KR20150115289A - 알데히드 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 미생물, 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생산방법 - Google Patents

알데히드 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 미생물, 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생산방법 Download PDF

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Abstract

알데히드 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 미생물, 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생산방법에 관한 것이다.

Description

알데히드 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 미생물, 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생산방법{An aldehyde dehydrogenase mutant, a polynucleotide coding the mutant, a vector and a microorganism having the polynucleotide, and a method for producing 1,4-butanediol using the same}
알데히드 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 미생물, 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생산방법에 관한 것이다.
1,4-부탄디올(1,4-BDO)은 용매로서 플라스틱, 섬유 및 폴리우레탄 등의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 1,4-BDO는 테트라히드로퓨란(THF)을 경유하여 스판덱스 섬유의 원료인 폴리테트라메틸렌 에테르 글리콜(PTMEG)로 변환될 수 있다.
1,4-BDO는 현재 아세틸렌과 포르말린을 원료로 하는 Reppe 공정 또는 부탄(butane)을 원료로 하는 Davy Mckee 공정에 의해 제조된다. 그러나, 화학적인 방법을 통한 1,4-BDO 생산은 가스 및 석유 관련 원료를 사용하므로, 생산비 절감 및 환경 보호 측면에서 대안적인 생산방법이 요구되고 있다. 이에, 미생물을 이용한 생물학적 1,4-BDO 생산방법이 제시되고 있다.
종래의 기술에 의해서도, 미생물을 통해 1,4-BDO를 효율적으로 생산하는 방법이 요구된다.
일 양상은 4-히드록시부티릴-CoA를 4-히드록시부티르알데히드로 전환을 촉매하는 활성을 갖고, 서열번호 1의 273번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 알데히드 데히드로게나제 변이체를 제공한다.
다른 양상은 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체 및/또는 상기 미생물을 이용한, 1,4-부탄디올을 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 4-히드록시부티릴-CoA를 4-히드록시부티르알데히드로 전환을 촉매하는 활성을 갖고, 서열번호 1의 273번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 알데히드 데히드로게나제 변이체를 제공한다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 알데히드 데히드로게나제는 클로스트리디움 베이제링키(Clostridium beijerinckii)에서 유래한 것일 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체는 서열번호 1에서 273번째 아미노산인 루이신(L)이 이소루이신(I) 또는 세린(S)으로 치환된 것일 수 있다. 상기 서열번호 1에서 273번째 아미노산인 루이신(L)이 이소루이신(I)으로 치환된 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 1에서 273번째 아미노산인 루이신(L)이 세린(S)으로 치환된 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 양상은 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서의 용어 "폴리뉴클레오티드"는 gDNA 및 cDNA와 같은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 폴리뉴클레오티드의 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 클로스트리디움 베이제링키(Clostridium beijerinckii)에서 유래한 것일 수 있다.
상기 서열번호 1에서 273번째 아미노산인 루이신(L)이 이소루이신(I)으로 치환된 변이체는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1에서 273번째 아미노산인 루이신(L)이 세린(S)으로 치환된 변이체는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 상기 벡터는 복제기점, 전사 조절 부위, 다중 클로닝 부위, 선별 마커, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 미세적 크기를 갖는 원핵생물, 진핵생물 세포 또는 유기체를 포함할 수 있다. 상기 미생물은 고세균, 진정세균, 또는 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물을 포함할 수 있다. 상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 4-히드록시부티레이트를 4-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다.
상기 활성 증가는 4-히드록시부티레이트의 4-히드록시부티릴-CoA로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드의 발현 증가에 의한 것일 수 있다. 본 명세서에서, 폴리펩티드의 발현 증가는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 증폭 또는 조절 영역의 변이에 의한 것을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제(4-hydroxybutyryl CoA:acetyl-CoA transferase: Cat2)일 수 있다. 상기 Cat2는 EC.2.8.3.a로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 Cat2는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 활성 증가는 Cat2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 내재적(endogenous) 또는 외인성(exogenous)일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 숙시닐-CoA, 알파-케토글루타레이트, 또는 그 조합을 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다.
상기 숙시닐-CoA를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성의 증가는 숙시닐-CoA의 숙시닉 세미알데히드로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드의 4-히드록시부티레이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 내재적 또는 외인성 폴리펩티드일 수 있다. 상기 외인성 폴리펩티드는 포르피로모나스(Porphyromonas) 속 또는 클로스트리디움(Clostridium) 속 유래일 수 있다.
상기 숙시닐-CoA의 숙시닉 세미알데히드로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드는 조효소 A-의존성 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase: SucD)일 수 있다. 상기 SucD은 EC.1.2.1.b로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 SucD은 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 숙시닉 세미알데히드의 4-히드록시부티레이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드는 4-히드록시부티레이트 세미알데히드 데히드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase: 4hbd)일 수 있다. 상기 4hbd는 EC.1.1.1.a로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 4hbd는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 숙시닐-CoA를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성의 증가는 SucD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 4hbd를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 SucD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 SucD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 4hbd를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 4hbD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 알파-케토글루타레이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성의 증가는 알파-케토글루타레이트의 숙시닉 세미알데히드로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드의 4-히드록시부티레이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 내재적 또는 외인성 폴리펩티드일 수 있다. 상기 외인성 폴리펩티드는 포르피로모나스(Porphyromonas) 속, 클로스트리디움(Clostridium),또는 미코박테리움(Mycobacterium) 속 유래일 수 있다.
상기 알파-케토글루타레이트의 숙시닉 세미알데히드로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드는 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(alpha-ketoglutarate decarboxylase: SucA)일 수 있다. 상기 SucA는 EC.4.1.1.71로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 SucA는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 숙시닉 세미알데히드의 4-히드록시부티레이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
또한, 상기 알파-케토글루타레이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성의 증가는 SucA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 4hbd를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 SucA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 SucA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 4hbd를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 활성, 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 호기성 호흡 제어를 조절하는 활성, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 "감소"는 조작되지 않은 미생물에 비하여 조작된 상기 미생물에서의 활성을 상대적으로 나타낸 것일 수 있다. 상기 활성은 적절한 대조군 종에 비하여, 상기 활성이 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.
