CN103045619B - 包括293g＞t突变的cyp2c9基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物学领域，涉及单碱基突变。更具体地，本发明涉及CYP2C9基因对应于SEQ ID NO.2的第293位的突变位点，所述位点由野生型的G突变为T，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及其应用。本发明还提供了检测所述突变位点的等位基因特异性寡核苷酸、试剂盒和检测方法。

Description

包括293G＞T突变的CYP2C9基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及单碱基突变。更具体地，本发明涉及CYP2C9基因相对于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO.2的第293位的突变位点，包含该突变位点的核酸片段及其相应编码的蛋白质片段。本发明还涉及鉴定所述突变位点的试剂和检测方法，以及鉴定该位点在指导用药中的应用。

背景技术

CYP2C9是细胞色素P450酶大家族CYP2C亚家族中最重要的一员，约占人肝微粒体CYP酶总量的20％。有大约10～16％临床常用药物经由CYP2C9氧化代谢，其中主要包括甲苯磺丁脲、S-华法林、苯妥英、格列吡嗪、格列苯脲、托拉噻咪、氯沙坦、厄贝沙坦和许多非甾体类抗炎药物(如：布洛芬、氯诺昔康、双氯芬酸和萘普生)等药物(参见参考文献1-5)。

CYP2C9基因具有高度多态性。目前为止，国际上已命名的等位基因共有35种(http://www.cypalleles.ki.se)，除去野生型(CYP2C9*1)外，共有34种突变类型可引起CYP2C9蛋白氨基酸组成发生改变，另外还有多种新发现的突变尚未被命名。研究较多且临床意义较大的突变类型主要包括以下10种：CYP2C9*2、*3、*5、*6、*8、*11、*12、*13、*14、*16，其中人种分布最广、研究最多、中国人群研究资料相对最丰富的突变型是CYP2C9*2(430C＞T)、CYP2C9*3(1075A＞C)(参见参考文献6-17、20)。

根据目前的临床研究显示，CYP2C9基因的这种多态性是造成CYP2C9酶活性在个体之间极大不同的主要原因，因此在携带不同CYP2C9基因型的个体间可引起药物疗效的极大差异，甚至产生严重的药物毒副作用或治疗不充分。因此，研究CYP2C9基因多态性对药物疗效的影响将对临床合理用药提供重要的科学依据(参见参考文献18、19、21、22)。

发明内容

本发明的目的是提供CYP2C9基因的新的单碱基突变位点，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及鉴定该突变位点在用药指导中的应用。

本发明的第一个方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ IDNO.1的第1001位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1001位的核苷酸是T；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第293位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第293位的核苷酸是T；或者为上述核酸片段的互补序列。

本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID NO.1的第1001位或对应于SEQ ID NO.2的第293位的突变位点的等位基因片段或其互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO.2的第293位的突变位点的核苷酸是T；所述等位基因片段是SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其互补序列。

本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含SEQ IDNO.6和/或SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.17所示的序列片段。

本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸在检测CYP2C9基因突变中的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物。

本发明的第五个方面是提供一种用药指导，包括检测待测样品中CYP2C9基因的对应于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO.2的第293位的单碱基突变；根据检测到的突变，调整由CYP2C9代谢的药物的给药量。

本发明的第六个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第293位的核苷酸。

本发明的第七个方面是提供CYP2C9蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQ ID NO.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3的第98位的缬氨酸，并且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。

本发明提供了包含新的单碱基突变的CYP2C9基因和编码序列。该基因在对应于SEQ ID NO.2的第293位核苷酸由G突变为T(293G＞T)，从而引起其编码的氨基酸由甘氨酸突变为缬氨酸，即对应于SEQ ID NO.3的第98位的缬氨酸。该突变的CYP2C9蛋白(命名为G98V)对药物的代谢活性比野生型降低。该单碱基突变对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。

附图说明

图1是本发明的SEQ ID NO.1的第1001位核苷酸测序图谱。

具体实施方式

通过下述具体实施方式说明本发明，但本发明内容不限于此。

如无其它说明，本发明的“核酸片段”由核苷酸或其类似物组成，可以是DNA、RNA或其类似物的片段；可以是单链或双链；可以是天然的(如基因组的)或合成的。

本发明中，“突变”指在检测的基因，即CYP2C9基因中存在与野生型CYP2C9基因序列不同的核苷酸位点。“突变位点”指碱基发生突变的位置。在本发明中，所述突变位点是对应于SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或SEQ ID NO.2所示序列中的第293位。

