KR20140016654A

KR20140016654A - 대장균 내에서 1,4-부탄디올의 생합성에 사용되는 효소의 개량과 개선된 유전자를 스크리닝 하는 방법

Info

Publication number: KR20140016654A
Application number: KR1020120083513A
Authority: KR
Inventors: 박진환; 이평천; 박재찬; 이영민; 이우용
Original assignee: 삼성전자주식회사; 아주대학교산학협력단
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2014-02-10
Also published as: US20140045232A1; JP2014023532A; US9121042B2

Abstract

일 구체예는 1,4-부탄다이올 생합성 경로중 말단의 2개 반응 (4-hydroxybutyryl-CoA에서 4-hydroxybutyraldehyde 생성 반응 및 4-hydroxybutyraldehyde에서 1,4-butanediol 생성 반응)에 대해 현재까지 활성이 보고되지 않은 효소인 butyraldehyde dehydrogenase (bld)와 butanol dehydrogenase (bdh)를 Clostridium saccharoperbutylacetonicum 으로 부터 도입하여 대장균에서 발현시킨 결과 1,4-butanediol 생산능이 있음을 확인하였다. 특히 butyraldehyde dehydrogenase 효소를 방향 진화 방법으로 활성를 강화하여 1,4-butanediol의 생산 농도를 2배 이상 향상시켰다.

Description

대장균 내에서 1,4-부탄디올의 생합성에 사용되는 효소의 개량과 개선된 유전자를 스크리닝 하는 방법{Improved enzyme used in synthesis of 1,4-BDO and screening method of the same}

일 구체예는 1,4-BDO를 효율적으로 생성하기 위해 개량된 부틸알데히드 디히드로게나제(butyraldehyde dehydrogenase, bld)와 이를 포함하는 형질전환 균주에 대한 것이다.

일 구체예는 상기 형질전환된 균주를 이용하여 고 효율로 1,4-BDO 를 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

4-부탄디올 (1,4-BDO)은 세계적으로 연간 약 130만 톤을 사용하는 용매로, 아세틸렌, 부탄, 프로필렌, 부타디엔과 같은 석유 기반 물질들로부터 생산하고 있다.

상기 1,4-부탄디올은 다양한 화학물질은 고분자, 솔벤트, 정밀화학 중간물질 등으로 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 쓰이고 있다. 현재 대부분의 탄소수4개 화학물질은 1,4-부탄디올, 말레익 안하이드라이드 등으로부터 유래되어 합성되고 있지만, 유가가 올라감에 따라 생산비용이 증대되고 있어 화학 생산공정을 보완 및 대체하는 공정의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 미생물을 이용한 생물학적 공정이 제시되고 있다.

화학적인 방법으로 생산하는 기존의 방식과 다르게 2011년 genometica에서는 대장균 내에서 Cat1 (succinyl-CoA synthetase from Clostridium kluyveri), SucD (CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase from Porphyromonas gingivalis), 4hbd (NAD dependent 4-hydroxybutyrate dehydrogenase from P. gingivalis), Cat2 (4-hydroxybutyryl CoA:acetyl-CoA transferase from P. gingivalis), ADHE2 (alcohol dehydrogenase from Clostridium acetobutylicum)유전자를 이용하여 1,4-BDO 생합성 회로를 구축했다.

일 구체예에서는 이미 대장균 내에서의 밝혀진 생합성 회로를 변형하여 새로운 생합성 경로를 구축하였다. 특히 이 경로에 가장 적합한 부틸알데히드 디히드로게나제(bld) 유전자 변이체를 발굴하여 1,4-BDO를 효율적으로 생산할 후 있는 미생물을 개발하였다.

일 구체예는 1,4-BOD를 고효율로 생산할 수 있는데 이용되는 재조합 부틸알데히드 디히드로게나제를 제공한다.

또다른 구체예는 1,4-BDO를 고효율로 생산할 수 있도록 재조합 bld 유전자를 포함하는 형질전환 미생물을 제공한다.

또다른 구체예는 1,4-BDO를 고효율로 생산할 수 있도록 재조합 bld 유전자 및 bdh 유전자를 포함하는 형질전환 미생물을 제공한다.

또다른 구체예는 1,4-BDO를 고효율로 생산할 수 있도록 재조합 cat1 유전자, sucD 유전자, 4hbd 유전자, cat2 유전자, bld 유전자 및 bdh 유전자를 포함하는 형질전환 미생물을 제공한다.

일 양상은 재조합 부틸알데히드 디히드로게나제에 대한 것이다.

일 구체예는 4-hydroxybutyryl CoA를 4-hydroxybutyraldehyde로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 부틸알데히드 디히드로게나제(butyraldehyde dehydrogenase, bld) 또는 bld 변이체를 제공한다.

상기 bld는 Clostridium saccharoperbutylacetonicum에서 유래한 유전자이다. 상기 bld는 서열번호 1의 폴리펩티드를 가질 수 있다.

명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다

이때, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 409번째 Asn, 361번째 Arg, 467번째 Ala, 371번째 Met, 176번째 Ala, 273번째 Leu 및 279번째 Lys으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

특히, 상기 bld 변이체 서열번호 1에서 409번째 Asn이 Thr로 치환되고, 361번째 Arg이 Ser으로 치환되고, 467번째 Ala이 Ser으로 치환될 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체 서열번호 1에서 361번째 Arg이 Ser으로 치환되고, 467번째 Ala이 Ser으로 치환될 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체 서열번호 1에서 371번째 Met이 Arg으로 치환되고, 361번째 Arg이 Ser으로 치환되고, 467번째 Ala이 Ser으로 치환될 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 176번째 Ala이 Thr로 치환되고, 273번째 Leu이 Ile으로 치환되고, 279번째 Lys이 Arg으로 치환되고, 361번째 Arg이 Ser으로 치환되고, 467번째 Ala이 Ser으로 치환될 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 176번째 Ala이 Thr로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 273번째 Leu이 Ile으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 279번째 Lys이 Arg으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 361번째 Arg이 Ser으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 467번째 Ala이 Ser으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 409번째 Asn이 Thr로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 361번째 Arg이 Ser으로 치환된 것일 수 있다.

