CN105793431A - 通过微生物代谢途径的遗传修饰制备延长的2-酮酸和由此生成的c6-c10化合物的方法 - Google Patents

通过微生物代谢途径的遗传修饰制备延长的2-酮酸和由此生成的c6-c10化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105793431A
CN105793431A CN201480065279.XA CN201480065279A CN105793431A CN 105793431 A CN105793431 A CN 105793431A CN 201480065279 A CN201480065279 A CN 201480065279A CN 105793431 A CN105793431 A CN 105793431A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
acid
modified
aldehyde
converted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480065279.XA
Other languages
English (en)
Inventor
P·C·桑格哈尼
C·C·斯托瓦斯
B·A·罗德里格斯
A·文卡特斯瓦兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dow Global Technologies LLC
Original Assignee
Dow Global Technologies LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Global Technologies LLC filed Critical Dow Global Technologies LLC
Publication of CN105793431A publication Critical patent/CN105793431A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01085—3-Isopropylmalate dehydrogenase (1.1.1.85)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03013—2-Isopropylmalate synthase (2.3.3.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01033—3-Isopropylmalate dehydratase (4.2.1.33)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

代谢途径的修饰包括遗传上工程化至少一种参与亮氨酸生物合成期间延长2酮酸的酶，优选至少异丙基苹果酸脱氢酶或合成酶(大肠杆菌中LeuB或LeuA)，以包括至少这种非天然酶、酶复合体或其组合来将2酮丁酸或2酮异戊酸转化为C7C11 2酮酸，其中这种生产比采用纯天然途径效率更高。接着可以将该C7C11 2酮酸通过天然或经遗传工程化的硫胺素依赖型脱羧酶转化以形成比所转化的C7C11 2酮酸少一个碳的C6C10醛。在一些实施方案中，该C6C10醛接着可以通过另外的天然或经遗传工程化的酶转化以形成其它C6C10产物，包括醇类、羧酸类和烷烃类。这种遗传工程为商业规模的体内生物合成方法提供了机遇，它可以比非生物方法更有成本效益地生产相同产品。

Description

通过微生物代谢途径的遗传修饰制备延长的2-酮酸和由此生成的 C6-C10化合物的方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2013年12月12日提交的、标题为“通过微生物代谢途径的遗传修饰从合成气制备辛醇的方法(Process to Prepare Octanol From Syngas Via GeneticModifications to Microbial Metabolic Pathways)”、序列号为61/915,040的美国临时专利申请的权益，通过引用将其全文并入本文。
技术领域
本发明涉及利用生物酶生产C6-C10醛类以及从它们制备的产物的领域。更具体地，其涉及利用工程化酶的领域，该酶可由经遗传修饰的微生物体表达以通过一个或多个代谢途径将合适的底物转化为C6-C10醛，或者在体外温浴以将2-酮丁酸或2-酮异戊酸转化为延长的2-酮酸，接着将2-酮酸转化为C6-C10醛。