在本发明中，“等位基因特异性”指特异地与等位基因杂交，如在严谨条件下进行杂交，使得鉴定对应于SEQ ID NO.1所示序列的第1001位或SEQ IDNO.2所示序列的第293位核苷酸为T。

本发明内容涉及CYP2C9基因的非同义突变。由于该突变位点位于基因的编码序列中，因此，本领域技术人员可知，所述突变位点既可以在基因组DNA中表现，也可以在编码序列(即CDS，对应于mRNA序列)中表现。本领域技术人员根据待检测样品，可以在基因组DNA或mRNA水平上对该突变位点进行检测。本申请中，SEQ ID NO.1是以本申请的突变位点为中心、前后各1kb的基因组DNA序列，即SEQ ID NO.1的第1001位是本发明涉及的突变位点。SEQ ID NO.2是具有所述突变位点的CYP2C9基因的编码序列，其中第293位是本发明涉及的突变位点。本领域技术人员可知，在本文中，对应于SEQID NO.2的第293位位点和对应于SEQ ID NO.1的第1001位位点同义互用。

本发明中，核苷酸和氨基酸的缩写采用本领域公知的缩写方式，如核苷酸中A表示腺嘌呤，G表示鸟嘌呤，C表示胞嘧啶，T表示胸腺嘧啶。氨基酸中，A表示丙氨酸，R表示精氨酸，N表示天冬酰胺，D表示天冬氨酸，C表示半胱氨酸，Q表示谷氨酰胺，E表示谷氨酸，G表示甘氨酸，H表示组氨酸，I表示异亮氨酸，L表示亮氨酸，K表示赖氨酸，M表示蛋氨酸，F表示苯丙氨酸，P表示脯氨酸，S表示丝氨酸，T表示苏氨酸，W表示色氨酸，Y表示酪氨酸，V表示缬氨酸。

本发明的内容是基于CYP2C9基因的新的单碱基突变位点。所述突变位点是位于CYP2C9基因的编码区内，对应于SEQ ID NO.2的第293位，该位点由野生型的G突变为T(293G＞T)；此外，由该突变的CYP2C9基因编码的蛋白的第98位由甘氨酸突变为缬氨酸(G98V)。

在第一个方面，本发明提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ IDNO.1的第1001位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1001位的核苷酸是T；或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.2的第293位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第293位的核苷酸是T；或者为上述核酸片段的互补序列。

在一种实施方式中，所述核酸片段的长度可以是如10-100、100-200、200-500、500-1000个核苷酸。优选地，所述核酸片段的长度是10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-100或100-300个核苷酸。

所述突变位点可以位于所述核酸片段的任何位置。

在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.1所示的序列。

在另一种实施方式中，所述核酸片段是SEQ ID NO.2所示的序列。

在其它实施方式中，所示核酸片段可以是SEQ ID NO.24-27所示的序列。

本发明的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID NO.1的第1001位或对应于SEQ ID NO.2的第293位的突变位点的等位基因片段或其互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，其中SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO.2的第293位的突变位点的核苷酸是T；所述等位基因片段是SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其互补序列。

在一种实施方式中，所述的寡核苷酸用作探针。所述探针能够在严谨条件下与包含突变位点的靶序列特异性杂交。本领域技术人员已知，所述探针不需要与靶序列完全互补，只要能与靶序列特异杂交即可。在优选的实施方案中，所述杂交条件可以满足使探针仅与靶序列特异性杂交。所述探针的长度可以是5-100个核苷酸，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸。所述突变位点可以出现在探针的任何位置。在优选的实施方式中，是突变位点出现在探针序列的中心或大约中心处。

在另一种实施方式中，所述寡核苷酸用作指导DNA合成的引物，如本领域公知的测序引物或合成引物等。所述引物不需要与模板完全互补，但应当与模板互补杂交以指导DNA合成。所述引物的长度可以是15-40个核苷酸长度，优选地为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。所述突变位点可以出现在所述引物的任何位置；优选地，所述突变位点出现在所述引物的3’末端。

