CN106282135A - 一种奎宁酮还原酶RrQR的制备方法及其在制备(R)-3-奎宁醇中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种奎宁酮还原酶RrQR的制备方法及其应用。该奎宁酮还原酶RrQR的下述用途属于本发明的保护范围：D1)RrQR在作为奎宁酮还原酶中的应用；D2)所述RrQR相关的生物材料在制备奎宁酮还原酶中的应用；D3)RrQR在合成R-3-奎宁醇中的应用；D4)所述RrQR相关的生物材料在合成R-3-奎宁醇中的应用。实验证明，本发明提供的奎宁酮还原酶RrQR具有较高的比活力和热稳定性，可将3-奎宁酮不对称还原生成光学活性的R-3-奎宁醇。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种奎宁酮还原酶RrQR的制备方法及其应用。
背景技术
R-3-奎宁醇是很多抗胆碱药物的重要中间体，例如索利那辛、瑞伐托酯等都是含有R-3-奎宁醇结构的最新抗胆碱药物，对于治疗尿失禁和慢性阻塞性肺病(COPD)有很好的疗效。R-3-奎宁醇的合成有化学法和生物法两种。化学法合成R-3-奎宁醇，在产物里，会残留金属催化剂，与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、立体选择性强多种优点，因此开发生物法来合成R-3-奎宁醇是工业化生产的方向。
采用奎宁酮还原酶来生产(R)-3-奎宁醇是研究的热点。催化3-奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇示意图见图1。宋水山等从土壤中筛选到粘红酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)在100mL反应体系中可将奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇,转化率90％,ee值为88％；朱敦明从土壤中筛选到两株微生物：诺卡氏(Nocardia sp.)和红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)分别将奎宁酮生成R-奎宁醇和(S)-奎宁醇；日本Sakayu Shimizu课题组利用从深红酵母(Rhodotorula rubra)中克隆得到的还原酶催化3-奎宁酮不对称还原得到(R)-3奎宁醇，产物浓度达到618mM,且对映体过量值(ee)＞99.9％,但此酶的Km值高达145mM，这一高Km值表明该酶对底物的亲和力较弱，底物浓度较低时反应速率较慢，底物浓度为120mM时，反应速率仅为最大速率的46％，导致反应时间的延长(Appl.Micbrobiol.Biotechnol.2009,83,617-626)；日本Nobuya Itoh等人筛选到一株淡黄微杆菌(Microbacterium luteolum)JCM9174，该菌能够还原3-奎宁酮生成(R)-奎宁醇，并从中克隆出两个NADH依赖性还原酶QNR和BacC经纯化后，测得其比活力分别为8.4U/mg和0.5U/mg(Appl.Environ.Microbiol.2013,79,1378-84)。徐建和等从放射性土壤杆菌中筛选奎宁酮还原酶，可以利用奎宁酮盐酸盐将其还原生成(R)-3-奎宁醇。将1M的奎宁酮在1.5小时后，将其完全转化成R)-3-奎宁醇，对映体过量值(ee)大于99％(专利申请号：201310422722.1)；徐建和等筛选出的奎宁酮还原酶比活力198U/mg，但是其热稳定性不够好(ORGANIC LETTERS 2013Vol.15,No.194917–4919)，因此，寻找比活力高、热稳定性好，高立体选择性的奎宁酮还原酶是满足还原酶法生产R-3-奎宁醇是迫切需要的技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是获得高活性和热稳定性以及高的立体选择性的奎宁酮还原酶。本发明所要解决的另一个技术问题是将奎宁酮还原酶与葡萄糖脱氢酶共表达，构建全细胞催化剂，用于R-3-奎宁醇的生物合成。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了如下D1-D4中任一种的应用：
D1)RrQR在作为奎宁酮还原酶中的应用；
D2)所述RrQR相关的生物材料在制备奎宁酮还原酶中的应用；
D3)RrQR在合成R-3-奎宁醇中的应用；
D4)所述RrQR相关的生物材料在合成R-3-奎宁醇中的应用；
所述RrQR是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有奎宁酮还原酶活性的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2由260个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
所述RrQR相关的生物材料，为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码所述RrQR的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
上述应用中，A1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的RrQR基因：
a1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述RrQR的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述RrQR的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID No.1由783个核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
上述应用中，A2)所述的表达盒和/或A3)所述重组载体可含有如下c1)或c2)或c3)所示的基因：