背景技术
对获得和利用化石燃料将来的稀缺、成本和环境影响方面的担忧刺激了在开发廉价、可再生生物质作为燃料和从它们制备的化学品的替代来源方面的兴趣由于原油价格已经上涨，生物基化学品和工业产品已成为它们的石油衍生对应物的引人注目的替代物。采用厌氧微生物体的发酵工艺提供了有前景的路线，用于将生物质和农业废物转化为有用产品，同时解决了处理低价值农产品和食物加工副产物/废物中可能遇到的问题。可从低成本的生物质原料制备的一些有用产品为有机酸类和醇类，尤其包括C6-C10醇类，例如辛醇。辛醇找到特定用途，作为较低成本的起始物制备辛烯，而辛烯为许多工业中非常抢手的原料化学品。这些工业包括聚乙烯工业，其将辛烯用作共聚单体用于溶液聚合；以及去垢剂工业，利用其烷基化酚类以生产去垢剂前体。一般通过线性α-烯烃(LAO)技术来制备辛烯，这依赖于高耗能的四聚化，结果，辛烯供应通常是不足的，促成了其不利的价格波动。因此，辨识更好的和较便宜的生产辛醇的方法预期将会导致较便宜的辛烯生产。一般而言，利用发酵工艺生产辛醇可提供这种成本降低，继而增加供应并稳定辛烯价格。
总的来说，用于改良工业微生物体的方法的范围从传统菌株改良(CSI)的随机法到代谢工程的高度理性方法。CSI经常对减轻产物抑制或改善生产率是有效的，但对于生成能生产全新产品的菌株而言远非有效手段。此外，CSI对时间和资源都是高消耗的。这是因为，为了获得对抑制性发酵产物有高耐受的菌株，必需通过在培养基中存在逐渐增加的抑制剂浓度情况下连续培养菌株来不断筛选并选择突变体。这通常与采用化学突变剂和/或紫外线(UV)辐射的诱导突变联合进行。但是，传统的培养筛选方法通常是冗长的，耗时的，并且经常是无结果的。
在建立产生新产品的菌株方面，代谢修饰常常是更有效的。这是因为，基因以及一些情况下的整个途径可在生物体间转移(重组方法)，和/或酶类可被修饰(工程化方法)。这些方法避免了CSI的一些缺点。代谢工程(该术语涵盖了重组和工程化方法)是靶向性的并且经常是更快的手段，被广泛用于设计菌株，通过代谢流量分布中的改变来实现代谢物过量生产方面更高的效率。迄今为止，这种工作的大多数涉及利用充分研究了遗传学和生理学的生物体(例如，大肠杆菌(E.coli)、酵母和杂交瘤细胞)来生产次生代谢物(例如抗生素)、氨基酸(例如，赖氨酸)和异源蛋白质。代谢流量分布的化学计量分析为合适的代谢修饰、最佳培养基配方和供料策略、以及生物过程优化提供了指导。但是，这种方法仍需要对发酵细胞中的代谢和调节网络有深入了解。尽管这些理性方法在涉及单个基因或单个基因簇内的数个基因情况下已是成功的，但它们常常在涉及更复杂或基本上未知的代谢途径情况下是无效的。这是因为，这些手段通常一次靶向一个基因，因此未能预测给定途径内多个基因之间的复杂相互作用。
酶的修饰通过修饰遗传密码部分即对应酶的表达的生物体DNA来进行。酶的修饰可导致全新功能性或者可以用于改善对期望的中间体或产物的特异性或效率。另外，某些酶已知是混杂的，常常执行一些超出它们已知的天然角色的任务。这些酶也可以经修饰来执行新的转化，但是到目前这种手段的成功通常限于并非商业上可行的产品产量。参见，例如Zhang，K.；Sawaya，M.R.；Eisenberg，D.S.；Liao，J.C.“用于生物合成非天然醇类的扩展代谢(Expanding metabolism for biosynthesis of nonnatural alcohols)，”《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，2008，105：20653-20658。修饰途径中的多种酶在理论上可以用作最大化特异性和/或催化效率的技术。
已知的在某些条件下产生辛醇的生物体的一个实例为梭菌(Clostridium)。WO2012135731中使用了梭菌的各个物种(例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、艰难梭菌(difficile)和克鲁氏梭菌(kluyveri))。该专利公开将梭菌物种的较差选择性生产(除了其它产物外，包括少量的正辛醇)归于该工程化微生物体表达或过表达β-酮硫解酶(例如，BktB)、乙酰辅酶A乙酰转移酶(例如，AtoB)、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(例如，Hbd，来自梭菌，或PaaHI)、巴豆酸酶(例如，Crt)、以及反式烯酰辅酶A还原酶(例如，Ter)的能力。