또한, 상기 변이체는 활성 부위(catalytic site)가 서열번호 1에서, 43번째에 위치한 Thr, 144번째에 위치한 Asn, 241번째에 위치한 Ala, 242번째에 위치한 Gly, 243번째에 위치한 Ala, 244번째에 위치한 Gly, 246번째에 위치한 Pro, 273번째에 위치한 Leu, 274번째에 위치한 Pro, 276번째에 위치한 Ile, 277번째에 위치한 Ala, 279번째에 위치한 Lys, 368번째에 위치한 Glu, 398번째에 위치한 His, 432번째에 위치한 Val 및 441번째에 위치한 Thr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

특히, 상기 변이체의 활성 부위는 43번째에 위치한 Thr이 Asp, 144번째에 위치한 Asn이 Asp, 241번째에 위치한 Ala이 Val, 242번째에 위치한 Gly이 Ser, 243번째에 위치한 Ala이 Gly, 244번째에 위치한 Gly이 Ser, 246번째에 위치한 Pro이 Tyr, 273번째에 위치한 Leu이 Ile, 274번째에 위치한 Pro이 Tyr, 276번째에 위치한 Ile이 Leu, 277번째에 위치한 Ala이 Val, 279번째에 위치한 Lys이 Arg, 368번째에 위치한 Glu이 Gln, 398번째에 위치한 His이 Lys, 432번째에 위치한 Val이 Leu 및 441번째에 위치한 Thr이 Asp으로 치환된 것일 수 있다.

또한, 상기 변이체는 서열번호 1에서 91번째에 위치한 Met, 139번째에 위치한 Ile, 140번째에 위치한 Thr, 141번째에 위치한 Pro, 142번째에 위치한 Ser, 143번째에 위치한 Thr, 166번째에 위치한 Asn, 167번째에 위치한 Gly, 168번째에 위치한 His, 169번째에 위치한 Pro, 170번째에 위치한 Gly, 201번째에 위치한 Asn, 202번째에 위치한 Pro, 203번째에 위치한 Thr, 204번째에 위치한 Met, 207번째에 위치한 Leu, 208번째에 위치한 Asp, 210번째에 위치한 Ile, 211번째에 위치한 Ile, 212번째에 위치한 Lys, 222번째에 위치한 Thr, 223번째에 위치한 Gly, 224번째에 위치한 Gly, 225번째에 위치한 Pro, 227번째에 위치한 Met, 230번째에 위치한 Thr, 231번째에 위치한 Leu, 241번째에 위치한 Ala, 242번째에 위치한 Gly, 243번째에 위치한 Ala, 244번째에 위치한 Gly, 273번째에 위치한 Leu, 274번째에 위치한 Pro, 275번째에 위치한 Cys, 326번째에 위치한 Ser, 327번째에 위치한 Ile, 328번째에 위치한 Asn, 329번째에 위치한 Lys, 332번째에 위치한 Val, 367번째에 위치한 Thr, 368번째에 위치한 Glu, 369번째에 위치한 Leu, 370번째에 위치한 Met 및 396번째에 위치한 Arg으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 bld 변이체일 수 있다.

특히, 상기 변이체는 청구항 1에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1에서 91번째에 위치한 Met이 Asp, 139번째에 위치한 Ile이 Leu, 140번째에 위치한 Thr이 Lys, 141번째에 위치한 Pro이 Tyr, 142번째에 위치한 Ser이 Gly, 143번째에 위치한 Thr이 Lys, 166번째에 위치한 Asn이 Asp, 167번째에 위치한 Gly이 Ser, 168번째에 위치한 His이 Lys, 169번째에 위치한 Pro이 Tyr, 170번째에 위치한 Gly이 Ser, 201번째에 위치한 Asn이 Asp, 202번째에 위치한 Pro이 Tyr, 203번째에 위치한 Thr이 Lys, 204번째에 위치한 Met이 Asp, 207번째에 위치한 Leu이 Ile, 208번째에 위치한 Asp이 Asn, 210번째에 위치한 Ile이 Leu, 211번째에 위치한 Ile이 Leu, 212번째에 위치한 Lys, 222번째에 위치한 Thr이 Lys, 223번째에 위치한 Gly이 Ser, 224번째에 위치한 Gly이 Ser, 225번째에 위치한 Pro이 His, 227번째에 위치한 Met이 Lys, 230번째에 위치한 Thr이 Lys, 231번째에 위치한 Leu이 Val, 241번째에 위치한 Ala이 Val, 242번째에 위치한 Gly이 Ser, 243번째에 위치한 Ala이 Val, 244번째에 위치한 Gly이 Ser, 273번째에 위치한 Leu이 Ile, 274번째에 위치한 Pro이 His, 275번째에 위치한 Cys이 Met, 326번째에 위치한 Ser이 Gly, 327번째에 위치한 Ile이 Leu, 328번째에 위치한 Asn이 Asp, 329번째에 위치한 Lys, 332번째에 위치한 Val이 Leu, 367번째에 위치한 Thr이 Lys, 368번째에 위치한 Glu이 Gln, 369번째에 위치한 Leu이 Leu, 370번째에 위치한 Met이 Lys 및 396번째에 위치한 Arg이 Lys으로 치환된 것일 수 있다.

또한, 상기 bld 변이체는 서열번호 2의 서열의 폴리펩티드일 수 있다.

또 다른 구체예는 상기 bld 또는 bld 변이체를 코딩하는 부틸알데히드 디히드로게나제 유전자를 제공한다. 이때, 상기 유전자는 Clostridium saccharoperbutylacetonicum에서 유래한 것일 수 있다.

