JP7090266B2 - シトクロムp450の突然変異タンパク質およびその使用 - Google Patents
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- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
突然変異タンパク質は非天然タンパク質で、かつ前記突然変異タンパク質はプロトパナキサジオールの生成を触媒する触媒活性を有し、そして前記突然変異タンパク質は野生型のシトクロムP450の配列番号1に対応する、
91番目のプロリン(P)、
87番目のロイシン(L)、
235番目のリジン(K)、
349番目のリジン(K)、
366番目のバリン(V)、
231番目のアスパラギン(N)、
285番目のセリン(S)、
113番目のグルタミン(Q)、
18番目のロイシン(L)、
からなる群から選ばれる一つまたは複数の酵素触媒活性に関連するコアアミノ酸で突然変異し、
ならびに/あるいは、
1~4番目における1、2、3、または4個のアミノ酸が欠失した、
タンパク質を提供する。
1番目のメチオニン(M)、
2番目のアラニン(A)、
3番目のアラニン(A)、
4番目のアラニン(A)。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異タンパク質は、配列番号1における1~4番目が欠失し、かつ18番目のロイシン(L)が突然変異した。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異タンパク質は、配列番号1における1~4番目が欠失し、かつ18番目のロイシン(L)がイソロイシン(I)に突然変異した。
235番目のリジン(K)がアルギニン(R)に突然変異し、および/または、
349番目のリジン(K)がアルギニン(R)に突然変異し、および/または、
366番目のバリン(V)がイソロイシン(I)に突然変異し、および/または、
231番目のアスパラギン(N)がチロシン(Y)に突然変異し、および/または、
285番目のセリン(S)がシステイン(C)に突然変異し、および/または、
91番目のプロリン(P)がヒスチジン(H)に突然変異し、および/または、
113番目のグルタミン(Q)がアルギニン(R)に突然変異し、および/または、
18番目のロイシン(L)がイソロイシン(I)に突然変異した。
もう一つの好適な例において、前記シトクロムP450の突然変異タンパク質のアミノ酸配列は配列番号2~8で示される。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異タンパク質は、前記突然変異(たとえば87、235、349、366、231、285、91、113、18、および/または1~4番目のアミノ酸)以外、ほかのアミノ酸配列は配列番号1で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記のほぼ同様とは、多くとも50個(好ましくは1~20個、より好ましくは1~10個、さらに好ましくは1~5個)のアミノ酸が相違し、ここで、前記の相違はアミノ酸の置換、欠失または付加を含み、かつ前記の突然変異タンパク質はプロトパナキサジオールの生成を触媒する触媒活性を有するままである。
もう一つの好適な例において、前記シトクロムP450の突然変異タンパク質は、ダンマレンジオール(DM)を反応させてプロトパナキサジオール(PPD)を生成するのを触媒する。
もう一つの好適な例において、前記シトクロムP450の突然変異タンパク質は、ダンマレンジオール(DM)のC12部位をヒドロキシ化させ、プロトパナキサジオール(PPD)を生成するのを触媒する。
(i)反応系のpHは5.0~9.0、好ましくは7.0~8.0、より好ましくは7.4~7.5であること、
(ii)反応温度は20~40℃、好ましくは25~35℃、より好ましくは26~33℃、最も好ましくは30℃であること、
(iii)反応時間は0.5h~36h、好ましくは2h~12h、より好ましくは2h~3hであること、
からなる群から選ばれる一つまたは複数の特徴を有する。
もう一つの好適な例において、前記シトクロムP450の突然変異タンパク質は、ダンマレンジオール(DM)からプロトパナキサジオール(PPD)への生成に対する触媒活性が野生型P450(配列番号1)の125~250%である。
(a)野生型のシトクロムP450タンパク質と比べ、触媒で得られるプロトパナキサジオール収量/ダンマレンジオール(PPD/DM)の比は≧20%、好ましくは23~250%、より好ましくは25~250%または30~200%であること、
(b)野生型のシトクロムP450タンパク質と比べ、触媒で得られるプロトパナキサジオール(PPD)の収量(mg/L)は≧300、好ましくは303~600、より好ましくは305~500であること、
からなる群から選ばれる一つまたは複数の特徴を有する。
もう一つの好適な例において、前記ポリヌクレオチドは、
(a) 配列番号2~8のいずれかで示されるペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(b) 配列番号15~21のいずれかで示されるポリヌクレオチド、
(c) ヌクレオチド配列と配列番号15~21のいずれかで示される配列との相同性が≧95%(好ましくは≧98%)で、かつ配列番号1または2~8のいずれかで示されるペプチドをコードするポリヌクレオチド、
