KR20150035654A - 1,4-bdo 생산능을 가진 미생물 및 그를 이용한 1,4-bdo를 생산하는 방법 - Google Patents

1,4-bdo 생산능을 가진 미생물 및 그를 이용한 1,4-bdo를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

1,4-BDO 생산능을 가진 미생물 및 그를 이용한 1,4-BDO를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

1,4-BDO 생산능을 가진 미생물 및 그를 이용한 1,4-BDO를 생산하는 방법{Microorganism capable of producing 1,4-BDO and method of producing 1,4-BDO using the same}
1,4-BDO 생산능을 가진 미생물 및 그를 이용한 1,4-BDO를 생산하는 방법에 관한 것이다.
1,4-BDO는 용매로서 및 일부 타입의 플라스틱, 탄성 섬유 및 폴리우레탄의 제조에 산업적으로 사용될 수 있다. 유기화학에서, 1,4-BDO는 감마-부티로락톤의 합성을 위하여 사용될 수 있다. 인산 및 고온의 존재하에서, 1,4-BDO는 탈수되어 중요한 용매인 테트라히드로푸란 (THF)이 될 수 있다.
1,4-BDO는 현재 석유화학 전구체인 아세틸렌, 말레익 무수물, 및 프로필렌 옥시로부터 생산된다. 그러나, 석유 값의 상승에 따라 1,4-BDO의 대안적인 생산방법이 요구되고 있다.
따라서, 1,4-BDO를 미생물을 이용하여 효율적으로 제조하는 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 1,4-BDO 생산능이 향상된 미생물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 미생물를 이용하여 1,4-BDO를 효율적을 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 활성, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 감소되어 있고, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것인 미생물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 활성의 감소는 미생물 중의 언급된 단백질의 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 활성의 감소는 언급된 단백질을 코딩하는 유전자의 발현의 감소뿐만 아니라 단백질 자체의 비활성 (specific activity)의 감소와 같은 여러 원인에 의한 감소를 포함할 수 있다. 상기 활성의 감소는 언급된 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감쇄에 의하여 감소되는 것일 수 있다. 상기 "감소"는 조작되지 않은 미생물에 비하여 상대적으로 감소되는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "불활성화 (inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감쇄 (attenuation)"는 유전자의 발현이 조작되지 않은 미생물에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 감소되어 있는 것을 의미할 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 상동 재조합에 의해 야기될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선발 마커에 의해 선발함으로써 이루어질 수 있다.
상기 미생물은, 에세리키아 (Escherichia) 속, 코리네박테리움 속, 또는 루멘 박테리아에 속하는 미생물일 수 있다. 에세리키아 속 미생물은 대장균 (E.coli)일 수 있다. 상기 미생물은 1,4-BDO 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제(LDH), 예를 들면, LDHA를 코딩하는 유전자, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 알콜 데히드로게나제 (ADH), 예를 들면, ADH1를 코딩하는 유전자, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합은 1,4-BDO 생산하는데 충분한 정도로 불활성화 또는 감쇄되어 있다. 상기 언급된 효소들의 활성은 적절한 대조군 종, 예를 들면 조작되지 않은 미생물에 비하여, 상기 언급된 효소의 활성이 약 75%이상, 약 80%이상, 약 85%이상, 약 90%이상, 약 95%이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성 및/또는 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성은 1,4-BDO 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다. 상기 활성은 대조군 대비 약 110%이상, 약 120%이상, 약 130%이상, 약 140%이상, 약 150%이상, 약 160%이상, 약 170%이상, 약 200%이상, 약 300%이상, 약 500%이상, 약 1000%이상, 약 2000%이상, 또는 약 10,000%이상 증가된 것일 수 있다.
피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드, 예를 들면, 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)+의 NAD(P)H로의 환원을 이용하여 피루베이트를 락테이트로 가역적으로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 EC.1.1.1.27 또는 EC 1.1.2.3에 속하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 락테이트 데히드로게나제 (LDH)를 코딩하는 대장균 ldhA일 수 있다.
아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드는 알콜 데히드로게나제 (ADH)일 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제 (ADH)는 NADH의 NAD+로의 산화와 함께 아세틸 CoA를 에탄올로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제는 EC 1.1.1.1에 속하는 효소일 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 adhE일 수 있다.
상기 말레이트 데히드로게나제는 NAD(P)+의 NAD(P)H로의 환원을 이용하여 옥살로아세테이트를 말레이트로 가역적으로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 말레이트 데히드로게나제는 EC 1.1.1.37에 속하는 것일 수 있다. 상기 말레이트 데히드로게나제는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 mdh일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다.
상기 발현의 증가는 내재적 유전자의 발현의 증가 또는 외래 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 내재적 유전자의 발현의 증가는 유전자의 증폭 또는 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 외래 유전자는 내재적 (endogenous) 또는 외재적 (exogenous) 유전자일 수 있다.
숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드는 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 숙시네이트 + CoA + NTP ↔ 숙시닐 CoA + Pi + NDP 반응을 촉매하는 것일 수 있다. NTP는 ATP 또는 GTP일 수 있다. 상기 효소는 숙시닐-CoA 신테타제 (숙시닐-CoA 리가제 또는 숙시네이트 티오키나제라고도 함)일 수 있다. 상기 효소는 숙시닐 CoA 신테타제 (SucCD) 또는 숙시닐-CoA:조효소 A 트랜스퍼라아제 (succinyl-CoA:coenzyme A transferase: Cat1)일 수 있다. 상기 숙시닐 CoA 신테타제는 EC 6.2.1 (acid-thiol ligase), 예를 들면, EC 6.2.1.4 또는 EC 6.2.1.5에 속하는 효소일 수 있다. 상기 숙시닐 CoA 신테타제 (유전자명 SucCD)는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 숙시닐 CoA 신테타제, SucCD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Cat1은 EC. 2.8.3 (CoA-transferase), 예를 들면, EC. 2.8.3.18에 속하는 것일 수 있다. 상기 Cat1은 acetate + succinyl-CoA를 가역적으로 acetyl-CoA+ succinate로 전환하는 것일 수 있다. 상기 SucCD를 코딩하는 유전자는 대장균 유래의 것일 수 있다. 상기 Cat1은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Cat1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 숙시닐 CoA 신테타제 (유전자명 SucCD)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 대장균 유래의 것일 수 있고, 상기 Cat1을 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri) 유래의 것일 수 있다.
숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 (CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase: SucD)일 수 있다. 상기 SucD은 전자 수용체로서 NAD 또는 NADP를 사용하는 옥시도리덕타제 (EC.1.2.1), 예를 들면, 아실-CoA를 알데히드로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 SucD는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 SucD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 및 그를 코딩하는 유전자는 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 유래의 것일 수 있다.
숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드는 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 (4-hydroxybutyrate dehydrogenase: 4HBd)일 수 있다. 상기 4HBd는 전자 수용체로서 NAD 또는 NADP를 사용하는 옥시도리덕타제 (EC.1.1.1), 예를 들면, 케톤을 히드록실 또는 알데히드를 알콜로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 4HBd는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 4HBd를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 및 그를 코딩하는 유전자는 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 유래의 것일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 예를 들면, sucCD, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 예를 들면, sucD, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 예를 들면, 4hbd, 또는 그 조합이 도입된 것일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드, 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다. 상기 발현의 증가는 내재적 유전자의 발현의 증가 또는 외래 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 내재적 유전자의 발현의 증가는 유전자의 증폭 또는 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 외래 유전자는 내재적 (endogenous) 또는 외재적 (exogenous) 유전자일 수 있다.
4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드는 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트랜스퍼라아제 (4-hydroxybutyryl CoA:acetyl-CoA transferase: Cat2)일 수 있다. 상기 Cat2는 CoA-트란스퍼라제 (EC.2.8.3)로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 Cat2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Cat2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트랜스퍼라아제 및 그를 코딩하는 유전자는 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 유래의 것일 수 있다.
4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: AdhE2) 및/또는 알데히드 데히드로게나제 (Ald)일 수 있다. Adhe2와 Ald는 4HB-CoA로부터 4-히드록시부티르알데히드를 거쳐 1,4-BDO로 전환시킬 수 있다. 상기 AdhE2 및 Ald는 2단계로 아실-CoA를 알콜로 전환하는 효소 (EC.1.1.1) 또는 EC 1.2.1.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 AdhE2는 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 AdhE2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제 및 그를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) 유래의 것일 수 있다. 상기 Ald는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Ald를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제 및 그를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 베이제링키 (Clostridium beijerinckii) 유래의 것일 수 있다.
4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 예를 들면 cat2, 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 예를 들면 ald, 또는 그 조합이 도입된 것일 수 있다. 상기 미생물은 α-케토글루타레이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자 (sucA)가 추가적으로 도입되지 않은 것일 수 있다.
상기 미생물은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 및 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄되어 있고, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것으로서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입되어 있고, 4-히드록시부티레이트를 4-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 4-히드록시부티릴-CoA를 1,4-부탄디올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입되어 있는 것인 대장균일 수 있다.
다른 양상은 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것인 미생물을 숙시네이트의 존재하에서 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 1,4-BDO를 회수하는 단계;를 포함하는, 1,4-BDO를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것인 미생물을 숙시네이트의 존재하에서 배양하는 단계를 포함한다.
상기 미생물은, 에세리키아 (Escherichia) 속, 코리네박테리움 속, 또는 루멘 박테리아에 속하는 미생물일 수 있다. 에세리키아 속 미생물은 대장균 (E.coli)일 수 있다. 상기 미생물은 1,4-BDO 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제(LDH), 예를 들면, LDHA를 코딩하는 유전자, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 알콜 데히드로게나제 (ADH), 예를 들면, ADH1를 코딩하는 유전자, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합은 1,4-BDO 생산하는데 충분한 정도로 불활성화 또는 감쇄되어 있다. 상기 언급된 효소들의 활성은 적절한 대조군 종, 예를 들면 조작되지 않은 미생물에 비하여, 상기 언급된 효소의 활성이 약 75%이상, 약 80%이상, 약 85%이상, 약 90%이상, 약 95%이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성 및/또는 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성은 1,4-BDO 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다. 상기 활성은 대조군 대비 약 110%이상, 약 120%이상, 약 130%이상, 약 140%이상, 약 150%이상, 약 160%이상, 약 170%이상, 약 200%이상, 약 300%이상, 약 500%이상, 약 1000%이상, 약 2000%이상, 또는 약 10,000%이상 증가된 것일 수 있다.
피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드, 예를 들면, 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)+의 NAD(P)H로의 환원을 이용하여 피루베이트를 락테이트로 가역적으로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 EC.1.1.1.27 또는 EC 1.1.2.3에 속하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 락테이트 데히드로게나제 (LDH)를 코딩하는 대장균 ldhA일 수 있다.
아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드는 알콜 데히드로게나제 (ADH)일 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제 (ADH)는 NADH의 NAD+로의 산화와 함께 아세틸 CoA를 에탄올로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제는 EC 1.1.1.1에 속하는 효소일 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 adhE일 수 있다.
상기 말레이트 데히드로게나제는 NAD(P)+의 NAD(P)H로의 환원을 이용하여 옥살로아세테이트를 말레이트로 가역적으로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 말레이트 데히드로게나제는 EC 1.1.1.37에 속하는 것일 수 있다. 상기 말레이트 데히드로게나제는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 mdh일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다.
상기 발현의 증가는 내재적 유전자의 발현의 증가 또는 외래 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 내재적 유전자의 발현의 증가는 유전자의 증폭 또는 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 외래 유전자는 내재적 (endogenous) 또는 외재적 (exogenous) 유전자일 수 있다.
숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드는 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 숙시네이트 + CoA + NTP ↔ 숙시닐 CoA + Pi + NDP 반응을 촉매하는 것일 수 있다. NTP는 ATP 또는 GTP일 수 있다. 상기 효소는 숙시닐-CoA 신테타제 (숙시닐-CoA 리가제 또는 숙시네이트 티오키나제라고도 함)일 수 있다. 상기 효소는 숙시닐 CoA 신테타제 (SucCD) 또는 숙시닐-CoA:조효소 A 트랜스퍼라아제 (succinyl-CoA:coenzyme A transferase: Cat1)일 수 있다. 상기 숙시닐 CoA 신테타제는 EC 6.2.1 (acid-thiol ligase), 예를 들면, EC 6.2.1.4 또는 EC 6.2.1.5에 속하는 효소일 수 있다. 상기 숙시닐 CoA 신테타제 (유전자명 SucCD)는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 숙시닐 CoA 신테타제 SucCD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Cat1은 EC. 2.8.3 (CoA-transferase), 예를 들면, EC. 2.8.3.18에 속하는 것일 수 있다. 상기 Cat1은 acetate + succinyl-CoA를 가역적으로 acetyl-CoA+ succinate로 전환하는 것일 수 있다. 상기 SucCD를 코딩하는 유전자는 대장균 유래의 것일 수 있다. 상기 Cat1은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Cat1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 숙시닐 CoA 신테타제 (유전자명 SucCD)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 대장균 유래의 것일 수 있고, 상기 Cat1을 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri) 유래의 것일 수 있다.
숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 (CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase: SucD)일 수 있다. 상기 SucD은 전자 수용체로서 NAD 또는 NADP를 사용하는 옥시도리덕타제 (EC.1.2.1), 예를 들면, 아실-CoA를 알데히드로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 SucD는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 SucD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제 및 그를 코딩하는 유전자는 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 유래의 것일 수 있다.
숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드는 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 (4-hydroxybutyrate dehydrogenase: 4HBd)일 수 있다. 상기 4HBd는 전자 수용체로서 NAD 또는 NADP를 사용하는 옥시도리덕타제 (EC.1.1.1), 예를 들면, 케톤을 히드록실 또는 알데히드를 알콜로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 4HBd는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 4HBd를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제 및 그를 코딩하는 유전자는 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 유래의 것일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 예를 들면, sucCD, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 예를 들면, sucD, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 예를 들면, 4hbd, 또는 그 조합이 도입된 것일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드, 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다. 상기 발현의 증가는 내재적 유전자의 발현의 증가 또는 외래 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 내재적 유전자의 발현의 증가는 유전자의 증폭 또는 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 외래 유전자는 내재적 (endogenous) 또는 외재적 (exogenous) 유전자일 수 있다.
4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드는 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트랜스퍼라아제 (4-hydroxybutyryl CoA:acetyl-CoA transferase: Cat2)일 수 있다. 상기 Cat2는 CoA-트란스퍼라제 (EC.2.8.3)로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 Cat2는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Cat2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트랜스퍼라아제 및 그를 코딩하는 유전자는 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis) 유래의 것일 수 있다.
4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase: AdhE2) 및/또는 알데히드 데히드로게나제 (Ald)일 수 있다. Adhe2와 Ald는 4HB-CoA로부터 4-히드록시부티르알데히드를 거쳐 1,4-BDO로 전환시킬 수 있다. 상기 AdhE2 및 Ald는 2단계로 아실-CoA를 알콜로 전환하는 효소 (EC.1.1.1) 또는 EC 1.2.1.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 AdhE2는 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 AdhE2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제 및 그를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) 유래의 것일 수 있다. 상기 Ald는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Ald를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제 및 그를 코딩하는 유전자는 클로스트리듐 베이제링키 (Clostridium beijerinckii) 유래의 것일 수 있다.
4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 예를 들면 cat2, 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 예를 들면 ald, 또는 그 조합이 도입된 것일 수 있다. 상기 미생물은 α-케토글루타레이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자 (sucA)가 추가적으로 도입되지 않은 것일 수 있다.
상기 미생물은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 및 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄되어 있고, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것으로서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입되어 있고, 4-히드록시부티레이트를 4-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 4-히드록시부티릴-CoA를 1,4-부탄디올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입되어 있는 것인 대장균일 수 있다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다. 상기 숙시네이트는 배양 중에서 피딩되는 것일 수 있다. 피딩되는 숙시네이트는 숙신산, 또는 그의 염일 수 있다. 상기 염은 소듐 염일 수 있다. 숙시네이트는 배양 시작시 또는 시작 후 1회 또는 2회 이상, 예를 들면, 수회에 공급할 수 있다. 공급 농도는 세포 농도, 공급시기 등에 따라 조절될 수 있으며, 일례로 0.1 ~ 수 백g/L, 예를 들면, 0.1 ~ 500g/L, 0.1 ~ 400g/L, 0.1 ~ 300g/L, 0.1 ~ 200g/L, 0.1 ~ 100g/L, 0.1 ~ 50g/L, 1.0 ~ 500g/L, 5.0 ~ 400g/L, 10 ~ 300g/L, 50 ~ 200g/L, 1~ 100g/L, 또는 5 ~ 50g/L,일 수 있다. 일례로, 상기 숙시네이트는 숙시네이트로부터 4-히드록시부티레이트 또는 1,4-BDO 생산 유전자가 충분히 발현되었을 때 공급될 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기 배양은 호기성, 미호기성, 또는 혐기성 조건에서 수행하는 것일 수 있다. 용어 "호기성 조건"은 배지가 산소 함유 공기와 교환가능한 상태에서 배양되는 것일 수 있다. 또한, 용어 "호기성 조건"은 배지 중 용존 산소 농도가 예를 들면, 포화 농도의 약 1%이상, 약 10%이상, 약 30%이상, 약 40%이상, 약 50%이상, 약 60%이상, 약 70%이상, 약 80%이상, 약 90%이상, 또는 약 100%의 농도에서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 배양은 배지 중 용존 산소 농도가 포화 농도의 약 1% 내지 약 100%, 약 1% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 또는 약 100%의 농도에서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 호기성 조건은 배양에 걸쳐서 유지되는 것일 수 있다. 상기 포화농도는 배양이 이루어지는 온도 예를 들면, 약 30℃에서의 포화 농도일 수 있다. 외부에서 공급되는 숙시네이트의 1,4-BDO로의 효율적인 전환을 위해서 배양 조건은 호기성일 수 있다.
상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 1,4-BDO의 생성량을 획득할때까지 지속될 수 있다.
일 양상에 따른 미생물에 의하면, 호기적 조건에서도 1,4-BDO 생산능을 가질 수 있다.
다른 양상에 따른 1,4-BDO를 생산하는 방법에 의하면, 1,4-BDO를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 1,4-BDO 생산용 미생물의 1,4-BDO 생산 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 pMloxC 벡터 지도를 나타낸 도면이다.
도 3은 pTac15k sucCD-sucD-4hbd 벡터를 나타낸 도면이다.
도 4는 pTrc99a ald-cat2 벡터를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 1,4- 부탄디올을 효율적으로 생성할 수 있는 미생물의 제작
본 실시예에서는 락테이트 데히드로게나제 유전자, 알코올 데히드로게나제 유전자 및 말레이트 데히드로게나제 유전자가 불활성화된, 1,4-BDO 생산능을 가지고 있는 미생물을 제작하였다.