在一些优选的实施方式中，所示寡核苷酸是如SEQ ID NO.28-33所示的序列。

基于此，本发明的第三个方面是提供用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.17所示的序列片段。

本发明的第四个方面是提供本发明的核酸片段或寡核苷酸用于检测CYP2C9基因突变的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物。

本发明的第五个方面是提供用药指导，包括检测待测样品中CYP2C9基因的对应于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO.2的第293位的单碱基突变。当检测到的CYP2C9基因在对应于SEQ ID NO.1的第1001位或SEQ ID NO.2的第293位的位点为T时，相对应地调整经CYP2C9代谢的药物的给药量。在具体的实施例中，当CYP2C9基因在SEQ ID NO.2的第293位的位点为T时，该基因编码的CYP2C9蛋白酶活性下降，故需要减少经CYP2C9代谢的药物的给药量。

本发明中所述的经CYP2C9代谢的药物包括：抗癌药物，如环磷酰胺、异环磷酰胺或紫杉醇；抗凝血药，如华法林、醋硝香豆素、抗惊厥药或美芬妥英；降糖药，如甲苯磺丁脲、那格列奈、吡格列酮或罗格列酮；抗癫痫药，如苯妥英或唑尼沙胺；抗疟药/抗寄生虫药，如阿莫地喹、盐酸氯胍或奎宁；抗精神病药，如阿米替林、西酞普兰、丙咪嗪、哌罗匹隆、舍曲林、硫利达嗪或文拉法辛；降压药，如氯沙坦、厄贝沙坦或缬沙坦；非类固醇性抗炎药，如双氯芬酸、氨基比林、安替比林、塞来昔布、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、氯诺昔康、甲芬那酸、萘普生、吡罗昔康或替诺昔康；镇痛药，如、洛哌丁胺、美沙酮或吗啡；质子泵抑制剂，如兰索拉唑或奥美拉唑；镇静药，如、氯巴占、甲苯比妥或佐匹克隆。

本发明的第六个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第293位的核苷酸。

在一种实施方式中，所述方法可以是测序法，包括分离并测定来自基因组DNA或RNA的核酸序列，分析其中包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的对应于第1001位的核苷酸或包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中的对应于第293位的核苷酸是否为T。测序法可以是本领域已知的任何可用的测序方法。测序引物可以根据本领域技术人员的常识进行设计，如在待检测位点的上下游适当位置处设计引物，以扩展包含该待测位点的片段，从而判断该位点的核苷酸。也可以采用本发明的寡核苷酸作为引物序列。

在另一种实施方式中，所述方法是利用探针杂交的方法，特异性地鉴定检测样品中包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中的对应于第1001位的核苷酸或包含对应于SEQ ID NO.2的序列的核酸中对应于第293位的核苷酸是否为T；所述方法中采用的探针是本发明的寡核苷酸。例如，从待测样品中分离出核酸，在允许探针与核酸中可能存在的特异性靶序列杂交的条件下使探针与核酸接触；可被检测的杂交可以通过使用由可检测的试剂标记过的探针来实现；例如，用放射性同位素、荧光染料或能催化形成可检测产物的酶来标记探针。标记探针、用标记探针检测样品中是否存在靶序列的方法都是本领域技术人员所熟知的。

在一种具体的实施方式中，提供以Taqman探针SNP检测法检测对应于SEQ ID NO.1的第1001位的核苷酸的方法，包括：

1)设计引物用于特异性扩增包含对应于SEQ ID NO.1的第1001位的PCR产物，同时设计两条Taqman-MGB探针，分别针对对应于SEQ ID NO.1的第1001位的G和T(如SEQ ID NO.33所示序列)等位基因。