(d) (a)~(c)のいずれかに記載のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド、
からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のポリヌクレオチドは、DNA配列、RNA配列、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ベクターは、発現ベクター、シャトルベクター、組込みベクターを含む。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は真核細胞で、たとえば酵母細胞または植物細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は原核細胞で、たとえば大腸菌である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、オタネニンジン細胞である。
発現に適切な条件において、本発明の第四の側面に記載の宿主細胞を培養することによって、シトクロムP450の突然変異タンパク質を発現させる工程と、
前記シトクロムP450の突然変異タンパク質を単離する工程と、
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の酵素製剤は、注射剤、および/または凍結乾燥製剤を含む。
(i)本発明の第一の側面に記載のシトクロムP450の突然変異タンパク質を反応基質と接触させ、触媒反応を行うことによって、前記プロトパナキサジオールを得る工程と、
(ii)任意に、前記プロトパナキサジオールを単離・精製する工程と、
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記反応基質は、ダンマレンジオールである。
もう一つの好適な例において、工程(i)では、前記触媒反応の時間は0.5h~36h、好ましくは2h~12h、より好ましくは2h~3hである。
もう一つの好適な例において、工程(i)では、前記触媒反応の温度は、20~40℃、好ましくは25~35℃、より好ましくは26~33℃、最も好ましくは30℃である。
もう一つの好適な例において、前記のプロモーターの配列は、配列番号10~13のいずれかで示される配列である。
前記突然変異プロモーターは転写強度に関連する以下のコアヌクレオチドを有し、
28番目のヌクレオチドTが欠失し、
417番目のヌクレオチドがGで、
445番目のヌクレオチドがGで、
654番目のヌクレオチドがAで、
655番目のヌクレオチドがAで、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号9で示される配列に基づくものである。
417番目のヌクレオチドがGで、
445番目のヌクレオチドがGで、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号9で示される配列に基づくものである。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター1D1は、417および445番目のヌクレオチド以外、ほかのヌクレオチドは配列番号9で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター1D1は配列番号10で示される配列を有する。
28番目のヌクレオチドTが欠失し、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号9で示される配列に基づくものである。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター9C1-2は、28番目のヌクレオチド以外、ほかのヌクレオチドは配列番号9で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター9C1-2は配列番号11で示される配列を有する。
654番目のヌクレオチドがAで、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号9で示される配列に基づくものである。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター11B5は、654番目のヌクレオチド以外、ほかのヌクレオチドは配列番号9で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター11B5は配列番号12で示される配列を有する。
655番目のヌクレオチドがAで、
ここで、前記ヌクレオチドの位置の番号は配列番号9で示される配列に基づくものである。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター15F1は、655番目のヌクレオチド以外、ほかのヌクレオチドは配列番号9で示される配列と同様か、ほぼ同様である。
もう一つの好適な例において、前記の突然変異プロモーター15F1は配列番号13で示される配列を有する。
本発明者は幅広く深く研究し、大量の選別によって、意外に、シトクロムP450の突然変異タンパク質の触媒活性を顕著に向上できる重要アミノ酸部位を見つけた。本発明者は、シトクロムP450 CYP716A47における重要部位に対して改造した後、PPD収量およびPPD/DM比率を顕著に向上させることができることを見出した。また、本発明者は、さらに、野生型のシトクロムP450 CYP716A47の1番目~4番目のアミノ酸が欠失し、同時にその一つの重要部位(たとえば18番目のアミノ酸)が突然変異すると、その触媒活性が顕著に向上し、具体的に、PPD/DMの比率が125.6%まで向上すると表れることを見出した。