하기 실시예에서는 대장균 W (ATCC 9637)에서 혐기 조건에서 주요 부산물인 락테이트의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 ldhA (서열번호 1 및 2), 에탄올의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 adhE (서열번호 3 및 4), 및 숙시네이트의 생성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 mdh (서열번호 5 및 6)을 결실시켰다. mdh 유전자의 결실은 내재적으로 생성된 숙시네이트가 아닌, 외부에서 공급해준 숙시네이트를 기질로 사용하여 1,4-BDO가 생산됨을 보이기 위해 수행하였다. 위와 같이 변이시킨 대장균을 숙네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 4-히드록시부티레이트를 1,4-BDO로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환함으로써 1,4-BDO를 효율적으로 생산하는 변이 대장균을 제조하였다.
1.1. 부산물 ( 락테이트 , 에탄올, 숙시네이트 ) 생성을 차단하기 위해 ldhA , adhE 및 mdh 유전자가 결실된 미생물의 제작
대장균 W (ATCC 9637)에서 아래 프라이머들로 일단계 유전자 불활성화 방법(Warner et al., PNAS, 6:97(12):6640-6645 (2000))을 이용하여 ldhA, adhE 및 mdh 유전자를 결실시키고, 얻어진 균주를 W△mdh△ldh△adhE로 명명하였다.
ldhA 유전자의 결실을 위해 pMloxC 벡터 (lee, K.H. et al., Molecular systems biology 3, 149 (2007) (도 2)를 주형으로 하여 서열번호 21 및 22의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 이때 얻어진 DNA 절편을 획득하여 람다-레드 리콤비나제 (λ-red recombinase)가 발현된 W 균주의 컴피턴트 세포 (electroporation-competent cell)에 일렉트로포레이션 (electroporation)하여 ldhA 유전자 결실 돌연변이 균주를 제작하였다. ldhA 유전자 결실의 확인을 위해 서열번호 23 및 24의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다.
또한, adhE 유전자의 결실을 위해 같은 방법으로 서열번호 25 및 26의 프라이머가 순차적으로 사용되었고, 결실의 확인을 위해 서열번호 27 및 28의 프라이머가 사용되었다.
또한, mdh 유전자의 결실을 위해 같은 방법으로 서열번호 29 및 30의 프라이머가 순차적으로 사용되었고, 결실의 확인을 위해 서열번호 31 및 32의 프라이머가 사용되었다.
1.2. sucCD , sucD , 4 hbd , ald 및 cat2 유전자의 도입
상기 1.1에서 얻은 대장균 W 돌연변이 균주 (W△mdh△ldh△adhE)에 sucCD (서열번호 7 및 8), sucD(서열번호 11 및 12), 4hbd(서열번호 13 및 14), cat2(서열번호 15 및 16), 및 ald (서열번호 17 및 18) 유전자를 도입하였다. sucCD는 대장균 유래의 유전자이고, sucD, 4hbd 및 cat2는 Porphyromonas gingivalis 유래의 것이고, ald는 Clostridium beijerinckii 유래의 것이다.
대장균 MGM1655의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 33 및 34의 프라이머를 사용한 PCR을 통하여, sucCD 유전자를 얻었다. 다음으로, P. gingivalis 유래sucD, 4hbd, 및 cat2, 및 C.beijerinckii 유래의 ald 유전자는 유전자 합성 ((주)코스모진텍), 한국)을 통해 제작하였다.
얻어진 sucCD 유전자를 제한효소 EcoRI 및 KpnI을 사용하여 pTac15k (Qian, Z. -G. et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4):651-662 (2009))에 도입하여, pTac15k sucCD 벡터를 제작하였다. pTac15k sucCD 벡터를 제한효소 KpnI로 자른 후 이를 벡터 DNA 조각으로 사용하고, 서열번호 35 및 36의 프라이머로 PCR하여 얻어진 sucD 유전자 조각과 서열번호 37 및 38의 프라이머로 PCR하여 얻어진 4hbd 유전자 조각을 모두 주형으로 사용하여 서열번호 35 및 38의 프라이머로 PCR하여 얻어진 sucD 및 4hbd 유전자를 포함하는 DNA 조각을 삽입 DNA 조각으로 사용하여 InFusion Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc., USA)를 통해 연결함으로써 pTac15ksucCD-sucD-4hbd 벡터 (도 3)를 제작하였다.
또한, 얻어진 ald 유전자를 제한효소 NcoI 및 EcoRI을 사용하여 pTrc99a (AP Biotech)에 도입하여, pTrc99a ald 벡터를 제작하였다. pTrc99a ald 벡터를 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 자른 후 cat2 유전자를 도입하여 pTrc99a ald-cat2 벡터 (도 4)를 제작하였다.
대장균 W △mdh△ldh△adhE 돌연변이 균주에 pTac15k sucCD-sucD-4hbd 및pTrc99a ald-cat2 벡터를 열 충격 (heat shock) 방법 (Sambrook, J & Russell, D.W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)으로 도입함으로써, 1,4-BDO 생성능을 가진 균주를 제작하였다. 상기 형질전환 균주는 엠피실린 (ampicillin, 100㎍/mL) 및 카나마이신 (Kanamycin, 50㎍/mL)이 포함된 LB 평판 배지에서 선별하여 수득하였다.
실시예 2: 상기 재조합 미생물의 배양을 통한 숙시네이트로부터 1,4- BDO 의 생산 확인
본 실시예에서는 실시예 1에서 제작한 1,4-부탄올 생성 유전자들을 포함하는 재조합 미생물의 배양을 통해 숙시네이트를 주요기질로 사용하여 1,4-부탄디올이 생산되는 것을 확인하였다.
구체적으로, 락테이트 데히드로게나제, 알코올 데히드로게나제 및 말레이트 데히드로게나제 유전자가 불활성화된 1,4-부탄디올 생산능을 가진 미생물을 숙시네이트 외부 공급 여부 및 공급량에 따른 1,4-부탄디올 생산능을 비교하였다.