这些修饰通常针对生物体的辅酶A途径，用于生产高级醇类。该途径规避了在梭菌的很多物种中发现的丁醇生产途径，其涉及到氧敏感的酶类和中间体。但是，通过该发明产生的正辛醇的量太小而不是商业上可行的。还参见，例如，Lee，J.Y.；Jang，Y.S.；Lee，J.；Papoutsakis，E.T.；Lee，S.Y.“用于高选择性丁醇生产的丙酮丁醇梭菌M5代谢工程(Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum M5for highly selective butanolproduction)，”《生物科技(Biotechnol.)》，2009，4：1432-1440；以及Wang，Y.；Blaschek，H.P.“通过拜氏梭菌发酵优化热带玉米秸秆汁的丁醇生产(Optimization of butanol productionfrom tropical maize stalk juice by fermentation with Clostridium beijerinckii)，”《生物资源科技(Bioresour.Technol.)》，2011，102，9985-9990。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备C7-C11 2-酮酸的方法，包括让选自2-酮丁酸和2-酮异戊酸的底物与(1)天然或经遗传修饰的LeuA酶；(2)经遗传修饰的LeuB′酶，其中该酶为(a)从大肠杆菌(Escherichia coli)获得并具有对应于序列表SEQ ID 1的氨基酸序列；该酶经修饰，是因为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸独立地取代Leu-96、Val-198、或其组合；或(b)该酶具有与序列表SEQ ID 1的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列；该酶与(a)中一样经修饰；以及(3)天然或经遗传修饰的LeuCD′酶复合体；在2-酮丁酸或2-酮异戊酸通过一个或多个步骤转化为C7-C11 2-酮酸的条件下接触。
在另一实施方案中，让如前一段描述所产生的C7-C11 2-酮酸与天然或经遗传修饰的硫胺素依赖型脱羧酶在该C7-C11 2-酮酸转化为比所转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下接触。
在又另一实施方案中，本发明提供了表达或过表达酶的微生物体，该酶为(1)从大肠杆菌获得并具有对应于序列表SEQ ID 1的氨基酸序列；该酶经修饰，是因为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸独立地取代Leu-96、Val-198、或其组合；或(2)具有与序列表SEQ ID 1的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列；该酶与(1)中一样经修饰。
在再一实施方案中，本发明提供了制备C6-C10醛的方法，包括(1)让含碳底物与一种或多种天然或经遗传修饰的酶在形成2-酮丁酸或2-酮异戊酸的条件下接触；(2)让该2-酮丁酸或2-酮异戊酸与(a)天然或经遗传修饰的LeuA酶；(b)经遗传修饰的LeuB′酶，其中该酶为(i)从大肠杆菌获得并具有对应于序列表SEQ ID 1的氨基酸序列；该酶经修饰，是因为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸独立地取代Leu-96、Val-198、或其组合；或(ii)该酶具有与序列表SEQ ID 1的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列；该酶与(a)中一样经修饰；以及(c)天然或经遗传修饰的LeuCD′酶复合体；在该2-酮丁酸或2-酮异戊酸通过一个或多个步骤转化为C7-C11 2-酮酸的条件下接触；以及(3)让该C7-C11 2-酮酸与天然或经遗传修饰的硫胺素依赖型脱羧酶在该C7-C1 12-酮酸转化为比所转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下接触；(1)、(2)和(3)的每一个在一个或多个步骤中发生；其中(1)、(2)和(3)独立地在经遗传修饰的微生物体体内或外部发生。
附图说明