引物设计原则为：

(1)序列选取应在基因的保守区段；

(2)避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；

(3)引物长度在18到24个核苷酸；

(4)Tm值在55-65℃，GC含量在40％-60％；

(5)引物之间的Tm值相差避免超过2℃；

(6)引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；

(7)PCR扩增片段长度在50bp-150bp；

(8)引物末端最后5个核苷酸不能有超过2个的G和C。

Taqman MGB探针设计原则为：

(1)探针的5’端避免出现G；

(2)Tm值应为65-67℃；

(3)尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp；

(4)尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，避免出现4个或4个以上的G重复出现；

(5)将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。

荧光基团可以采用FAM、VIC等来标记两个等位基因。

2)利用上述引物和探针，对待测样本进行实时定量PCR。

PCR条件：95℃预变性10分钟后进入30个扩增循环：92℃变性12秒，60℃退火及延伸1分钟(此阶段检测荧光信号)。

3)数据分析。

分析实验结果，根据样本两种荧光的强弱判定待测样本CYP2C9基因是否存在293G＞T突变。

本发明中，所述样品可以是任何包含核酸的样品，如血液；优选所述样品来自于人。所述核酸可以是DNA或编码RNA，优选为基因组DNA。本发明的分析核酸的方法可以以DNA或RNA为目标物。本领域技术人员可知，当以DNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQ ID NO.1的序列的核酸中对应于第1001位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQ ID NO.1的序列设计；当以RNA为检测目标物时，分析待测样品中的包含对应于SEQID NO.2的序列的核酸中对应于第293位的核苷酸，所使用的探针或引物根据SEQ ID NO.2的序列设计。

本发明的第七个方面是提供CYP2C9蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQ ID NO.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3的第98位的缬氨酸，且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸，如10-20、20-50或50-100个氨基酸。

下面将通过具体的实施例进一步说明本发明，但以下具体的实施例仅出于示例性的目的。

实施例

实施例1：人CYP2C9基因新的突变位点的鉴定

本实施例中，采集2127份血液样本，提取血液中的基因组DNA，设计测序引物对CYP2C9基因的9个外显子进行序列扩增、测序，筛选CYP2C9基因的突变位点

1)提取DNA：

从每位被测者采取5ml静脉EDTA抗凝血液样本；然后按照普通盐析法和/或采用专门的DNA提取试剂盒(购自美国Omega公司的DNA提取试剂盒)提取待测血样的基因组DNA。

2)PCR扩增：

设计扩增引物，对获得的基因组DNA样品中的CYP2C9基因的9个外显子序列进行扩增。所述扩增引物对序列见表1。

采用50μl PCR反应体系，包括：1×PCR缓冲液、1.5mM MgCl₂、100～150ng的基因组DNA、上下游引物均为0.2μM、dNTP为0.4mM、TaKaRa公司的LATaq DNA聚合酶1.5U。PCR扩增循环参数如下：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火30秒，72℃延伸2分30秒，30个循环后再延伸5分钟。退火温度与引物长度相关，具体温度见表1。

使用美国ABI公司的GeneAmp PCR System 9700扩增仪扩增。

表1：测序引物对及退火温度

3)纯化扩增产物：

取50μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，刀片切取目的条带。按照E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒(Omega公司)要求进行目的条带的DNA回收纯化。

4)测序：

以回收后的产物为模板，使用测序引物按照CEQ^TM DTCS-Quick Start Kit测序试剂盒(美国Beckman公司)要求进行测序PCR反应，反应结束并纯化后，用美国Beckman公司的CEQ8000型基因测序仪进行分离以判读扩增产物的序列。测序引物见表2。

表2：测序引物

区域	测序引物(5’-3’)
		外显子1	TACCTCTAGGGATACAC(SEQ ID NO.16)
外显子2&3	CTAACAACCAGGACTCATAAT(SEQ ID NO.17)
		外显子4	TTGCTGTTAAGGGAATTTGTAGGTAAGATA(SEQ ID NO.18)
外显子5	TAGTGGTCTATTTTGTTATTCATTCAT(SEQ ID NO.19)
		外显子6	TTCCAGTTTCTATGTTG(SEQ ID NO.20)
外显子7	ACCCGGTGATGGTAGAGGTT(SEQ ID NO.21)
		外显子8	ACGGGATTTCCTCATCTG(SEQ ID NO.22)
外显子9	CGATACACTGAACAGTTATTGC(SEQ ID NO.23)