2.1. pTac15k ( sucCD - sucD -4 hbd ) 및 pTrc99a ( ald - cat2 )가 도입된 재조합 대장균 W △ mdh △ ldh △ adhE 균주를 이용한 숙시네이트로부터 1,4- BDO 의 생산 확인
실시예 1에서 얻어진 형질전환 균주인 pTac15k (sucCD-sucD-4hbd) 및 pTrc99a (ald-cat2)가 도입된 W △mdh△ldh△adh 균주를 100μg/mL 엠피실린, 및 50μg/mL 카나마이신을 함유한 10mL LB 배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 전 배양을 수행하였다. 그 후, 15 g/L 글루코스, 1 g/L 효모 추출물 (yeast extract), 100mM MOPS, 10mM NaHCO3, 100μg/mL 암피실린, 및 50μg/mL 카나마이신을 함유한 MR 배지 50mL을 함유한 250mL 플라스크에 상기 전 배양액 0.5mL를 접종하여 30℃에서 220rpm으로 진탕하면서 (shaking) 배양하였다. 상기 MR 배지는 증류수 1L당 6.67g KH2PO4, 4g (NH4)2HPO4, 0.8g citric acid, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 5mL trace metal solution (증류수 1L당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10mL 포함)의 성분이 있고 10N NaOH로 pH를 7.0으로 맞춘 것이다. 상기 플라스크는 막으로 된 벤트 캡 (vent cap)이 설치되어 공기가 교환되도록 되어 있다. 도입 유전자의 발현을 유도하기 위해 OD600이 0.5가 될 때까지 성장시키고, OD600이 0.5가 되었을 때 0.25 mM IPTG를 배지에 첨가하였다. IPTG 첨가 후 4 시간 동안 배양한 후 소듐 숙시네이트를 0g/L, 3g/L, 및 30g/L 농도로 각각 한번에 모두 공급한 후 48 시간 동안 동일 조건에서 배양하였다. 그 결과, 1,4-BDO 생산량 (mg/L) 및 숙시네이트 소모량 (g/L)은 표 1과 같다.
1,4-BDO 및 숙시네이트의 분석 과정은 다음과 같다: 상기 배양액에서 1 mL를 취하여 13000 rpm에서 30분 동안 원심분리를 하였고, 상등액을 다시 한번 같은 조건으로 원심분리 후 800 μL를 0.45 μm 필터로 여과하여 샘플을 준비했다. 이 중에서 10 μL의 샘플을 UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography, Waters)를 이용하여 1,4-BDO의 양을 분석하였다. UHPLC는 Refractive index detector (RID)가 장착된 Agilent 1100 장치를 사용했다. 4 mM H2SO4 용액을 이동상으로 사용하고 BIO-RAD Aminex HPX-87H Column을 고정상으로 사용했으며, 이때의 유속은 0.7 ml/min이다. 컬럼과 검출기의 온도는 모두 50℃이다.
숙시네이트 첨가량 (g/L) 1,4-BDO 생산량 (mg/L) 숙시네이트 소모량 (g/L)
0 0 0
3 33 2.3
30 173 6.7
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에 따른 배양방법에 의하면, 숙시네이트가 공급되지 않은 경우는 1,4-BDO가 생산되지 않고, 숙시네이트가 공급된 경우에만 1,4-BDO가 생산되었다. 또한, 숙시네이트 첨가양이 증가할수록 숙시네이트 소모량도 증가하고 1,4-BDO 생산량도 증가하였다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd. <120> Microorganism capable of producing 1,4-BDO and method of producing 1,4-BDO using the same <130> PN100757 <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 329 <212> PRT <213> E.coli <400> 1 Met Lys Leu Ala Val Tyr Ser Thr Lys Gln Tyr Asp Lys Lys Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Gln Val Asn Glu Ser Phe Gly Phe Glu Leu Glu Phe Phe Asp Phe 20 25 30 Leu Leu Thr Glu Lys Thr Ala Lys Thr Ala Asn Gly Cys Glu Ala Val 35 40 45 Cys Ile Phe Val Asn Asp Asp Gly Ser Arg Pro Val Leu Glu Glu Leu 50 55 60 Lys Lys His Gly Val Lys Tyr Ile Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn 65 70 75 80 Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Lys Glu Leu Gly Leu Lys Val Val Arg 85 90 95 Val Pro Ala Tyr Asp Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Ile Gly Met 100 105 110 Met Met Thr Leu Asn Arg Arg Ile His Arg Ala Tyr Gln Arg Thr Arg 115 120 125 Asp Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Thr Gly Phe Thr Met Tyr Gly 130 135 140 Lys Thr Ala Gly Val Ile Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Ile Leu Lys Gly Phe Gly Met Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Tyr 165 170 175 Pro Ser Ala Ala Ala Leu Glu Leu Gly Val Glu Tyr Val Asp Leu Pro 180 185 190 Thr Leu Phe Ser Glu Ser Asp Val Ile Ser Leu His Cys Pro Leu Thr 195 200 205 Pro Glu Asn Tyr His Leu Leu Asn Glu Ala Ala Phe Asp Gln Met Lys 210 215 220 Asn Gly Val Met Ile Val Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu Ile Asp Ser 225 230 235 240 Gln Ala Ala Ile Glu Ala Leu Lys Asn Gln Lys Ile Gly Ser Leu Gly 245 250 255 Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Arg Asp Leu Phe Phe Glu Asp Lys Ser 260 265 270 Asn Asp Val Ile Gln Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala Cys His 275 280 285 Asn Val Leu Phe Thr Gly His Gln Ala Phe Leu Thr Ala Glu Ala Leu 290 295 300 Thr Ser Ile Ser Gln Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser Asn Leu Glu Lys 305 310 315 320 Gly Glu Thr Cys Pro Asn Glu Leu Val 325 <210> 2 <211> 990 <212> DNA <213> E.coli <400> 2 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60 gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120 actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180 ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240 aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300 gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360 caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgacgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420 actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480 cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540 gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600 atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactaccatc tgttgaacga agccgccttc 660 gatcagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720 caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780 gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtaattca ggatgacgta 840 ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctatttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900 gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960 ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990 <210> 3 <211> 891 <212> PRT <213> E.coli <400> 3 Met Ala Val Thr Asn Val Ala Glu Leu Asn Ala Leu Val Glu Arg Val 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gln Arg Glu Tyr Ala Ser Phe Thr Gln Glu Gln Val Asp 20 25 30 Lys Ile Phe Arg Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asp Ala Arg Ile Pro 35 40 45 Leu Ala Lys Met Ala Val Ala Glu Ser Gly Met Gly Ile Val Glu Asp 50 55 60 Lys Val Ile Lys Asn His Phe Ala Ser Glu Tyr Ile Tyr Asn Ala Tyr 65 70 75 80 Lys Asp Glu Lys Thr Cys Gly Val Leu Ser Glu Asp Asp