상기 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드, 호기성 호흡 제어를 조절하는 인자를 코딩하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 피루베이트로부터 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 호기성 호흡 제어를 조절하는 인자를 코딩하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감쇄된 것일 수 있다.
피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC.1.1.1.27 또는 EC.1.1.1.28으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 대장균 유래의 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 대장균 W 염색체 (Escherichia coli W chromosome) 유래의 것일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12753486의 Gene ID를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 락테이트 데히드로게나제 (NADH-linked lactate dehydrogenase)를 코딩하는 대장균 ldhA일 수 있다. 상기 ldhA 유전자는 서열번호 15의 아미노산 서열 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
피루베이트를 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트를 포르메이트로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 피루베이트 + CoA ↔ 포르메이트 + 아세틸 CoA 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 효소는 대장균 피루베이트 포르메이트 리아제 (pyruvate formate lyase: Pfl)일 수 있다. 상기 Pfl은 EC.2.3.1.54로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12752499의 Gene ID 를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 대장균 pflB일 수 있다. 상기 pflB유전자는 서열번호 17의 아미노산 서열 및 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드는 알콜 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: Adh)일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제는 NADH의 NAD+로의 산화와 함께 아세틸 CoA를 에탄올로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제는 EC.1.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12753141의 Gene ID 를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 adhE일 수 있다. 상기 adhE유전자는 서열번호 19의 아미노산 서열 및 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드는 NAD+의 NADH로의 환원을 이용하여 옥살로아세테이트를 말레이트로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 말레이트 데히드로게나제 (malate dehydrogenase: Mdh)일 수 있다. 상기 말레이트 데히드로게나제는 EC 1.1.1.37로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12697256의 Gene ID 를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 mdh일 수 있다. 상기 mdh유전자는 서열번호 21의 아미노산 서열 및 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
호기성 호흡 제어를 조절하는 인자의 폴리펩티드는 ArcA일 수 있다. 상기 ArcA는 DNA-결합 반응 조절자 (DNA-binding response regulator)일 수 있다. 상기 ArcA는 2인자 시스템(two component system)의 DNA-결합 반응 조절자일 수 있다. 상기ArcA는 2인자 (ArcB-ArcA) 신호-전달 체계 집단에 속하고, 동족 감각 키나아제 (sensory kinase) ArcB와 공조하여 다양한 오페론의 발현을 부정적으로 또는 긍정적으로 제어하는 전면적인 조절 시스템 (global regulation system)을 형성할 수 있다. 상기 ArcA는 미세호기성 조건 하에서 작용하여 낮은 산소 수준에 민감한 중심 대사 효소들의 활성을 허용하는 유전자 산물의 발현을 유도하는 것일 수 있다. 미세호기성 하에서 arcA/arcB의 결실은 ldh, icd, gltA, mdh, 및 gdh 유전자의 비 활성을 증가시킬 수 있다. 상기 arcA유전자는 서열번호 23의 아미노산 서열 및 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드는 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 (succinate semialdehyde dehydrogenase: Ssadh)일 수 있다. 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제는 NAD+ 또는 NADP+ 의 NADH 또는 NADPH로의 환원과 함께 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제는 EC.1.2.1.24 또는 EC.1.2.1.16로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12695413또는 12696616의 Gene ID 를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 각각 NAD-연결된 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 sad및 NADP-연결된 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 gabD 일 수 있다. 상기 sad유전자는 서열번호 25의 아미노산 서열 및 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 gabD유전자는 서열번호 27의 아미노산 서열 및 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 미생물은 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체, NADH 둔감성 시트레이트 신타제 변이체, 또는 그 조합을 발현하는 것일 수 있다.
외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래일 수 있다. 상기 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛은 LpdA일 수 있다. 클럽시엘라 뉴모니아 유래의 LpdA는 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 발현은 외래 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 외래 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 lpdA이고 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일수 있다. 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체는 서열번호 29에서 354번째 Glu가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 다른 아미노산은 Lys일 수 있다. 상기 미생물은 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체는 서열번호 31의 아미노산 서열 및 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
NADH 둔감성 시트레이트 신타제(NADH insensitive citrate synthase)는 GltA일 수 있다. 상기 GltA는 서열번호 33의 아미노산 서열 및 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. NADH 둔감성 시트레이트 신타제 변이체는 서열번호 33에서 164번째 Arg이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 다른 아미노산은 Leu일 수 있다. 상기 미생물은 NADH 둔감성 시트레이트 신타제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 시트레이트 신타제 변이체는 서열번호 35의 아미노산 서열 및 서열번호 36의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체와 4-히드록시부티릴-CoA를 접촉하는 단계를 포함하는, 1,4-부탄디올을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 접촉은 배양을 포함할 수 있다. 상기 배양은 4-히드록시부티릴 CoA를 포함하는 배지 하에서 이루어질 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체에 관하여는 전술한 바와 같다.
다른 양상은 상기 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 1,4-부탄디올을 회수하는 단계를 포함하는, 1,4-부탄디올을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기 배양은 호기성 또는 미호기성 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 용어 "호기성 조건"은 배지가 산소 함유 공기와 교환가능한 상태에서 배양되는 것일 수 있다. 용어 "미호기성 조건"은 대기 중 산소의 수준보다 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 상태에서 배양되는 것일 수 있다. 상기 미호기성 조건에서의 배양은 배지 중의 용존 산소 농도가 포화 농도의 1 내지 20%, 1.5 내지 18%, 2 내지 15%, 2.5 내지 10%, 3 내지 8%인 것일 수 있다. 상기 포화 농도는 배양이 이루어지는 온도에서의 포화 농도일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃일 수 있다.
