JP2014023532A - 大腸菌内で１，４−ブタンジオールの生合成に使われる酵素の改良、及び改良された遺伝子をスクリーニングする方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 大腸菌内で１，４−ＢＤＯの生合成に使われる酵素の改良、及び改良された遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【解決手段】 １，４−ＢＤＯ生合成経路中の末端の二つの反応（４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡから４−ヒドロキシブチルアルデヒドの生成反応、及び４−ヒドロキシブチルアルデヒドから１，４−ＢＤＯの生成反応）に対して、これまで活性が報告されていない酵素であるブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（butyraldehyde dehydrogenase）と、ブタノールデヒドロゲナーゼ とを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから大腸菌に導入して発現させた結果、１，４−ＢＤＯの生産能があることを確認した。特に、butyraldehyde dehydrogenaseの活性を進化分子工学により強化して、１，４−ＢＤＯの生産濃度を２倍以上向上させた。
【選択図】図１
【解決手段】 １，４−ＢＤＯ生合成経路中の末端の二つの反応（４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡから４−ヒドロキシブチルアルデヒドの生成反応、及び４−ヒドロキシブチルアルデヒドから１，４−ＢＤＯの生成反応）に対して、これまで活性が報告されていない酵素であるブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（butyraldehyde dehydrogenase）と、ブタノールデヒドロゲナーゼ とを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから大腸菌に導入して発現させた結果、１，４−ＢＤＯの生産能があることを確認した。特に、butyraldehyde dehydrogenaseの活性を進化分子工学により強化して、１，４−ＢＤＯの生産濃度を２倍以上向上させた。
【選択図】図１
Description
本発明は、１，４−ブタンジオールを効率的に生成するために改良されたブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（butyraldehyde dehydrogenase）、ｂｌｄ遺伝子、及びこれを含む形質転換菌株に関する。また、該形質転換された菌株を利用して、高効率で１，４−ブタンジオールを生産する方法に関する。
１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）は、世界的に年間約１３０万トンを使用する溶媒であって、アセチレン、ブタン、プロピレン、ブタジエンのような石油を原料とする物質から化学的に生産している。
前記１，４−ＢＤＯは、多様な化学物質の高分子、溶剤、精密化学中間物質などとして化学産業の全般にわたって重要に使われている。現在、ほとんどの炭素数４の化学物質は、１，４−ＢＤＯ、無水マレイン酸などから由来して合成されているが、原油価格が高くなるにつれて、生産コストが高くなって、化学生産工程を補完及び代替する工程の開発が要求されている。ここで、前記化学生産工程の代案として、微生物を利用した生物学的工程が提示されている。
特許文献１では、種々の酵素用いて１，４−ブタンジオールを生産することが開示されている（特許請求の範囲８、１６および１８）。既存の化学的生産方式とは異なり、Ｇｅｎｏｍａｔｉｃａ社は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉからのスクシニル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子（succinyl-CoA synthetase gene,ｓｕｃＣＤ）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからのＣｏＡ−依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase,ｓｕｃＤ）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからのＮＡＤ依存性４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（4-hydroxybutyrate dehydrogenase,４ｈｂｄ）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓからの４−ヒドロキシブチリルＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡ転移酵素遺伝子（4-hydroxybutyryl CoA:acetyl-CoA transferase,ｃａｔ２）、 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈＥ２）を利用して、１，４−ＢＤＯを大腸菌内で生合成する回路を２０１１年に構築した。
ひとつの実施の形態においては、既に大腸菌内で確認されていた生合成回路を変更させて、新たな生合成回路を構築した。例えば、この回路に最も適したブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体を有し、１，４−ＢＤＯを効率的に生産することができる微生物を開発した。
Harry Yim, Metabolic engineering of E.coli for direct production of 1,4 butanediol, 22 May 2011, nature chemical biology
本発明の目的は、１，４−ＢＤＯを高効率で生産するのに利用される組み換えブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを提供することにある。
本発明の他の目的は、１，４−ＢＤＯを高効率で生産するように、組み換えｂｌｄ遺伝子を含む形質転換微生物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、１，４−ＢＤＯを高効率で生産するように、組み換えｂｌｄ遺伝子及びｂｄｈ遺伝子を含む形質転換微生物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、１，４−ＢＤＯを高効率で生産するように、組み換えｓｕｃＣＤ遺伝子、ｓｕｃＤ遺伝子、４ｈｂｄ遺伝子、ｃａｔ２遺伝子、ｂｌｄ遺伝子及びｂｄｈ遺伝子を含む形質転換微生物を提供することにある。
本発明は、以下の内容をその骨子とする。
（１） ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを、４−ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する触媒活性を有することを特徴とするブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（butyraldehyde dehydrogenase）またはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
（２） 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ。
（３） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎ、３６１番目のＡｒｇ、４６７番目のＡｌａ、３７１番目のＭｅｔ、１７６番目のＡｌａ、２７３番目のＬｅｕ及び２７９番目のＬｙｓからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（４） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎがＴｈｒに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（５） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（６） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３７１番目のＭｅｔがＡｒｇに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（７） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、１７６番目のＡｌａがＴｈｒに置換され、２７３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換され、２７９番目のＬｙｓがＡｒｇに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（８） 前記butyraldehyde dehydrogenase 変異体は、配列番号１で、１７６番目のＡｌａがＴｈｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase 変異体。
（９） 前記ｂｌｄ変異体は、配列番号１で、２７３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のｂｌｄ変異体。
（１０） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、２７９番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１１） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載の butyraldehyde dehydrogenase 変異体。