本明細書で用いられるように、用語「AxxB」とはxx番目のアミノ酸Aがアミノ酸Bに変わることを表し、たとえば「L87I」とは87番目のアミノ酸LがIに突然変異することを表し、ほかも同じように表記する。
本明細書で用いられるように、用語「突然変異タンパク質」、「本発明の突然変異タンパク質」、「本発明のシトクロムP450の突然変異タンパク質」は入れ替えて使用することができ、いずれも非天然のシトクロムP450の突然変異タンパク質で、かつ前記突然変異タンパク質は配列番号1で示されるタンパク質を人工的に改造したタンパク質で、ここで、前記の突然変異タンパク質は酵素の触媒活性に関連するコアアミノ酸を含有し、かつ前記コアアミノ酸のうち、少なくとも一つが人工的に改造され、そして本発明の突然変異タンパク質はダンマレンジオールDMのC12がヒドロキシ化してプロトパナキサジオールPPDになるのを触媒する酵素活性を有する。
91番目のプロリン(P)、
87番目のロイシン(L)、
235番目のリジン(K)、
349番目のリジン(K)、
366番目のバリン(V)、
231番目のアスパラギン(N)、
285番目のセリン(S)、
113番目のグルタミン(Q)、
18番目のロイシン(L)、ならびに/あるいは、
1~4番目における1、2、3、または4個のアミノ酸の欠失であり、かつ上記コアアミノ酸を突然変異させて得た突然変異タンパク質または前記1~4番目のアミノ酸を欠失させて得た突然変異タンパク質はダンマレンジオールDMのC12がヒドロキシ化してプロトパナキサジオールPPDになるのを触媒する酵素活性を有する。
87番目のロイシン(L)がイソロイシン(I)に突然変異し、および/または、
235番目のリジン(K)がアルギニン(R)に突然変異し、および/または、
349番目のリジン(K)がアルギニン(R)に突然変異し、および/または、
366番目のバリン(V)がイソロイシン(I)に突然変異し、および/または、
231番目のアスパラギン(N)がチロシン(Y)に突然変異し、および/または、
285番目のセリン(S)がシステイン(C)に突然変異し、および/または、
91番目のプロリン(P)がヒスチジン(H)に突然変異し、および/または、
113番目のグルタミン(Q)がアルギニン(R)に突然変異し、および/または、
18番目のロイシン(L)がイソロイシン(I)に突然変異した。
本発明の突然変異タンパク質の断片、誘導体や類似物は、(i)1個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基(好ましくは保存的なアミノ酸残基)が置換された突然変異タンパク質でもよく、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、または(ii)1個または複数個のアミノ酸残基に置換基がある突然変異タンパク質でもよく、または(iii)成熟の突然変異タンパク質と他の化合物(たとえば、ポリエチレングリコールような突然変異タンパク質の半減期を延ばす化合物)と融合した突然変異タンパク質でもよく、または(iv)付加のアミノ酸配列がこの突然変異タンパク質に融合した突然変異タンパク質(たとえばリーダー配列または分泌配列またはこの突然変異タンパク質を精製するための配列または蛋白質前駆体配列、あるいは抗原IgG断片と形成した融合蛋白質)でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似体は当業者に公知の範囲に入っている。本発明において、保存的に置き換えたアミノ酸は、表Iのようにアミノ酸の置き換えを行って生成することが好ましい。
好ましくは、前記の突然変異タンパク質は配列番号2~8で示される。もちろん、本発明の突然変異タンパク質は配列番号2~8で示される配列と比べ、通常、高い相同性を有し、好ましくは、前記の突然変異タンパク質と配列番号2~8で示される配列との相同性は少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%~90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%で、最も好ましくは≧485/486(99.79%)である。
本発明は、さらに、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは突然変異タンパク質の断片、類似物および誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。本分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドの代替形態で、1つまたは2つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入でもよいが、実質的にコードする突然変異タンパク質の機能を変えることはない。
本発明のポリヌクレオチドの全長配列は、通常、PCR増幅法、組換え法または人工合成の方法で得られる。PCR増幅法について、本発明で公開された関連のヌクレオチド配列、特に読み枠によってプライマーを設計し、市販のcDNAライブラリーまたは当業者に既知の通常の方法によって調製されるcDNAライブラリーを鋳型とし、増幅して関連配列を得る。配列が長い場合、通常、2回または2回以上のPCR増幅を行った後、各回の増幅で得られた断片を正確な順でつなげる必要がある。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