상기 1,4-부탄디올의 회수는 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 이들의 조합에 의하여 이루어질 수 있다.
일 양상에 따른 알데히드 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 이용하여 효율적으로 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
다른 양상에 따른 1,4-부탄디올을 생산하는 방법에 의하면 효율적으로 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
도 1은 pTrc99a ald(M)-cat2의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 재조합 대장균 W026 (pTrc99a ald-cat2) (WT으로 표시), 대장균 W026 (pTrc99a aldM1-cat2) (L273I로 표시) 및 대장균 W026 (pTrc99a aldM2-cat2) (L273S로 표시)의 4-HB 소모량 및 1,4-BDO 생산량을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 알데히드 데히드로게나제 ( ald ) 변이체를 갖는 미생물의 제조
1.1. 부산물 ( Lactate , Formate , Ethanol , Succinate ) 생성 차단 및 혐기 조건에서 세포의 성장과 탄소원 소모를 위해 대사경로가 조작된 미생물의 제작
1.1.1. ldhA , pflB , adhE , mdh , arcA , sad , 및 gabD 유전자의 결실
대장균 W (ATCC 9637)에서 one-step inactivation 방법 [Warner et al., PNAS,6;97(12):6640-6645, 2000; lee, K.H. et al., Molecular systems biology 3, 149, 2007]을 이용하여, ldhA, pflB, adhE, mdh, arcA, sad 및 gabD 유전자를 결실시켰다.
ldhA 유전자를 결실시키기 위해, pMloxC 벡터 [lee, K.H. et al., Molecular systems biology 3, 149 (2007)]를 주형으로 하여 서열번호 37 및 38의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 수득된 DNA 절편을 람다-레드 리콤비나제(λ-red recombinase)가 발현되는 W 균주의 컴피턴트 세포(competent cell)에 일렉트로포레이션(electroporation)하여 ldhA 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였다. 상기 ldhA 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 39 및 40의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhA를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 41 및 42의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 pflB 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 pflB 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 43 및 44의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflB를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 45 및 46의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 adhE 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 adhE 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 47 및 48의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhE를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 49 및 50의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 mdh 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 mdh 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 51 및 52의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdh를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 53 및 54의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 arcA 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 arcA 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 55 및 56의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcA를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 57 및 58의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 sad 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 sad 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 59 및 60의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsad를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 61 및 62의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 gabD 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 gabD 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 63 및 64의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD를 얻었다.
1.1.2. 대장균 lpdA 유전자의 클렙시엘라 뉴모니아 유래 lpdA 유전자의 돌연변이로 치환
대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD 균주에서 one-step inactivation 방법을 이용하여, 대장균의 lpdA 유전자를 클렙시엘라 뉴모니아 유래 lpdA 유전자의 돌연변이로 치환하였다.
클렙시엘라 뉴모니아 유래 lpdA 유전자의 돌연변이 K.lpdA(E354K)는, 서열번호 65 및 66의 프라이머를 이용한 위치-특이적 돌연변이 유발(site direct mutagenesis)을 통해 수득하였다. pSacHR06 벡터 [미국 특허공보 제2013-0164805호]를 주형으로 하여 서열번호 67 및 68의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 수득된 DNA 절편을 람다-레드 리콤비나제가 발현되는 W 균주의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하여 lpdA 유전자를 sacB-Km cassette로 대체시켰다. 이후, 상기 수득한 클렙시엘라 뉴모니아 유래 lpdA 유전자의 돌연변이 K.lpdA(E354K)를 주형으로 하여 서열번호 69 및 70의 프라이머로 PCR을 수행하고 one-step inactivation 방법을 한번 더 수행하여, lpdA 유전자가 sacB-Km cassette로 대체된 부분을 K.lpdA(E354K)로 치환하였다. 치환된 유전자를 확인하기 위해 서열번호 71 및 72의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD ΔlpdA::K.lpdA(E354K)를 얻었다.
1.1.3. 대장균 gltA 유전자의 돌연변이 도입
대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD ΔlpdA::K.lpdA(E354K) 균주에서 one-step inactivation 방법을 이용하여, 대장균 gltA 유전자의 돌연변이인 gltA(R164L)를 도입하였다.
대장균 gltA 유전자의 돌연변이 gltA(R164L)는, 서열번호 73 및 74의 프라이머를 이용한 위치-특이적 돌연변이 유발을 통해 수득하였다. pSacHR06 벡터를 주형으로 하여 서열번호 75 및 76의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 수득된 DNA 절편을 람다 레드 리콤비나제가 발현되는 W 균주의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하여 gltA 유전자를 sacB-Km cassette로 대체시켰다. 이후, 상기 수득한 대장균 gltA 유전자의 돌연변이 gltA(R164L)를 주형으로 하여 서열번호 77 및 78의 프라이머로 PCR을 수행하고 one-step inactivation 방법을 한번 더 수행하여 gltA 유전자가 sacB-Km cassette로 대체된 부분을 gltA(R164L)로 치환하였다. 치환된 유전자를 확인하기 위해 서열번호 79 및 80의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다. 그 결과, 대장균 W 유래 돌연변이 균주 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD ΔlpdA::K.lpdA(E354K) gltA(R164L)을 얻었고, 이를 W026으로 명명하였다.
1.2. Ald 야생형 및 Cat2 발현 벡터의 제작
서열번호 7 및 8의 포르피로모나스 긴기아발리(Porphyromonas gingivali)유래 cat2 유전자와 서열번호 1 및 2의 클로스트리디움 베이제링키(Clostridium beijerinckii)유래 ald 유전자는 유전자 합성 ((주)코스모진텍, 한국)을 통해 제작하였다. 얻어진 ald 유전자를 제한효소 NcoI 및 EcoRI을 사용하여 pTrc99a (AP Biotech 社)에 도입하여, pTrc99a ald 벡터를 제작하였다. pTrc99a ald 벡터를 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 자른 후 cat2 유전자를 도입하여 pTrc99a ald-cat2 벡터 (도 1)를 제작하였다.