5)数据分析：

将测得的序列与野生型CYP*1序列(GenBank注册号NM_000771.3)进行比对。

通过比对分析，在一份样品中发现CYP2C9基因编码区的第293位的核苷酸由G变为T(如图1所示)，该突变位于CYP2C9基因的第2个外显子内。据此推断该CYP2C9基因编码的蛋白质中，第98位氨基酸由甘氨酸(G)突变为缬氨酸(V)。该新的293位突变(293G＞T)已被国际P450命名委员会确认命名为新等位基因CYP2C9*39。

本实施例中示例性地给出了鉴定新突变位点的方法。本领域技术人员根据上述内容可以清楚地得知特异性地检测待测样品中包含对应于SEQ ID NO.1的第1001位核苷酸的方法：分离样品中的核酸，在本实施例中对应的实验条件下进行扩增反应，引物使用引物对SEQ ID NO.6和7；用测序引物SEQ IDNO.17对扩增的产物进行测序；将测序结果与野生型结果比对，分析对应于SEQ ID NO.1的第1001位位点的核苷酸。

实施例2：酶代谢活性分析

根据现有的研究结果，野生型对各种药物的代谢活性均比较高，而*2型的代谢活性比野生型的代谢活性有明显下降，*3型的代谢活性比*2型更低(参见参考文献18、19、21、22)。因此，在本领域中已有这样一种共识：同一个基因型所表达的酶对特异性底物的代谢活性可以代表对其它底物药的代谢活性。从而，根据某一基因型所表达的酶对特异性底物代谢活性数据可以类推该基因型所表达的酶对其它底物药的代谢活性(如，可以将该基因型所表达的酶的代谢活性与野生型所表达的酶的代谢活性进行比较)。

在本实施例中，根据上述的突变位点，以野生型CYP2C9(*1)基因为模板，定点突变了CYP2C9基因编码区的第293位的核苷酸(由G变为T)，构建表达载体表达突变型CYP2C9蛋白(命名为G98V)，利用Promega公司的CYP2C9活性检测试剂盒(含有CYP2C9特异性底物)检测该突变型CYP2C9的酶活性，以判断与野生型CYP2C9(*1)相比，其酶促代谢活性是否发生改变。

1)目的基因的表达

以野生型CYP2C9(*1)质粒载体(由美国南佛罗里达大学的周树峰教授馈赠)为模板，定点突变CYP2C9基因编码区的第293位核苷酸，即得到包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸的ORF区序列，将该目的基因及内参基因Gluc(一种分泌型荧光素酶，其翻译产物可分泌到培养基中，并通过特定试剂盒检测到荧光信号；其骨架载体是pIRES pGluc-Basic，购自NEB公司，货号N8082S)分别连接至双基因表达载体pIRES(购自Clontech公司，货号631605)的A、B位点中，使两个基因位于同一CMV启动子控制下，最终获得双基因表达载体pIRES-Gluc-2C9。将8*104个非洲绿猴肾上皮细胞来源的COS-7细胞(此细胞株已被广泛应用于CYP2C9体外活性分析，详见参考文献18、21)铺于24孔板；过夜培养后，利用脂质体lip2000转染500ng质粒载体pIRES-Gluc-2C9，以表达目的蛋白CYP2C9(G98V)及内参蛋白Gluc。

2)酶活性检测

继续培养48小时后，加入200μ1新鲜DMEM培养基(含10％FBS)，并参照Promega公司CYP2C9检测试剂盒(货号：V8791)的使用说明，加入4μl CYP2C9的底物Luciferin-H，混匀后继续培养8小时后取50μl培养基加入等体积的Promega试剂盒(货号：V8791)检测缓冲液。该检测缓冲液中含萤火虫荧光素酶；底物Luciferin-H经CYP2C9代谢后的产物D-luciferin与萤火虫荧光素酶反应后可产生荧光。利用Promega公司的GLOMAX 20/20Luminometer(GLOMAX 20/20发光检测仪)检测荧光信号。再取7μl培养基参照Gluc检测kit(NEB公司，货号：E3300)使用说明，加入等体积的检测缓冲液，利用GLOMAX 20/20 Luminometer检测Gluc荧光信号。将与CYP2C9直接相关的荧光信号/内参Gluc荧光信号值作为最终的实验数据，与野生型(*1型)CYP2C9数据对比，可分析待测突变体的代谢活性的变化。每种实验对象进行三个平行实验，实验结果见表3。