또 다른 구체예는 상기 유전자가 도입된 1,4-BDO를 생산할 수 있는 미생물를 제공한다. 상기 미생물은 4-hydroxybutyraldehyde를 1,4-butanediol로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 부탄올 디히드로게나제(butanol dehydrogenase, bdh) 유전자가 더 도입된 것일 수 있다. 이때 상기 유전자는 서열번호 3일 수 있다. 상기 균주는 추가적으로 succinate를 succinyl CoA로 전환하는 활성을 가진 cat1을 코딩하는 유전자, succinyl CoA를 succinic semialdehyde로 전환하는 활성을 가진 sucD 을 코딩하는 유전자, succinic semialdehyde를 4-hydroxybutyrate로 전환하는 활성을 가진 4hbd을 코딩하는 유전자 및 4-hydroxybutyrate를 4-hydroxybutyl CoA로 전환하는 활성을 가진 cat2 을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 이때, 상기 미생물은 E.coli일 수 있다.

또한, 상기 재조합 부틸알데히드 디히드로게나제를 코딩하는 유전자 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용될 수 있다.

발현용 벡터로서 작동을 하려면 복제원점, 프로모터, MCS 및 선택 마커를 함유해야 한다. 복제원점은 플라스미드가 숙주 세포의 염색체와 별도로 복제할 수 있는 기능을 부여해 주고, 프로모터는 삽입되는 외래유전자의 전사 과정에 작용을 하며, MCS는 다중 클로닝 사이트로서 외래 유전자가 다양한 제한효소 사이트를 통해 삽입될 수 있게 하며, 선택 마커는 벡터가 숙주 세포에 제대로 들어갔는지를 확인시켜 주는 역할을 한다. 선택 마커는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있고, 바람직하게는 비용의 측면을 고려하여 앰피실린 또는 겐타마이신 내성 유전자가 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 바람직하게는 강한 프로모터, 예컨대 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터 등을 포함하며, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는 바람직하게는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터 또는 T7 프로모터이다. 이와 같은 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 연결되어 있다

본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

또 다른 구체예는 4-hydroxybutyryl CoA와 bld 또는 bld 변이체를 접촉하는 단계를 포함하는 4-hydroxybutyaldehyde를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 bld 또는 bld 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

또 다른 구체예는 4-hydroxybutyaldehyde와 Bdh를 접촉하는 단계를 포함하는 1,4-butanediol을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 4-hydroxybutyryl CoA와 bld 또는 bld 변이체를 접촉하는 단계; 및

상기에서 수득된 반응물에 Bdh를 접촉하는 단계를 포함하는 1,4-butanediol을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, bld 또는 bld 변이체, bdh를 미생물에 도입하여 미생물을 제공하는 단계; 상기 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 미생물을 1,4-BDO 분리 단계를 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등에서 배양될 수 있다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 갈락토오즈 등이 이용될 수 있다. 또한, 미생물이 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 무기질소화합물 등 일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 암모늄염 등 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1 ~ 10 %의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건일 수 있다.

상기 방법에서 상기 미생물을 제공하는 단계에 있어서, succinate를 succinyl CoA로 전환하는 활성을 가진 cat1을 코딩하는 유전자, succinyl CoA를 succinic semialdehyde로 전환하는 활성을 가진 sucD 을 코딩하는 유전자, succinic semialdehyde를 4-hydroxybutyrate로 전환하는 활성을 가진 4hbd을 코딩하는 유전자 및 4-hydroxybutyrate를 4-hydroxybutyl CoA로 전환하는 활성을 가진 cat2 을 코딩하는 유전자가 미생물에 더 도입된 것일 수 있다.

또한, bld 또는 bld 변이체를 미생물에 도입하여 미생물을 제공하는 단계; 상기 배양물에 schiff’s reagent를 접촉시키는 단계; 및 흡광도를 측정하여 1,4-BDO 생산량 확인방법을 제공한다. 이때, 상기 1,4-BDO의 생산량 확인은 4-hydroxybutyraldehyde 생산량을 측정을 통하여 이루어지는 것이다.

일 구체예는 1,4-부탄다이올 생합성 경로중 butyraldehyde dehydrogenase (bld)와 butanol dehydrogenase (bdh)를 대장균에 도입하여 발현시킨 결과 1,4-butanediol 생산능이 있음을 확인하였다. 특히 특이적으로 1,4-BDO를 고효율로 생산할 수 있는 bld 변이체를 수득하여, 이를 이용하여 생산 농도가 2배 이상 향상된 재조합 형질전환 미생물을 획득하였다. 상기 형질전환 미생물을 이용할 경우 효율적으로 1,4-BDO를 생산할 수 있다.

