KR101222126B1 - 활성이 향상된 티올레이즈 및 이를 이용한 바이오부탄올의 제조 방법 - Google Patents
활성이 향상된 티올레이즈 및 이를 이용한 바이오부탄올의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
활성이 향상된 티올라아제의 변이 단백질; 상기 티올라아제의 변이 단백질를 코딩하는 유전자; 상기 티올라아제의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체; 및 활성이 우수한 티올라아제, 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 바이오부탄올 제조용 조성물 및 바이오부탄올 제조 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 활성이 향상된 티올라아제의 변이 단백질, 상기 티올라아제의 변이 단백질를 코딩하는 유전자, 상기 티올라아제의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체, 및 활성이 우수한 티올라아제, 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 바이오부탄올 제조용 조성물 및 바이오부탄올 제조 방법에 관한 것이다.
화석연료에 대한 의존도의 증가는 지구온난화, 유가급등 등의 여러 문제를 야기하고 있으며, 이런 문제들을 해결하기 위하여 국제적으로 대체에너지 개발에 많은 노력을 하고 있다. 바이오에너지는 충분한 에너지원료와 유일한 수송용 대체에너지원이라는 장점을 가지고 있기 때문에 많은 연구가 진행되고 있다. 현재까지 대부분의 바이오에너지 연구는 바이오에탄올 생산에 집중되어 왔지만 최근에는 바이오에탄올 보다 우수한 연료인 바이오부탄올 생산연구가 활발하게 진행되고 있다. 바이오부탄올은 에너지 함유량이 높고, 수송 및 저장이 용이하며, 직접적으로 수송용 연료로 사용될 수 있다는 장점을 가지고 있다.
바이오부탄올은 혐기성균인 Clostridium acetobutylicum이 가장 효율적으로 합성하는 것으로 알려져 있다. 바이오부탄올은 acetyl-CoA에서부터 6단계의 복잡한 과정을 거쳐 합성되며 각각의 과정은 각기 다른 단백질에 의해 반응이 일어난다. 하지만 합성과정에 관여하는 효소들의 단백질구조분석연구는 아직 이루어지지 않고 있으며, 이로 인하여 바이오부탄올 합성의 분자수준에서의 규명은 아직 이루어지지 않고 있다.
따라서 바이오부탄올 생산에 관련한 단백질들의 구조분석을 통한 분자수준에서의 기작규명과 단백질구조정보를 기반한 개량단백질의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 바이오부탄올 생산에 관련한 단백질들의 구조분석을 통한 분자수준에서의 기작규명과 단백질구조정보를 기반한 개량단백질의 개발에 성공하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 일례는 활성이 향상된 티올라아제(thiolase, acetyl-CoA C-acetyltransferase, THL)의 변이 단백질을 제공한다.
또 다른 예는 상기 티올라아제의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또 다른 예는 상기 티올라아제의 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체를 제공한다.
또 다른 예는 상기 티올라아제의 변이 단백질, 또는 형질전환체를 이용하여 바이오부탄올을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 산화환원 전환조절 (redox-switch modulation)을 통한 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제의 활성 조절 방법을 제공한다.
또 다른 예는 대장균의 티올레이즈를 이용하여 바이오부탄올을 제조하는 방법을 제공한다.
우선, 본 발명자들은 바이오부탄올 생합성에 관련한 아세틸-CoA C-아세틸트랜스퍼레이즈 (티올라아제 (thiolase), THL) 단백질의 대량생산, 결정화를 통하여 입체구조를 규명하였으며, 단백질입체구조 정보를 통하여 THL 단백질의 조절기작을 분자수준에서 규명하였다. 여기에 유전자변이기술을 도입하여 THL 단백질의 조절기작을 변형함으로써 기존의 THL 보다 활성이 2.5배 향상되는 변이단백질을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일례는 활성이 증진된 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제 (CaTHL)의 변이 단백질을 제공한다. 상기 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제는 SEQ ID NO: 1(Accession No. NP_349476, 392aa)의 아미노산 서열을 갖는 것으로, 본 발명에 따른 티올라아제의 변이 단백질은 아래의 두 가지 아미노산 변이를 모두 포함하는 것이다:
SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 중의 153번째 아미노산 자리에 위치하는 아스파라진(Asn)의 티로신(Tyr)으로의 치환(N153Y); 및
SEQ ID NO: 1의 티올라아제의 아미노산 서열 중 286번째 아미노산 자리에 위치하는 알라닌(Ala)의 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg)으로의 치환(A286K 또는 A286R).
선택적으로, 상기 티올라아제의 변이 단백질은 상기 두 가지 아미노산 변이에 더하여 아래의 변이 중 한 가지 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다:
SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 중의 77번째 아미노산 자리에 위치하는 발린(Val)의 글루타민(Gln) 또는 글루타메이트(Glu)로의 치환(V77Q 또는 V77E);
SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 중의 80번째 아미노산 자리에 위치하는 프롤린(Pro)의 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)으로의 치환(P80T 또는 P80S); 및
SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 중의 290번째 아미노산 자리에 위치하는 티로신(Tyr)의 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)으로의 치환(Y290T 또는 Y290S).
본 발명의 구체예에서, 상기 티올라아제의 변이 단백질은 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제의 아미노산 서열 중 N153Y 및 A286K의 2개의 아미노산 변형을 갖는 것(SEQ ID NO: 2) 또는 V77Q, N153Y 및 A286K의 3개의 아미노산 변이를 갖는 것(SEQ ID NO: 3)일 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따른 티올라아제의 변이 단백질은, 비변형(wild-type) Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제가 환원 조건에서는 활성화되지만 산화조건에서는 불활성화되는 산화환원 전환조절(redox-switch modulation) 특성을 갖기 때문에, 다른 미생물 유래의 티올라아제보다 낮은 활성을 보이는 단점(도 2 참조)을 극복하여, 산화조건에서 불활성화되지 않고 활성을 유지하는 비산화환원 전환조절(non-redox switch modulation) 특성을 가짐으로써, 비변형 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제보다 현저하게 우수한 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다 (실시예 4 및 도 4 참조).