关于Luciferin-H的介绍：

CYP2C9的典型代谢活性是可对芳香环结构进行羟基化作用(参见参考文献23、24，相关内容通过引用的方式结合至本文)。本实施例中应用的检测底物Luciferin-H含芳香环结构，CYP2C9可特异性的对该底物的R1位羟基化，而产生新的代谢底物D-Luciferin([4S]-4，5-dihydro-2-[6′-hydroxy-2′-benzothiazolyl]-4-thiazolecarboxylic acid)，后者可与检测试剂中的萤火虫荧光素酶反应而发光，信号的强弱与产物D-luciferin的量直接相关，即后者反映了待检CYP2C9蛋白的酶促活性。已有研究表明，利用该检测方法可有效反映CYP2C9对常见药物的代谢特征，主要包括CYP2C9探针药物华法林、甲苯磺丁脲、双氯芬酸、苯妥英、布洛芬；同时还包括部分常见药物磺胺苯吡唑、曲格列酮、阿扎莫林、吡罗昔康、磺胺苯吡唑、咪康唑、氟伏沙明等(参见参考文献22、24、25)。因此本实验方案的数据可普遍适用于其它经CYP2C9代谢的药物，包括本申请文件中之前列出的药物。

表3：酶代谢活性的实验结果

从结果可以看出，3个阴性对照均呈现出了预期趋势：空载体检测不到2C9的信号，相对于野生型*1型，已知突变型*2型活性有明显下降(大约有近60％的减少)，*3型下降最大(大约下降93％)，该数值及趋势与已有报道一致(参见参考文献18、19、21、22)。

利用该体外检测体系可以看出：G98V的代谢活性比野生型降低大约80％，即该突变可引起所表达酶的代谢活性明显降低。因此，在实践中，需要考虑对携带该基因型的个体在用药剂量上进行适当调节，如减少药物的使用量和避免药物不良反应的发生。这种通过基因导向的药物调整对于治疗窗狭窄的药物(如华法林、苯妥英等)更为重要。