c1)其编码序列是SEQ ID No.5的cDNA分子或DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码葡萄糖脱氢酶(GDH)的cDNA分子或基因组DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码葡萄糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码RrQR的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的RrQR的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码RrQR且具有RrQR功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码RrQR的核酸分子的表达盒(RrQR基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达RrQR的DNA。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述的微生物可为细菌、酵母、藻或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为埃希氏菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)。所述大肠杆菌(Escherichia coli)可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种R-3-奎宁醇的制备方法。
本发明所提供的一种R-3-奎宁醇的制备方法，包括用葡萄糖脱氢酶和所述RrQR将3-奎宁酮转化为R-3-奎宁醇。
上述R-3-奎宁醇的制备方法中，用葡萄糖脱氢酶和所述RrQR将3-奎宁酮转化为R-3-奎宁醇可为用表达葡萄糖脱氢酶和所述RrQR的重组细胞(简称全细胞催化剂)将3-奎宁酮转化为R-3-奎宁醇。
上述R-3-奎宁醇的制备方法中，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列可为SEQ ID No.6所示。
所述表达葡萄糖脱氢酶和所述RrQR的重组细胞含有SEQ ID No.5所示的所述葡萄糖脱氢酶的编码基因(GDH基因)。
上述R-3-奎宁醇的制备方法中，所述表达葡萄糖脱氢酶和所述RrQR的重组细胞具体可为表达所述葡萄糖脱氢酶和所述RrQR的重组微生物细胞。
上述R-3-奎宁醇的制备方法中，所述的微生物可为细菌、酵母、藻或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌，可为埃希氏菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)。所述大肠杆菌(Escherichia coli)可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
上述R-3-奎宁醇的制备方法中，所述表达葡萄糖脱氢酶和所述RrQR的重组细胞按照包括如下步骤的方法构建：将含有所述RrQR基因和所述GDH基因的共表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到所述表达葡萄糖脱氢酶和所述RrQR的重组细胞。
上述R-3-奎宁醇的制备方法中，用葡萄糖脱氢酶和所述RrQR将3-奎宁酮转化为R-3-奎宁醇可为向溶剂为pH7.0200mM磷酸缓冲液中加入表达葡萄糖脱氢酶和所述RrQR的重组细胞、3-奎宁酮盐酸盐、葡萄糖和NAD+得到反应体系，30℃保温反应。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述RrQR的制备方法。
本发明所提供的所述RrQR的制备方法，可包括将所述RrQR的编码基因在生物细胞中进行表达得到具有奎宁酮还原酶活性的蛋白质。
上述所述RrQR的制备方法中，所述RrQR的编码基因可为如下⑴或⑵或⑶所示的核酸分子：
⑴核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
⑵与⑴限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ IDNo.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
⑶在严格条件下与⑴限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，SEQ ID No.1由783个核苷酸组成，SEQ ID No.1的核苷酸编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述所述蛋白质RrQR的制备方法中，所述生物细胞可为微生物细胞。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为埃希氏菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)。所述大肠杆菌(Escherichiacoli)可为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。
本发明还提供了一种RrQR基因。
本发明所提供的RrQR基因，为如下⑴或⑵或⑶所示的基因：
⑴核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
⑵与⑴限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ IDNo.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