도 1은 대장균에서 구축한 1,4-BDO 생합성 대사경로를 나타낸 것이다.. (A)는 숙시네이트(succinate)에서 유래하여 구축된 1,4-BDO 대사 경로 물질과 그 효소를 나타낸다. (B)는 대장균 내에 도입된 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 Schiff's reagent를 이용하여 플레이트 상에서 알데히드 검출 실험한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 외래 유전자가 도입되지 않은 TOP10을 나타낸 것이다. (B)는 pSTV-cs4c, pUCM이 도입된 TOP10을 나타낸 것이다. (C)는 pSTV-cs4c, pUCM-bld가 도입된 TOP10을 나타낸 것이다.
도 3은 선별한 콜로니를 배양하여 얻은 상층액과 schiff's reagent를 반응 시켰을 때, 알데히드 반응을 확인한 결과를 나타낸다. (A)는 1시간 동안 상온에서 반응을 시켰을 경우, 색의 변화를 나타낸다.
1; pSTV-cs4c + pUCM-bld(WT), 2; pSTV-cs4c + pUCM-bldM1, 3; pSTV-cs4c + pUCM-bldM2, 4; pSTV-cs4c + pUCM-bldM3, 5; pSTV-cs4c + pUCM-bldM4, 6; pSTV-cs4c + pUCM-bldM5
(B)는 1 시간 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정했을 때의 그래프를 나타낸다.
bld가 활성이 좋으면 4-hydroxybutyraldehyde가 많이 나오고, 이는 schiff's reagent와 결합을 하여 색이 나타나 스크리닝을 하는 데에 유용하게 쓰일 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 WT-Bld와 다양한 bld 변이체 (Bld-M1 내지 Bld-M5)에 cs4c(cat1, sucD, 4hbd 및 cat2 유전자)와 Bdh(butanol dehydrogenase)를 미생물에 도입하여 bld 변이체에 따른 1,4-BDO의 생산량을 확인하였다. 또한, 양성 대조군으로 cs4c와 adhE 유전자를 미생물에 도입하여 1,4-BDO가 생산됨을 확인하였다.
도 5는 표 3에서 개신된 Bld-M1 내지 Bld-M5의 돌연변이 위치 중 어느 곳의 돌연변이가 Bld 변이체의 활성을 가장 잘 유도하는지 확인하기 위하여 하나씩의 돌연변이를 갖는 Bld 변이체를 생산하였다. 그 결과 돌연변이 Bld-S1 내지 Bld-S6를 제작하였고, 제작된 Bld 변이체를 이용하여 1,4-BDO 생산능력을 확인하였다. 그 결과, Bld-2에서 현저하게 1,4-BDO가 생산됨을 확인하였고, 야생현 Bld (서열번호 1 참조)의 273번째가 변이된 것이 가장 우수한 1,4-BDO 생산능을 가지고 있음을 확인하였다.
도 6은 bld와 이와 유사한 활성을 가질 것으로 예측되는 단백질 서열을 비교하여 공통적인 서열을 표시한 것이다.
도 7은 bld의 3차원 구조를 나타낸 것이다. 도 7a는 전체 bld의 3차원 구조를 나타낸 것이고, 도 7b는 bld의 활성 부위와 이것의 기질인 NADPH를 도시한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<실시예 1> 형질전환 숙주 및 형질전환을 위한 제작된 발현벡터

1,4-BDO를 효율적으로 생산하기 위하여 이용한 재조합 미생물 및 상기 미생물을 형질전환 시키기 위한 발현 벡터는 하기 표 1과 같다.

Strains and plasmids	Relevant properties	Source or reference
Strains
Escherichia coli XL1-Blue	F' ::Tn10 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/ recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thihsdR17 (rK mK+) glnV44 relA1 lac	Stratagene
Escherichia coli TOP10	F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(Str^R)endA1	Invitrogen
Clostridium saccharoperbutylacetonicum KCTC 5577 Clostridium acetobutylicum KTCT1790	Source for bldandbdhgenes Source for adhE2 gene	KCTC KCTC
Plasmids
pUCM	Cloning vector modified from pUC19; constitutive lacpromoter,Ap^r	1
pUCM-bld pUCM-adhE2	Constitutively expressed bldgeneofC. saccharoperbutylacetonicum Constitutively expressed adhE2genefromC.acetobutylicum	This study
pUCM-bdh	Constitutively expressed bdhgeneofC. saccharoperbutylacetonicum	This study
pUCM-bld-M1-5 series	Constitutively expressed bldmutantgenes1-5generatedbyrandommutagenesis	This study
pUCM-bld-S1-6 series	Constitutively expressed bldmutantgenes1-6generatedbysite-directedmutagenesis	This study
pBBR1MCS2	Broad-host-range plasmid, Km^r	2
pBBR-bdh	Constitutively expressed bdhgeneofC. saccharoperbutylacetonicum, Km^r	This study
pSTV28	Plasmid with a replication origin of pACYC184, Cm^r	Takara
pSTV-cs4c	Constitutively expressed cat1,sucD,4hbd,andcat2genestogether	This study

1. Kim, S. H., Y. H. Park, C. Schmidt-Dannert, and P. C. Lee. 2010. Redesign, reconstruction, and directed extension of the brevibacterium linens C40 carotenoid pathway in escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology 76:5199-5206.

2. Peterson, K. M. 1995. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 166:175-176.

<실시예 2> 대사회로 유전자의 모듈화

pGEM vector에 합성된 cat1-sucD-4hbd-cat2 유전자를 constitutive한 promoter의 조절하에 이루어 지도록 pUCM 벡터의 XbaⅠ, NotⅠ자리에 cloning을 진행하였다. 그 후, pSTV 28 벡터의 SacⅠ, BamHⅠ 자리에 subcloning을 진행하였다.

AdhE2는 Clostridium acetobutylicum의 chromosomal DNA에서 PCR로 증폭한 후, pUCM 벡터의 XbaⅠ, NotⅠ자리에 cloning을 진행했다. PCR은 DNA engine thermal cycler(Bio-Rad) 를 이용하였고, 95℃ 4분에 이어, 94℃ 1분, 50℃ 40초, 72℃ 1분의 3과정을 32회 반복한 후, 마지막으로 72℃ 7분의 과정을 거쳐 수행하였다.

각 primer에 대한 DNA 서열은 표 2와 같다.