（１２） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１３） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎがＴｈｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１４） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１５） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体の活性部位は、配列番号１で、４３番目に位置したＴｈｒ、１４４番目に位置したＡｓｎ、２４１番目に位置したＡｌａ、２４２番目に位置したＧｌｙ、２４３番目に位置したＡｌａ、２４４番目に位置したＧｌｙ、２４６番目に位置したＰｒｏ、２７３番目に位置したＬｅｕ、２７４番目に位置したＰｒｏ、２７６番目に位置したＩｌｅ、２７７番目に位置したＡｌａ、２７９番目に位置したＬｙｓ、３６８番目に位置したＧｌｕ、３９８番目に位置したＨｉｓ、４３２番目に位置したＶａｌ、及び４４１番目に位置したＴｈｒからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１６） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体の活性部位は、４３番目に位置したＴｈｒがＡｓｐに、１４４番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、２４１番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４２番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４３番目に位置したＡｌａがＧｌｙに、２４４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４６番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２７３番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２７４番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２７６番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２７７番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２７９番目に位置したＬｙｓがＡｒｇに、３６８番目に位置したＧｌｕがＧｌｎに、３９８番目に位置したＨｉｓがＬｙｓに、４３２番目に位置したＶａｌがＬｅｕに、４４１番目に位置したＴｈｒがＡｓｐに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１５）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１７） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、９１番目に位置したＭｅｔ、１３９番目に位置したＩｌｅ、１４０番目に位置したＴｈｒ、１４１番目に位置したＰｒｏ、１４２番目に位置したＳｅｒ、１４３番目に位置したＴｈｒ、１６６番目に位置したＡｓｎ、１６７番目に位置したＧｌｙ、１６８番目に位置したＨｉｓ、１６９番目に位置したＰｒｏ、１７０番目に位置したＧｌｙ、２０１番目に位置したＡｓｎ、２０２番目に位置したＰｒｏ、２０３番目に位置したＴｈｒ、２０４番目に位置したＭｅｔ、２０７番目に位置したＬｅｕ、２０８番目に位置したＡｓｐ、２１０番目に位置したＩｌｅ、２１１番目に位置したＩｌｅ、２１２番目に位置したＬｙｓ、２２２番目に位置したＴｈｒ、２２３番目に位置したＧｌｙ、２２４番目に位置したＧｌｙ、２２５番目に位置したＰｒｏ、２２７番目に位置したＭｅｔ、２３０番目に位置したＴｈｒ、２３１番目に位置したＬｅｕ、２４１番目に位置したＡｌａ、２４２番目に位置したＧｌｙ、２４３番目に位置したＡｌａ、２４４番目に位置したＧｌｙ、２７３番目に位置したＬｅｕ、２７４番目に位置したＰｒｏ、２７５番目に位置したＣｙｓ、３２６番目に位置したＳｅｒ、３２７番目に位置したＩｌｅ、３２８番目に位置したＡｓｎ、３２９番目に位置したＬｙｓ、３３２番目に位置したＶａｌ、３６７番目に位置したＴｈｒ、３６８番目に位置したＧｌｕ、３６９番目に位置したＬｅｕ、３７０番目に位置したＭｅｔ、及び３９６番目に位置したＡｒｇからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１８） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、９１番目に位置したＭｅｔがＡｓｐに、１３９番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、１４０番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、１４１番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、１４２番目に位置したＳｅｒがＧｌｙに、１４３番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、１６６番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、１６７番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、１６８番目に位置したＨｉｓがＬｙｓに、１６９番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、１７０番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２０１番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、２０２番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２０３番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２０４番目に位置したＭｅｔがＡｓｐに、２０７番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２０８番目に位置したＡｓｐがＡｓｎに、２１０番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２１１番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２１２番目に位置したＬｙｓがＴｈｒに、２２２番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２２３番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２２４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２２５番目に位置したＰｒｏがＨｉｓに、２２７番目に位置したＭｅｔがＬｙｓに、２３０番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２３１番目に位置したＬｅｕがＶａｌに、２４１番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４２番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４３番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２７３番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２７４番目に位置したＰｒｏがＨｉｓに、２７５番目に位置したＣｙｓがＭｅｔに、３２６番目に位置したＳｅｒがＧｌｙに、３２７番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、３２８番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、３２９番目に位置したＬｙｓがＴｈｒに、３３２番目に位置したＶａｌがＬｅｕに、３６７番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、３６８番目に位置したＧｌｕがＧｌｎに、３６９番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、３７０番目に位置したＭｅｔがＬｙｓに、３９６番目に位置したＡｒｇがＬｙｓに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１９） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号２の配列のポリペプチドを有する組み換えbutyraldehyde dehydrogenaseであることを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（２０） （１）〜（１９）のうちいずれか１つに記載のbutyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体をコードすることを特徴とするｂｌｄ遺伝子。
（２１） 前記butyraldehyde dehydrogenaseをコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから由来したことを特徴とする（２０）に記載のｂｌｄ遺伝子。
（２２） （２０）または（２１）に記載のｂｌｄ遺伝子が導入された１，４−ブタンジオールを生産することができることを特徴とする微生物。
（２３） 前記微生物は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドを、１，４−ブタンジオールに転換する触媒活性を有するブタノールデヒドロゲナーゼ（butanol dehydrogenase,Bdh）遺伝子がさらに導入されたことを特徴とする（２２）に記載の微生物。
（２４） 前記ｂｄｈ遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから由来したことを特徴とする（２３）に記載の微生物。
（２５） 前記菌株は、コハク酸をスクシニルＣｏＡに転換する活性を有するｓｕｃＣＤをコードする遺伝子、スクシニルＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに転換する活性を有するｓｕｃＤをコードする遺伝子、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに転換する活性を有する４ｈｂｄをコードする遺伝子、及び４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチルＣｏＡに転換する活性を有するｃａｔ２をコードする遺伝子、をさらに含むことを特徴とする（２２）〜（２４）のいずれか１つに記載の微生物。
（２６） 前記微生物は、組み換え大腸菌であることを特徴とする（２２）〜（２５）のうちいずれか１つに記載の微生物。
（２７） ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡと、butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体とを接触させるステップを含むことを特徴とする４−ヒドロキシブチルアルデヒドを生産する方法。
（２８） 前記butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする（２７）に記載の方法。
（２９） ４−ヒドロキシブチルアルデヒドとbutanol dehydrogenaseとを接触させるステップを含むことを特徴とする１，４−ＢＤＯを生産する方法。
（３０） ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡと、butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体とを接触させるステップと、
前記で得られた反応物に、butanol dehydrogenaseを接触させるステップと、を含むことを特徴とする１，４−ＢＤＯを生産する方法。
（３１） butyraldehyde dehydrogenase遺伝子またはbutyraldehyde dehydrogenase遺伝子変異体、及びbutanol dehydrogenase遺伝子を微生物に導入して、微生物を提供するステップと、
前記微生物を培養するステップと、
前記微生物から１，４−ブタンジオールを分離するステップと、を含むことを特徴とする１，４−ブタンジオールを生産する方法。
（３２） 前記微生物を提供するステップにおいて、コハク酸をスクシニルＣｏＡに転換する活性を有するｓｕｃＣＤをコードする遺伝子、スクシニルＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに転換する活性を有するｓｕｃＤをコードする遺伝子、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに転換する活性を有する４ｈｂｄをコードする遺伝子、及び４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチルＣｏＡに転換する活性を有するｃａｔ２をコードする遺伝子、がさらに導入されたことを特徴とする（３１）に記載の１，４−ブタンジオールを生産する方法。