⑶在严格条件下与⑴限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，SEQ ID No.1由783个核苷酸组成，SEQ ID No.1的核苷酸编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述RrQR基因相关的生物材料。
本发明所提供的与RrQR基因相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码所述RrQR基因的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述所述与RrQR基因相关的生物材料中，B2)所述的表达盒和/或B3)所述重组载体可含有如下d1)或d2)或d3)所示的基因：
d1)其编码序列是SEQ ID No.5的cDNA分子或DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码葡萄糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码葡萄糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA分子。
实验证明，本申请提供的奎宁酮还原酶RrQR的比活力为227.49U/mg，而在同等条件下奎宁酮还原酶ArQR的比活力为200U/mg。对奎宁酮还原酶RrQR热稳定性的进行分析表明，奎宁酮还原酶RrQR具有很高的热稳定性，30℃孵育8小时，奎宁酮还原酶RrQR的相对活力依然保持在70.58％，而奎宁酮还原酶ArQR的相对活力只有25.37％。同时利用本申请提供的奎宁酮还原酶RrQR可将3-奎宁酮不对称还原生成光学活性的R-3-奎宁醇，在4.5小时内，可以将2M的底物完全转化，是目前报道的最高水平。结果表明，利用本申请提供的奎宁酮还原酶RrQR不对称还原3-奎宁酮所得R-3-奎宁醇的转化率大于99％,产物的ee值大于99.0％。
附图说明
图1为奎宁酮还原酶催化3-奎宁酮生成R-3-奎宁醇示意图。
图2为重组表达质粒pBAD/RrQR的图谱。
图3RrQR蛋白的表达和纯化图谱。
M为蛋白质分子量Marker；泳道1为重组菌BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌体裂解上清液；泳道2为RrQR纯化蛋白。
图4ArQR蛋白的表达和纯化图谱。
M为蛋白质分子量Marker；泳道1为重组菌BL21(DE3)/pBAD/ArQR菌体裂解上清液；泳道2为ArQR纯化蛋白。
图5为重组奎宁酮还原酶RrQR和ArQR的热稳定性的分析比较结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌BL21(DE3)为Invitrogen公司产品，产品目录号为C6010-03。
下述实施例中的pBAD-hisB为Invitrogen公司产品。产品目录号为VT1275。
实施例1、重组奎宁酮还原酶RrQR催化3-奎宁酮的不对称还原生产R-3-奎宁醇
本实施例以徐建和公开的重组奎宁酮还原酶ArQR作为对照，具体实验方法如下：
一、重组奎宁酮还原酶表达载体的构建
1、RrQR基因表达质粒的构建
人工合成SEQ ID No.1所示的DNA分子(RrQR基因)，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质RrQR。
将质粒pBAD-hisB的XhoⅠ识别序列和PstⅠ识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子，保持pBAD-hisB的其它序列不变得到RrQR基因表达载体，其名称为pBAD/RrQR。pBAD/RrQR表达SEQ ID No.2所示的蛋白质RrQR。重组表达质粒pBAD/RrQR的构建示意图见图2。
2、ArQR基因表达质粒的构建
人工合成SEQ ID No.3所示的DNA分子(ArQR基因)，编码SEQ ID No.4所示的蛋白质ArQR。
将质粒pBAD-hisB的XhoⅠ识别序列和PstⅠ识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子，保持pBAD-hisB的其它序列不变得到ArQR基因表达载体，其名称为pBAD/ArQR。pBAD/ArQR表达SEQ ID No.4所示的蛋白质ArQR。
二、重组奎宁酮还原酶的表达和纯化
1、重组奎宁酮还原酶RrQR的表达和纯化
1.1、将重组表达质粒pBAD/RrQR用氯化钙法导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有pBAD/RrQR的重组菌大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pBAD/RrQR。将BL21(DE3)/pBAD/RrQR接种于LB液体培养基，37℃振荡培养过夜得到BL21(DE3)/pBAD/RrQR培养菌液1，然后将BL21(DE3)/pBAD/RrQR培养菌液1以1:100(体积比)接种到LB液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)中，振荡培养至OD600值0.6-0.8得到BL21(DE3)/pBAD/RrQR培养菌液2。向BL21(DE3)/pBAD/RrQR培养菌液2中加入阿拉伯糖，使阿拉伯糖在体系中的浓度为0.2％(质量百分比)，30℃，诱导14h，收集菌体PBS重悬后超声破碎，得到BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌体破碎液。将该菌体破碎液12000rpm离心10min，得到的BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌体裂解上清液和BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌体裂解沉淀进行SDS-PAGE。