Gene	Sequence	서열번호	Enzyme site
bdh	F; 5’- GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGGAGAATTTTAGATTTAATG	서열번호 3	XbaⅠ
bdh	R; 5’- TTCCCTTGCGGCCGCTTAAAGGGACATTTCTAA	서열번호 4	NotⅠ
bld	F; 5’- GCCCCGGGAGGAGGATTACAAAATGATTAAAGACACGCTAGTTTC	서열번호 5	XmaⅠ
bld	R; 5’- TTCCCTTGCGGCCGCTTAACCGGCGAGTACACATC	서열번호 6	NotⅠ
cs4c	F; 5’- GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAGTAAAGGGATTAAGAAC	서열번호 7	XbaⅠ
cs4c	R; 5’- TTCCCTTGCGGCCGCTTAACCAAAACGTTTGCG	서열번호 8	NotⅠ
Sub_BamHⅠ_R	R; 5’- CGGGATCCCGGTGTGAAATACCG	서열번호 9	BamHⅠ
Sub_EcoRⅠ_R	R; 5’- GAATTCCGGTGTGAAATACCG	서열번호 10	EcoRⅠ
Sub_SacI_F	F; 5’- GAGCTCCCGACTGGAAAGCG	서열번호 11	SacⅠ
Sub_SalI_F adhE2	F; 5’- ACGCGTCGACCCGACTGGAAAGCG F; 5’- GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGATTTTGCATCTGCTG R; 5’- TTCCCTTGCGGCCGCTTAAAACGACTTGATGTAGAT	서열번호 12 서열번호 13 서열번호 14	SalI XbaI NotI

<실시예 3> 유전자의 개량과 스크리닝

<3-1> bld 돌연변이 제작

1,4-BDO 생산량의 증가를 위해서 방향 진화(directed evolution) 방법으로 bld 유전자를 개량하였다. 실수 유발 PCR (error prone PCR) 방법을 이용하여 bld의 서열을 바꿨다. 2.5 mM MgCl₂와 서브클로닝(subcloning)용 프라이머를 사용하였다. G-rich dNTP (T:A:C:G = 1:1:1:4)와 T-rich dNTP (T:A:C:G = 4:1:1:1)를 각각 사용하여 error의 다양성을 높였다. 이들은 pUCM 벡터의 XmaⅠ, NotⅠ자리에 클로닝을 진행했다.

<3-1> 1,4-BDO를 고효율로 생산하기 위한 bld 돌연변이 스크리닝

pSTV 28- cat1-sucD-4hbd-cat2 (pSTV-cs4c) 벡터가 도입된 TOP10에 pUCM-bld를 도입시켰다.

library 중에서 생산량이 높일 수 있는 유전자를 찾기 위해서 schiff’s reagent를 사용하였다. schiff’s reagent는 30 mg/ml sodium bisulfate (in water), 0.5 M KCl (in water), 2 mg/ml pararosaniline (in ethanol)가 2:1:2의 비율로 섞여진 용액으로 콜로니가 뜬 플레이트 상에서 반응 시키기 위해 0.8% agar (in water)에 용액을 첨가하였다[3]. 두 용액을 잘 섞은 후, plate에 붓고 37℃에서 약 3 시간 정도 반응을 시켰다. 그 후 빨간색을 나타내는 colony를 선별하여 2 ml LB 배지에서 37℃, 250 rpm으로 12시간 배양했다. 배양액 1 ml을 13000 rpm, 10 분 동안 원심분리를 하여 얻어진 상등액의 200 ul와 schiff’s reagent 100 ul를 잘 섞어서 37℃에서 1~5시간 반응시켰다. 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 높은 흡광도를 보인 유전자는 pSTV-cs4c, pBBR-bdh와 함께 TOP10에 도입하여 배양하였다. 그림 2와 3이 위의 설명에 해당한다.

<실시예 4> 대장균 배양 및 1,4-BDO 생산

상기 기술한 클로닝을 비롯한 유전자 모듈의 발현으로 1,4-BDO 생산을 위해 Escherichia coli strain TOP10을 사용하였다.

3 개의 plasmid가 포함된 재조합 대장균은 serum bottle을 이용하여 혐기 조건으로 30℃, 250 rpm에서 48시간 배양하였다. 배지 조성은 0.6% 탄산 칼슘과 2% 포도당이 포함된 LB 100 ml이며, 50 μg/ml chloramphenicol, 100 μg/ml ampicillin, 50 μg/ml kanamycin을 모두 첨가하였다.

배양조건은 질소를 주입하여 혐기 조건으로 하였고, 30℃, 250 rpm에서 18시간 배양하였다. 배지 조성은 2% 포도당이 포함된 LB 배지 1 L이며, 50 μg/ml chloramphenicol, 100 μg/ml ampicillin, 50 μg/ml kanamycin을 모두 첨가하였다. 배지의 pH는 5 N NaOH로 조절하였다.

상기 기술한 방법으로 1,4-BDO 생합성에 관련된 유전자들을 모듈화 한 것을 대장균 내에 형질전환 시켰을 때, 재조합 대장균은 1,4-BDO를 생산하였다. 실험 결과 4-hydroxybutyrate에서부터 축적되어 1,4-BDO의 생산이 적은 것으로 나타났다. 그래서 먼저 4-hydroxybutyraldehyde를 많이 만들어서 1,4-BDO쪽으로 대사 경로가 진행되도록 실험을 구성하였다.

<실시예 5> 1,4-BDO의 분석

100 ml 배지에서 1 ml을 취하여 13000 rpm에서 30분동안 원심분리를 하였고, 상등액을 다시 한번 같은 조건으로 원심분리 후 800 ul를 0.45 um filter로 여과하여 샘플을 준비했다. 이 중에서 10 ul의 샘플을 HPLC 분석에 사용하였다. HPLC는 Refractive index detector (RID)가 장착된 Agilent 1100 장치를 사용했다. 4 mM H2SO4 용액을 이동상으로 사용하고 BIO-RAD Aminex HPX-87H Column을 고정상으로 사용했으며, 이때의 유속은 0.7 ml/min이다. 컬럼과 검출기의 온도는 모두 50℃이다.

1,4-BDO의 생산량을 분석한 결과, 기존의 bld를 cs4c, bdh 유전자와 함께 TOP10 내에서 발현을 시켰을 때 보다 개량된 bld를 도입하여 배양하였을 때, 더 많은 양의 1,4-BDO를 확보할 수 있었다. 두 배 이상 차이를 보이며 2-1번 샘플이 약 0.4 g/L 농도의 1,4-BDO를 생산하는 것을 알 수 있다(도 4 참조). 또한, 나머지 Bld-M1, Bld-M3, M4, M5 샘플도 모두 control(Bld-WT) 보다 높은 1,4-BDO 생산성을 보였다(도 4 참조). Bld mutant 들의 염기서열을 분석한 결과 표3과 같이 변형이 일어난 것을 알 수 있었다.