후술하는 바와 같이, Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제가 산화적 환경하에서 불활성화 되는 것은 산화환원 전환조절(redox-switch modulation) 기작에 의하여 산화적 환경 하에서 시스테인 잔기 (C88, C378) 간의 이황화결합에 기인한다. 상기한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 중의 77번째, 80번째, 153번째, 286번째 및 290번째 아미노산 자리는 상기 시스테인 잔기 (C88, C378) 간의 이황화결합 부위 주변에 위치하는 자리로서, 이들 자리에서 안정된 수소결합이 형성되면 티올라아제의 구조적 안정성이 증대되어 상기 두 시스테인 잔기 간 이황화결합이 형성될 수 있는 거리적 접근성이 확보되지 않기 때문에, 산화 환경이 되어도 상기 두 시스테인 잔기 간 이황화결합이 발생하지 않게 되며, 이 때, 상기 두 시스테인 잔기 간 이황화결합과 경쟁적인 안정적인 수소 결합에 특히 중요한 아미노산 위치는 153번째 및 286번째 자리이다.
따라서, 상기 위치의 아미노산이 보다 안정되고 강력한 수소결합을 형성할 수 있는 아미노산 잔기로 치환되면, 티올라아제의 구조적 안정성에 기여하고, 산화 환경에서도 상기 두 시스테인 잔기 간 이황화결합의 형성을 방지하여, 티올라아제가 활성을 유지할 수 있도록 한다.
이와 같이 보다 안정되고 강력한 수소 결합을 형성할 수 있도록 예컨대, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 중의 153번째 아미노산 자리에 위치하는 아스파라진(Asn)이 티로신(Tyr)으로 치환(N153Y)되고, 286번째 아미노산 자리에 위치하는 알라닌(Ala)이 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg)으로 치환(A286K 또는 A286R)될 수 있다. 여기에 더하여, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 중의 77번째 아미노산 자리에 위치하는 발린(Val)이 글루타민(Gln) 또는 글루타메이트(Glu)로 치환(V77Q 또는 V77E)되거나, 및/또는 80번째 아미노산 자리에 위치하는 프롤린(Pro)이 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)으로 치환(P80T 또는 P80S)되거나, 및/또는 290번째 아미노산 자리에 위치하는 티로신(Tyr)이 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)으로 치환(Y290T 또는 Y290S)되면, 산화적 환경에서 저하된 활성이 환원적 환경에서 보다 효과적으로 복원될 수 있다.
이와 같은 이황화결합 주변 부위의 구조적 안정성은 이황화결합과 경쟁관계에 있기 때문에 (실시예 3 참조), 상기와 같은 아미노산 변이(치환)에 의하여, 이황화결합 부위의 주변 부위의 잔기들 간 강력한 수소결합이 형성되어 구조적으로 안정화됨으로써, 산화적 환경에서도 상기 시스테인 잔기 (C88, C378) 간의 거리상 접근성이 확보되지 못하여 이들 간 이황화결합이 형성되지 않게 되어, 비-산화환원 전환조절(non-redox switch modulation) 기작을 가지는 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제의 변이 단백질이 얻어질 수 있다.
본 발명의 다른 예는 상기한 바와 같은 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제의 변이 단백질, 예컨대, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 '발현벡터'란 상기 티올라아제의 변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따라 클로닝된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. '작동가능하게 연결(operably linked)' 된다는 것은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 조절 서열에 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴크레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리포좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터의 모벡터로 사용되는 벡터는 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에서 숙주세포로 사용되는 미생물에서의 발현을 위하여 통상적으로 사용되는 모든 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체 등이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 예는 숙주세포를 상기 발현벡터로 형질전환하여 얻어진 형질전환체 (형질전환 세포)를 제공한다.
상기 숙수세포는 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia 속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물 및 효모 등의 진핵세포 미생물을 모두 의미하는 것으로, 예컨대, 클로스트리디아 (Clostridia) 속 미생물 (예컨대, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, 또는 Clostridium saccharobutylicum), 대장균 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 형질전환은 본 발명의 티올라아제의 변이 단백질 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터를 숙주 세포로 도입하기 위하여 통상적으로 사용되는 모든 수단에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 발현벡터는, 이에 제한되지는 않지만, 염화칼슘(CaCl2) 및 열쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation), PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다.
본 발명자들은 또한 대장균 유래의 티올라아제 (EcTHL, ZP_03027833, Ec number=2.3.1.9, SEQ ID NO: 4, 393 aa)가 기존에 사용되어 오던 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제보다 상대적 활성이 우수한 것을 확인하였으며 (도 2 참조), 이는 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제가 산화환원전환조절을 받아서 반응이 진행되어 따라서 상대적으로 산화적 환경으로 변함에 따른 활성 저하가 일어나는 반면, 대장균 유래의 티올라아제는 반응이 진행되어 상대적인 산화적 환경이 되어도 활성이 저하되지 않는 비-산화환원 전환조절(non-redox switch modulation) 기작을 갖기 때문인 것을 확인하였다. 이러한 대장균 유래의 티올라아제의 비-산화환원 전환 조절 기작은 3차원 입체구조를 조사함으로써 확인하였다 (도 3 참조).