1.3. Ald 변이체 및 Cat2 발현 벡터의 제작
실시예 1.2에서 얻은 서열번호 1 및 2의 야생형 ald를 포함하는 pTrc99a ald-cat2 벡터를 주형으로 하여 서열번호 81 및 82의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 273번째 아미노산인 루신(leucine, L)이 이소루신(isoleucine, I)으로 치환된 서열번호 3의 ald 변이체를 발현하는 pTrc99a aldM1-cat2 (도 1)을 제작하였다. 또한 상기 동일한 방법으로 서열번호 83 및 84의 프라이머를 이용하여 273번째 아미노산인 루신(leucine, L)이 세린(serine, S)으로 치환된 서열번호 5의 ald 변이체를 발현하는 pTrc99a aldM2-cat2 (도 1)를 제작하였다.
1.4. 미생물에의 도입
실시예 1.1에서 제작된 대장균 W026 에 실시예 1.2 및 1.3에서 제작된 cat 유전자 및 ald 야생형 또는 변이체 2종을 각각 포함하는 벡터 3종을 각각 열 충격 (heat shock) 방법 (Sambrook, J & Russell, D.W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)으로 도입함으로써, 1,4-BDO 생성능을 가진 균주를 제작하였다. 상기 형질전환 균주는 암피실린 (Ampicillin, 100 μg/ml)이 포함된 LB 평판 배지에서 선별하여 수득하였다.
그 결과, 재조합 미생물 E.coli W026 (pTrc99a ald-cat2), E.coli W026 (pTrc99a aldM1-cat2), 및 E.coli W026 (pTrc99a aldM2-cat2)를 얻었다. Ald 야생형이 도입된 재조합 균주 E.coli W026 (pTrc99a ald-cat2)는 Ald 변이체 2종이 각각 도입된 E.coli W026 (pTrc99a aldM1-cat2) 및 E.coli W026 (pTrc99a aldM2-cat2)와의 1,4-BDO 생산능 비교를 위한 대조군으로 사용하였다.
실시예 2: 실시예 1에서 제작된 미생물의 1,4- BDO 생성능 확인
실시예 1에서 얻어진 형질전환 균주인 E.coli W026 (pTrc99a aldM1-cat2) 및 E.coli W026 (pTrc99a aldM2-cat2)를, 대조군인 W026 (pTrc99a ald-cat2)와 100 ㎍/mL 암피실린을 함유한 10 mL LB 배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 전 배양을 수행하였다.
그 후, 15 g/L 글루코스, 1 g/L 효모 추출물 (yeast extract), 10 mM 4-히드록시부티레이트 (4HB), 및 100 ㎍/mL 암피실린을 함유한 MR 배지 30 mL을 함유한 125mL 플라스크에 상기 전 배양액 0.3 mL를 접종하여 30℃에서 220 rpm으로 진탕하면서 (shaking) 24시간 배양하였다. 상기 MR 배지는 증류수 1L당 6.67g KH2PO4, 4g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 5mL trace metal solution (증류수 1L당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10mL 포함)의 성분이 있고 10N NaOH로 pH를 7.0으로 맞춘 것이다. 상기 4-히드록시부티레이트 (4HB)는 감마부틸로락톤 (Gammabutyrolactone, Sigma-Aldrich)을 NaOH로 반응시켜 합성하였다. 도입 유전자의 발현을 유도하기 위해 OD600이 0.5가 될 때까지 성장시키고, OD600이 0.5가 되었을 때 0.25 mM IPTG를 배지에 첨가하였다.
생산된 1,4-BDO의 분석 과정은 다음과 같다: 30 mL 배지에서 1 mL을 취하여 13000 rpm에서 30분동안 원심분리를 하였고, 상등액을 다시 한번 같은 조건으로 원심분리 후 800 ul를 0.45 um 필터로 여과하여 샘플을 준비했다; 이 중에서 10 ul의 샘플을 UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography, Water)를 이용하여 1,4-BDO의 양을 분석하였다; UHPLC는 Refractive index detector (RID)가 장착된 Agilent 1100 장치를 사용했다; 4 mM H2SO4 용액을 이동상으로 사용하고 BIO-RAD Aminex HPX-87H Column을 고정상으로 사용했으며, 이때의 유속은 0.7 ml/min이다; 컬럼과 검출기의 온도는 모두 50℃이다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 형질전환 균주인 대장균 W026 (pTrc99a ald-cat2) (WT으로 표시), 대장균 W026 (pTrc99a aldM1-cat2) (L273I로 표시) 및 대장균 W026 (pTrc99a aldM2-cat2) (L273S로 표시)의 4-HB 소모량 및 1,4-BDO 생산량을 나타낸 그래프이다. 대장균 W026 (pTrc99a aldM1-cat2) 또는 대장균 W026 (pTrc99a aldM2-cat2)은 대조군인 대장균 W026 (pTrc99a ald-cat2)에 비하여, 4HB 소모량은 약 1.64배 증가하였고, 1,4-BDO 생성은 약 1.32배 증가하였다. 이로부터, L273I 또는 L273S 치환된 알데히드 데히드로게나제 변이체의 4-히드록시부티릴-CoA를 4-히드록시부티르알데히드로 전환을 촉매하는 활성이 야생형 알데히드 데히드로게나제보다 우수함을 확인하였다.