Thr Phe Gly 85 90 95 Thr Ile Thr Ile Ala Glu Pro Ile Gly Ile Ile Cys Gly Ile Val Pro 100 105 110 Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu 115 120 125 Lys Thr Arg Asn Ala Ile Ile Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Asp 130 135 140 Ala Thr Asn Lys Ala Ala Asp Ile Val Leu Gln Ala Ala Ile Ala Ala 145 150 155 160 Gly Ala Pro Lys Asp Leu Ile Gly Trp Ile Asp Gln Pro Ser Val Glu 165 170 175 Leu Ser Asn Ala Leu Met His His Pro Asp Ile Asn Leu Ile Leu Ala 180 185 190 Thr Gly Gly Pro Gly Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro 195 200 205 Ala Ile Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Val Val Ile Asp Glu Thr 210 215 220 Ala Asp Ile Lys Arg Ala Val Ala Ser Val Leu Met Ser Lys Thr Phe 225 230 235 240 Asp Asn Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Val Val Val Val Asp 245 250 255 Ser Val Tyr Asp Ala Val Arg Glu Arg Phe Ala Thr His Gly Gly Tyr 260 265 270 Leu Leu Gln Gly Lys Glu Leu Lys Ala Val Gln Asp Val Ile Leu Lys 275 280 285 Asn Gly Ala Leu Asn Ala Ala Ile Val Gly Gln Pro Ala Tyr Lys Ile 290 295 300 Ala Glu Leu Ala Gly Phe Ser Val Pro Glu Asn Thr Lys Ile Leu Ile 305 310 315 320 Gly Glu Val Thr Val Val Asp Glu Ser Glu Pro Phe Ala His Glu Lys 325 330 335 Leu Ser Pro Thr Leu Ala Met Tyr Arg Ala Lys Asp Phe Glu Asp Ala 340 345 350 Val Glu Lys Ala Glu Lys Leu Val Ala Met Gly Gly Ile Gly His Thr 355 360 365 Ser Cys Leu Tyr Thr Asp Gln Asp Asn Gln Pro Ala Arg Val Ser Tyr 370 375 380 Phe Gly Gln Lys Met Lys Thr Ala Arg Ile Leu Ile Asn Thr Pro Ala 385 390 395 400 Ser Gln Gly Gly Ile Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Lys Leu Ala Pro Ser 405 410 415 Leu Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp Gly Gly Asn Ser Ile Ser Glu Asn 420 425 430 Val Gly Pro Lys His Leu Ile Asn Lys Lys Thr Val Ala Lys Arg Ala 435 440 445 Glu Asn Met Leu Trp His Lys Leu Pro Lys Ser Ile Tyr Phe Arg Arg 450 455 460 Gly Ser Leu Pro Ile Ala Leu Asp Glu Val Ile Thr Asp Gly His Lys 465 470 475 480 Arg Ala Leu Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Phe Asn Asn Gly Tyr Ala 485 490 495 Asp Gln Ile Thr Ser Val Leu Lys Ala Ala Gly Val Glu Thr Glu Val 500 505 510 Phe Phe Glu Val Glu Ala Asp Pro Thr Leu Ser Ile Val Arg Lys Gly 515 520 525 Ala Glu Leu Ala Asn Ser Phe Lys Pro Asp Val Ile Ile Ala Leu Gly 530 535 540 Gly Gly Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Ile Met Trp Val Met Tyr Glu 545 550 555 560 His Pro Glu Thr His Phe Glu Glu Leu Ala Leu Arg Phe Met Asp Ile 565 570 575 Arg Lys Arg Ile Tyr Lys Phe Pro Lys Met Gly Val Lys Ala Lys Met 580 585 590 Ile Ala Val Thr Thr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Pro Phe 595 600 605 Ala Val Val Thr Asp Asp Ala Thr Gly Gln Lys Tyr Pro Leu Ala Asp 610 615 620 Tyr Ala Leu Thr Pro Asp Met Ala Ile Val Asp Ala Asn Leu Val Met 625 630 635 640 Asp Met Pro Lys Ser Leu Cys Ala Phe Gly Gly Leu Asp Ala Val Thr 645 650 655 His Ala Met Glu Ala Tyr Val Ser Val Leu Ala Ser Glu Phe Ser Asp 660 665 670 Gly Gln Ala Leu Gln Ala Leu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Leu Pro Ala 675 680 685 Ser Tyr His Glu Gly Ser Lys Asn Pro Val Ala Arg Glu Arg Val His 690 695 700 Ser Ala Ala Thr Ile Ala Gly Ile Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly 705 710 715 720 Val Cys His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ser Gln Phe His Ile Pro 725 730 735 His Gly Leu Ala Asn Ala Leu Leu Ile Cys Asn Val Ile Arg Tyr Asn 740 745 750 Ala Asn Asp Asn Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Ser Gln Tyr Asp Arg 755 760 765 Pro Gln Ala Arg Arg Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Asp His Leu Gly Leu 770 775 780 Ser Ala Pro Gly Asp Arg Thr Ala Ala Lys Ile Glu Lys Leu Leu Ala 785 790 795 800 Trp Leu Glu Thr Leu Lys Ala Glu Leu Gly Ile Pro Lys Ser Ile Arg 805 810 815 Glu Ala Gly Val Gln Glu Ala Asp Phe Leu Ala Asn Val Asp Lys Leu 820 825 830 Ser Glu Asp Ala Phe Asp Asp Gln Cys Thr Gly Ala Asn Pro Arg Tyr 835 840 845 Pro Leu Ile Ser Glu Leu Lys Gln Ile Leu Leu Asp Thr Tyr Tyr Gly 850 855 860 Arg Asp Tyr Val Glu Gly Glu Thr Ala Ala Lys Lys Glu Ala Ala Pro 865 870 875 880 Ala Lys Ala Glu Lys Lys Ala Lys Lys Ser Ala 885 890 <210> 4 <211> 2676 <212> DNA <213> E.coli <400> 4 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60 cgtgaatatg ccagtttcac tcaagagcaa gtagacaaaa tcttccgcgc cgccgctctg 120 gctgctgcag atgctcgaat cccactcgcg aaaatggccg ttgccgaatc cggcatgggt 180 atcgtcgaag ataaagtgat caaaaaccac tttgcttctg aatatatcta caacgcctat 240 aaagatgaaa aaacctgtgg tgttctgtct gaagacgaca cttttggtac catcactatc 300 gctgaaccaa tcggtattat ttgcggtatc gttccgacca ctaacccgac ttcaactgct 360 atcttcaaat cgctgatcag tctgaagacc cgtaacgcca ttatcttctc cccgcacccg 420 cgtgcaaaag atgccaccaa caaagcggct gatatcgttc tgcaggctgc tatcgctgcc 480 ggtgctccga aagatctgat cggctggatc gatcaacctt ctgttgaact gtctaacgca 540 ctgatgcacc acccagacat caacctgatc ctcgcgactg 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gaagtagaca tatatggtaa tgtaaacagt acgcacgtta tgggaagcaa aatgatgaat 1260 ggcataggcg gttctggcga ctttgcccgc aatgcatatc tcactatctt cactacagag 1320 tctatcgcca aaaaaggcga tatctcaagc atagtgccta tggtatccca tgtggatcat 1380 accgaacatg atgtaatggt catcgttacc gaacagggag tagcggatct gcgcggtctt 1440 tctcctaggg aaaaggcggt ggctataatc gaaaattgcg ttcatccgga ctataaggat 1500 atgctgatgg agtattttga agaagcgtgc aaatcgtcag gtgggaacac cccacacaat 1560 cttgaaaaag ctctttcatg gcacacaaaa tttataaaaa cgggtagcat gaaataa 1617 <210> 11 <211> 451 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 11 Met Glu Ile Lys Glu Met Val Ser Leu Ala Arg Lys Ala Gln Lys Glu 1 5 10 15 Tyr Gln Ala Thr