Pro Ser Leu Glu Ser Val 20 25 30 Gln Lys Gly Glu Glu Leu Lys Glu Gly Glu Val Thr Val Ala Val Arg 35 40 45 Ser Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Val His Phe Trp Lys His Gly Cys 50 55 60 Ile Gly Pro Met Ile Val Glu Cys Asp His Val Leu Gly His Glu Ser 65 70 75 80 Ala Gly Glu Val Ile Ala Val His Pro Ser Val Lys Ser Ile Lys Val 85 90 95 Gly Asp Arg Val Ala Ile Glu Pro Gln Val Ile Cys Asn Ala Cys Glu 100 105 110 Pro Cys Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Gly Cys Glu Arg Val Asp Phe Leu 115 120 125 Ser Thr Pro Pro Val Pro Gly Leu Leu Arg Arg Tyr Val Asn His Pro 130 135 140 Ala Val Trp Cys His Lys Ile Gly Asn Met Ser Tyr Glu Asn Gly Ala 145 150 155 160 Met Leu Glu Pro Leu Ser Val Ala Leu Ala Gly Leu Gln Arg Ala Gly 165 170 175 Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ile Cys Gly Ala Gly Pro Ile Gly 180 185 190 Leu Ile Thr Met Leu Cys Ala Lys Ala Ala Gly Ala Cys Pro Leu Val 195 200 205 Ile Thr Asp Ile Asp Glu Gly Arg Leu Lys Phe Ala Lys Glu Ile Cys 210 215 220 Pro Glu Val Val Thr His Lys Val Glu Arg Leu Ser Ala Glu Glu Ser 225 230 235 240 Ala Lys Lys Ile Val Glu Ser Phe Gly Gly Ile Glu Pro Ala Val Ala 245 250 255 Leu Glu Cys Thr Gly Val Glu Ser Ser Ile Ala Ala Ala Ile Trp Ala 260 265 270 Val Lys Phe Gly Gly Lys Val Phe Val Ile Gly Val Gly Lys Asn Glu 275 280 285 Ile Gln Ile Pro Phe Met Arg Ala Ser Val Arg Glu Val Asp Leu Gln 290 295 300 Phe Gln Tyr Arg Tyr Cys Asn Thr Trp Pro Arg Ala Ile Arg Leu Val 305 310 315 320 Glu Asn Gly Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Val Thr His Arg Phe Pro 325 330 335 Leu Glu Asp Ala Leu Lys Ala Phe Glu Thr Ala Ser Asp Pro Lys Thr 340 345 350 Gly Ala Ile Lys Val Gln Ile Gln Ser Leu Glu 355 360 <210> 4 <211> 1092 <212> DNA <213> Neurospora crassa <400> 4 atggcttcta gcgcttccaa gaccaacatt ggcgttttca ccaaccctca gcatgatctg 60 tggatcagcg aggcctctcc ctctctcgag agcgtccaaa agggcgaaga gctgaaggaa 120 ggcgaggtca ctgttgccgt ccgaagcaca ggcatttgcg gatccgacgt ccacttctgg 180 aagcatggtt gcatcggccc catgatcgtc gaatgcgatc atgtcctcgg ccacgagtcg 240 gcaggcgagg tcattgctgt ccatcccagc gtcaagagca tcaaggtcgg cgacagggtt 300 gccattgagc cccaagtcat ctgcaatgcc tgcgagccct gcctgactgg ccgttacaac 360 ggatgcgagc gcgttgactt cctctctacg ccccctgtgc ccggccttct ccgccgctac 420 gttaaccacc ctgccgtgtg gtgccacaaa atcggtaaca tgtcctatga gaacggtgcc 480 atgctcgagc ccctttccgt ggcgctggcc ggtcttcaga gagccggtgt tcgtctgggc 540 gaccctgtcc tcatctgtgg tgccggcccc attggtctga tcaccatgct ctgcgccaag 600 gccgctggtg cctgccctct tgtcattacc gacattgacg aaggccgctt gaagttcgcc 660 aaggagatct gccccgaggt cgtcacccac