<110> SAMSUNG ELECTORNICS CO., LTD. <120> An aldehyde dehydrogenase mutant, a polynucleotide coding the mutant, a vector and a microorganism having the polynucleotide, and a method for producing 1,4-butanediol using the same <130> PN101365 <160> 84 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Clostridium beijerinckii <400> 1 Met Asn Lys Asp Thr Leu Ile Pro Thr Thr Lys Asp Leu Lys Val Lys 1 5 10 15 Thr Asn Gly Glu Asn Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Ser Ser 20 25 30 Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Ser Ala Val 35 40 45 His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Gln Asn Lys Glu Val 65 70 75 80 Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95 Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110 Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Ala Val Val Phe Asn Gly His Pro Cys Ala Lys Lys Cys Val Ala 165 170 175 Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro 180 185 190 Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Glu Ser Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly 210 215 220 Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile 245 250 255 Glu Lys Ala Gly Arg Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn 260 265 270 Leu Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala 275 280 285 Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn 290 295 300 Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn 305 310 315 320 Glu Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala 325 330 335 Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Asn Val Lys 340 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ttgctaagta cacccccggc accgaggatc ttaccaccac cgcctggtct 360 ggcgataatg gactgaccgt tgtggaaatg tccccctacg gcgttatcgg ggcaattacc 420 ccaagcacaa acccaaccga aaccgtgatt tgtaactcga tcggaatgat cgccgcaggt 480 aacgctgtgg ttttcaacgg ccacccatgc gcaaagaagt gcgttgcatt tgccgtggag 540 atgatcaaca aggcaattat ctcatgcggt ggtcctgaaa acctcgtcac taccattaag 600 aatccaacta tggagtcgct tgatgctatc attaagcacc catcgatcaa gcttctctgt 660 ggaactggcg gccctggcat ggtcaaaacg ctcctgaaca gcgggaaaaa ggcgattgga 720 gccggtgcag gtaatccgcc cgtcatcgtg gacgatacgg cagatattga gaaggccggt 780 cgttccatca tcgaaggctg ctcatttgat aacaacctgc cgtgcattgc tgagaaagaa 840 gttttcgttt tcgagaacgt tgccgatgac cttatttcca atatgttgaa gaataatgca 900 gtgatcatca acgaagacca agtttccaaa ctgatcgatc tcgtccttca gaaaaacaac 960 gagactcagg aatatttcat taacaagaag tgggtgggca aagacgcaaa gctgttcttg 1020 gatgagattg acgtggagag cccttccaac gtcaagtgca ttatctgtga agtcaacgct 1080 aaccatcctt tcgtgatgac ggaattgatg atgccaatcc tgccgattgt tcgagtaaaa 1140 gacattgacg aagctatcaa gtacgcgaaa atcgccgaac agaaccgcaa gcactctgct 1200 tatatctact ctaagaacat tgacaatctg aaccggtttg aacgggagat cgacactacc 1260 atctttgtca aaaacgcgaa atccttcgct ggcgtgggct atgaagctga gggattcacc 1320 accttcacca ttgcggggag caccggtgaa ggcatcactt ctgcccgcaa cttcacccgc 1380 cagcgccgtt gcgtactcgc cggttaa 1407 <210> 3 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ald_L273I_aa <400> 3 Met Asn Lys Asp Thr Leu Ile Pro Thr Thr Lys Asp Leu Lys Val Lys 1 5 10 15 Thr Asn Gly Glu Asn Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Ser Ser 20 25 30 Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Ser Ala Val 35 40 45 His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Gln Asn Lys Glu Val 65 70 75 80 Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95 Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110 Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Ala Val Val Phe Asn Gly His Pro Cys Ala Lys Lys Cys Val Ala 165 170 175 Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro 180 185 190 Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Glu Ser Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly 210 215 220 Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile 245 250 255 Glu Lys Ala Gly Arg Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn 260 265 270 Ile Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala 275 280 285 Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn 290 295 300 Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn 305 310 315 320 Glu Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala 325 330 335 Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Asn Val Lys 340 345 350 Cys Ile Ile Cys Glu Val Asn Ala Asn His Pro Phe Val Met Thr Glu 355 360 365 Leu Met Met Pro Ile Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu 370 375 380 Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu 405 410 415 Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val 420 425 430 Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr 435 440 445 Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys 450 455 460 Val Leu Ala Gly 465 <210> 4 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ald_L273I_nt <400> 4 atgaataagg atacgttgat