상기 결과로부터, bld가 활성이 좋으면 4-hydroxybutyraldehyde가 많이 나오고, 이는 schiff's reagent와 결합을 하여 색이 나타나 스크리닝을 하는 데에 유용하게 쓰일 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<표 3>

<실시예 6> 돌연변이 중 가장 효과가 좋은 돌연변이 선별

상기 표3에서 보듯이 Bld-M1 내지 Bld-M5 돌연변이 들은 적게는 1개에서 많게는 5개의 아미노산에서 돌연변이가 일어난 것으로 확인되었다. 이에 어떤 돌연변이가 가장 큰 효과를 보이는 지 알아보기 위해 총 6개의 돌연변이 각각에 대해 실시예 4, 5 와 동일한 방법으로 1,4-BDO 생산량을 확인하였다. 그 결과 도 5에서 보듯이 Bld-S2 (L273I) 균주가 가장 높은 1,4-BDO 생산량(0.08 g/L)을 보이는 것을 확인하였다. 다른 돌연변이(Bld-S5,S6)도 미세한 향상을 보였다. 주목할 점은 L273I mutation을 포함하는 Bld-S2의 경우, 지금까지 가장 성능이 좋다고 알려진 AdhE2 보다 3배 이상 효과가 좋은 것으로 확인된 것이다.

<실시예 7> Bld의 homology modeling

돌연변이가 효소의 활성에 영향을 미친 원인을 밝혀내기 위해서는 효소의 3차원 입체 구조를 살펴볼 필요가 있다. 하지만 BLD의 입체 구조는 아직 밝혀지지 않았기 때문에 homology modeling 기법을 사용해 BLD의 입체 구조를 새롭게 생성해냈다. 우선, BLAST search를 통해 Bld와 유사한 서열의 단백질 구조를 탐색했고, 그 결과 두 단백질(Protein Data Bank ID: 3K9D, 3MY7)이 가장 유사도가 높았다. 이 두 단백질 서열들을 템플릿으로 삼고, BLD 서열을 이 템플릿에 정렬시켰다 (도 6). 끝으로 템플릿 기반의 BLD 입체 구조를 생성했다 (도 7). 이 모델링은 모두 Discovery Studio 3.1 소프트웨어를 이용했다.

알데히드탈수소효소(알데히드 디히드로게나제)의 반응 메커니즘에 따르면 기질과 반응하는 아미노산이 존재하는데, 이는 시스테인 아미노산으로써 다양한 알데히드탈수소효소(알데히드 디히드로게나제)들에게서 잘 보존되어 있다 (J. Mol. Biol (2007) 366, 481-493; Nat. Struct. Mol. Biol. (1997) 4, 317-326). 서열 정렬 결과를 통해서 BLD에서도 이 시스테인 아미노산이 보존되어 있음을 확인할 수 있고, 이는 275번째 아미노산(Cys275)이다 (도 6). BLD의 활성을 개선시킨 돌연변이에 대해서 입체 구조를 기반으로 분석해 볼 때, Cys275와 인접하거나 조효소 결합 자리와 가까운 위치에서 돌연변이가 일어나면 효소의 활성을 증대시킬 수 있음을 알 수 있다 (도 7). 도 7의 A는 homology modeling 으로부터 생성된 Bld의 입체 구조이다. Cys275와 Leu273 아미노산들은 노란색 막대(stick model) 모델로 나타냈고, 조효소는 분홍색 막대로 표현했다. 도 7의 B는 catalytic site의 close-up view이고, 위의 두 아미노산의 위치가 잘 드러나도록 조효소는 표시하지 않았다.

상기 결과로부터, 앞으로 Cys275 근처의 아미노산들을 돌연변이 시킴으로써 BLD를 더 개선시킬 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. 즉, 기질과 반응하는 catalytic site 주변의 아미노산의 변형이 해당 효소의 활성 향상에 기여한다는 것을 알 수 있었다.

<110> samsung advanced institute technology <120> Improved enzyme used in synthesis of 1,4-BDO and screening method of the same <130> PN097268 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Clostridium saccharoperbutylacetonicum <400> 1 Met Ile Lys Asp Thr Leu Val Ser Ile Thr Lys Asp Leu Lys Leu Lys 1 5 10 15 Thr Asn Val Glu Asn Ala Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asp Ser Ser 20 25 30 Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Asn Ala Val 35 40 45 His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Glu Asn Lys Glu Ile 65 70 75 80 Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95 Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110 Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Thr Val Val Phe Asn Gly His Pro Gly Ala Lys Lys Cys Val Ala 165 170 175 Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro 180 185 190 Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Asp Ser Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly 210 215 220 Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile 245 250 255 Glu Lys Ala Gly Lys Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn 260 265 270 Leu Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala 275 280 285 Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn 290 295 300 Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn 305 310 315 320 Glu Thr Gln Glu Tyr Ser Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala 325 330 335 Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Ser Val Lys 340 345 350 Cys Ile Ile Cys Glu Val Ser Ala Arg His Pro Phe Val Met Thr Glu 355 360 365 Leu Met Met Pro Ile Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu 370 375 380 Ala Ile Glu Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu 405 410 415 Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val 420 425 430 Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr 435 440 445 Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys 450 455 460 Val Leu Ala Gly 465 <210> 2 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of butyraldehyde dehydrogenase_L273I <400> 2 Met Ile Lys Asp Thr Leu Val Ser Ile Thr Lys Asp Leu Lys Leu Lys 1 5 10 15 Thr Asn Val Glu Asn Ala Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asp Ser Ser 20 25 30 Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Asn Ala Val 35 40 45 His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Glu Asn Lys Glu Ile 65 70 75 80 Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95 Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110 Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Thr Val Val Phe Asn Gly His Pro Gly Ala Lys Lys Cys Val Ala 165 170 175 Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro 180 185 190 Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Asp Ser Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly 210 215 220 Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile 245 250 255 Glu Lys Ala Gly Lys Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn 260 265 270 Ile Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala 275 280 285 Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn 290 295 300 Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn 305 310 315 320 Glu Thr Gln Glu Tyr Ser Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala 325 330 335 Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Ser Val Lys 340 345 350 Cys Ile Ile Cys Glu Val Ser Ala Arg His Pro Phe Val Met Thr Glu 355 360 365 Leu Met Met Pro Ile Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu 370 375 380 Ala Ile Glu Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu 405 410 415 Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val 420 425 430 Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr 435 440 445 Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys 450 455 460 Val Leu Ala Gly 465 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of bdh <400> 3 gctctagaag gaggattaca aaatggagaa ttttagattt aatg 44 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of bdh <400> 4 ttcccttgcg gccgcttaaa gggacatttc taa 33 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of bld <400> 5 gccccgggag gaggattaca aaatgattaa agacacgcta gtttc 45 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of bld <400> 6 ttcccttgcg gccgcttaac cggcgagtac acatc 35 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of cs4c <400> 7 gctctagaag gaggattaca aaatgagtaa agggattaag aac 43 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of cs4c <400> 8 ttcccttgcg gccgcttaac caaaacgttt gcg 33 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub_BamHI_R <400> 9 cgggatcccg gtgtgaaata ccg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub_EcoRI_R <400> 10 cgggatcccg gtgtgaaata ccg 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub_SacI_F <400> 11 gagctcccga ctggaaagcg 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sub_SalI_F <400> 12 acgcgtcgac ccgactggaa agcg 24 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of adhE2 <400> 13 gctctagaag gaggattaca aaatgatttt gcatctgctg 40 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of adhE2 <400> 14 ttcccttgcg gccgcttaaa acgacttgat gtagat 36