따라서, 본 발명은 대장균 유래의 티올라아제의 바이오부탄올 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 상기 대장균 유래의 티올라아제는 이를 발현하는 대장균 세포로서 사용되거나, 다른 미생물 (예컨대, 클로스트리디아 (Clostridia) 속 미생물 (예컨대, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, 또는 Clostridium saccharobutylicum))에 형질전환되어 형질전환체 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는 상기 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제의 변이 단백질, 상기 변이 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체; 및 대장균 유래의 티올라아제(SEQ ID NO: 4), 상기 대장균 유래의 티올라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 대장균 유래의 티올라아제를 발현하는 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 바이오부탄올 제조용 조성물을 제공한다. 바람직한 예에서, 상기 바이오부탄올 제조용 조성물은 상기 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제의 변이 단백질을 발현하는 형질전환체 및 대장균 유래의 티올라아제(SEQ ID NO: 4)를 발현하는 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 대장균 유래의 티올라아제(SEQ ID NO: 4)를 발현하는 세포는 대장균 유래의 티올라아제(SEQ ID NO: 4)를 발현하는 형질전환체, 또는 본래의 티올라아제(SEQ ID NO: 4)를 발현하는 대장균 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예는 상기 바이오부탄올 제조용 조성물을 바이오부탄올 제조 공정에 사용하는 것을 특징으로 하는 바이오부탄올의 제조 방법을 제공한다. 즉, 상기 사용된 바이오부탄올 제조용 조성물은 앞서 설명한 바와 같이 Clostridium acetobutylicum 유래의 티올라아제(SEQ ID NO: 1)의 변이 단백질, 또는 대장균 유래의 티올라아제(SEQ ID NO: 4)를 발현하는 형질전환체, 또는 본래의 티올라아제(SEQ ID NO: 4)를 발현하는 대장균 세포를 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 바이오부탄올 제조 방법은,
바이오부탄올 제조 공정에 있어서,
상기 바이오부탄올 제조용 조성물을 탄소 기질과 함께 배양하는 단계; 및
생성된 부탄올을 회수하는 단계
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 탄소 기질은 하나 이상의 탄소 원자를 함유하고, 미생물에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미하는 것으로, 예컨대, 글루코오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 만노오스, 자일로오스 등의 단당류; 락토오스, 말토오스, 슈크로오스, 셀로비오스 등의 이당류; 올리고당류; 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 전분, 자일란 등의 다당류; 메탄올 등의 하나의 탄소 원자만 포함하는 단일 탄소 기질; 및 글리세롤 등의 폴리올 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양은 사용된 숙주세포에 적합하게 통상적으로 사용되는 모든 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 배양 조건은 사용된 숙주세포의 배양 조건에 따른다. 예컨대, 클로스트리디아 (Clostridia) 속 미생물의 경우 20℃ 내지 55℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃에서 발효시킬 수 있으며, 구체적으로 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 경우에는 약 35℃에서 발효시킬 수 있다.
또한, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래의 티올라아제가 환원적 환경에서 활성화된다는 것에 착안하여, 본 발명의 다른 측면은, 바이오부탄올 제조에 있어서, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)을 산화적 조건이 아닌 환경, 예컨대, 환원적 조건하에서 반응키는 것을 특징으로 하는 바이오부탄올 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은
클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)을 탄소 기질과 함께 환원적 조건 하에서 배양하는 단계; 및
생성된 부탄올을 회수하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 산화적 조건이 아닌 환경 (예컨대, 환원적 조건)은 특별한 제한이 없으며, 관련 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 환원 조건일 수 있다. 예컨대, 상기 환원적 조건은 환원제 (예컨대, 베타-머캅토 에탄올 (beta-mercaptoethanol, BME), DTT(dithiothreitol) 등)가 적용된 조건 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 바이오부탄올 생합성에 관여하는 단백질인 Clostridium acetobutylicum THL (CaTHL)의 3차원 입체구조를 규명하였다(도 1 참조). CaTHL 단백질은 두 분자의 Acetyl-CoA를 이용하여 acetoacetyl-CoA를 합성하는 효소로써 바이오부탄올 생합성 첫 단계에 관여하는 효소이다. 본 발명자들은 THL과 acetyl-CoA와의 결합구조 규명을 통하여 단백질의 작용기작을 규명하였으며, 두 개의 시스테인(cystein) 잔기(C88, C378)가 단백질활성부위에 위치하고 단백질활성에 관여한다는 것을 밝혔다.
중요한 것은 단백질의 구조적 정보를 토대로 CaTHL 단백질이 두 개의 시스테인 잔기 간의 가역이황화결합 (reversible disulfide bond)을 매개로 환경의 산화/환원적 변화에 따라 기능이 조절되는 산화환원 전환조절(redox-switch modulation)을 통하여 활성이 조절된다는 것을 규명하였다. 즉, 환원적 환경에서는 두 개의 시스테인 잔기가 환원되어 단백질이 활성을 나타내는 반면에, 산화적 환경에서는 두 개의 시스테인 잔기 간에 이황화결합이 형성되어 시스테인 잔기가 활성에 관여할 수 없게 됨으로써 단백질이 비활성 상태가 되는 것이다. 이러한 환경의 산화/환원적 변화에 따른 가역이황화결합은 주변부위의 구조적 변형을 동반하게 되며, 본 발명자들은 환원적 상태에서는 주변구조가 정상적으로 형성되는 반면, 산화적 상태에서는 주변구조가 안정되지 못하고 무너지는 것을 관찰하였다.
알려진 바에 의하면 바이오부탄올의 합성이 환경의 산화/환원적 변화에 따라 민감하게 조절된다는 것이 보고되어 있으며, 본 발명자들이 규명한 CaTHL의 산화환원 전환조절(redox-switch modulation)에 의한 조절기작은 이를 잘 설명해주고 있다. 즉, 환원적 환경에서는 두 개의 시스테인 잔기(C88, C378)가 환원되어 단백질이 활성을 나타냄으로써 바이오부탄올의 생합성이 가능하지만, 산화적 환경에서는 두 개의 시스테인 잔기 간에 이황화결합이 형성되고 단백질이 비활성 상태가 됨으로써 바이오부탄올의 생합성이 이루어질 수 없게 되는 것이다.