cccgaccacc aaggatctga aggtcaagac caatggcgag 60 aacatcaatc ttaaaaacta caaagacaac agctcctgtt tcggagtgtt tgaaaatgtg 120 gaaaacgcga tctcctcagc agtacacgcg caaaagatcc tctctttgca ctacactaag 180 gaacagcgtg aaaagattat cacggagatc cgcaaagcgg cactgcagaa caaagaggtc 240 ctggctacaa tgatcttgga ggagacacat atgggtcgct acgaggacaa gatcctcaag 300 cacgagcttg ttgctaagta cacccccggc accgaggatc ttaccaccac cgcctggtct 360 ggcgataatg gactgaccgt tgtggaaatg tccccctacg gcgttatcgg ggcaattacc 420 ccaagcacaa acccaaccga aaccgtgatt tgtaactcga tcggaatgat cgccgcaggt 480 aacgctgtgg ttttcaacgg ccacccatgc gcaaagaagt gcgttgcatt tgccgtggag 540 atgatcaaca aggcaattat ctcatgcggt ggtcctgaaa acctcgtcac taccattaag 600 aatccaacta tggagtcgct tgatgctatc attaagcacc catcgatcaa gcttctctgt 660 ggaactggcg gccctggcat ggtcaaaacg ctcctgaaca gcgggaaaaa ggcgattgga 720 gccggtgcag gtaatccgcc cgtcatcgtg gacgatacgg cagatattga gaaggccggt 780 cgttccatca tcgaaggctg ctcatttgat aacaacatcc cgtgcattgc tgagaaagaa 840 gttttcgttt tcgagaacgt tgccgatgac cttatttcca atatgttgaa gaataatgca 900 gtgatcatca acgaagacca agtttccaaa ctgatcgatc tcgtccttca gaaaaacaac 960 gagactcagg aatatttcat taacaagaag tgggtgggca aagacgcaaa gctgttcttg 1020 gatgagattg acgtggagag cccttccaac gtcaagtgca ttatctgtga agtcaacgct 1080 aaccatcctt tcgtgatgac ggaattgatg atgccaatcc tgccgattgt tcgagtaaaa 1140 gacattgacg aagctatcaa gtacgcgaaa atcgccgaac agaaccgcaa gcactctgct 1200 tatatctact ctaagaacat tgacaatctg aaccggtttg aacgggagat cgacactacc 1260 atctttgtca aaaacgcgaa atccttcgct ggcgtgggct atgaagctga gggattcacc 1320 accttcacca ttgcggggag caccggtgaa ggcatcactt ctgcccgcaa cttcacccgc 1380 cagcgccgtt gcgtactcgc cggttaa 1407 <210> 5 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ald_L273S_aa <400> 5 Met Asn Lys Asp Thr Leu Ile Pro Thr Thr Lys Asp Leu Lys Val Lys 1 5 10 15 Thr Asn Gly Glu Asn Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Ser Ser 20 25 30 Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Ser Ala Val 35 40 45 His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Gln Asn Lys Glu Val 65 70 75 80 Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95 Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110 Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Ala Val Val Phe Asn Gly His Pro Cys Ala Lys Lys Cys Val Ala 165 170 175 Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro 180 185 190 Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Glu Ser Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly 210 215 220 Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile 245 250 255 Glu Lys Ala Gly Arg Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn 260 265 270 Ser Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala 275 280 285 Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn 290 295 300 Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn 305 310 315 320 Glu Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Asn Lys 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cacggagatc cgcaaagcgg cactgcagaa caaagaggtc 240 ctggctacaa tgatcttgga ggagacacat atgggtcgct acgaggacaa gatcctcaag 300 cacgagcttg ttgctaagta cacccccggc accgaggatc ttaccaccac cgcctggtct 360 ggcgataatg gactgaccgt tgtggaaatg tccccctacg gcgttatcgg ggcaattacc 420 ccaagcacaa acccaaccga aaccgtgatt tgtaactcga tcggaatgat cgccgcaggt 480 aacgctgtgg ttttcaacgg ccacccatgc gcaaagaagt gcgttgcatt tgccgtggag 540 atgatcaaca aggcaattat ctcatgcggt ggtcctgaaa acctcgtcac taccattaag 600 aatccaacta tggagtcgct tgatgctatc attaagcacc catcgatcaa gcttctctgt 660 ggaactggcg gccctggcat ggtcaaaacg ctcctgaaca gcgggaaaaa ggcgattgga 720 gccggtgcag gtaatccgcc cgtcatcgtg gacgatacgg cagatattga gaaggccggt 780 cgttccatca tcgaaggctg ctcatttgat aacaactccc cgtgcattgc tgagaaagaa 840 gttttcgttt tcgagaacgt tgccgatgac cttatttcca atatgttgaa gaataatgca 900 gtgatcatca acgaagacca agtttccaaa ctgatcgatc tcgtccttca gaaaaacaac 960 gagactcagg aatatttcat taacaagaag tgggtgggca aagacgcaaa gctgttcttg 1020 gatgagattg acgtggagag cccttccaac gtcaagtgca ttatctgtga agtcaacgct 1080 aaccatcctt tcgtgatgac ggaattgatg atgccaatcc tgccgattgt tcgagtaaaa 1140 gacattgacg aagctatcaa gtacgcgaaa atcgccgaac agaaccgcaa gcactctgct 1200 tatatctact ctaagaacat tgacaatctg aaccggtttg aacgggagat cgacactacc 1260 atctttgtca aaaacgcgaa atccttcgct ggcgtgggct atgaagctga gggattcacc 1320 accttcacca ttgcggggag caccggtgaa ggcatcactt ctgcccgcaa cttcacccgc 1380 cagcgccgtt gcgtactcgc cggttaa 1407 <210> 7 <211> 431 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 7 Met Lys Asp Val Leu Ala Glu Tyr Ala Ser Arg Ile Val Ser Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys His Ile Lys Asn Gly Glu Arg Val Ala Leu Ser His 20 25 30 Ala Ala Gly Val Pro Gln Ser Cys Val Asp Ala Leu Val Gln Gln Ala 35 40 45 Asp Leu Phe Gln Asn Val Glu Ile Tyr His Met Leu Cys Leu Gly Glu 50 55 60 Gly Lys Tyr Met Ala Pro Glu Met Ala Pro His Phe Arg His Ile Thr 65 70 75 80 Asn Phe Val Gly