1.2、按照上述方法，将重组表达质粒pBAD/RrQR替换为质粒pBAD-hisB，其它步骤均相同，将得到BL21(DE3)/pBAD菌体裂解上清液和BL21(DE3)/pBAD菌体裂解沉淀进行SDS-PAGE。
1.3、将步骤1.1中的BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌体裂解上清液和HisTrap FF crude预装柱(GE公司产品，产品目录号为11-0004-58)结合，然后分别用含有20mM咪唑的PBS洗脱液和含有500mM咪唑PBS洗脱液洗脱，将500mM咪唑PBS洗脱液洗脱的蛋白为获得纯化蛋白RrQR。将纯化蛋白RrQR进行SDS-PAGE。
结果表明，蛋白质RrQR存在于BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌体裂解上清液(图3)和BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌体裂解沉淀中，BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌体裂解上清液中的蛋白质RrQR可被镍柱纯化，分子量大小为29kDa。BL21(DE3)/pBAD菌体裂解上清液和BL21(DE3)/pBAD菌体裂解沉淀中均无蛋白质RrQR的表达。
利用改良型Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司产品，产品目录号SK3041),测得重组奎宁酮还原酶的蛋白质RrQR浓度为5.1mg/mL。
2、重组奎宁酮还原酶ArQR的表达和纯化
按照上述步骤1，将重组表达质粒pBAD/RrQR替换为重组表达质粒pBAD/ArQR，进一步用氯化钙法导入大肠杆菌BL21(DE3)、阿拉伯糖诱导、纯化得到重组奎宁酮还原酶ArQR酶液，测得重组奎宁酮还原酶ArQR酶液中的蛋白质ArQR浓度为11mg/mL。结果见图4。
三、奎宁酮还原酶比活力的测定
1、奎宁酮还原酶活力的测定方法如下：制备1ml反应体系1，该反应体系1的pH7.0，溶剂为0.1mmol/L磷酸缓冲液，溶质为3-奎宁酮、NAD+和步骤二制备的重组奎宁酮还原酶酶液。1ml反应体系1中，3-奎宁酮的浓度为2μmol/L，NADH的浓度为0.1μmol/L，步骤二制备的重组奎宁酮还原酶稀释100倍，上样10μL。测定步骤如下：首先向pH7.0的0.1mmol/L磷酸缓冲液中加入3-奎宁酮和NADH，30℃保温2分钟后加入步骤二制备的重组奎宁酮还原酶酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。利用分光光度计，通过检测340nm处吸光值的变化来测定奎宁酮还原酶的活力。酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)。式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位ml；6220为NADH的摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。
每单位奎宁酮还原酶活力的定义为在上述条件下，每分钟催化生成1μM NADH所需的酶量。
2、重组奎宁酮还原酶RrQR和ArQR的比活力
酶的比活力的计算公式为：酶的比活力(U/mg)＝酶活力/蛋白浓度
根据上述步骤1中奎宁酮还原酶活力的测定方法，测得纯化蛋白RrQR的比活力为227.49U/mg，纯化蛋白ArQR的比活力为200U/mg。
四、重组奎宁酮还原酶RrQR热稳定性的分析
1、重组奎宁酮还原酶RrQR的热稳定性
1.1、将步骤二制备的重组奎宁酮还原酶RrQR酶液在30℃分别孵育1小时、2小时、4小时、6小时和8小时，分别得到热处理1小时的酶液、热处理2小时的酶液、热处理4小时的酶液、热处理6小时的酶液和热处理8小时的酶液。
1.2、按照步骤三中奎宁酮还原酶活力的测定方法，将步骤三中的步骤二制备的重组奎宁酮还原酶酶液分别替换为热处理1小时的酶液，得到热处理1小时的奎宁酮还原酶RrQR活力。按照下述公式计算得到热处理1小时奎宁酮还原酶RrQR的相对活力。
奎宁酮还原酶RrQR的相对活力＝(热处理1小时的奎宁酮还原酶RrQR活力/酶液的奎宁酮还原酶RrQR活力)*100％
按照上述方法，分别将热处理1小时的酶液替换为热处理2小时的酶液、热处理4小时的酶液、热处理6小时的酶液和热处理8小时的酶液，分别得到热处理2小时奎宁酮还原酶RrQR的相对活力、热处理4小时奎宁酮还原酶RrQR的相对活力、热处理6小时奎宁酮还原酶RrQR的相对活力和热处理8小时奎宁酮还原酶RrQR的相对活力。
2、重组奎宁酮还原酶ArQR的热稳定性
按照上述步骤将步骤二制备的重组奎宁酮还原酶RrQR酶液替换为步骤二制备的重组奎宁酮还原酶ArQR酶液，其余步骤均相同，得到热处理1小时奎宁酮还原酶ArQR的相对活力、热处理2小时奎宁酮还原酶ArQR的相对活力、热处理4小时奎宁酮还原酶ArQR的相对活力、热处理6小时奎宁酮还原酶ArQR的相对活力和热处理8小时奎宁酮还原酶ArQR的相对活力。
实验结果见图5，重组奎宁酮还原酶RrQR和重组奎宁酮还原酶ArQR孵育8小时，重组奎宁酮还原酶RrQR的相对活力依然保持在70.58％，而重组奎宁酮还原酶ArQR的相对活力只有25.37％。结果表明，重组奎宁酮还原酶RrQR具有较高的热稳定性。
五、全细胞催化剂的获得
1、共表达载体质粒的构建
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)DSM No.319购自德国微生物菌种保藏中心。用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)DSM No.319的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，以GGCGTTCGTATGGATTAACTGCAAAAGGAGATATAATGATGTATACAGATTTAAAAGATAAAG和TGGCTGCCGCGCGGCACCAGCTGCAGTTAGCCTCTTCCTGCTTGGAAAG为引物进行PCR扩增得到PCR产物。所述PCR产物中包含SEQ ID No.5所示的DNA分子。