바이오부탄올 생합성 분야의 연구활성화와 더불어 최근에는 Clostridium acetobutylicum 유래 바이오부탄올 생합성에 관여하는 단백질 유전자를 대장균에 주입하여 대장균으로부터 바이오부탄올을 생산하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 대장균에도 THL(EcTHL)이 존재하며, 본 발명자들은 EcTHL이 어떠한 기작에 의해 조절되는지를 규명하기 위하여 EcTHL 단백질의 입체구조 규명 및 생화학적 연구를 수행하였다. 여기서 얻어진 결과(도 2 참조 및 도 3 참조)를 통하여 EcTHL은, 산화환원 전환조절(redox-switch modulation)되는 CaTHL와 달리, 산화환원 전환조절에 의해 조절되지 않는다는 것을 규명하였다.
본 발명에서 규명한 CaTHL의 산화환원 전환조절(redox-switch modulation)에 의한 조절기작은 매우 특이적인 것이라 할 수 있다.
본 발명자들은 CaTHL, 및 EcTHL의 조절기작이 각 단백질의 활성에 미치는 영향을 측정하였으며, 흥미롭게도 산화환원 전환조절(redox-switch modulation)로 조절되는 야생형 CaTHL의 산화환원 전환 조절로 조절되지 않는 EcTHL의 활성(100%)에 대한 상대 활성이 약 30% 정도에 그친다는 것을 확인하였다 (도 2). 이는 CaTHL의 경우 약간의 산화적 환경(대사 진행에 따라 초기 조건과 비교하여 상대적으로 산화적으로 변화되는 경우도 포함)에서도 두 개의 시스테인 잔기 간에 이황화결합을 형성함으로써 단백질이 상당부분 비활성을 나타내기 때문으로 분석된다.
실제적으로 CaTHL(NP_349476, Ec number=2.3.1.9, SEQ ID NO: 1)와 EcTHL(ZP_03027833, Ec number=2.3.1.9, SEQ ID NO: 4)의 아미노산서열은 60% 정도의 상동성을 가지며, 전체적인 구조 또한 유사하다.
이러한 서열상 및 구조상의 유사성에도 불구하고, 바이오부탄올 생합성 균주인 Clostridium acetobutylicum 유래 CaTHL만 이황화결합을 형성하면서 환경의 산화/환원적 변화에 의해 조절되는 기작을 갖는 것과 관련하여 연구한 결과, 생리학적으로 Clostridium acetobutylicum은 혐기성균인 반면 대장균은 호기성균인데, 혐기성균의 세포질(cytosol)은 호기성균의 세포질에 비해 비교적 환원적 환경을 유지하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 생리학적인 차이가 THL의 조절기작의 차이를 일부 설명할 수 있다.
그러나, 구조분자생물학적인 이유는 3종의 단백질 입체구조를 면밀히 분석함으로써 그 해답을 찾을 수 있었다. 앞에서 설명한 바와 같이 CaTHL은 산화적 환경에서 두 개의 활성 시스테인 잔기 간에 이황화결합을 형성하며, 이는 주변부위의 구조적 변형을 유도한다. 3종의 단백질 입체구조를 면밀히 관찰한 결과 구조적 변형을 일으키는 주변부위의 구조적 안정성에 매우 큰 차이는 발견할 수 있다(도 3 참조). EcTHL 단백질의 경우에는 주변부위가 매우 강한 수소결합을 통하여 안정화되어 있는 반면, CaTHL 단백질의 경우에는 주변부위에 강한 수소결합이 존재하지 않으면서 구조적으로 안정화되어 있지 않다.
이러한 주변부위의 안정화정도는 이황화결합 형성과 구조적으로 경쟁관계에 있다는 것이다. 즉, CaTHL 단백질의 경우에는 두 개의 시스테인 잔기 간의 이황화결합력이 주변부위가 안정화되는 힘에 비해 매우 강하기 때문에 산화적 환경에서 이황화결합의 형성이 가능하다. 반면, EcTHL 단백질의 경우에는 주변부위가 매우 안정하게 유지를 하기 때문에 두 개의 시스테인 잔기 간의 이황화결합력이 주변부위의 구조적 변형을 유도할 수 있는 충분한 힘이 없으며 산화적 환경에서도 이황화결합의 형성이 불가능하다는 것이다.
유사한 구조를 가지고 있고, 또한 유사한 기능을 하는 단백질들 간의 조절기작의 차이가 구조적 안정성에 기인한다는 사실은 본 발명자들에 의하여 처음으로 밝혀진 것이다.
위 결과를 종합하면, CaTHL 단백질은 산화환원 전환조절(redox-switch modulation) 기작으로 인해 낮은 활성을 나타내며, Clostridium acetobutylicum의 바이오부탄올 생합성 과정에서 상대적 산화 환경 하에서 CaTHL 단백질이 비활성화 되어 바이오부탄올의 생합성이 저해된다. 반면, EcTHL는 구조적 안정성에 의하여 높은 바이오부탄올 생합성 효율을 보인다.
EcTHL과 달리 CaTHL의 산화환원 전환조절(redox-switch modulation) 기작은 이황화결합 주변부위의 낮은 구조적 안정성에 기인하고 있다. 이러한 중요한 CaTHL 단백질의 특성은 CaTHL 단백질의 조절기작을 변형함으로서 높은 활성을 나타내는 고기능 변이단백질의 개발을 가능하게 한다. 본 발명자들은 단백질변이기술(site-directed point matagenesis)을 도입하여 CaTHL 활성 주변부위의 잔기를 변이, 주변부위 잔기들 간에 강한 수소결합을 형성하게 하여 산화적 환경에서도 이황화결합을 형성하지 않게 함으로써 비-산화환원 전환조절(non-redox switch modulation) 기작을 가지는 CaTHL 변이단백질을 개발하였다. 본 발명에서 개발한 CaTHL 변이 단백질은, 예컨대, N153Y/A286K 이중변이단백질과 V77Q/N153Y/A286K 삼중변이단백질 등과 같이, SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에서 V77Q, N153Y, 및 A286K 중 하나 이상의 변이를 갖는 단백질일 수 있다.