图1显示了通过LeuABCD的递归活性在步骤1至3中延长2-酮酸。延长后，所得延长的2-酮酸(IV)接着在步骤4中通过(硫胺素依赖型的)脱羧酶的活性转化为醛(V)，最终在步骤5中通过醇脱氢酶的活性转化为醇(VI)。
图2显示了两相关但不同的产生1-辛醇的路线。在一个路线中，Wood-Ljungdahl途径将合成气转化为乙酰辅酶A，另一途径接着将乙酰辅酶A转化为丙酮酸。丙酮酸接着转化为2-酮丁酸，最终启动了LeuABCD途径，这里2-酮丁酸转化为(在本实施方案中)2-酮壬酸。一旦形成了延长的2-酮酸(所述2-酮壬酸)，(硫胺素依赖型的)脱羧酶将其转化为C6-C10醛(本实施方案中，辛醛)，醇脱氢酶将辛醛转化为C6-C10醇(本实施方案中，1-辛醇)。
具体实施方式
在另一路线中，也显示在图2，可能的糖代谢途径之一，在本实施方案中为糖酵解或戊糖磷酸途径，将C5或C6糖转化为丙酮酸，之后遵循与第一路线相同的途径顺序到达1-辛醇。
序列表SEQ ID 1显示了天然(野生型)大肠杆菌LeuB基因序列，包括碱基对和对应的氨基酸。序列表自由文本项陈述如下：“野生型大肠杆菌LeuB”。
序列表SEQ ID 2显示了天然(野生型)大肠杆菌LeuB的氨基酸，但没有对应的碱基对。
序列表SEQ ID 3-20，如所描述的，显示了具有特异碱基对修饰(显示在奇数序列中)和氨基酸修饰(无对应碱基对)(显示在偶数序列中)的LeuB′变体酶。每一个的序列表自由文本项(<223>)陈述了具体变体的名称。在下文中定义和讨论这些名称。
总的来说，本发明包括将2-酮丁酸或2-酮异戊酸转化为C7-C11 2-酮酸的方法；进行该转化的经遗传修饰的酶或酶的组合；以及制备可能为醛、醇、羧酸、或烷烃的C6-C10产物的方法，该方法通过让诸如合成气的或者C5或C6糖(例如蔗糖、葡萄糖或戊糖)的含碳底物与一系列酶接触来进行，这些酶在一个或多个步骤中、某些实施方案中在3个或更多步骤中、以及优选5个或更多步骤中将含碳底物转化为C6-C10产物。任一方法都可以在上述非天然产生的即经遗传工程化的细胞的实施方案之一中、即在非天然产生的微生物体中通过生物合成来进行；或者通过体外方法学来进行。
在制备C6-C10醛的方法中，通过一种或多种酶的作用以及在一个或多个步骤中，让所选的含碳底物先转化为丙酮酸，再从丙酮酸转化为2-酮丁酸或者备选地转化为2-酮异戊酸。接着，该2-酮丁酸或2-酮异戊酸通过LeuABCD途径(当提及大肠杆菌微生物体时所称的)内的三个非天然的即经遗传修饰的酶或酶复合体或它们的组合中至少一个的作用经由链延长转化为C7-C112-酮酸，该LeuABCD途径为非天然亮氨酸途径的一部分(图1)。完成这种链延长的第一组可能利用的经修饰的酶在本文中鉴定为构成Leu A′(2-异丙基苹果酸合成酶)、Leu B′(异丙基苹果酸脱氢酶)、以及Leu CD′(两种酶合起来称为异丙基苹果酸异构酶复合体)。接着，通过至少一种多种酶的作用，可以将C7-C11 2-酮酸转化为C6-C10醛，所述酶包括天然或经遗传修饰的硫胺素依赖型脱羧酶，其将C7-C112-酮酸转化为比所转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛。
最终，该C6-C10醛可在各种工业应用中就此使用，或者可以用作中间体或起始物来生产其它化学品。例如，C6-C10醛可以与醇脱氢酶接触，其将C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇。可选地，其可与醛脱氢酶接触，该酶将它转化为相应的C6-C10羧酸。最后，其可以与脂肪醛脱羧酶接触，该酶将它转化为相应的C6-C10烷烃。硫胺素依赖型脱羧酶和醇脱氢酶、醛脱氢酶或脂肪醛脱羧酶的每一个可以独立地为天然的或经遗传修饰的。
用在本文时，术语“遗传修饰的”或“修饰的”指具有有意改变的氨基酸序列的酶(无论是概括地还是具体地提及的酶，例如醇脱氢酶等)，或者具有有意改变的基因组的微生物体(取决于任一术语作为形容词时所处位置)。这种改变可以通过重组技术来完成，其中一个或多个基因从另一、不同的微生物体转移进靶微生物体；通过工程技术来完成，其中一般通过定点突变来改变靶微生物体内的氨基酸，导致至少一个氨基酸(以及常常是一个以上)转变为不同氨基酸；或者通过二者来完成。
在优选的实施方案中，以理想地高特异性生成该C6-C10产物，例如C6-C10醇，如1-辛醇，即，基于总产物重量(wt)，优选至少25百分比(％)、更优选至少40％、还更优选至少50％、以及最优选至少70％(即，wt％)为目标产物，换言之，期望产物(例如，1-辛醇)的产量优选为每克原料至少0.25克产物(g/g)、更优选至少0.4g/g、还更优选至少0.5g/g、以及最优选至少0.7g/g。