本明細書で用いられるように、「野生型シトクロムP450」とは、天然に存在する、人工的に改造されていないシトクロムP450で、そのヌクレオチドは遺伝子工学技術、たとえばゲノムシークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって得られ、そのアミノ酸配列はヌクレオチド配列から推測することができる。前記野生型シトクロムP450のアミノ酸配列は配列番号1で示される。
上記に係る野生タンパク質、本発明の突然変異タンパク質の配列情報は表2(実施例を参照)に示す。
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたは本発明の突然変異タンパク質コード配列で遺伝子工学によって生成する宿主細胞、ならびに組み換え技術によって本発明に係るポリペプチドを生成する方法にも関する。
通常の組み換えDNA技術によって、本発明のポリヌクレオチド配列で組み換えの突然変異タンパク質を発現または生産することができる。一般的に、以下の工程を含む。
(1)本発明の本発明の突然変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド(または変異体)を使用し、あるいはこのポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する。
(2)適切な培地において宿主細胞を培養する。
(3)培地または細胞からタンパク質を分離し、精製する。
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、植物細胞(たとえばオタネニンジン細胞)がある。
当業者は、どうやって適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞を選択するか、よくわかる。
(i)大量の選別と改造を経て、本発明は、初めて、シトクロムP450(CYP716A47)の触媒活性部位およびそのプロモーターの重要部位を見出し、関連部位を改造すると、シトクロムP450の触媒活性と発現量が顕著に向上し、かつPPD収量とPPD/DM比率が顕著に向上する。
(ii)本発明は、初めて、野生型のシトクロムP450 CYP716A47の1番目~4番目のアミノ酸が欠失し、同時にその一つの重要部位(たとえば18番目のアミノ酸)が突然変異すると、その触媒活性が顕著に向上し、具体的に、PPD/DMの比率が125.6%まで向上すると表れることを見出した。
(iii)本発明は、また、野生型のシトクロムP450 CYP716A47のほかの部位、たとえば235/349/366/231/285/91/113番目などの部位の一つまたは複数のアミノ酸を突然変異させると、その触媒活性が顕著に向上し、具体的に、PPD/DMの比率が26.1~80.2%向上すると表れることを見出した。
特に説明しない限り、本発明の実施例における試薬および材料はいずれも市販品である。
シトクロムP450 CYP716A47のライブラリーを選別するため、本発明では、まず、プロトパナキサジオールの前駆体化合物であるダンマレンジオールを生産する出芽酵母基盤細胞を1株構築した。
野生型出芽酵母にダンマレンジオール合成酵素遺伝子PgDDSを導入し、出芽酵母自身のメバロン酸経路によって合成された2,3-エポキシスクアレンでダンマレンジオールを合成することができる。合成の律速ステップの最適化、前駆体の供給の最適化などを含む人工的に構築されたダンマレンジオール合成経路に対する最適化によって高収率でダンマレンジオールを生産する出芽酵母菌株WP8を出芽酵母基盤細胞として得たが、図1に示す。
(1)シトクロムP450遺伝子配列(optPPDSと名づけ、配列番号14で、配列番号1をコードするアミノ酸配列)を鋳型とし、プライマーEP-1(5’’-ATGGCTGCGGCCATGGTCTTAT-3’’(配列番号22))およびEP-2(5’’-GTTATGTGGATGCAGATGGATT-3’’ (配列番号23)を使用してエラープローンPCRを行った。前記エラープローンPCRはStratagene社のGeneMorph II Random Mutagenesis Kitランダム突然変異キットを使用した。PCRプログラムは、95℃ 2minで、95℃ 10s、55℃ 15s、72℃ 2minの計28サイクルで、72℃ 10min後、10℃に降温させ、鋳型の使用量は50ngであった。PCR産物にアガロースゲル電気泳動を行った後、得られたシトクロムP450をエラープローンPCR産物として得た。
(2)出芽酵母ゲノムを鋳型とし、分子クローニングの通常の方法における酢酸リチウム転換方法によって工程(1)におけるエラープローンPCR産物を実施例1で製造された出芽酵母基盤細胞に導入し、形質転換産物(すなわち形質転換体)を得た。
(4)24枚の96ウェルプレートに対する選別によって、プロトパナキサジオールの収量/ダンマレンジオールの比率(PPD/DM)が20%以上向上したクローンを計7つ得たが、番号はそれぞれ1G4、2D8、3B9、8G7、9C1、16F8および24A10である。それぞれ各クローンのゲノムを鋳型とし、プライマーEP-1およびEP-2でPCRを行って各クローンのシトクロムP450の断片を得、シークエンシングを行うことによって、各突然変異体のヌクレオチド配列およびタンパク質配列を得た。