산화적 환경에서도 이황화결합이 형성되지 않는 것은 생화학적 방법을 통하여 증명하였다 (실시예 4 참조). 활성비교 실험을 수행한 결과(도 4의 위쪽 참조), 비-산화환원 전환조절(non-redox switch modulation) CaTHL 변이단백질의 활성이 wild-type CaTHL 단백질에 비해 약 2.5배 정도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 153번 아스파라긴(asparagine) 잔기를 티로신(tyrosine) 잔기로 변이하고, 286번 알라닌(alanine) 잔기를 리신(lysine) 잔기로 변이시킨 변이단백질(N153Y/A286K)의 경우에는 단백질 입체구조를 규명하였으며, 두 개의 시스테인 잔기 (C88, C378) 간에 이황화결합이 형성되지 않는다는 것과, 주변부위의 구조가 안정적으로 수소결합을 형성하고 있다는 것을 구조적으로 증명하였다(도 4의 아래쪽 참조).
또한, EcTHL는 구조적 안정성에 의하여 별도의 변이를 수반하지 않고도 높은 바이오부탄올 생합성 효율을 보이는 것을 알 수 있다 (도 2 및 도 4 그래프 참조).
바이오부탄올 생합성에 관여하는 핵심 단백질인 CaTHL 단백질의 조절기작 변형을 통한 고기능 단백질의 개발은 두 가지 측면에서 다음과 같은 매우 중요한 의미 및 기대효과를 가지고 있다.
그 중 한 가지 측면은 구조기반 산화환원 전환조절 교체 (structure-based redox-swapping) 기술의 제공이다. 본 발명은 산화환원 전환조절(redox-switch modulation)되는 단백질을 비-산화환원 전환조절(non-redox switch modulation)되는 단백질로 변형한 최초의 결과이다. 지금까지, 가역이황화결합 형성을 매개로 하는 산화환원 전환조절(redox-switch modulation) 기작으로 활성이 조절되는 여러 단백질들이 보고되어 왔다. 하지만, 산화환원 전환조절(redox-switch modulation) 기작의 분자구조생물학적 이해를 통한 조절변형에 대해서는 보고된 바가 없다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 연구를 통하여 "구조기반 단백질공학 (structure-based protein engineering)", "산화환원 전환조절 교체 (redox-swapping)", "구조기반 산화환원 전환조절 교체 (structure-based redox-swapping)" 등으로 이름 지어질 수 있는 새로운 단백질공학기술을 개발하였다 할 수 있다.
이러한 기술은 단백질의 입체구조규명을 토대로 조절기작의 구조적 특성을 분석하고 이를 통하여 단백질변이기술을 도입함으로써 가능하게 되었으며, 단백질의 구조적 정보 없이 임의변이(random mutation)을 통해서는 불가능한 연구이다. 이러한 기술은 CaTHL 뿐만 아니라 타 단백질에도 도입이 가능하기 때문에 새로운 고기능 개량단백질의 개발에 널리 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
또 다른 측면은 바이오부탄올의 고효율 생산이다. 앞에서 설명한 바와 같이 비-산화환원 전환조절(non-redox switch modulation) CaTHL 변이단백질이 wild-type CaTHL 단백질에 비해 약 2.5배 정도의 활성증가를 보여주고 있다. 이러한 CaTHL 변이단백질 유전자를 Clostridium acetybutylicum에 도입하여 wild-type CaTHL 단백질 유전자와 교체함으로써 비교적 산화적 환경에서도 계속적인 바이오부탄올의 생산을 유도할 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 시도는 바이오부탄올 생산성향상에 직접 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 바이오부탄올이 바이오에탄올에 비해 수송용 대체에너지원으로 매우 우수한 특성을 가지고 있지만 수송용 대체 에너지원으로서의 사용이 제한적인 이유로 바이오부탄올의 생산성이 바이오에탄올에 비해 낮고 발효균주의 바이오부탄올에 대한 저항성이 낮기 때문인 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 현재 국제적으로 진행되고 있는 바이오부탄올 연구는 바이오부탄올 생산성 향상 연구와 저항성 향상 연구에 집중되고 있다. 이러한 맥락에서 본 연구를 통해서 개발된 고기능 CaTHL 변이 단백질은 바이오부탄올 생산성 향상에 획기적인 기여를 할 것이며 바이오에너지분야의 연구개발 및 상업화에 매우 중요한 원천기술이 될 것으로 기대된다.
또한, 기존에 바이오부탄올 제조에 사용되던 CaTHL 단백질(야생형)보다 바이오부탄올 생합성 효율이 우수한 EcTHL를 제공하여 이 또한 바이오부탄올 제조에 상당한 기여를 할 것으로 기대된다.
도 1은 Clostridium acetobutylicum THL 단백질 입체구조(상)와 산화환원적 전환조절 (redox-switch modulation) 기작(하)을 보여주는 입체구조이다.
도 2은 Clostridium acetobutylicum THL 단백질(CaTHL) 및 대장균 (E. coli) THL 단백질(EcTHL)의 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 CaTHL과 EcTHL의 수소결합에 따른 활성 주변부위의 안정성 비교 결과를 보여주는 모식도이다.
도 4는 CaTHL(W/T), 이중 변이 CaTHL(N153Y/A286K), 3중 변이 CaTHL (V77Q/N153Y/A286K), 및 EcTHL(W/T)의 활성을 비교한 그래프, 및 이중 변이 CaTHL(N153Y/A286K)의 입체구조이다.