序列：

SEQ ID NO.1：基因组DNA序列

ACTATTGACCTGGCAATTGCGGCCTCTATGTGGGCTTTTGGGAGTCCTAGGTGGAGTCCATAGAGAGATATTTTTAGTATAAATGCTATGATGCATGCTAATCATAAAAGGCTATTAAACCAGGAAATTGTTAGTTCTTGAAGCTGGGTATTGGTCTTAAGGTAGACTCGAAAGTGCTGATAAATTTCTCAAGCATCAGTGTTTGAATAAGCGGAGTTTCAAATTTTGGTCTGCTGTACATTAGCTGTGAGACACTGAAAATGAATTTGTCATTCTCTGAGCTCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTTACTCTGTAGCTCAGGCTGGAGTGCAGTGGTACAATCTTGGCTCACTGCAACCTCCATCTCCCAGGTCCCCATTCAAGAAATTCTCCTGCCTCAGTCCCCCAAGTAGCTAGCATTACAGGCATGCACCACCATGCTCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGTGGTATCACCTTGTTGGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTTGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGTTGGGATTACAGGCAGGAGCCACCACACCTGGCCGTTTGTTTAAAATAGAGTAAATAGACCTGCTGAATATGTTGATGTGAGTATTAATTGTAATCTGCATAGCAATTGTCTGACCATTGCCTTGAACATCACAGGCCATCTGAGTGGCAAGTATAATCATCATCATGTTTCTATTTAAAATTCAGAAATATTTGAAGCCTGTGTGGCTGAATAAAAGCATACAAATACAATGAAAATATCATGCTAAATCAGGCTTAGCAAATGGACAAAATAGTAACTTCGTTTGCTGTTATCTCTGTCTACTTTCCTAGCTCTCAAAGGTCTATGGCCCTGTGTTCACTCTGTATTTTGGCCTGAAACCCATAGTGGTGCTGCATGGATATGAAGCAGTGAAGGAAGCCCTGATTGATCTTGGAGAGGAGTTTTCTGGAAGAGTCATTTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAGGATTTGGTAGGTGTGCATGTGCCTGTTTCAGCATCTGTCTTGGGGATGGGGAGGATGGAAAACAGAGACTTACAGAGCTCCTCGGGCAGAGCTTGGCCCATCCACATGGCTGCCCAGTGTCAGCTTCCTCTTTCTTGCCTGGGATCTCCCTCCTAGTTTCGTTTCTCTTCCTGTTAGGAATTGTTTTCAGCAATGGAAAGAAATGGAAGGAGATCCGGCGTTTCTCCCTCATGACGCTGCGGAATTTTGGGATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCTTGTGGAGGAGTTGAGAAAAACCAAGGGTGGGTGACCCTACTCCATATCACTGACCTTACTGGACTACTATCTTCTCTACTGACATTCTTGGAAACATTTCAGGGGTGGCCATATCTTTCATTATGAGTCCTGGTTGTTAGCTCATGTGAAGCGGGGGTTTGAAGCTGAGAGCCAAGGGAATTTGCACATATTTGTGCTGTGTGTGTACAGGCATGATTGTGCGTACAGTGTGGGTATAAAAGGTTCATTTAATCCCATGTTCTCCTGAACTTTGCTTTTTTGCTTTCAAATAAGAAATGATGAATATAGATTTTGAGTTCATTTTTTGAAAGAGTTAAAGAGCAGTGTTTTTCCCATTACCTATTCCAGAACATGTCACCAGAGAATACTTGACAAGTCAACATGGTGGGAATGGCCCTATCATACCCATATGGAGCATGAACCAAATGGCATGTGCTTTTATTTAATTGGACTGTGTTTGTATGGTCAGCCTCACTGACTTCTCTGGGGTTTCTTTTAGGCCCGTGCTTGCCATTCTGGCCAGTAATGACATTCTACAGTTTTTATTGCTTAGGCATATCTTAGTGCAGTTCTCATCAATTATTATTTCTCTGTAAACACAGCATTATTTTAAAAATAGTATTAATTATTTCTTGTTACTGTATTG

SEQ ID NO.2：编码序列

ATGGATTCTCTTGTGGTCCTTGTGCTCTGTCTCTCATGTTTGCTTCTCCTTTCACTCTGGAGACAGAGCTCTGGGAGAGGAAAACTCCCTCCTGGCCCCACTCCTCTCCCAGTGATTGGAAATATCCTACAGATAGGTATTAAGGACATCAGCAAATCCTTAACCAATCTCTCAAAGGTCTATGGCCCTGTGTTCACTCTGTATTTTGGCCTGAAACCCATAGTGGTGCTGCATGGATATGAAGCAGTGAAGGAAGCCCTGATTGATCTTGGAGAGGAGTTTTCTGGAAGAGTCATTTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAACAGAGGATTTGGAATTGTTTTCAGCAATGGAAAGAAATGGAAGGAGATCCGGCGTTTCTCCCTCATGACGCTGCGGAATTTTGGGATGGGGAAGAGGAGCATTGAGGACCGTGTTCAAGAGGAAGCCCGCTGCCTTGTGGAGGAGTTGAGAAAAACCAAGGCCTCACCCTGTGATCCCACTTTCATCCTGGGCTGTGCTCCCTGCAATGTGATCTGCTCCATTATTTTCCATAAACGTTTTGATTATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTAATGGAAAAGTTGAATGAAAACATCAAGATTTTGAGCAGCCCCTGGATCCAGATCTGCAATAATTTTTCTCCTATCATTGATTACTTCCCGGGAACTCACAACAAATTACTTAAAAACGTTGCTTTTATGAAAAGTTATATTTTGGAAAAAGTAAAAGAACACCAAGAATCAATGGACATGAACAACCCTCAGGACTTTATTGATTGCTTCCTGATGAAAATGGAGAAGGAAAAGCACAACCAACCATCTGAATTTACTATTGAAAGCTTGGAAAACACTGCAGTTGACTTGTTTGGAGCTGGGACAGAGACGACAAGCACAACCCTGAGATATGCTCTCCTTCTCCTGCTGAAGCACCCAGAGGTCACAGCTAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACGTGTGATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTACACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACATTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGCCCCATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTCAGAAACTATCTCATTCCCAAGGGCACAACCATATTAATTTCCCTGACTTCTGTGCTACATGACAACAAAGAATTTCCCAACCCAGAGATGTTTGACCCTCATCACTTTCTGGATGAAGGTGGCAATTTTAAGAAAAGTAAATACTTCATGCCTTTCTCAGCAGGAAAACGGATTTGTGTGGGAGAAGCCCTGGCCGGCATGGAGCTGTTTTTATTCCTGACCTCCATTTTACAGAACTTTAACCTGAAATCTCTGGTTGACCCAAAGAACCTTGACACCACTCCAGTTGTCAATGGATTTGCCTCTGTGCCGCCCTTCTACCAGCTGTGCTTCATTCCTGTCT