His Asn Gln Glu Ala Val Asp Asn Ile Cys Arg Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Val Ile Tyr Glu Asn Ala Ala Ile Leu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Val Asp Glu Thr Gly Met Gly Val Tyr Glu His Lys Val Ala Lys Asn 50 55 60 Gln Gly Lys Ser Lys Gly Val Trp Tyr Asn Leu His Asn Lys Lys Ser 65 70 75 80 Ile Gly Ile Leu Asn Ile Asp Glu Arg Thr Gly Met Ile Glu Ile Ala 85 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gtggccaaga atcaggggaa atccaaaggc gtctggtaca atttgcacaa taaaaaatcg 240 atcggtatct taaatataga cgagagaacc gggatgatcg agatagcaaa acctatcggg 300 gttgttggag ccgtaacccc gacgacaaac ccgattgtga ctccaatgag caacatcatt 360 tttgccctta agacatgcaa tgccattatt atcgccccac atcccagatc caaaaaatgc 420 tcagcacatg cagttcgtct gataaaggaa gcaatcgctc cgtttaatgt cccggaggga 480 atggttcaga tcattgaaga gcccagcatc gagaaaactc aggaactaat gggcgccgtg 540 gatgtggtag ttgcgacggg tggtatgggt atggtgaaat ctgcatattc ttcagggaag 600 ccttcttttg gtgtaggagc cggtaacgtt caagtgatcg tggatagtaa tatcgatttt 660 gaagctgcgg cagaaaaaat tatcaccggc cgtgctttcg acaatgggat catctgttca 720 ggcgaacaga gtatcatcta caacgaagct gacaaggaag ctgtcttcac agccttccgc 780 aaccatggtg catatttttg tgatgaagcg gagggagatc gggcccgtgc tgcgattttt 840 gagaatggcg ccatcgcgaa agatgtagtc ggccagagcg ttgcctttat cgcgaagaaa 900 gcaaatatca atataccgga gggtacccgt attctggttg ttgaagctcg cggcgtcgga 960 gcagaggatg tcatatgtaa ggaaaaaatg tgtccagtta tgtgcgcctt aagctacaag 1020 cacttcgagg aaggtgtaga aatcgcacgt acgaacttgg ccaacgaagg taacggccat 1080 acctgtgcga tccattccaa caatcaggcg catatcatac tggcaggttc agaactgacg 1140 gtttcgcgga tcgtggtcaa tgcgccgagt gccactacag caggcggtca catccaaaat 1200 ggtctggcag tgacaaatac gctcggatgc gggagttggg gtaataactc tatctccgag 1260 aactttactt ataaacacct gttaaacatt agccgcatag cgccgcttaa ttcaagcatt 1320 cacattcctg atgacaaaga gatctgggaa ctctaa 1356 <210> 13 <211> 371 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 13 Met Gln Leu Phe Lys Leu Lys Ser Val Thr His His Phe Asp Thr Phe 1 5 10 15 Ala Glu Phe Ala Lys Glu Phe Cys Leu Gly Glu Arg Asp Leu Val Ile 20 25 30 Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Glu Pro Tyr Met Lys Ala Cys Gln Leu Pro 35 40 45 Cys His Phe Val Met Gln Glu Lys Tyr Gly Gln Gly Glu Pro Ser Asp 50 55 60 Glu Met Met Asn Asn Ile Leu Ala Asp Ile Arg Asn Ile Gln Phe Asp 65 70 75 80 Arg Val Ile Gly Ile Gly Gly Gly Thr Val Ile Asp Ile Ser Lys Leu 85 90 95 Phe Val Leu Lys Gly Leu Asn Asp Val Leu Asp Ala Phe Asp Arg Lys 100 105 110 Ile Pro Leu Ile Lys Glu 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gtgaggcggc atgggatatt atcctggagg tattcaagaa aatagccgaa 660 cacggccctg aataccgctt tgagaagctg ggagaaatga tcatggcctc caactatgct 720 ggtatagcct tcgggaatgc aggcgtgggt gccgttcacg ctctaagcta tccattggga 780 ggcaattatc atgtgccgca tggcgaggct aactatcagt tttttacaga ggtctttaaa 840 gtataccaaa agaaaaatcc tttcggctat atagtcgaac tcaactggaa gctgtccaag 900 attctgaact gtcagcctga atacgtctat ccgaaactgg atgagttact cggctgtctt 960 ctgaccaaaa aaccgctgca cgaatacggc atgaaagatg aagaggtacg tggatttgcg 1020 gaatcagtgc ttaagactca gcagcggttg ctcgcgaata attatgttga gcttactgtt 1080 gatgaaattg aaggtatcta cagacgactg tactaa 1116 <210> 15 <211> 431 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 15 Met Lys Asp Val Leu Ala Glu Tyr Ala Ser Arg Ile Val Ser Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys His Ile Lys Asn Gly Glu Arg Val Ala Leu Ser His 20 25 30 Ala Ala Gly Val Pro Gln Ser Cys Val Asp Ala Leu Val Gln Gln Ala 35 40 45 Asp Leu Phe Gln Asn Val Glu Ile Tyr His Met Leu Cys Leu Gly Glu 50 55 60 Gly Lys Tyr Met Ala Pro Glu Met Ala Pro 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Phe Glu Asn Val Ala 275 280 285 Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn 290 295 300 Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn 305 310 315 320 Glu Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala 325 330 335 Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Asn Val Lys 340 345 350 Cys Ile Ile Cys Glu Val Asn Ala Asn His Pro Phe Val Met Thr Glu 355 360 365 Leu Met Met Pro Ile Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu 370 375 380 Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu 405 410 415 Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val 420 425 430 Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr 435 440 445 Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys 450 455 460 Val Leu Ala Gly 465 <210> 20 <211> 1407 <212> DNA <213> Clostridium beijerinckii <400> 20 atgaataagg atacgttgat cccgaccacc aaggatctga aggtcaagac caatggcgag 60 aacatcaatc ttaaaaacta caaagacaac agctcctgtt tcggagtgtt tgaaaatgtg 120 gaaaacgcga tctcctcagc agtacacgcg caaaagatcc tctctttgca ctacactaag 180 gaacagcgtg aaaagattat cacggagatc cgcaaagcgg cactgcagaa caaagaggtc 240 ctggctacaa tgatcttgga ggagacacat atgggtcgct acgaggacaa gatcctcaag 300 cacgagcttg ttgctaagta cacccccggc accgaggatc ttaccaccac cgcctggtct 360 ggcgataatg gactgaccgt tgtggaaatg tccccctacg gcgttatcgg ggcaattacc 420 ccaagcacaa acccaaccga aaccgtgatt tgtaactcga tcggaatgat cgccgcaggt 480 aacgctgtgg ttttcaacgg ccacccatgc gcaaagaagt gcgttgcatt tgccgtggag 540 atgatcaaca aggcaattat ctcatgcggt ggtcctgaaa acctcgtcac taccattaag 600 aatccaacta tggagtcgct tgatgctatc attaagcacc catcgatcaa gcttctctgt 660 ggaactggcg gccctggcat ggtcaaaacg ctcctgaaca gcgggaaaaa ggcgattgga 720 gccggtgcag gtaatccgcc cgtcatcgtg gacgatacgg cagatattga gaaggccggt 780 cgttccatca tcgaaggctg ctcatttgat aacaacctgc cgtgcattgc tgagaaagaa 840 gttttcgttt tcgagaacgt tgccgatgac cttatttcca atatgttgaa 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer_up <400> 23 tacactaagc