도 5는 CaTHL(W/T), 이중 변이 CaTHL(N153Y/A286K), 3중 변이 CaTHL (V77Q/N153Y/A286K), 및 EcTHL(W/T)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, CaTHL(N153Y/A286K)와 CaTHL (V77Q/N153Y/A286K)의 변이 부분을 회색 음영으로 나타내었다.
도 2은 Clostridium acetobutylicum THL 단백질(CaTHL) 및 대장균 (E. coli) THL 단백질(EcTHL)의 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 CaTHL과 EcTHL의 수소결합에 따른 활성 주변부위의 안정성 비교 결과를 보여주는 모식도이다.
도 4는 CaTHL(W/T), 이중 변이 CaTHL(N153Y/A286K), 3중 변이 CaTHL (V77Q/N153Y/A286K), 및 EcTHL(W/T)의 활성을 비교한 그래프, 및 이중 변이 CaTHL(N153Y/A286K)의 입체구조이다.
도 5는 CaTHL(W/T), 이중 변이 CaTHL(N153Y/A286K), 3중 변이 CaTHL (V77Q/N153Y/A286K), 및 EcTHL(W/T)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, CaTHL(N153Y/A286K)와 CaTHL (V77Q/N153Y/A286K)의 변이 부분을 회색 음영으로 나타내었다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예
1:
티올레이즈
단백질의 준비
1.1:
Clostridium
acetobutylicum
THL
(
CaTHL
) 단백질 및 변이 단백질의 준비
Clostridium acetobutylicim chromosome을 한국생명공학연구원 생물자원센테에서 분양받았다. 아래의 표 1의 프라이머쌍을 이용하여 하기의 표 2의 PCR 조건으로 PCR을 수행하여 통해 CaTHL 유전자를 증폭하였다. 단백질의 C 말단에 Hexa-Histidine tag를 가지는 재조합 단백질을 대장균에서 과발현시키기 위하여, 상기 얻어진 CaTHL 유전자를 pET-30a(+) 발현벡터(Invitrogen)에 NdeI과 XhoI 제한효소 (New England BioLabs Ins.)를 사용하여 클로닝하였다.
| 서열번호 | Primer | Sequence |
| 5 | CaTHL NdeI Forward | 5'-GCGCGCATATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAGTGC-3' |
| 6 | CaTHL XhoI Reverse | 5'-GCGCGCTCGAGGCACTTTTCTAGCAATATTGCTGTTC-3' |
| 7 | CaTHL V77Q Forward | 5'-CTTTTAAAGCAGGATTACCACAAGAAATTCCAGCTATG-3' |
| 8 | CaTHL V77Q Reverse | 5'-CATAGCTGGAATTTCTTGTGGTAATCCTGCTTTAAAAG-3' |
| 9 | CaTHL P80T(+V77Q) Forward | 5'-GATTACCACAAGAAATTACAGCTATGACTATTAATAAG-3' |
| 10 | CaTHL P80T(+V77Q) Reverse | 5'-CTTATTAATAGTCATAGCTGTAATTTCTTGTGGTAATC-3' |
| 11 | CaTHL N153Y Forward | 5'-GATTGTGGGATGCATTTTATGATTACCACATGG-3' |
| 12 | CaTHL N153Y Reverse | 5'-CCATGTGGTAATCATAAAATGCATCCCACAATC-3' |
| 13 | CaTHL A286K Forward | 5'-CAGGAGTTGACCCAAAAATAATGGGATATGG-3' |
| 14 | CaTHL A286K Reverse | 5'-CCATATCCCATTATTTTTGGGTCAACTCCTG-3' |
| 15 | CaTHL Y290T(+A286K) Forward | 5'-CCCAAAAATAATGGGAACTGGACCTTTCTATGC-3' |
| 16 | CaTHL Y290T(+A286K) Reverse | 5'-GCATAGAAAGGTCCAGTTCCCATTATTTTTGGG-3' |
| temperature | time | cycle | |
| Pre-denature | 95 ℃ | 5 min. | 1 cycle |
| Denature | 95 ℃ | 45 sec. | 30 cycles |
| Annealing | 56 ℃ | 45 sec. | |
| Elongation | 72 ℃ | 3 min. | |
| Post-elongation | 72 ℃ | 5 min. | 1 cycle |
Inoue method로 준비된 B834(DE3)/BL21(DE3) strain의 대장균(competent cell)에 상기 CaTHL 유전자를 클로닝한 pET-30a(+)을 42 ℃ 열처리(heat shock)을 통해 주입하여, 재조합 단백질을 과발현할 수 있도록 대장균을 형질전환하였다.
형질전환된 대장균을 LB 배지(Sigma)에서 대량배양하였다. 대량 배양시, 37℃ 진탕 배양기(shacking incubator)에서 배지 부피에 대한 균주 부피를 1 %(v/v)로 하여 접종 후, O.D600 0.5에서 1mM IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 사용하여 재조합 단백질이 대장균에서 과발현 되도록 유도한 후, 22 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
배양한 대장균은 2000rpm에서 10분동안 원심분리하여 상청액을 제거하고 침전된 세포를 수확 및 분리하였다. 상기 수확 및 분리된 세포를 40mM Tris-HCl pH8.0/5mM β-mercaptoethanol (BME)로 구성된 파쇄 용액에 다시 부유시켜 초음파(sonication)로 파쇄한 후, 얻어진 파쇄물을 15000rpm에서 1시간동안 원심분리하여 상청액을 취하여 가용성 단백질을 얻었다.
상기 세포에서 발현된 재조합단백질은 재조합단백질의 Hexa-Histidine tag과 니켈금속원소간의 친화성(affinity)를 이용하여 정제하였다. 보다 구체적으로, 조추출액(crude extract, 상청액)을 약 10ml Ni-NTA resin(QIAGEN)으로 충진된 Econo-column (Bio-rad)에 중력으로 흘려 재조합 단백질을 Ni-NTA resin에 흡착시키고 단백질의 순도를 높이기 위해 40mM Tris-HCl pH8.0/ 5mM β mercaptoethanol/27mM Imidazole의 행굼용액(washing buffer) 50ml을 흘려주었다. 이 후, 40mM Tris-HCl pH8.0/5mM β-mercaptoethanol/150mM Imidazole의 용출용액(elution buffer)으로 용출시켜 대량의 재조합 단백질 분리 및 정제하였다.
Ni-NTA를 통해 정제된 재조합 단백질은 size-exclusion chromatorgraphy의 방법을 통하여 고순도로 대량정제하였다. Superdex200 column(Amersham)으로 40mM Tris-HCl pH8.0/5mM β-mercaptoethanol 용액을 2.5 ml/min의 속도로 흘려 단백질 크기에 따른 대장균의 단백질을 제거하고, 41.2 kDa 단백질을 취하여 CaTHL 단백질을 준비하였다.
CaTHL의 변이 단백질은 상기 표 1의 프라이머쌍을 이용한 site-directed mutagenesis 기술에 의하여 본 실시예에 기재된 방법으로 준비하였다.
1.2:
E.
coli
THL
(
EcTHL
) 단백질의 준비
상기 실시예 1.1과 유사한 방법으로 EcTHL 단백질을 준비하였다.
한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받은 Escherichia coli (K-12) chromosome을 template로 EcTHL 유전자 specific primer(EcTHL_F_BamHI; 5'-CCGGATCCATGAAAAATTGTGTCATCGTCAGTGC-3' (SEQ ID NO 17), EcTHL_F_XhoI; 5'-CCCTCGAGTTAATTCAACCGTTCAATCACCATCG-3' (SEQ ID NO 18))를 이용하여 PCR을 통해 유전자를 증폭하였으며, PCR 조건은 상기 표 2와 같다.
상기 증폭된 유전자를 BamHI, XhoI 제한효소(New England Biolab.)를 사용하여 pPROEXHTb 발현벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. pPROEXHTb는 N말단에 Hexa-Histidine tag과 rTEV(recombinant Tobaco Etch Virus) protease(Invitrogen Inc.)로 자를 수 있는 자리가 Hexa-Histidine tag과 단백질 사이에 있어 재조합 단백질로부터 Hexa-Histidine tag를 제거할 수 있다.
상기 실시예 1,1과 동일한 방법으로 상기 EcTHL 유전자를 포함하는 발현벡터를 대장균에 유전자를 주입하여 대장균 EcTHL 단백질을 대량발현시켰다. 상기 실시예 1.1과 동일한 방법으로 Ni-NTA column통해 재조합 단백질을 회수한 후, rTEV처리와 Ni-NTA column을 사용한 negative purification, ion-exchange chromatography, size-exclusion chromatorgraphy 방법 순차적으로 적용하여 고순도의 N말단에 Hexa-Histidine tag을 제거한 EcTHL 단백질(41.3 kDa)을 대량 정제하였다.
실시예
2.
CaTHL
의 3차원 입체구조 규명
상기 실시예 1.1에서 고순도로 정제된 재조합 CaTHL 단백질을 단백질 농축 키트인 VIVASPIN(Sartorious stedim biotech)을 사용하여 20mg/ml로 농축하였다. Sitting-drop plate (Hampton Research)를 사용하여 30%(v/v) PEG(Polyethylene glycol) 400 (Sigma Aldrich)/0.1M Acetate pH4.5/0.1M Calcium Acetate (Sigma Aldrich) 조건에서 성공적으로 결정화하였다.
상기 얻어진 단백질 결정은 PAL(Pohang Accelerator Laboratory; 포항가속기연구소)의 6C1 beamline에서 X-선 회절을 통해 데이터를 수집하였다. 데이터 이미지들을 HKL2000 소프트웨어(HKL Research, Ins)를 통해 Indexing과 Scaling하였다. ZrTHL(P07097, Ec number=2.3.1.9)의 입체구조를 주형(template)으로 하여 MR (molecular replacement)과정을 거쳐 전자밀도 지도 (Electron density map)를 제작하였다. 이 전자밀도 지도를 기반으로 COOT 소프트웨어 (http://www.biop.ox.ac.uk/coot)를 사용하여 단백질 분자의 3차원 입체 구조를 모델링하여 단백질입체 구조를 해명하여 도 1에 나타내었다.
정제와 단백질 결정시 공기 중 산소의 접촉에 의해 산화되어 단백질입체구조에서 기질 활성 위치에 있는 촉매반응 잔기인 88번 378번 시스테인 잔기 간에 이황화결합이 형성됨을 확인하였다 (도 1 참조).
다만, 야생형 CaTHL 단백질은 입체구조상 매우 불안정하여 약간의 산화환경에서도 이황화결합이 형성되어, 이황화결합이 형성되지 않은 본래 상태의 완전한 입체구조를 파악하기 어려우므로, 본 실시예의 결과인 도 1 및 하기의 실시예 3의 결과인 도 3의 CaTHL 단백질의 입체구조는 야생형 CaTHL 단백질의 88번째 아미노산 위치의 시스테인을 세린으로 치환(C88S)하여 관찰한 결과이다.
실시예
3.
CaTHL
와
EcTHL
단백질의 구조적 안정성
실시예 2와 같은 방법으로 상기 실시예 1.1 및 1.2에서 얻은 CaTHL(NP_349476, Ec number=2.3.1.9)와 EcTHL(ZP_03027833, Ec number=2.3.1.9)의 산화환경에서의 3차원 구조를 조사하여 구조의 안정성을 비교하였다.