上記で得られた各野生型および突然変異体のタンパク質配列の情報およびPPD/DMは図2および表2に示す。
(1)出芽酵母ゲノムを鋳型とし、実施例1の方法によって、配列番号14で出芽酵母菌株WP8を形質転換させ、プロトパナキサジオールを生産する組換え出芽酵母菌株WP8-WTを得た。
(2)野生型optPPDS遺伝子の代わりに、同じようにそれぞれ突然変異体の遺伝子1G4、2D8、3B9、8G7、9C1、16F8および24A10(ヌクレオチド配列は配列番号15~21で、対応するアミノ酸配列は配列番号2~8)を鋳型とした。上記PCRで各PCR断片を得、それぞれ出芽酵母菌株WP8を形質転換させ、各突然変異体タンパク質を含有する、プロトパナキサジオールを生産する組換え出芽酵母菌株WP8-1G4、WP8-2D8、WP8-3B9、WP8-8G7、WP8-9C1、WP8-16F8およびWP8-24A10を得た。
液体培地の調製:培地:1% Yeast Extract(酵母エキス)、2% Peptone(ペプトン)、2% Dextrose(デキストロース)(グルコース)を調製した。
固体培地プレートに画線した組換え出芽酵母菌WP8-1G4、WP8-2D8、WP8-3B9、WP8-8G7、WP8-9C1、WP8-16F8およびWP8-24A10を取り、それぞれ5mL液体培地を含有する試験管に置いて一晩振とう培養し(30℃、250rpm、16h)、遠心で菌体を収集し、10mL 液体培地が入った50mL三角フラスコに移し、OD600が0.05になるように調整し、30℃、250rpmで4日振とう培養して発酵産物を得た。本方法は各組換え酵母に対して同時に一つの平行実験を設けた。
Claims (11)
- アミノ酸配列が配列番号1で示される野生型のシトクロムP450において、
91番目のプロリン(P)
が、突然変異しているタンパク質であって、
ここで91番目のプロリン(P)は、ヒスチジン(H)に突然変異しており、ならびに、
前記タンパク質は非天然タンパク質であり、
前記タンパク質はプロトパナキサジオールの生成を触媒する触媒活性を有しており、および、
前記タンパク質は、ダンマレンジオール(DM)のC12部位をヒドロキシ化させ、プロトパナキサジオール(PPD)を生成するのを触媒する
ことを特徴とする、前記タンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質において、
87番目のロイシン(L)がイソロイシン(I)に突然変異している;および/または
235番目のリジン(K)がアルギニン(R)に突然変異している;および/または
349番目のリジン(K)がアルギニン(R)に突然変異している;および/または
366番目のバリン(V)がイソロイシン(I)に突然変異している;および/または
231番目のアスパラギン(N)がチロシン(Y)に突然変異している;および/または
285番目のセリン(S)がシステイン(C)に突然変異している;および/または
113番目のグルタミン(Q)がアルギニン(R)に突然変異している;および/または
18番目のロイシン(L)がイソロイシン(I)に突然変異している;および/または
1~4番目における1、2、3、または4個のアミノ酸が欠失している;
タンパク質であって、
前記タンパク質はプロトパナキサジオールの生成を触媒する触媒活性を有しており、および、
前記タンパク質は、ダンマレンジオール(DM)のC12部位をヒドロキシ化させ、プロトパナキサジオール(PPD)を生成するのを触媒する
ことを特徴とする、前記タンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項4に記載のベクターを含むか、あるいは、そのゲノムに請求項3に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、宿主細胞。
- 請求項1に記載のタンパク質を生成する方法であって、
発現に適切な条件において、請求項5に記載の宿主細胞を培養することによって、前記タンパク質を発現させる工程と、
前記タンパク質を単離する工程
とを含むことを特徴とする、前記方法。 - 請求項1に記載のタンパク質を含むことを特徴とする、酵素製剤。
- プロトパナキサジオールを製造する方法であって、
(i)請求項1に記載のタンパク質を反応基質と接触させ、触媒反応を行うことによって、前記プロトパナキサジオールを得る工程と、
(ii)任意に、前記プロトパナキサジオールを単離・精製する工程
とを含むことを特徴とする、前記方法。 - 請求項1に記載のタンパク質の使用であって、ダンマレンジオール(DM)からプロトパナキサジオール(PPD)への生成、またはダンマレンジオール(DM)からプロトパナキサジオール(PPD)への生成を触媒する触媒製剤の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。
- 請求項1に記載のタンパク質または請求項5に記載の宿主細胞の使用であって、プロトパナキサジオール(PPD)の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。
- 遺伝子組み換え植物を生成する方法であって、植物細胞である請求項5に記載の宿主細胞を、植物に再生させる工程を含む、前記方法。
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