aaggtcgagc gcctgtcggc cgaggagtcg 720 gccaagaaga tcgtcgagag ctttggtgga atcgagcccg cggtggctct cgagtgtact 780 ggtgtcgaga gcagtatcgc ggctgctatc tgggccgtca agttcggcgg caaggtgttc 840 gtcatcggcg tgggcaagaa cgagatccag attcctttca tgcgcgccag tgtgcgcgag 900 gtcgacctgc agttccagta ccgttactgc aacacttggc ccagggccat tcgcctggtc 960 gagaatggcc tcgttgacct caccaggctg gtgacgcacc gtttcccgtt ggaggatgcg 1020 ctcaaggcgt tcgagacggc gtcagacccc aagacgggtg ccatcaaggt gcagatccag 1080 agtctggagt aa 1092 <210> 5 <211> 363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 5 Met Ala Ser Ser Ala Ser Lys Thr Asn Ile Gly Val Phe Thr Asn Pro 1 5 10 15 Gln His Asp Leu Trp Ile Ser Glu Ala Ser Pro Ser Leu Glu Ser Val 20 25 30 Gln Lys Gly Glu Glu Leu Lys Glu Gly Glu Val Thr Val Ala Val Arg 35 40 45 Ser Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Val His Phe Trp Lys His Gly Cys 50 55 60 Ile Gly Pro Met Ile Val Glu Cys Asp His Val Leu Gly His Glu Ser 65 70 75 80 Ala Gly Glu Val Ile Ala Val His Pro Ser Val Lys Ser Ile Lys Val 85 90 95 Gly Asp Arg Val Ala Ile Glu Pro Gln Val Ile Cys Asn Ala Cys Glu 100 105 110 Pro Cys Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Gly Cys Glu Arg Val Asp Phe Leu 115 120 125 Ser Thr Pro Pro Val Pro Gly Leu Leu Arg Arg Tyr Val Asn His Pro 130 135 140 Ala Val Trp Cys His Lys Ile Gly Asn Met Ser Tyr Glu Asn Gly Ala 145 150 155 160 Met Leu Glu Pro Leu Ser Val Ala Leu Ala Gly Leu Gln Arg Ala Gly 165 170 175 Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ile Cys Gly Ala Gly Pro Val Gly 180 185 190 Leu Ile Thr Met Leu Cys Ala Lys Ala Ala Gly Ala Cys Pro Leu Val 195 200 205 Ile Thr Asp Ile Asp Glu Gly Arg Leu Lys Phe Ala Lys Glu Ile Cys 210 215 220 Pro Glu Val Val Thr His Lys Val Glu Arg Leu Ser Ala Glu Glu Ser 225 230 235 240 Ala Lys Lys Ile Val Glu Ser Phe Gly Gly Ile Glu Pro Ala Val Ala 245 250 255 Leu Glu Cys Thr Gly Val Glu Ser Ser Ile Ala Ala Ala Ile Trp Ala 260 265 270 Val Lys Phe Gly Gly Lys Val Phe Val Ile Gly Val Gly Lys Asn Glu 275 280 285 Ile Gln Ile Pro Phe Met Arg Ala Ser Val Arg Glu Val Asp Leu Gln 290 295 300 Phe Ala Tyr Arg Tyr Cys Asn Thr Trp Pro Arg Ala Ile Arg Leu Val 305 310 315 320 Glu Asn Gly Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Val Thr His Arg Phe Pro 325 330 335 Leu Glu Asp Ala Leu Lys Ala Phe Glu Thr Ala Ser Asp Pro Lys Thr 340 345 350 Gly Ala Ile Lys Val Gln Ile Gln Ser Leu Glu 355 360 <210> 6 <211> 1092 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 6 atggcttcta gcgcttccaa gaccaacatt ggcgttttca ccaaccctca gcatgatctg 60 tggatcagcg aggcctctcc ctctctcgag agcgtccaaa agggcgaaga