（３３） butyraldehyde dehydrogenase またはbutyraldehyde dehydrogenase変異体を微生物に導入して、微生物を提供するステップと、
前記培養物に、シッフ試薬を接触させるステップと、
吸光度を測定するステップと、を含むことを特徴とする１，４−ブタンジオールの生産量を確認する方法。
（３４） 前記１，４−ブタンジオールの生産量の確認は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドの生産量の測定を通じて行われることを特徴とする（３３）に記載の方法。
（１） ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを、４−ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する触媒活性を有することを特徴とするブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（butyraldehyde dehydrogenase）またはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
（２） 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ。
（３） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎ、３６１番目のＡｒｇ、４６７番目のＡｌａ、３７１番目のＭｅｔ、１７６番目のＡｌａ、２７３番目のＬｅｕ及び２７９番目のＬｙｓからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（４） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎがＴｈｒに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（５） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（６） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３７１番目のＭｅｔがＡｒｇに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（７） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、１７６番目のＡｌａがＴｈｒに置換され、２７３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換され、２７９番目のＬｙｓがＡｒｇに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（８） 前記butyraldehyde dehydrogenase 変異体は、配列番号１で、１７６番目のＡｌａがＴｈｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase 変異体。
（９） 前記ｂｌｄ変異体は、配列番号１で、２７３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のｂｌｄ変異体。
（１０） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、２７９番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１１） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載の butyraldehyde dehydrogenase 変異体。
（１２） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１３） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎがＴｈｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１４） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（３）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１５） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体の活性部位は、配列番号１で、４３番目に位置したＴｈｒ、１４４番目に位置したＡｓｎ、２４１番目に位置したＡｌａ、２４２番目に位置したＧｌｙ、２４３番目に位置したＡｌａ、２４４番目に位置したＧｌｙ、２４６番目に位置したＰｒｏ、２７３番目に位置したＬｅｕ、２７４番目に位置したＰｒｏ、２７６番目に位置したＩｌｅ、２７７番目に位置したＡｌａ、２７９番目に位置したＬｙｓ、３６８番目に位置したＧｌｕ、３９８番目に位置したＨｉｓ、４３２番目に位置したＶａｌ、及び４４１番目に位置したＴｈｒからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１６） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体の活性部位は、４３番目に位置したＴｈｒがＡｓｐに、１４４番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、２４１番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４２番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４３番目に位置したＡｌａがＧｌｙに、２４４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４６番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２７３番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２７４番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２７６番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２７７番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２７９番目に位置したＬｙｓがＡｒｇに、３６８番目に位置したＧｌｕがＧｌｎに、３９８番目に位置したＨｉｓがＬｙｓに、４３２番目に位置したＶａｌがＬｅｕに、４４１番目に位置したＴｈｒがＡｓｐに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１５）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１７） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、９１番目に位置したＭｅｔ、１３９番目に位置したＩｌｅ、１４０番目に位置したＴｈｒ、１４１番目に位置したＰｒｏ、１４２番目に位置したＳｅｒ、１４３番目に位置したＴｈｒ、１６６番目に位置したＡｓｎ、１６７番目に位置したＧｌｙ、１６８番目に位置したＨｉｓ、１６９番目に位置したＰｒｏ、１７０番目に位置したＧｌｙ、２０１番目に位置したＡｓｎ、２０２番目に位置したＰｒｏ、２０３番目に位置したＴｈｒ、２０４番目に位置したＭｅｔ、２０７番目に位置したＬｅｕ、２０８番目に位置したＡｓｐ、２１０番目に位置したＩｌｅ、２１１番目に位置したＩｌｅ、２１２番目に位置したＬｙｓ、２２２番目に位置したＴｈｒ、２２３番目に位置したＧｌｙ、２２４番目に位置したＧｌｙ、２２５番目に位置したＰｒｏ、２２７番目に位置したＭｅｔ、２３０番目に位置したＴｈｒ、２３１番目に位置したＬｅｕ、２４１番目に位置したＡｌａ、２４２番目に位置したＧｌｙ、２４３番目に位置したＡｌａ、２４４番目に位置したＧｌｙ、２７３番目に位置したＬｅｕ、２７４番目に位置したＰｒｏ、２７５番目に位置したＣｙｓ、３２６番目に位置したＳｅｒ、３２７番目に位置したＩｌｅ、３２８番目に位置したＡｓｎ、３２９番目に位置したＬｙｓ、３３２番目に位置したＶａｌ、３６７番目に位置したＴｈｒ、３６８番目に位置したＧｌｕ、３６９番目に位置したＬｅｕ、３７０番目に位置したＭｅｔ、及び３９６番目に位置したＡｒｇからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１８） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、９１番目に位置したＭｅｔがＡｓｐに、１３９番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、１４０番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、１４１番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、１４２番目に位置したＳｅｒがＧｌｙに、１４３番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、１６６番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、１６７番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、１６８番目に位置したＨｉｓがＬｙｓに、１６９番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、１７０番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２０１番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、２０２番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２０３番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２０４番目に位置したＭｅｔがＡｓｐに、２０７番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２０８番目に位置したＡｓｐがＡｓｎに、２１０番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２１１番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２１２番目に位置したＬｙｓがＴｈｒに、２２２番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２２３番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２２４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２２５番目に位置したＰｒｏがＨｉｓに、２２７番目に位置したＭｅｔがＬｙｓに、２３０番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２３１番目に位置したＬｅｕがＶａｌに、２４１番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４２番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４３番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２７３番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２７４番目に位置したＰｒｏがＨｉｓに、２７５番目に位置したＣｙｓがＭｅｔに、３２６番目に位置したＳｅｒがＧｌｙに、３２７番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、３２８番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、３２９番目に位置したＬｙｓがＴｈｒに、３３２番目に位置したＶａｌがＬｅｕに、３６７番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、３６８番目に位置したＧｌｕがＧｌｎに、３６９番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、３７０番目に位置したＭｅｔがＬｙｓに、３９６番目に位置したＡｒｇがＬｙｓに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（１９） 前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号２の配列のポリペプチドを有する組み換えbutyraldehyde dehydrogenaseであることを特徴とする（１）に記載のbutyraldehyde dehydrogenase変異体。