atagttgttg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_do <400> 24 ctttcttcat tgtggttctc 20 <210> 25 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhE KO primer <400> 25 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 26 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhE KO primer <400> 26 ttaagcggat tttttcgctt ttttctcagc tttagccgga gcggcttctt tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-up <400> 27 caccgcactg actatactct 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer-do <400> 28 gatgaaggct aatgctgtcg 20 <210> 29 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdh KO primer_up <400> 29 atgaaagtcg cagtcctcgg cgctgctggc ggtattggcc aggcgcttgc taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 30 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mdh KO primer_do <400> 30 ttacttatta acgaactctt cgcccagggc gatatctttc ttcagcgtat tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_up <400> 31 ggttcctgat tacggcaatt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_do <400> 32 attcaggaat atccggcaac 20 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gctagaattc atgaacttac atgaatatca gg 32 <210> 34 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gcaaggtacc ttatttcaga acagttttca g 31 <210> 35 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gaaaactgtt ctgaaataag tcacacagga aacagaattc atggaaataa aagagatg 58 <210> 36 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 ttcagtttga acagttgcat gaattctgtt tcctgtgtga ttagagttcc cagatctc 58 <210> 37 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 aagagatctg ggaactctaa tcacacagga aacagaattc atgcaactgt tcaaactg 58 <210> 38 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 cgactctaga ggatccccgg ttagtacagt cgtctgtaga taccttc 47

Claims (23)

  1. 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 활성, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 감소되어 있고, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것인 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 에세리키아 (Escherichia) 속, 코리네박테리움 속, 또는 루멘 박테리아에 속하는 미생물인 것인 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 대장균 (E.coli)인 것인 미생물.
  4. 청구항 1에 있어서, 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 활성은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 활성은 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성은 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 감소에 의하여 감소된 것인 미생물.
  5. 청구항 4에 있어서, 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감쇄된 것인 미생물.
  6. 청구항 1에 있어서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 미생물.
  7. 청구항 1에 있어서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입된 것인 미생물.
  8. 청구항 1에 있어서, 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드, 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 미생물.
  9. 청구항 1에 있어서, 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트를 4-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 4-히드록시부티릴-CoA를 1,4-부탄디올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입에 의하여 증가된 것인 미생물.
  10. 청구항 1에 있어서, 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입되어 있고, 4-히드록시부티레이트를 4-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트를 4-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 4-히드록시부티릴-CoA를 1,4-부탄디올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입되어 있고, 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감쇄된 것인 대장균인 미생물.
  11. 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것인 미생물을 숙시네이트의 존재하에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 1,4-BDO를 회수하는 단계;를 포함하는, 1,4-BDO를 생산하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 숙시네이트는 배양 중 피딩되는 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 배양은 포화 용존 산소 농도의 약 1 내지 약 100%의 농도에서 수행되는 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 미생물은 에세리키아 (Escherichia) 속, 코리네박테리움 속, 또는 루멘 박테리아에 속하는 것인 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 미생물은 대장균 (E.coli)인 것인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 미생물은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 활성, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 감소되어 있는 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 미생물은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 활성은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 활성은 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성은 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 감소에 의하여 감소된 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 미생물은 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감쇄된 것인 방법.
  19. 청구항 11에 있어서, 상기 미생물은 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 방법.
  20. 청구항 11에 있어서, 상기 미생물은 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입된 것인 방법.
  21. 청구항 11에 있어서, 상기 미생물은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드, 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 방법.
  22. 청구항 11에 있어서, 상기 미생물은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입에 의하여 증가된 것인 방법.
  23. 청구항 11에 있어서, 상기 미생물은 숙시네이트를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 활성은 숙시네이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닐 CoA를 숙시닉 세미알데히드 (SSA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 숙시닉 세미알데히드 (SSA)를 4-히드록시부티레이트 (4HB)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입되어 있고, 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 (4HB)를 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 4-히드록시부티릴-CoA (4HB-CoA)를 1,4-부탄디올 (1,4-BDO)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 도입되어 있고, 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감쇄된 것인 대장균인 방법.


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