gctgaaggaa 120 ggcgaggtca ctgttgccgt ccgaagcaca ggcatttgcg gatccgacgt cgccttctgg 180 aagcatggtt gcatcggccc catgatcgtc gaatgcgatc atgtcctcgg ccacgagtcg 240 gcaggcgagg tcattgctgt ccatcccagc gtcaagagca tcaaggtcgg cgacagggtt 300 gccattgagc cccaagtcat ctgcaatgcc tgcgagccct gcctgactgg ccgttacaac 360 ggatgcgagc gcgttgactt cctctctacg ccccctgtgc ccggccttct ccgccgctac 420 gttaaccacc ctgccgtgtg gtgccacaaa atcggtaaca tgtcctatga gaacggtgcc 480 atgctcgagc ccctttccgt ggcgctggcc ggtcttcaga gagccggtgt tcgtctgggc 540 gaccctgtcc tcatctgtgg tgccggcccc gtcggtctga tcaccatgct ctgcgccaag 600 gccgctggtg cctgccctct tgtcattacc gacattgacg aaggccgctt gaagttcgcc 660 aaggagatct gccccgaggt cgtcacccac aaggtcgagc gcctgtcggc cgaggagtcg 720 gccaagaaga tcgtcgagag ctttggtgga atcgagcccg cggtggctct cgagtgtact 780 ggtgtcgaga gcagtatcgc ggctgctatc tgggccgtca agttcggcgg caaggtgttc 840 gtcatcggcg tgggcaagaa cgagatccag attcctttca tgcgcgccag tgtgcgcgag 900 gtcgacctgg ccttccagta ccgttactgc aacacttggc ccagggccat tcgcctggtc 960 gagaatggcc tcgttgacct caccaggctg gtgacgcacc gtttcccgtt ggaggatgcg 1020 ctcaaggcgt tcgagacggc gtcagacccc aagacgggtg ccatcaaggt gcagatccag 1080 agtctggagt aa 1092 <210> 7 <211> 363 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 7 Met Ala Ser Ser Ala Ser Lys Thr Asn Ile Gly Val Phe Thr Asn Pro 1 5 10 15 Gln His Asp Leu Trp Ile Ser Glu Ala Ser Pro Ser Leu Glu Ser Val 20 25 30 Gln Lys Gly Glu Glu Leu Lys Glu Gly Glu Val Thr Val Ala Val Arg 35 40 45 Ser Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Val His Phe Trp Lys His Gly Cys 50 55 60 Ile Gly Pro Met Ile Val Glu Cys Asp His Val Leu Gly His Glu Ser 65 70 75 80 Ala Gly Glu Val Ile Ala Val His Pro Ser Val Lys Ser Ile Lys Val 85 90 95 Gly Asp Arg Val Ala Ile Glu Ala Gln Val Ile Cys Asn Ala Cys Glu 100 105 110 Pro Cys Leu Thr Gly Arg Tyr Asn Gly Cys Glu Arg Val Asp Phe Leu 115 120 125 Ser Thr Pro Pro Val Pro Gly Leu Leu Arg Arg Tyr Val Asn His Pro 130 135 140 Ala Val Trp Cys His Lys Ile Gly Asn Met Ser Tyr Glu Asn Gly Ala 145 150 155 160 Met Leu Glu Pro Leu Ser Val Ala Leu Ala Gly Leu Gln Arg Ala Gly 165 170 175 Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ile Cys Gly Ala Gly Pro Val Gly 180 185 190 Leu Ile Thr Met Leu Cys Ala Lys Ala Ala Gly Ala Cys Pro Leu Val 195 200 205 Ile Thr Asp Ile Asp Glu Gly Arg Leu Lys Phe Ala Lys Glu Ile Cys 210 215 220 Pro Glu Val Val Thr His Lys Val Glu Arg Leu Ser Ala Glu Glu Ser 225 230 235 240 Ala Lys Lys Ile Val Glu Ser Phe Gly Gly Ile Glu Pro Ala Val Ala 245 250 255 Leu Glu Cys Thr Gly Val Glu Ser Ser Ile Ala Ala Ala Ile Trp Ala 260 265 270 Val Lys