（２０） （１）〜（１９）のうちいずれか１つに記載のbutyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体をコードすることを特徴とするｂｌｄ遺伝子。
（２１） 前記butyraldehyde dehydrogenaseをコードする遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから由来したことを特徴とする（２０）に記載のｂｌｄ遺伝子。
（２２） （２０）または（２１）に記載のｂｌｄ遺伝子が導入された１，４−ブタンジオールを生産することができることを特徴とする微生物。
（２３） 前記微生物は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドを、１，４−ブタンジオールに転換する触媒活性を有するブタノールデヒドロゲナーゼ（butanol dehydrogenase,Bdh）遺伝子がさらに導入されたことを特徴とする（２２）に記載の微生物。
（２４） 前記ｂｄｈ遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから由来したことを特徴とする（２３）に記載の微生物。
（２５） 前記菌株は、コハク酸をスクシニルＣｏＡに転換する活性を有するｓｕｃＣＤをコードする遺伝子、スクシニルＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに転換する活性を有するｓｕｃＤをコードする遺伝子、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに転換する活性を有する４ｈｂｄをコードする遺伝子、及び４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチルＣｏＡに転換する活性を有するｃａｔ２をコードする遺伝子、をさらに含むことを特徴とする（２２）〜（２４）のいずれか１つに記載の微生物。
（２６） 前記微生物は、組み換え大腸菌であることを特徴とする（２２）〜（２５）のうちいずれか１つに記載の微生物。
（２７） ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡと、butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体とを接触させるステップを含むことを特徴とする４−ヒドロキシブチルアルデヒドを生産する方法。
（２８） 前記butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする（２７）に記載の方法。
（２９） ４−ヒドロキシブチルアルデヒドとbutanol dehydrogenaseとを接触させるステップを含むことを特徴とする１，４−ＢＤＯを生産する方法。
（３０） ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡと、butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体とを接触させるステップと、
前記で得られた反応物に、butanol dehydrogenaseを接触させるステップと、を含むことを特徴とする１，４−ＢＤＯを生産する方法。
（３１） butyraldehyde dehydrogenase遺伝子またはbutyraldehyde dehydrogenase遺伝子変異体、及びbutanol dehydrogenase遺伝子を微生物に導入して、微生物を提供するステップと、
前記微生物を培養するステップと、
前記微生物から１，４−ブタンジオールを分離するステップと、を含むことを特徴とする１，４−ブタンジオールを生産する方法。
（３２） 前記微生物を提供するステップにおいて、コハク酸をスクシニルＣｏＡに転換する活性を有するｓｕｃＣＤをコードする遺伝子、スクシニルＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに転換する活性を有するｓｕｃＤをコードする遺伝子、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに転換する活性を有する４ｈｂｄをコードする遺伝子、及び４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチルＣｏＡに転換する活性を有するｃａｔ２をコードする遺伝子、がさらに導入されたことを特徴とする（３１）に記載の１，４−ブタンジオールを生産する方法。
（３３） butyraldehyde dehydrogenase またはbutyraldehyde dehydrogenase変異体を微生物に導入して、微生物を提供するステップと、
前記培養物に、シッフ試薬を接触させるステップと、
吸光度を測定するステップと、を含むことを特徴とする１，４−ブタンジオールの生産量を確認する方法。
（３４） 前記１，４−ブタンジオールの生産量の確認は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドの生産量の測定を通じて行われることを特徴とする（３３）に記載の方法。
本発明によれば、１，４−ＢＤＯの生合成の経路中に、butyraldehyde dehydrogenaseとbutanol dehydrogenaseとを大腸菌に導入して発現させた結果、１，４−ＢＤＯの生産能があることを確認した。特に、１，４−ＢＤＯを特異的に高効率で生産することが可能なbutyraldehyde dehydrogenase変異体が得られ、これを利用して、生産濃度が２倍以上向上した組み換え形質転換微生物を獲得した。前記形質転換微生物を利用する場合、効率的に１，４−ＢＤＯを生産することができる。
本発明におけるひとつの実施の形態においては、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを、４−ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する触媒活性を有するbutyraldehyde dehydrogenase(Bld)またはbutyraldehyde dehydrogenase変異体が提供される。
前記butyraldehyde dehydrogenase（ｂｌｄ）遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから由来した遺伝子である。前記Ｂｌｄは、配列番号１のポリペプチドを有する。好ましくは、Ｂｌｄは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは不可されたアミノ酸配列からなり、かつ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する触媒活性を有するタンパク質である。
明細書において使用される用語“ポリヌクレオチド”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）分子とＲＮＡ分子とを包括的に含む意味を有し、ポリヌクレオチドの基本構成単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基の部位が変形された類似体も含む。
この時、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎ、３６１番目のＡｒｇ、４６７番目のＡｌａ、３７１番目のＭｅｔ、１７６番目のＡｌａ、２７３番目のＬｅｕ及び２７９番目のＬｙｓからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されてもよい。
例えば、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎがＴｈｒに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３７１番目のＭｅｔがＡｒｇに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase 変異体は、配列番号１で、１７６番目のＡｌａがＴｈｒに置換され、２７３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換され、２７９番目のＬｙｓがＡｒｇに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、１７６番目のＡｌａがＴｈｒに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、２７３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、２７９番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎがＴｈｒに置換されてもよい。また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換されてもよい。
また、前記変異体の活性部位は、配列番号１で、４３番目に位置したＴｈｒ、１４４番目に位置したＡｓｎ、２４１番目に位置したＡｌａ、２４２番目に位置したＧｌｙ、２４３番目に位置したＡｌａ、２４４番目に位置したＧｌｙ、２４６番目に位置したＰｒｏ、２７３番目に位置したＬｅｕ、２７４番目に位置したＰｒｏ、２７６番目に位置したＩｌｅ、２７７番目に位置したＡｌａ、２７９番目に位置したＬｙｓ、３６８番目に位置したＧｌｕ、３９８番目に位置したＨｉｓ、４３２番目に位置したＶａｌ、及び４４１番目に位置したＴｈｒからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されてもよい。