Claims

4-hydroxybutyryl CoA를 4-hydroxybutyraldehyde로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 부틸알데히드 디히드로게나제(butyraldehyde dehydrogenase, bld) 또는 bld 변이체.
청구항 1에 있어서, 상기 bld는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인 bld.
청구항 1에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 409번째 Asn, 361번째 Arg, 467번째 Ala, 371번째 Met, 176번째 Ala, 273번째 Leu 및 279번째 Lys으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 409번째 Asn이 Thr로 치환되고, 361번째 Arg이 Ser으로 치환되고, 467번째 Ala이 Ser으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 361번째 Arg이 Ser으로 치환되고, 467번째 Ala이 Ser으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 371번째 Met이 Arg으로 치환되고, 361번째 Arg이 Ser으로 치환되고, 467번째 Ala이 Ser으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 176번째 Ala이 Thr로 치환되고, 273번째 Leu이 Ile으로 치환되고, 279번째 Lys이 Arg으로 치환되고, 361번째 Arg이 Ser으로 치환되고, 467번째 Ala이 Ser으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 176번째 Ala이 Thr로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 273번째 Leu이 Ile으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 279번째 Lys이 Arg으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 361번째 Arg이 Ser으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 467번째 Ala이 Ser으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 409번째 Asn이 Thr로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 3에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 1에서 361번째 Arg이 Ser으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 1에 있어서, 상기 변이체의 활성 부위(catalytic site)가 서열번호 1에서, 43번째에 위치한 Thr, 144번째에 위치한 Asn, 241번째에 위치한 Ala, 242번째에 위치한 Gly, 243번째에 위치한 Ala, 244번째에 위치한 Gly, 246번째에 위치한 Pro, 273번째에 위치한 Leu, 274번째에 위치한 Pro, 276번째에 위치한 Ile, 277번째에 위치한 Ala, 279번째에 위치한 Lys, 368번째에 위치한 Glu, 398번째에 위치한 His, 432번째에 위치한 Val 및 441번째에 위치한 Thr으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 15에 있어서, 상기 변이체의 활성 부위는 43번째에 위치한 Thr이 Asp, 144번째에 위치한 Asn이 Asp, 241번째에 위치한 Ala이 Val, 242번째에 위치한 Gly이 Ser, 243번째에 위치한 Ala이 Gly, 244번째에 위치한 Gly이 Ser, 246번째에 위치한 Pro이 Tyr, 273번째에 위치한 Leu이 Ile, 274번째에 위치한 Pro이 Tyr, 276번째에 위치한 Ile이 Leu, 277번째에 위치한 Ala이 Val, 279번째에 위치한 Lys이 Arg, 368번째에 위치한 Glu이 Gln, 398번째에 위치한 His이 Lys, 432번째에 위치한 Val이 Leu 및 441번째에 위치한 Thr이 Asp으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 1에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1에서 91번째에 위치한 Met, 139번째에 위치한 Ile, 140번째에 위치한 Thr, 141번째에 위치한 Pro, 142번째에 위치한 Ser, 143번째에 위치한 Thr, 166번째에 위치한 Asn, 167번째에 위치한 Gly, 168번째에 위치한 His, 169번째에 위치한 Pro, 170번째에 위치한 Gly, 201번째에 위치한 Asn, 202번째에 위치한 Pro, 203번째에 위치한 Thr, 204번째에 위치한 Met, 207번째에 위치한 Leu, 208번째에 위치한 Asp, 210번째에 위치한 Ile, 211번째에 위치한 Ile, 212번째에 위치한 Lys, 222번째에 위치한 Thr, 223번째에 위치한 Gly, 224번째에 위치한 Gly, 225번째에 위치한 Pro, 227번째에 위치한 Met, 230번째에 위치한 Thr, 231번째에 위치한 Leu, 241번째에 위치한 Ala, 242번째에 위치한 Gly, 243번째에 위치한 Ala, 244번째에 위치한 Gly, 273번째에 위치한 Leu, 274번째에 위치한 Pro, 275번째에 위치한 Cys, 326번째에 위치한 Ser, 327번째에 위치한 Ile, 328번째에 위치한 Asn, 329번째에 위치한 Lys, 332번째에 위치한 Val, 367번째에 위치한 Thr, 368번째에 위치한 Glu, 369번째에 위치한 Leu, 370번째에 위치한 Met 및 396번째에 위치한 Arg으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 1에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1에서 91번째에 위치한 Met이 Asp, 139번째에 위치한 Ile이 Leu, 140번째에 위치한 Thr이 Lys, 141번째에 위치한 Pro이 Tyr, 142번째에 위치한 Ser이 Gly, 143번째에 위치한 Thr이 Lys, 166번째에 위치한 Asn이 Asp, 167번째에 위치한 Gly이 Ser, 168번째에 위치한 His이 Lys, 169번째에 위치한 Pro이 Tyr, 170번째에 위치한 Gly이 Ser, 201번째에 위치한 Asn이 Asp, 202번째에 위치한 Pro이 Tyr, 203번째에 위치한 Thr이 Lys, 204번째에 위치한 Met이 Asp, 207번째에 위치한 Leu이 Ile, 208번째에 위치한 Asp이 Asn, 210번째에 위치한 Ile이 Leu, 211번째에 위치한 Ile이 Leu, 212번째에 위치한 Lys, 222번째에 위치한 Thr이 Lys, 223번째에 위치한 Gly이 Ser, 224번째에 위치한 Gly이 Ser, 225번째에 위치한 Pro이 His, 227번째에 위치한 Met이 Lys, 230번째에 위치한 Thr이 Lys, 231번째에 위치한 Leu이 Val, 241번째에 위치한 Ala이 Val, 242번째에 위치한 Gly이 Ser, 243번째에 위치한 Ala이 Val, 244번째에 위치한 Gly이 Ser, 273번째에 위치한 Leu이 Ile, 274번째에 위치한 Pro이 His, 275번째에 위치한 Cys이 Met, 326번째에 위치한 Ser이 Gly, 327번째에 위치한 Ile이 Leu, 328번째에 위치한 Asn이 Asp, 329번째에 위치한 Lys, 332번째에 위치한 Val이 Leu, 367번째에 위치한 Thr이 Lys, 368번째에 위치한 Glu이 Gln, 369번째에 위치한 Leu이 Leu, 370번째에 위치한 Met이 Lys 및 396번째에 위치한 Arg이 Lys으로 치환된 것인 bld 변이체.
청구항 1에 있어서, 상기 bld 변이체는 서열번호 2의 서열의 폴리펩티드인 것인 재조합 bld.
청구항 1 내지 19 중 어느 하나의 bld 또는 bld 변이체를 코딩하는 부틸알데히드 디히드로게나제 유전자.
청구항 20에 있어서, 상기 BLD를 코딩하는 유전자는 Clostridium saccharoperbutylacetonicum에서 유래한 것인 유전자.
청구항 20의 유전자가 도입된 1,4-BDO를 생산할 수 있는 미생물.
청구항 22에 있어서, 상기 미생물은 4-hydroxybutyraldehyde를 1,4-butanediol로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 부탄올 디히드로게나제(butanol dehydrogenase, bdh) 유전자가 더 도입된 것인 미생물.
청구항 23에 있어서, 상기 bdh 유전자는 clostridium sacchroperbutylacetonicum 유래의 것인 미생물.
청구항 23에 있어서, 상기 균주는 추가적으로 succinate를 succinyl CoA로 전환하는 활성을 가진 cat1을 코딩하는 유전자, succinyl CoA를 succinic semialdehyde로 전환하는 활성을 가진 sucD 을 코딩하는 유전자, succinic semialdehyde를 4-hydroxybutyrate로 전환하는 활성을 가진 4hbd을 코딩하는 유전자 및 4-hydroxybutyrate를 4-hydroxybutyl CoA로 전환하는 활성을 가진 cat2 을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 미생물.
청구항 22 내지 청구항 25 증 어느 하나에 있어서, 상기 미생물은 E.coli인 것인 재조합 미생물.
4-hydroxybutyryl CoA와 bld 또는 bld 변이체를 접촉하는 단계를 포함하는 4-hydroxybutyaldehyde를 생산하는 방법.
청구항 27에 있어서, 상기 bld 또는 bld 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것인 방법.
4-hydroxybutyaldehyde와 Bdh를 접촉하는 단계를 포함하는 1,4-butanediol을 생산하는 방법.
4-hydroxybutyryl CoA와 bld 또는 bld 변이체를 접촉하는 단계; 및
상기에서 수득된 반응물에 Bdh를 접촉하는 단계를 포함하는 1,4-butanediol을 생산하는 방법.
bld 또는 bld 변이체, bdh를 미생물에 도입하여 미생물을 제공하는 단계;
상기 미생물을 배양하는 단계; 및
상기 미생물을 1,4-BDO 분리 단계를 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 방법.
청구항 31 있어서, 상기 미생물을 제공하는 단계에 있어서, succinate를 succinyl CoA로 전환하는 활성을 가진 cat1을 코딩하는 유전자, succinyl CoA를 succinic semialdehyde로 전환하는 활성을 가진 sucD 을 코딩하는 유전자, succinic semialdehyde를 4-hydroxybutyrate로 전환하는 활성을 가진 4hbd을 코딩하는 유전자 및 4-hydroxybutyrate를 4-hydroxybutyl CoA로 전환하는 활성을 가진 cat2 을 코딩하는 유전자가 더 도입된 것인 1,4-BDO를 생산하는 방법.
bld 또는 bld 변이체를 미생물에 도입하여 미생물을 제공하는 단계;
상기 배양물에 schiff’s reagent를 접촉시키는 단계; 및
흡광도를 측정하여 1,4-BDO 생산량을 확인방법.
청구항 33에 있어서, 상기 1,4-BDO의 생산량 확인은 4-hydroxybutyraldehyde 생산량을 측정을 통하여 이루어지는 것인 방법.