Gly Asn Ser Arg Lys Ala Val Glu Glu Asn Arg Ala 85 90 95 Asp Phe Ile Pro Val Phe Phe Tyr Glu Val Pro Ser Met Ile Arg Lys 100 105 110 Asp Ile Leu His Ile Asp Val Ala Ile Val Gln Leu Ser Met Pro Asp 115 120 125 Glu Asn Gly Tyr Cys Ser Phe Gly Val Ser Cys Asp Tyr Ser Lys Pro 130 135 140 Ala Ala Glu Ser Ala His Leu Val Ile Gly Glu Ile Asn Arg Gln Met 145 150 155 160 Pro Tyr Val His Gly Asp Asn Leu Ile His Ile Ser Lys Leu Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Met Ala Asp Tyr Pro Ile Tyr Ser Leu Ala Lys Pro Lys Ile 180 185 190 Gly Glu Val Glu Glu Ala Ile Gly Arg Asn Cys Ala Glu Leu Ile Glu 195 200 205 Asp Gly Ala Thr Leu Gln Leu Gly Ile Gly Ala Ile Pro Asp Ala Ala 210 215 220 Leu Leu Phe Leu Lys Asp Lys Lys Asp Leu Gly Ile His Thr Glu Met 225 230 235 240 Phe Ser Asp Gly Val Val Glu Leu Val Arg Ser Gly Val Ile Thr Gly 245 250 255 Lys Lys Lys Thr Leu His Pro Gly Lys Met Val Ala Thr Phe Leu Met 260 265 270 Gly Ser Glu Asp Val Tyr His Phe Ile Asp Lys Asn Pro Asp Val Glu 275 280 285 Leu Tyr Pro Val Asp Tyr Val Asn Asp Pro Arg Val Ile Ala Gln Asn 290 295 300 Asp Asn Met Val Ser Ile Asn Ser Cys Ile Glu Ile Asp Leu Met Gly 305 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cggaaagata tccttcatat agatgtggcc 360 attgtccaac tctcaatgcc agatgagaat ggttactgca gctttggcgt atcttgcgat 420 tatagcaaac cggcggcgga atcggcgcat ttagttattg gggaaatcaa ccgtcagatg 480 ccatatgtgc atggtgacaa cttgattcac atatcgaagt tggattacat cgtgatggcg 540 gattacccaa tttattctct ggcgaagccc aaaatcggag aagtagagga agctatcggc 600 cgtaactgtg ccgagcttat tgaagatggt gccaccctac agctgggtat cggcgcgatt 660 ccggatgcag ctctgctgtt tctgaaggac aaaaaagatc tggggattca tactgaaatg 720 ttctccgatg gcgttgttga actggtgcgc agtggtgtaa ttactggaaa aaaaaagaca 780 ttgcatcccg gtaagatggt cgcgacgttt cttatgggat cagaagacgt gtatcatttc 840 atcgacaaga atccggatgt ggaactgtat ccggttgatt acgtcaatga tccgagggtt 900 atcgctcaga atgataatat ggtcagcatc aatagctgta tcgagatcga tctaatgggc 960 caagtggtga gcgagtgcat aggctccaaa cagtttagtg gcaccggggg tcaagtagat 1020 tatgtccgcg gggcagcttg gtctaaaaac ggcaaaagca tcatggcaat tccctcaaca 1080 gccaaaaacg gtactgcatc tcggatagtt cctataattg cagagggcgc tgctgtaaca 1140 accctccgca acgaagtcga ctacgttgtt acggaatatg ggatagcaca gttaaaaggt 1200 aagagtttgc gtcagcgcgc agaagctctt attgcgatag cccacccgga ctttagagag 1260 gaactgacga agcatctgcg caaacgtttt ggttaa 1296 <210> 9 <211> 451 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivali <400> 9 Met Glu Ile Lys Glu Met Val Ser Leu Ala Arg Lys Ala Gln Lys Glu 1 5 10 15 Tyr Gln Ala Thr His Asn Gln Glu Ala Val Asp Asn Ile Cys Arg Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Val Ile Tyr Glu Asn Ala Ala Ile Leu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Val Asp Glu Thr Gly Met Gly Val Tyr Glu His Lys Val Ala Lys Asn 50 55 60 Gln Gly Lys Ser Lys Gly Val Trp Tyr Asn Leu His Asn Lys Lys Ser 65 70 75 80 Ile Gly Ile Leu Asn Ile Asp Glu Arg Thr Gly Met Ile Glu Ile Ala 85 90 95 Lys Pro Ile Gly Val Val Gly Ala Val Thr Pro Thr Thr Asn Pro Ile 100 105 110 Val Thr Pro Met Ser Asn Ile Ile Phe Ala Leu Lys Thr Cys Asn Ala 115 120 125 Ile Ile Ile Ala Pro His Pro Arg Ser Lys Lys Cys Ser Ala His Ala 130 135 140 Val Arg Leu Ile Lys Glu Ala Ile Ala Pro Phe Asn Val Pro Glu Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Ile Ile Glu Glu Pro Ser Ile 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gatctgggaa ctctaa 1356 <210> 11 <211> 371 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 11 Met Gln Leu Phe Lys Leu Lys Ser Val Thr His His Phe Asp Thr Phe 1 5 10 15 Ala Glu Phe Ala Lys Glu Phe Cys Leu Gly Glu Arg Asp Leu Val Ile 20 25 30 Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Glu Pro Tyr Met Lys Ala Cys Gln Leu Pro 35 40 45 Cys His Phe Val Met Gln Glu Lys Tyr Gly Gln Gly Glu Pro Ser Asp 50 55 60 Glu Met Met Asn Asn Ile Leu Ala Asp Ile Arg Asn Ile Gln Phe Asp 65 70 75 80 Arg Val Ile Gly Ile Gly Gly Gly Thr Val Ile Asp Ile Ser Lys Leu 85 90 95 Phe Val Leu Lys Gly Leu Asn Asp Val Leu Asp Ala Phe Asp Arg Lys 100 105 110 Ile Pro Leu Ile Lys Glu Lys Glu Leu Ile Ile Val Pro Thr Thr Cys 115 120 125 Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Asn Ile Ser Ile Ala Glu Ile Lys Ser 130 135 140 Arg His Thr Lys Met Gly Leu Ala Asp Asp Ala Ile Val Ala Asp His 145 150 155 160 Ala Ile Ile Ile Pro Glu Leu Leu Lys Ser Leu Pro Phe His Phe Tyr 165 170 175 Ala Cys Ser Ala Ile Asp Ala Leu Ile His Ala Ile Glu Ser Tyr Val 180 185 190 Ser 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gtcagcctga atacgtctat ccgaaactgg atgagttact cggctgtctt 960 ctgaccaaaa aaccgctgca cgaatacggc atgaaagatg aagaggtacg tggatttgcg 1020 gaatcagtgc ttaagactca gcagcggttg ctcgcgaata attatgttga gcttactgtt 1080 gatgaaattg aaggtatcta cagacgactg tactaa 1116 <210> 13 <211> 1214 <212> PRT <213> Mycobacterium bovis <400> 13 Met Tyr Arg Lys Phe Arg Asp Asp Pro Ser Ser Val Asp Pro Ser Trp 1 5 10 15 His Glu Phe Leu Val