例えば、前記変異体の活性部位は、４３番目に位置したＴｈｒがＡｓｐに、１４４番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、２４１番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４２番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４３番目に位置したＡｌａがＧｌｙに、２４４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４６番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２７３番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２７４番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２７６番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２７７番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２７９番目に位置したＬｙｓがＡｒｇに、３６８番目に位置したＧｌｕがＧｌｎに、３９８番目に位置したＨｉｓがＬｙｓに、４３２番目に位置したＶａｌがＬｅｕに、４４１番目に位置したＴｈｒがＡｓｐに置換されてもよい。
また、前記変異体は、配列番号１で、９１番目に位置したＭｅｔ、１３９番目に位置したＩｌｅ、１４０番目に位置したＴｈｒ、１４１番目に位置したＰｒｏ、１４２番目に位置したＳｅｒ、１４３番目に位置したＴｈｒ、１６６番目に位置したＡｓｎ、１６７番目に位置したＧｌｙ、１６８番目に位置したＨｉｓ、１６９番目に位置したＰｒｏ、１７０番目に位置したＧｌｙ、２０１番目に位置したＡｓｎ、２０２番目に位置したＰｒｏ、２０３番目に位置したＴｈｒ、２０４番目に位置したＭｅｔ、２０７番目に位置したＬｅｕ、２０８番目に位置したＡｓｐ、２１０番目に位置したＩｌｅ、２１１番目に位置したＩｌｅ、２１２番目に位置したＬｙｓ、２２２番目に位置したＴｈｒ、２２３番目に位置したＧｌｙ、２２４番目に位置したＧｌｙ、２２５番目に位置したＰｒｏ、２２７番目に位置したＭｅｔ、２３０番目に位置したＴｈｒ、２３１番目に位置したＬｅｕ、２４１番目に位置したＡｌａ、２４２番目に位置したＧｌｙ、２４３番目に位置したＡｌａ、２４４番目に位置したＧｌｙ、２７３番目に位置したＬｅｕ、２７４番目に位置したＰｒｏ、２７５番目に位置したＣｙｓ、３２６番目に位置したＳｅｒ、３２７番目に位置したＩｌｅ、３２８番目に位置したＡｓｎ、３２９番目に位置したＬｙｓ、３３２番目に位置したＶａｌ、３６７番目に位置したＴｈｒ、３６８番目に位置したＧｌｕ、３６９番目に位置したＬｅｕ、３７０番目に位置したＭｅｔ、及び３９６番目に位置したＡｒｇからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたbutyraldehyde dehydrogenase変異体であってもよい。
例えば、前記変異体は、配列番号１で、９１番目に位置したＭｅｔがＡｓｐに、１３９番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、１４０番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、１４１番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、１４２番目に位置したＳｅｒがＧｌｙに、１４３番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、１６６番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、１６７番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、１６８番目に位置したＨｉｓがＬｙｓに、１６９番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、１７０番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２０１番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、２０２番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２０３番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２０４番目に位置したＭｅｔがＡｓｐに、２０７番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２０８番目に位置したＡｓｐがＡｓｎに、２１０番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２１１番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２１２番目に位置したＬｙｓがＴｈｒに、２２２番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２２３番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２２４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２２５番目に位置したＰｒｏがＨｉｓに、２２７番目に位置したＭｅｔがＬｙｓに、２３０番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２３１番目に位置したＬｅｕがＶａｌに、２４１番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４２番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４３番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２７３番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２７４番目に位置したＰｒｏがＨｉｓに、２７５番目に位置したＣｙｓがＭｅｔに、３２６番目に位置したＳｅｒがＧｌｙに、３２７番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、３２８番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、３２９番目に位置したＬｙｓがＴｈｒに、３３２番目に位置したＶａｌがＬｅｕに、３６７番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、３６８番目に位置したＧｌｕがＧｌｎに、３６９番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、３７０番目に位置したＭｅｔがＬｙｓに、３９６番目に位置したＡｒｇがＬｙｓに置換されてもよい。
また、前記butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号２の配列のポリペプチドを有する。好ましくは、butyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは不可されたアミノ酸配列からなり、かつ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを４−ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する触媒活性を有するタンパク質である。
本発明の他の具体例は、前記butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体をコードするｂｌｄ遺伝子を提供する。この時、前記遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから由来したものである。
本発明のさらに他の具体例は、前記遺伝子が導入された１，４−ＢＤＯを生産することができる微生物を提供する。前記微生物は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドを、１，４−ＢＤＯに転換する触媒活性を有するブタノールデヒドロゲナーゼ（ｂｄｈ）遺伝子がさらに導入されたものである。この時、前記遺伝子は、配列番号１８である（配列番号１９は、配列番号１８に対応するブタノールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列である）。前記菌株は、コハク酸をスクシニルＣｏＡに転換する活性を有するｓｕｃＣＤをコードする遺伝子、スクシニルＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに転換する活性を有するｓｕｃＤをコードする遺伝子、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに転換する活性を有する４ｈｂｄをコードする遺伝子、及び４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチルＣｏＡに転換する活性を有するｃａｔ２をコードする遺伝子をさらに含む。この時、前記微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉであることが好ましい。
また、前記組み換えｂｌｄをコードする遺伝子を含む組み換え発現ベクターを提供する。
また、前記組み換えｂｌｄをコードする遺伝子を含む組み換え発現ベクターを提供する。
用語“ベクター”は、適切な宿主内でＤＮＡを発現させる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトを意味する。前記ベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクターなどが使われる。
発現ベクターとして機能するためには、ベクターは、複製起点、プロモーター、ＭＣＳ及び選択マーカーを含まなければならない。複製起点は、プラスミドが宿主細胞の染色体と別途に複製する機能を付与し、プロモーターは、挿入される外来遺伝子の転写過程に作用し、ＭＣＳは、マルチクローニングサイトであって、外来遺伝子が多様な制限酵素サイトを通じて挿入可能にし、選択マーカーは、ベクターが宿主細胞に正しく挿入されたかを確認する役割を行う。選択マーカーは、当業界で通常的に利用される抗生物質耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子があり、望ましくは、コスト側面を考慮して、アンピシリンまたはゲンタマイシンの耐性遺伝子である。
一方、本発明のベクターが、原核細胞を宿主とする場合には、望ましくは、強いプロモーター、例えば、ラムダＰＬプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどを含む。真核細胞を宿主とする場合には、望ましくは、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、及びＨＳＶのｔｋプロモーター）を含む。望ましくは、前記プロモーターは、ラムダＰＬプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、またはＴ７プロモーターである。かかるプロモーターは、遺伝子をコードする配列と作動的に連結されている。
本明細書で使われた用語“作動的に連結された”は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と、他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記遺伝子をコードする核酸配列の転写及び／または翻訳を調節する。
本発明のさらに他の具体例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡと、butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体とを接触させるステップを含む４−ヒドロキシブチルアルデヒドを生産する方法を提供する。前記butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有する。