将载体pBAD/RrQR的用PstⅠ单酶切，然后利用Gibson组装克隆试剂盒(NEB公司产品，产品目录号为E2611L)组装上述PCR产物，保持载体pBAD/RrQR的其它序列不变得到含有GDH基因和RrQR基因的的共表达载体，其名称为pBAD/RrQR/GDH。pBAD/RrQR/GDH表达SEQ ID No.2所示的蛋白质RrQR和SEQ ID No.6所示的蛋白质GDH。
2、全细胞催化剂的获得
将重组表达质粒pBAD/RrQR/GDH用氯化钙法导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有pBAD/RrQR/GDH的重组菌大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pBAD/RrQR/GDH。
将BL21(DE3)/pBAD/RrQR/GDH接种到LB液体培养基(含50μg/mL氨苄青霉素)中，振荡培养至OD600值0.6-0.8，加入阿拉伯糖，使阿拉伯糖在体系中的浓度为0.2％(质量百分比)，30℃，诱导培养14h后收集菌体，收集到的菌体即为全细胞催化剂。
六、全细胞催化剂还原3-奎宁酮催化合成(R)-3-奎宁醇
制备65ml反应体系，该反应体系中溶剂为pH7.0200mM磷酸缓冲液，溶质为3-奎宁酮盐酸盐、葡萄糖、NAD+和步骤五制备全细胞催化剂。65ml反应体系中，3-奎宁酮盐酸盐的浓度为2M，葡萄糖的浓度为2M，NAD+的浓度为0.1mmol/L，全细胞催化剂的浓度为10g(湿重)/L。在30℃，110rpm，振荡反应4.5个小时。反应过程中，用2M NaOH调节反应体系中pH值，使pH值保持在7.0。反应结束后用2M NaOH调至pH 13.0，加入0.4ml三氯甲烷进行萃取，萃取两次，萃取液合并后加入无水硫酸钠干燥过夜，然后分析测定底物转化率和还原产物的ee值。
产物ee值的具体分析条件如下：
使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-chirasil-DEX CB(25m*0.25mm*0.25μm)(Agilent公司产品，产品目录号为CP7502)，以氮气为载气，进样口温度220℃，检测器温度220℃。
实验结果见表1。结果表明，测得用RrQR以上述条件下不对称还原3-奎宁酮所得R-3-奎宁醇的转化率大于99％,产物的ee值大于99.0％。检测标准品，S-3-奎宁醇的保留时间为32.78，R-3-奎宁醇的保留时间为33.45.我们所得产物全部为R型。
表1.RrQR催化3-奎宁酮不对称还原的结果
Claims (10)
1.D1-D4中任一种的应用：
D1)RrQR在作为奎宁酮还原酶中的应用；
D2)所述RrQR相关的生物材料在制备奎宁酮还原酶中的应用；
D3)RrQR在合成R-3-奎宁醇中的应用；
D4)所述RrQR相关的生物材料在合成R-3-奎宁醇中的应用；
所述RrQR是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有奎宁酮还原酶活性的蛋白质；
所述RrQR相关的生物材料，为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码所述RrQR的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：
a1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：A2)所述表达盒和/或A3)所述重组载体含有如下b1)或b2)或b3)所示的基因：
b1)其编码序列是SEQ ID No.5的cDNA分子或DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码葡萄糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码葡萄糖脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.R-3-奎宁醇的制备方法，包括用葡萄糖脱氢酶和权利要求1所述RrQR将3-奎宁酮转化为R-3-奎宁醇。
5.权利要求1所述RrQR的制备方法，包括将在生物细胞中表达权利要求1所述RrQR的编码基因，得到所述RrQR。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述RrQR的编码基因为如下⑴或⑵或⑶所示的核酸分子：
⑴核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
⑵与⑴限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
⑶在严格条件下与⑴限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述微生物为酵母、细菌、藻或真菌。
9.RrQR基因；所述RrQR基因为如下⑴或⑵或⑶所示的基因：
⑴核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
⑵与⑴限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
⑶在严格条件下与⑴限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
10.与权利要求9所述RrQR基因相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码权利要求9所述RrQR基因的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
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