CaTHL (C88S, 환원 5mM DTT 처리)와 EcTHL (산화 환경 0.5mM 과산화수소(H2O2) 처리)의 3차원 구조를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, EcTHL 단백질의 경우에는 주변부위가 매우 강한 수소결합을 통하여 안정화되어 있는 반면, CaTHL 단백질의 경우에는 주변부위에 강한 수소결합이 존재하지 않으면서 구조적으로 안정화되어 있지 않은 것을 확인할 수 있다. 이러한 주변부위의 안정화정도는 이황화결합 형성과 구조적으로 경쟁관계에 있다는 것이다. 즉, CaTHL 단백질의 경우에는 두 개의 시스테인 잔기 간의 이황화결합력이 주변부위가 안정화되는 힘에 비해 매우 강하기 때문에 산화적 환경에서 이황화결합의 형성이 가능하다. 하지만 EcTHL 단백질의 경우에는 주변부위가 매우 안정한 구조를 유지하기 때문에 두 개의 시스테인 잔기 간의 이황화결합력이 주변부위의 구조적 변형을 유도할 수 있는 충분한 힘이 없으며 산화적 환경에서도 이황화결합의 형성이 불가능하다는 것이다. 유사한 구조를 가지고 있고, 또한 유사한 기능을 하는 단백질들 간의 조절 기작의 차이가 구조적 안정성에 기인한다는 사실은 본 발명을 통하여 처음으로 밝혀진 것이다.
본 실시예를 통하여, CaTHL 단백질은 야생형 상태에서 약간의 산화 환경에서 이황화결합에 의하여 단백질 활성 저하의 문제가 발생할 수 있어서 산화환원 전환조절(redox-switch modulation)을 받는 반면, EcTHL 단백질은 야생형 상태로도 산화환경에서 우수한 안정성을 보임(비산화환원 전환조절(non-redox-switch modulation))을 구조적으로 입증하였다.
실시예
4.
CaTHL
의
산화환원적
전환조절 확인
CaTHL 단백질과 EcTHL 단백질의 활성은 THL 단백질의 반응 특성상 조효소인 CoA(Coenzyme A)와 Acetoacetyl-CoA를 반응시켜 반응 진행에 따른 Acetoacetyl-CoA의 감소를 303nm 파장에서 측정함으로써 단백질의 활성을 측정하였다. 상기 단백질의 활성 측정시, 67mM Tris-HCl/5mM MgCl2로 구성된 100ml 반응용액에 0.13mM Acetoacetyl-CoA(MP bio), 0.33mM CoA(MP bio), 및 실시예 1.1의 CaTHL 0.015mg 또는 실시예 1.2의 EcTHL 0.015mg을 사용하여 반응시켰다.
또한, 상기 2종의 THL 단백질의 1mM DTT 처리시의 활성을 EcTHL 활성을 100으로 한 상대적 값으로 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 산화환원 전환조절(redox-switch modulation)로 조절되는 CaTHL의 활성이 그렇지 않은 EcTHL의 활성에 비하여 약 30% 정도의 활성을 나타내는 것을 밝혔다. 이는 CaTHL의 경우 약간의 산화적 환경에서도 두 개의 시스테인 잔기 간에 이황화결합을 형성함으로써 단백질이 상당부분 비활성을 나타내기 때문으로 분석된다.
또한, 실시예 1.1에서 준비된 CaTHL 변이 단백질(N153Y/A286K, V77Q/N153Y/A286K)의 활성을 위와 같은 방법으로 측정하여 얻은 결과를 위에서 측정한 CaTHL 야생형 단백질 및 EcTHL 단백질의 활성과 함께, EcTHL 단백질 활성을 100%로 하여 도 4의 그래프에 나타내었다. 또한 상기 실시예 2와 동일한 방법으로(5mM DTT) N153Y/A286K 변이 단백질의 입체구조를 규명하여 도 4의 입체구조로서 나타내었다. 다만, 실시예 2에서는 야생형 CaTHL의 완전한 입체구조를 보기 위하여 88번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환(C88S)시켜 관찰하였으나, 본 실시예에서 입체구조를 본 N153Y/A286K 변이 단백질의 경우에는 구조적 안정성이 매우 향상되어 C88S 치환 없이 같은 치환 없이도 입체구조 관찰이 가능하였다.
도 4의 그래프에서 확인되는 바와 같이, 상기 CaTHL 변이 단백질의 활성이 CaTHL 야생형 단백질에 비해 약 2.5배 정도 증가하는 것을 확인할 수 있다. 특히, 153번 아스파라긴(asparagine) 잔기를 티로신(tyrosine) 잔기로 변이하고, 286번 알라닌(alanine) 잔기를 리신(lysine) 잔기로 변이시킨 변이단백질(N153Y/A286K)의 경우에는 단백질 입체구조를 규명하였으며(도 4의 단백질 입체구조 참조), 두 개의 시스테인 잔기 간에 이황화결합이 형성되지 않는다는 것과, 주변부위의 구조가 안정적으로 수소결합을 형성하고 있다는 것을 구조적으로 증명하였다.
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Claims (10)
- 삭제
- 삭제
- 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래의 티올라아제의 변이 단백질로서, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 변이 단백질.
- 제3항의 변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제4항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
- 숙주세포를 제5항의 발현 벡터로 형질전환하여 얻어진 형질전환체.
- 제6항에 있어서,
상기 숙주세포는 원핵세포 미생물 또는 진핵세포 미생물인 형질전환체. - 제6항의 형질전환체를 포함하는, 바이오부탄올 제조용 조성물.
- 바이오부탄올 제조에 있어서,
제8항의 바이오부탄올 제조용 조성물을 탄소 기질과 함께 배양하는 단계; 및
생성된 부탄올을 회수하는 단계
를 포함하는, 바이오부탄올 제조 방법. - 삭제
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