Asp Tyr Ser Pro Glu Pro Thr Ser Gln Pro Ala 20 25 30 Ala Glu Pro Thr Arg Val Thr Ser Pro Leu Val Ala Glu Arg Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Pro Lys Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ala 50 55 60 Gly Asn Gly Val Val Ala Ala Leu Ala Ala Lys Thr Ala Val Pro Pro 65 70 75 80 Pro Ala Glu Gly Asp Glu Val Ala Val Leu Arg Gly Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Val Val Lys Asn Met Ser Ala Ser Leu Glu Val Pro Thr Ala Thr Ser 100 105 110 Val Arg Ala Val Pro Ala Lys Leu Leu Ile Asp Asn Arg Ile Val Ile 115 120 125 Asn Asn Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr His 130 135 140 Leu Leu Gly Tyr Ala 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cgtcgcgcac gtgatggcaa actgactacc gaagacttcg cgggtgtgac catttccctg 720 accaacccgg gcaccatcgg tactgtacat agcgtaccac gtctgatgcc gggtcagggt 780 gcgattatcg gcgttggtgc tatggagtat ccggccgagt ttcagggtgc ttccgaagag 840 cgtatcgcgg aactgggtat tggtaaactg attaccctga cgagcaccta cgaccaccgc 900 atcatccagg gcgccgaaag cggtgacttc ctgcgtacca tccatgaact gctgctgtcc 960 gatggtttct gggatgaagt cttccgcgaa ctgtctattc cgtacctgcc ggtccgttgg 1020 tccaccgata acccggattc tattgtagac aaaaacgccc gcgttatgaa cctgatcgca 1080 gcgtatcgta atcgtggcca cctgatggca gacacggacc ctctgcgtct ggacaaagcg 1140 cgttttcgca gccacccgga cctggaagtt ctgactcatg gcctgactct gtgggatctg 1200 gatcgcgtat ttaaagtgga tggctttgca ggtgcccagt acaagaaact gcgtgatgtt 1260 ctgggcctgc tgcgtgacgc ctattgccgc catattggtg ttgaatacgc gcacatcctg 1320 gacccagagc agaaagaatg gctggagcag cgtgtggaaa ccaaacacgt taagccgacc 1380 gtagcgcagc agaaatacat cctgtctaag ctgaacgctg ccgaggcttt cgaaaccttt 1440 ctgcagacga aatatgttgg tcagaaacgc ttctccctgg agggtgcaga atctgtgatc 1500 ccgatgatgg 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8 <400> 80 gatgtatttc acacggtgct tc 22 <210> 81 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L273I primer f <400> 81 gaaggctgct catttgataa caacatcccg tgcattgctg agaaagaagt tttcg 55 <210> 82 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L273I primer r <400> 82 cgaaaacttc tttctcagca atgcacggga tgttgttatc aaatgagcag ccttc 55 <210> 83 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L273S primer f <400> 83 gaaggctgct catttgataa caactccccg tgcattgctg agaaagaagt tttcg 55 <210> 84 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L273S primer r <400> 84 cgaaaacttc tttctcagca atgcacgggg agttgttatc aaatgagcag ccttc 55

Claims (19)

  1. 4-히드록시부티릴-CoA를 4-히드록시부티르알데히드로 전환을 촉매하는 활성을 갖고, 서열번호 1의 273번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 알데히드 데히드로게나제 변이체.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1의 273번째 아미노산인 루이신(L)이 이소루이신(I) 또는 세린(S)으로 치환된 것인 알데히드 데히드로게나제 변이체.
  3. 청구항 1의 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 청구항 3에 있어서, 서열번호 4 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 청구항 1의 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  6. 청구항 1의 알데히드 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물.
  7. 청구항 6에 있어서, 에세리키아(Escherichia) 속 또는 코리네박테리움 속에 속하는 미생물인 것인 미생물.
  8. 청구항 6에 있어서, 4-히드록시부티레이트를 4-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것인 미생물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 활성 증가는 4-히드록시부티레이트의 4-히드록시부티릴-CoA로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드의 발현 증가에 의한 것인 미생물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 활성 증가는 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것인 미생물.
  11. 청구항 6에 있어서, 숙시닐-CoA, 알파-케토글루타레이트, 또는 그 조합을 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성이 증가되어 있는 미생물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 활성 증가는 숙시닐-CoA의 숙시닉 세미알데히드로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 알파-케토글루타레이트의 숙시닉 세미알데히드로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드의 4-히드록시부티레이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현 증가에 의한 것인 미생물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 활성 증가는 조효소 A-의존성 숙시닉 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 4-히드록시부티레이트 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합의 도입에 의한 것인 미생물.
  14. 청구항 6에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 활성, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 호기성 호흡 제어를 조절하는 활성, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것인 미생물.
  15. 청구항 14에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 호기성 호흡 제어를 조절하는 인자를 코딩하는 유전자, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄된 것인 미생물.
  16. 청구항 6에 있어서, 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체, NADH 둔감성 시트레이트 신타제 변이체, 또는 그 조합을 발현하는 것인 미생물.
  17. 청구항 1의 알데히드 데히드로게나제 변이체와 4-히드록시부티릴-CoA를 접촉시키는 단계를 포함하는, 1,4-부탄디올을 생산하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 접촉시킨 반응물과 알코올 데히드로게나제를 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 6의 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 1,4-부탄디올을 회수하는 단계를 포함하는, 1,4-부탄디올을 생산하는 방법.
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