本発明のさらに他の具体例は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドとbutanol dehydrogenaseとを接触させるステップを含む１，４−ＢＤＯを生産する方法を提供する。
本発明のさらに他の具体例は、４−ヒドロキシブチリルＣｏＡと、butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体とを接触させるステップと、前記で得られた反応物に、butanol dehydrogenaseを接触させるステップと、を含む１，４−ＢＤＯを生産する方法を提供する。
本発明のさらに他の具体例は、butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体及びbutanol dehydrogenaseを微生物に導入して、微生物を提供するステップと、前記微生物を培養するステップと、前記微生物から、１，４−ＢＤＯを分離するステップと、を含む１，４−ＢＤＯを生産する方法を提供する。
前記微生物が利用可能な炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などで培養される。具体的には、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトースなどが利用される。また、微生物が利用可能な窒素源は、有機窒素化合物、無機窒素化合物などである。具体的には、アミノ酸、アミド、アミン、硝酸塩、アンモニウム塩などである。微生物を培養する酸素条件は、正常酸素分圧の好気性条件、大気中に０．１〜１０体積％の酸素を含む低酸素条件、または酸素のない嫌気性条件である。
前記微生物を提供するステップにおいて、コハク酸をスクシニルＣｏＡに転換する活性を有するｓｕｃＣＤをコードする遺伝子、スクシニルＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに転換する活性を有するｓｕｃＤをコードする遺伝子、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに転換する活性を有する４ｈｂｄをコードする遺伝子、及び４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチルＣｏＡに転換する活性を有するｃａｔ２をコードする遺伝子が微生物にさらに導入されてもよい。
本発明のさらに他の具体例は、butyraldehyde dehydrogenaseまたはbutyraldehyde dehydrogenase変異体を微生物に導入して、微生物を提供するステップと、前記培養物に、シッフ試薬を接触させるステップと、吸光度を測定するステップと、を含む１，４−ＢＤＯの生産量を確認する方法を提供する。この時、前記１，４−ＢＤＯの生産量の確認は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドの生産量の測定を通じて行われる。
以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業者にとって自明である。
（実施例１）形質転換宿主及び形質転換のために製作された発現ベクター
１，４−ＢＤＯを効率的に生産するために利用した組み換え微生物、及び前記微生物を形質転換させるための発現ベクターは、下記の表１の通りである。
１，４−ＢＤＯを効率的に生産するために利用した組み換え微生物、及び前記微生物を形質転換させるための発現ベクターは、下記の表１の通りである。
（実施例２）代謝経路遺伝子のモジュール化
ｐＧＥＭベクターに合成されたｓｕｃＣＤ−ｓｕｃＤ−４ｈｂｄ−ｃａｔ２遺伝子を、構成的なプロモーターの調節下でなすように、ｐＵＣＭベクターのＸｂａＩ及びＮｏｔＩ
の位置にクローニングした。次いで、ｐＳＴＶ２８ベクターのＳａｃＩ及びＢａｍＨＩの
位置にサブクローニングした。
ｐＧＥＭベクターに合成されたｓｕｃＣＤ−ｓｕｃＤ−４ｈｂｄ−ｃａｔ２遺伝子を、構成的なプロモーターの調節下でなすように、ｐＵＣＭベクターのＸｂａＩ及びＮｏｔＩ
の位置にクローニングした。次いで、ｐＳＴＶ２８ベクターのＳａｃＩ及びＢａｍＨＩの
位置にサブクローニングした。
ｂｄｈ遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍの染色体ＤＮＡでＰＣＲにより増幅した後、ｐＵＣＭベクターのＸｂａＩ
及びＮｏｔＩの位置にクローニングした。ｂｌｄ遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓ
ａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍの染色体ＤＮＡでＰＣＲにより増幅した後、ｐＵＣＭベクターのＸｍａＩ及びＮｏｔＩの位置にクローニングした。
及びＮｏｔＩの位置にクローニングした。ｂｌｄ遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓ
ａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍの染色体ＤＮＡでＰＣＲにより増幅した後、ｐＵＣＭベクターのＸｍａＩ及びＮｏｔＩの位置にクローニングした。
ＡｄｈＥ２遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの染色体ＤＮＡでＰＣＲにより増幅した後、ｐＵＣＭベクターのＸｂａＩ及びＮｏｔＩの位置に
クローニングした。ＰＣＲは、ＤＮＡエンジンサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を利用し、９５℃で４分間に続き、９４℃で１分間、５０℃で４０秒間、７２℃で１分間の三つの過程を３２回反復した後、最後に７２℃で７分間の過程を経て行った。
クローニングした。ＰＣＲは、ＤＮＡエンジンサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を利用し、９５℃で４分間に続き、９４℃で１分間、５０℃で４０秒間、７２℃で１分間の三つの過程を３２回反復した後、最後に７２℃で７分間の過程を経て行った。
各プライマーについてのＤＮＡ配列は、表２の通りである。
（実施例３）遺伝子の改良及びスクリーニング
（３−１）ｂｌｄ変異体の製作
１，４−ＢＤＯの生産量の増加のために、進化分子工学によってｂｌｄ遺伝子を改良した。エラープローンＰＣＲを利用して、ｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの配列を変えた。２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2と、サブクローニング用のプライマーとを使用した。ＧリッチｄＮＴＰ（Ｔ：Ａ：Ｃ：Ｇ＝１：１：１：４）と、ＴリッチｄＮＴＰ（Ｔ：Ａ：Ｃ：Ｇ＝４：１：１：１）とをそれぞれ使用して、エラーの多様性を高めた。これらは、ｐＵＣＭベクターのＸｍａＩ及びＮｏｔＩの位置にクローニングされた
。
（３−２）１，４−ＢＤＯを高効率で生産するためのｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ変異体のスクリーニング
ｐＳＴＶ ２８−ｓｕｃＣＤ−ｓｕｃＤ−４ｈｂｄ−ｃａｔ２（ｐＳＴＶ−ｃｓ４ｃ）ベクターが導入されたＴＯＰ１０に、ｐＵＣＭ−ｂｌｄまたはｐＵＣＭ−ｂｌｄ−Ｍ１〜ｐＵＣＭ−ｂｌｄ−Ｍ５を導入した。
（３−１）ｂｌｄ変異体の製作
１，４−ＢＤＯの生産量の増加のために、進化分子工学によってｂｌｄ遺伝子を改良した。エラープローンＰＣＲを利用して、ｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの配列を変えた。２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2と、サブクローニング用のプライマーとを使用した。ＧリッチｄＮＴＰ（Ｔ：Ａ：Ｃ：Ｇ＝１：１：１：４）と、ＴリッチｄＮＴＰ（Ｔ：Ａ：Ｃ：Ｇ＝４：１：１：１）とをそれぞれ使用して、エラーの多様性を高めた。これらは、ｐＵＣＭベクターのＸｍａＩ及びＮｏｔＩの位置にクローニングされた
。
（３−２）１，４−ＢＤＯを高効率で生産するためのｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ変異体のスクリーニング
ｐＳＴＶ ２８−ｓｕｃＣＤ−ｓｕｃＤ−４ｈｂｄ−ｃａｔ２（ｐＳＴＶ−ｃｓ４ｃ）ベクターが導入されたＴＯＰ１０に、ｐＵＣＭ−ｂｌｄまたはｐＵＣＭ−ｂｌｄ−Ｍ１〜ｐＵＣＭ−ｂｌｄ−Ｍ５を導入した。
ライブラリのうち生産量を増加させることができる遺伝子を探すために、シッフ試薬を使用した。シッフ試薬は、３０ｍｇ／ｍｌの硫酸水素ナトリウム（水溶）、０．５ＭのＫＣｌ（水溶）及び２ｍｇ／ｍｌのパラローザニリン（エタノール中）が２：１：２の体積の割合で混ぜられた溶液であって、コロニーが浮いたプレート上で反応させるために、０．８重量％のアガー（水溶）に溶液を添加した。二つの溶液をよく混ぜた後、プレートに注いで、３７℃で約３時間反応させた。その後、赤色を呈するコロニーを選別して、２ｍｌのＬＢ培地で３７℃、２５０ｒｐｍで１２時間培養した。培養液１ｍｌを１３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行って得られた上清液の２００μｌと、シッフ試薬１００μｌとをよく混ぜて、３７℃で１〜５時間反応させた。５４０ｎｍの吸光度を測定し、高い吸光度を表した遺伝子は、ｐＳＴＶ−ｃｓ４ｃ及びｐＢＢＲ−ｂｄｈと共に、ＴＯＰ１０に導入して培養した（図１Ｂ）。図２及び図３が前記の説明に該当する。
（実施例４）大腸菌の培養及び１，４−ＢＤＯの生産
クローニングと遺伝子モジュールの発現によって１，４−ＢＤＯを生産するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）菌株ＴＯＰ１０を使用した。
（実施例４）大腸菌の培養及び１，４−ＢＤＯの生産
クローニングと遺伝子モジュールの発現によって１，４−ＢＤＯを生産するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）菌株ＴＯＰ１０を使用した。
三つのプラスミドを含む組み換え大腸菌は、セラムボトルを利用して、嫌気条件で３０℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。培地組成は、０．６重量％の炭酸カルシウムと、２重量％のグルコースを含むＬＢの１００ｍｌであり、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンをいずれも添加した。
窒素を注入して嫌気条件で培養条件を準備し、３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間培養した。培地組成は、２重量％のグルコースを含むＬＢ培地の１Ｌであり、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンをいずれも添加した。培地のｐＨは、５ＮのＮａＯＨで調節した。
前述した方法により、１，４−ＢＤＯの生合成に係る遺伝子をモジュール化したものを、大腸菌内に形質転換させると、組み換え大腸菌は、１，４−ＢＤＯを生産した。結果としては、４−ヒドロキシブチレートが先に蓄積されるため、１，４−ＢＤＯの生産は少なかった。したがって、１，４−ＢＤＯに至る代謝経路を作るため、４−ヒドロキシブチルアルデヒドが多く生産される方法について実験をデザインした。
（実施例５）１，４−ＢＤＯの分析