Phe Gly Gly Lys Val Phe Val Ile Gly Val Gly Lys Asn Glu 275 280 285 Ile Gln Ile Pro Phe Met Arg Ala Ser Val Arg Glu Val Asp Leu Gln 290 295 300 Phe Ala Tyr Arg Tyr Cys Asn Thr Trp Pro Arg Ala Ile Arg Leu Val 305 310 315 320 Glu Asn Gly Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Val Thr His Arg Phe Pro 325 330 335 Leu Glu Asp Ala Leu Lys Ala Phe Glu Thr Ala Ser Asp Pro Lys Thr 340 345 350 Gly Ala Ile Lys Val Gln Ile Gln Ser Leu Glu 355 360 <210> 8 <211> 1092 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 8 atggcttcta gcgcttccaa gaccaacatt ggcgttttca ccaaccctca gcatgatctg 60 tggatcagcg aggcctctcc ctctctcgag agcgtccaaa agggcgaaga gctgaaggaa 120 ggcgaggtca ctgttgccgt ccgaagcaca ggcatttgcg gatccgacgt cgccttctgg 180 aagcatggtt gcatcggccc catgatcgtc gaatgcgatc atgtcctcgg ccacgagtcg 240 gcaggcgagg tcattgctgt ccatcccagc gtcaagagca tcaaggtcgg cgacagggtt 300 gccattgagg cccaagtcat ctgcaatgcc tgcgagccct gcctgactgg ccgttacaac 360 ggatgcgagc gcgttgactt cctctctacg ccccctgtgc ccggccttct ccgccgctac 420 gttaaccacc ctgccgtgtg gtgccacaaa atcggtaaca tgtcctatga gaacggtgcc 480 atgctcgagc ccctttccgt ggcgctggcc ggtcttcaga gagccggtgt tcgtctgggc 540 gaccctgtcc tcatctgtgg tgccggcccc gtcggtctga tcaccatgct ctgcgccaag 600 gccgctggtg cctgccctct tgtcattacc gacattgacg aaggccgctt gaagttcgcc 660 aaggagatct gccccgaggt cgtcacccac aaggtcgagc gcctgtcggc cgaggagtcg 720 gccaagaaga tcgtcgagag ctttggtgga atcgagcccg cggtggctct cgagtgtact 780 ggtgtcgaga gcagtatcgc ggctgctatc tgggccgtca agttcggcgg caaggtgttc 840 gtcatcggcg tgggcaagaa cgagatccag attcctttca tgcgcgccag tgtgcgcgag 900 gtcgacctgg ccttccagta ccgttactgc aacacttggc ccagggccat tcgcctggtc 960 gagaatggcc tcgttgacct caccaggctg gtgacgcacc gtttcccgtt ggaggatgcg 1020 ctcaaggcgt tcgagacggc gtcagacccc aagacgggtg ccatcaaggt gcagatccag 1080 agtctggagt aa 1092

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 서열번호 3의 58번째 아미노산인 히스티딘은 알라닌으로 치환되고, 191번째 아미노산인 아이소류신은 발린으로 치환되고, 306번째 아미노산인 글루타민은 알라닌으로 동시에 치환된 돌연변이체; 또는
    서열번호 3의 58번째 아미노산인 히스티딘은 알라닌으로 치환되고, 191번째 아미노산인 아이소류신은 발린으로 치환되고, 306번째 아미노산인 글루타민은 알라닌으로 치환되고,104번째 아미노산인 프롤린은 알라닌으로 동시에 치환된 돌연변이체 중 하나인 돌연변이체 L-아라비톨 탈수소효소.
  6. 삭제
  7. 제 5항에 있어서, 상기 돌연변이체 효소는 서열번호 5 또는 7의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 돌연변이 L-아라비톨 탈수소효소.
  8. 제 5항의 효소를 코딩하는 유전자.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6 또는 8의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
  10. 제 8항의 유전자를 포함하는 재조합벡터.
  11. 제 10항의 재조합벡터를 미생물에 형질전환시켜서 형질전환체를 제조하여 제 5항의 효소를 발현하는 단계를 포함하는 제 5항의 돌연변이체 효소의 제조방법.

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