SEQ ID NO.3：氨基酸序列

MDSLVVLVLCLSCLLLLSLWRQSSGRGKLPPGPTPLPVIGNILQIGIKDISKSLTNLSKVYGPVFTLYFGLKPIVVLHGYEAVKEALIDLGEEFSGRVIFPLAERANRGFGIVFSNGKKWKEIRRFSLMTLRNFGMGKRSIEDRVQEEARCLVEELRKTKASPCDPTFILGCAPCNVICSIIFHKRFDYKDQQFLNLMEKLNENIKILSSPWIQICNNFSPIIDYFPGTHNKLLKNVAFMKSYILEKVKEHQESMDMNNPQDFIDCFLMKMEKEKHNQPSEFTIESLENTAVDLFGAGTETTSTTLRYALLLLLKHPEVTAKVQEEIERVIGRNRSPCMQDRSHMPYTDAVVHEVQRYIDLLPTSLPHAVTCDIKFRNYLIPKGTTILISLTSVLHDNKEFPNPEMFDPHHFLDEGGNFKKSKYFMPFSAGKRICVGEALAGMELFLFITSILQNFNLKSLVDPKNLDTTPVVNGFASVPPFYQLCFIPV

SEQ ID NO.24：核酸片段

AGTTTTCTGGAAGAGTCATTTTCCCACTGGC

SEQ ID NO.25：核酸片段

AGAGGAGTTTTCTGGAAGAGTCATTTTCCCACTGGCTGAAA

SEQ ID NO.26：核酸片段

CTTGGAGAGGAGTTTTCTGGAAGAGTCATTTTCCCACTGGCTGAAAGAGCT

SEQ ID NO.27：核酸片段

TTGATCTTGGAGAGGAGTTTTCTGGAAGAGTCATTTTCCCACTGGCTGAAAGAGCTAACAG

SEQ ID NO.28：寡核苷酸序列

CAGTGGGAAAATGAC

SEQ ID NO.29：寡核苷酸序列

TCAGCCAGTGGGAAAATGAC

SEQ ID NO.30：寡核苷酸序列

CTCTTTCAGCCAGTGGGAAAATGAC

SEQ ID NO.31：寡核苷酸序列

GTTAGCTCTTTCAGCCAGTGGGAAAATGAC

SEQ ID NO.32：寡核苷酸序列

CCTCTGTTAGCTCTTTCAGCCAGTGGGAAAATGAC

SEQ ID NO.33：寡核苷酸序列

ATGACTCTTCCAGA

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Claims (7)

1.核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID NO.1的第1001位的突变位点，且是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其互补序列，其中第1001位的核苷酸是T；或者所述核酸片段包含对应于SEQ IDNO.2的第293位的突变位点，且是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其互补序列，其中第293位的核苷酸是T。

2.根据权利要求1所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的长度是10-100、100-200、200-500或500-1000个核苷酸。

3.根据权利要求2所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的长度是10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-100或100-300个核苷酸。

4.根据权利要求1所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段是SEQID NO.1、2、24-27所示的序列。

5.用于检测和/或分析单碱基突变的试剂盒，包括权利要求1-4任一项所述的核酸片段；或者包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.17所示的序列片段。

6.权利要求1-4任一项所述的核酸片段在制备检测CYP2C9基因突变的制剂中的应用。

7.CYP2C9蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQ ID NO.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID NO.3的第98位的缬氨酸，并且为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。