培地１００ｍｌのうち１ｍｌを取り出し、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、上清液を再び同じ条件で遠心分離した後、８００μｌを０．４５μｍのフィルタで濾過して、サンプルを用意した。そのうち、１０μｌのサンプルを、ＨＰＬＣ分析に使用した。ＨＰＬＣは、ＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００装置を使用した。４ｍＭのＨ2ＳＯ4溶液を移動相として使用し、ＢＩＯ−ＲＡＤ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラムを固定相として使用し、流速は０．７ｍｌ／ｍｉｎとした。カラムと検出器の温度は、いずれも５０℃であった。
（実施例５）１，４−ＢＤＯの分析
培地１００ｍｌのうち１ｍｌを取り出し、１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、上清液を再び同じ条件で遠心分離した後、８００μｌを０．４５μｍのフィルタで濾過して、サンプルを用意した。そのうち、１０μｌのサンプルを、ＨＰＬＣ分析に使用した。ＨＰＬＣは、ＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００装置を使用した。４ｍＭのＨ2ＳＯ4溶液を移動相として使用し、ＢＩＯ−ＲＡＤ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラムを固定相として使用し、流速は０．７ｍｌ／ｍｉｎとした。カラムと検出器の温度は、いずれも５０℃であった。
１，４−ＢＤＯの生産量を分析した結果、既存のｂｌｄを、ｃｓ４ｃ遺伝子及びｂｄｈ遺伝子と共に、ＴＯＰ１０内で発現させた時よりも、改良されたｂｌｄを導入して培養した時、さらに多くの量の１，４−ＢＤＯを確保できた。Ｂｌｄ−Ｍ２のサンプルは、他のサンプルの２倍以上である約０．０４ｇ／Ｌもの濃度の１，４−ＢＤＯを生産した（図４参照）。また、残りのＢｌｄ−Ｍ１、Ｂｌｄ−Ｍ３、Ｂｌｄ−Ｍ４及びＢｌｄ−Ｍ５のサンプルも、いずれもコントロール（Ｂｌｄ−ＷＴ）よりも高い１，４−ＢＤＯ生産性を表した（図４参照）。ｂｌｄ変異体の塩基配列を分析した結果、表３のように配列が変化したことが分かった。なお、図４におけるＣＳ４Ｃ＋ＡｄｈＥ２は、ＡｄｈＥがＢｌｄ活性およびＢｄｈ活性を有しているので、Ｂｄｈを有していない。したがって、ＣＳ４Ｃ＋ＡｄｈＥ２はポジティブコントロールとなる。
前記結果から、ｂｌｄの活性が良好であれば、４−ヒドロキシブチルアルデヒドが多く生成され、これは、シッフ試薬と結合して色が表れて、スクリーニングを行うのに有用に使われるということを確認できた。
（実施例６）最も効果的な突然変異の選別
前記表３に示したように、Ｂｌｄ−Ｍ１〜Ｂｌｄ−Ｍ５の突然変異体は、一つ以上、多いときは五つのアミノ酸の変異が起こったことが確認された。ここで、どの突然変異が最も効果的であるかを調べるために、Ｂｌｄ−Ｓ１〜Ｂｌｄ−Ｓ６（表２）の合計６個の突然変異体について、実施例４、５と同一な方法により１，４−ＢＤＯの生産量を確認した。その結果、図５に示したように、Ｂｌｄ−Ｓ２（Ｌ２７３Ｉ）突然変異体菌株が、最も高い１，４−ＢＤＯの生産量（０．０８ｇ／Ｌ）を表すことを確認した。他の突然変異体（Ｂｌｄ−Ｓ５及びＢｌｄ−Ｓ６）も、わずかに向上した。注目する点は、Ｌ２７３Ｉ突然変異を含むＢｌｄ−Ｓ２の場合、これまで性能が最も良好であると知られたａｄｈＥ２よりも、３倍以上効果が高いものと確認されたのである。
（実施例７）Butyraldehyde dehydrogenaseのホモロジーモデリング
突然変異が酵素の活性に影響を及ぼす原因を明らかにするためには、酵素の三次元立体構造を見る必要がある。しかし、butyraldehyde dehydrogenaseの立体構造は、まだ明らかになっていないので、ホモロジーモデリング技法を使用して、butyraldehyde dehydrogenaseの立体構造を新たに生成した。まず、ＢＬＡＳＴサーチを通じて、butyraldehyde dehydrogenaseと類似した配列の蛋白質構造を探索し、その結果、二つの蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ＩＤ：３Ｋ９Ｄ，３ＭＹ７）が、最も類似度が高かった。当該二つの蛋白質の配列をテンプレートとし、butyraldehyde dehydrogenase の配列をこのテンプレートに整列させた（図６）。最後に、テンプレートに基づいたbutyraldehyde dehydrogenaseの立体構造を生成した（図７）。このモデリングは、いずれもＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ３．１ソフトウェアを利用した。
前記表３に示したように、Ｂｌｄ−Ｍ１〜Ｂｌｄ−Ｍ５の突然変異体は、一つ以上、多いときは五つのアミノ酸の変異が起こったことが確認された。ここで、どの突然変異が最も効果的であるかを調べるために、Ｂｌｄ−Ｓ１〜Ｂｌｄ−Ｓ６（表２）の合計６個の突然変異体について、実施例４、５と同一な方法により１，４−ＢＤＯの生産量を確認した。その結果、図５に示したように、Ｂｌｄ−Ｓ２（Ｌ２７３Ｉ）突然変異体菌株が、最も高い１，４−ＢＤＯの生産量（０．０８ｇ／Ｌ）を表すことを確認した。他の突然変異体（Ｂｌｄ−Ｓ５及びＢｌｄ−Ｓ６）も、わずかに向上した。注目する点は、Ｌ２７３Ｉ突然変異を含むＢｌｄ−Ｓ２の場合、これまで性能が最も良好であると知られたａｄｈＥ２よりも、３倍以上効果が高いものと確認されたのである。
（実施例７）Butyraldehyde dehydrogenaseのホモロジーモデリング
突然変異が酵素の活性に影響を及ぼす原因を明らかにするためには、酵素の三次元立体構造を見る必要がある。しかし、butyraldehyde dehydrogenaseの立体構造は、まだ明らかになっていないので、ホモロジーモデリング技法を使用して、butyraldehyde dehydrogenaseの立体構造を新たに生成した。まず、ＢＬＡＳＴサーチを通じて、butyraldehyde dehydrogenaseと類似した配列の蛋白質構造を探索し、その結果、二つの蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ＩＤ：３Ｋ９Ｄ，３ＭＹ７）が、最も類似度が高かった。当該二つの蛋白質の配列をテンプレートとし、butyraldehyde dehydrogenase の配列をこのテンプレートに整列させた（図６）。最後に、テンプレートに基づいたbutyraldehyde dehydrogenaseの立体構造を生成した（図７）。このモデリングは、いずれもＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ３．１ソフトウェアを利用した。
アルデヒドデヒドロゲナーゼの反応メカニズムによれば、基質と反応するアミノ酸が存在するが、これは、システインアミノ酸として多様なアルデヒドデヒドロゲナーゼによく保存されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（２００７）３６６，４８１−４９３；Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）４，３１７−３２６）。配列整列結果を通じて、butyraldehyde dehydrogenaseでも、当該システインアミノ酸が保存されていることを確認でき、これは、２７５番目のアミノ酸（Ｃｙｓ２７５）である（図６）。butyraldehyde dehydrogenaseの活性を改善させた突然変異に対して、立体構造に基づいて分析する時、Ｃｙｓ２７５と隣接するか、または補酵素結合位置と近い位置で突然変異が起これば、酵素の活性を増大させるということが分かる（図７）。図７Ａは、ホモロジーモデリングにより生成されたbutyraldehyde dehydrogenaseの立体構造である。Ｃｙｓ２７５とＬｅｕ２７３のアミノ酸は、黄色棒モデルで表し、補酵素は、ピンク棒モデルで表した。図７Ｂは、触媒部位のクローズアップビューであり、前記二つのアミノ酸の位置がよく表れるように、補酵素は表示していない。
前記結果から、今後Ｃｙｓ２７５近辺のアミノ酸を突然変異させることによって、butyraldehyde dehydrogenaseをさらに改善させる可能性を確認できた。すなわち、基質と反応する触媒部位周辺のアミノ酸の変形が、当該酵素の活性の向上に寄与するということが分かった。
本発明の新たな酵素を利用する場合、１，４−ＢＤＯの生産性が増加した。したがって、このように、butyraldehyde dehydrogenase酵素の活性を進化分子工学により強化する場合、産業的に非常に有用に活用できる。
Claims (34)
- ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡを、４−ヒドロキシブチルアルデヒドに転換する触媒活性を有することを特徴とするブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（butyraldehyde dehydrogenase）またはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎ、３６１番目のＡｒｇ、４６７番目のＡｌａ、３７１番目のＭｅｔ、１７６番目のＡｌａ、２７３番目のＬｅｕ及び２７９番目のＬｙｓからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎがＴｈｒに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、３７１番目のＭｅｔがＡｒｇに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、１７６番目のＡｌａがＴｈｒに置換され、２７３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換され、２７９番目のＬｙｓがＡｒｇに置換され、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換され、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、１７６番目のＡｌａがＴｈｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、２７３番目のＬｅｕがＩｌｅに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、２７９番目のＬｙｓがＡｒｇに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、４６７番目のＡｌａがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、４０９番目のＡｓｎがＴｈｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、３６１番目のＡｒｇがＳｅｒに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体の活性部位は、配列番号１で、４３番目に位置したＴｈｒ、１４４番目に位置したＡｓｎ、２４１番目に位置したＡｌａ、２４２番目に位置したＧｌｙ、２４３番目に位置したＡｌａ、２４４番目に位置したＧｌｙ、２４６番目に位置したＰｒｏ、２７３番目に位置したＬｅｕ、２７４番目に位置したＰｒｏ、２７６番目に位置したＩｌｅ、２７７番目に位置したＡｌａ、２７９番目に位置したＬｙｓ、３６８番目に位置したＧｌｕ、３９８番目に位置したＨｉｓ、４３２番目に位置したＶａｌ、及び４４１番目に位置したＴｈｒからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体の活性部位は、４３番目に位置したＴｈｒがＡｓｐに、１４４番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、２４１番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４２番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４３番目に位置したＡｌａがＧｌｙに、２４４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４６番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２７３番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２７４番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２７６番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２７７番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２７９番目に位置したＬｙｓがＡｒｇに、３６８番目に位置したＧｌｕがＧｌｎに、３９８番目に位置したＨｉｓがＬｙｓに、４３２番目に位置したＶａｌがＬｅｕに、４４１番目に位置したＴｈｒがＡｓｐに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１５に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、９１番目に位置したＭｅｔ、１３９番目に位置したＩｌｅ、１４０番目に位置したＴｈｒ、１４１番目に位置したＰｒｏ、１４２番目に位置したＳｅｒ、１４３番目に位置したＴｈｒ、１６６番目に位置したＡｓｎ、１６７番目に位置したＧｌｙ、１６８番目に位置したＨｉｓ、１６９番目に位置したＰｒｏ、１７０番目に位置したＧｌｙ、２０１番目に位置したＡｓｎ、２０２番目に位置したＰｒｏ、２０３番目に位置したＴｈｒ、２０４番目に位置したＭｅｔ、２０７番目に位置したＬｅｕ、２０８番目に位置したＡｓｐ、２１０番目に位置したＩｌｅ、２１１番目に位置したＩｌｅ、２１２番目に位置したＬｙｓ、２２２番目に位置したＴｈｒ、２２３番目に位置したＧｌｙ、２２４番目に位置したＧｌｙ、２２５番目に位置したＰｒｏ、２２７番目に位置したＭｅｔ、２３０番目に位置したＴｈｒ、２３１番目に位置したＬｅｕ、２４１番目に位置したＡｌａ、２４２番目に位置したＧｌｙ、２４３番目に位置したＡｌａ、２４４番目に位置したＧｌｙ、２７３番目に位置したＬｅｕ、２７４番目に位置したＰｒｏ、２７５番目に位置したＣｙｓ、３２６番目に位置したＳｅｒ、３２７番目に位置したＩｌｅ、３２８番目に位置したＡｓｎ、３２９番目に位置したＬｙｓ、３３２番目に位置したＶａｌ、３６７番目に位置したＴｈｒ、３６８番目に位置したＧｌｕ、３６９番目に位置したＬｅｕ、３７０番目に位置したＭｅｔ、及び３９６番目に位置したＡｒｇからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１で、９１番目に位置したＭｅｔがＡｓｐに、１３９番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、１４０番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、１４１番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、１４２番目に位置したＳｅｒがＧｌｙに、１４３番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、１６６番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、１６７番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、１６８番目に位置したＨｉｓがＬｙｓに、１６９番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、１７０番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２０１番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、２０２番目に位置したＰｒｏがＴｙｒに、２０３番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２０４番目に位置したＭｅｔがＡｓｐに、２０７番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２０８番目に位置したＡｓｐがＡｓｎに、２１０番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２１１番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、２１２番目に位置したＬｙｓがＴｈｒに、２２２番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２２３番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２２４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２２５番目に位置したＰｒｏがＨｉｓに、２２７番目に位置したＭｅｔがＬｙｓに、２３０番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、２３１番目に位置したＬｅｕがＶａｌに、２４１番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４２番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２４３番目に位置したＡｌａがＶａｌに、２４４番目に位置したＧｌｙがＳｅｒに、２７３番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、２７４番目に位置したＰｒｏがＨｉｓに、２７５番目に位置したＣｙｓがＭｅｔに、３２６番目に位置したＳｅｒがＧｌｙに、３２７番目に位置したＩｌｅがＬｅｕに、３２８番目に位置したＡｓｎがＡｓｐに、３２９番目に位置したＬｙｓがＴｈｒに、３３２番目に位置したＶａｌがＬｅｕに、３６７番目に位置したＴｈｒがＬｙｓに、３６８番目に位置したＧｌｕがＧｌｎに、３６９番目に位置したＬｅｕがＩｌｅに、３７０番目に位置したＭｅｔがＬｙｓに、３９６番目に位置したＡｒｇがＬｙｓに置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体。
- 請求項１〜１９のうちいずれか１項に記載のブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体をコードすることを特徴とするｂｌｄ遺伝子。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから由来したことを特徴とする請求項２０に記載のｂｌｄ遺伝子。
- 請求項２０または２１に記載のｂｌｄ遺伝子が導入された１，４−ブタンジオールを生産することができることを特徴とする微生物。
- 前記微生物は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドを、１，４−ブタンジオールに転換する触媒活性を有するブタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子がさらに導入されたことを特徴とする請求項２２に記載の微生物。
- 前記ｂｄｈ遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍから由来したことを特徴とする請求項２３に記載の微生物。
- 前記菌株は、コハク酸をスクシニルＣｏＡに転換する活性を有するｓｕｃＣＤをコードする遺伝子、スクシニルＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに転換する活性を有するｓｕｃＤをコードする遺伝子、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに転換する活性を有する４ｈｂｄをコードする遺伝子、及び４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチルＣｏＡに転換する活性を有するｃａｔ２をコードする遺伝子、をさらに含むことを特徴とする請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の微生物。
- 前記微生物は、組み換え大腸菌であることを特徴とする請求項２２〜２５のうちいずれか１項に記載の微生物。
- ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡと、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体とを接触させるステップを含むことを特徴とする４−ヒドロキシブチルアルデヒドを生産する方法。
- 前記ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
- ４−ヒドロキシブチルアルデヒドとブタノールデヒドロゲナーゼとを接触させるステップを含むことを特徴とする１，４−ブタンジオールを生産する方法。
- ４−ヒドロキシブチリルＣｏＡと、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼまたはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ変異体とを接触させるステップと、
前記で得られた反応物に、ブタノールデヒドロゲナーゼを接触させるステップと、を含むことを特徴とする１，４−ブタンジオールを生産する方法。 - ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子またはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子変異体、及びブタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を微生物に導入して、微生物を提供するステップと、
前記微生物を培養するステップと、
前記微生物から１，４−ブタンジオールを分離するステップと、を含むことを特徴とする１，４−ブタンジオールを生産する方法。 - 前記微生物を提供するステップにおいて、コハク酸をスクシニルＣｏＡに転換する活性を有するｓｕｃＣＤをコードする遺伝子、スクシニルＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに転換する活性を有するｓｕｃＤをコードする遺伝子、コハク酸セミアルデヒドを４−ヒドロキシブチレートに転換する活性を有する４ｈｂｄをコードする遺伝子、及び４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチルＣｏＡに転換する活性を有するｃａｔ２をコードする遺伝子、がさらに導入されたことを特徴とする請求項３１に記載の１，４−ブタンジオールを生産する方法。
- ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子またはブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子変異体を微生物に導入して、微生物を提供するステップと、
前記培養物に、シッフ試薬を接触させるステップと、
吸光度を測定するステップと、を含むことを特徴とする１，４−ブタンジオールの生産量を確認する方法。 - 前記１，４−ブタンジオールの生産量の確認は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドの生産量の測定を通じて行われることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
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