如上文提到的，本发明可以在体内或体外进行。体内法可以优选用于商业规模的生产，而体外法可以更方便地用于实验室和一般的研究目的，例如进行酶学测定。一般而言，体内法利用微生物体的天然代谢途径，在不同数量的步骤中，首选将适合的含碳底物转化为丙酮酸，然后将丙酮酸转化为2-酮丁酸，或者备选地，转化为2-酮异戊酸。
在一个实施方案中，所选的微生物体可以具有Wood-Ljungdahl途径，也称为“合成气固定途径”，其中合成气转化为乙酰辅酶A。这可以在某些产乙酸的菌种中有效进行，例如梭菌属的那些菌种，包括但不限于，特别是，杨氏梭菌(C.ljungdahlii)。在该途径中，合成气到乙酰辅酶A的转化一般包括二氧化碳还原为一氧化碳，然后到乙酰辅酶A，其中通过两种酶的作用，即一氧化碳脱氢酶，其催化二氧化碳的还原，以及乙酰辅酶A合成酶，其将所得的一氧化碳与甲基基团组合以形成乙酰辅酶A。从这时起，乙酰辅酶A在另一途径上继续，其中其通过PFOR(铁氧还蛋白氧化还原酶)还原转化为丙酮酸。这种途径可以存在于生物体中，包括例如，梭菌、大肠杆菌、固氮螺菌(Azospirillum)、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母(Saccharomyces)和棒状杆菌(Corynebacterium)。
在替代实施方案中，诸如C5或C6糖(葡萄糖、蔗糖、戊糖或其组合)的适合的含碳底物可以通过糖代谢途径之一直接转化为丙酮酸，例如糖酵解或戊糖磷酸途径。
其之后，丙酮酸可以通过PC(丙酮酸羧化酶)；AAT(天冬氨酸氨基转移酶)；ThrABC(ThrA，其为双功能的天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶；ThrB，其为高丝氨酸激酶；以及ThrC，其为苏氨酸合成酶)；以及ASD(天冬氨酸半醛脱氢酶)首先转化为L-苏氨酸。接着L-苏氨酸通过ILva(苏氨酸脱水酶)转化为2-酮丁酸。在替代实施方案中，丙酮酸可以通过IlvBN/IlvGM、IlvC、以及IlvD转化为2-酮异戊酸。还参见上文Zhang，K.；Sawaya，M.R.等。
在生成2-酮丁酸或2-酮异戊酸后，对非天然亮氨酸生物合成途径的天然LeuABCD部分的遗传修饰起作用，以实现在一个或多个步骤中转化为C7-C11 2-酮酸。在某些实施方案中，涉及几个步骤，并在体内法中，采用至少一个经修饰的(内源或外源的)酶、酶复合体或其组合(本文中集中称为“LeuA′B′CD′”)来将2-酮丁酸或2-酮异戊酸转化为期望的C7-C11 2-酮酸。例如，当发生链延长时，2-酮丁酸首先转化为2-酮戊酸，然后转化为2-酮己酸，然后转化为2-酮庚酸，或者转化为多至2-酮十一酸，这取决于所期望的最终产物。替代地，2-酮异戊酸首先转化为2-酮异己酸，然后转化为2-酮异庚酸，依此类推。但是，可能任选地仅修饰一个酶、酶复合体或其组合-例如，LeuA′、LeuB′、或LeuCD′-以从2-酮丁酸或2-酮异戊酸开始获得可接受的或期望的C7-C11 2-酮酸产物。
一旦形成的延长的C7-C11 2-酮酸，可以就此使用，或者转化为C6-C10醛。对于这种转化，采用天然或经遗传修饰的硫胺素依赖型脱羧酶(DC′)，得到比所转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛。C6-C10醛自身具有广泛应用，还作为生产C6-C10醇、羧酸、烷烃及其组合的起始物或中间体，如上文所述。图1显示了C6-C10醇的生产，在一个实施方案中为辛醇。
为了如上文所述让非天然生物体能够在体内进行某些部分的转化，例如以便生成C6-C10醛和/或C6-C10醇，有利的是进行类似于以下描述的操作方案。一般而言，随此文包括的实施例涉及酶工程来改变氨基酸，以便修饰酶功能性，尤其是就活性和/或特异性而言。这种氨基酸的改变可以用于产生用于小规模目的的经修饰的酶，例如，用于体外分析；或者可以为基因组修饰的基础，以便生成适合于较大规模生产的微生物体菌株。
该方法学可以实施，如本领域技术人员所充分了解的。通常，利用合适的数据库如GenBank来获得天然酶的遗传密码，接着鉴定适合于修饰的密码子。这种鉴定可以用作本领域已知的蛋白工程方法的基础，其中计算机分子模拟鉴定并且还能区分结构位置，在该位置可以有效采用对酶/底物界面的修饰。接着采用称为定点突变的分子生物学技术进行给定的预期修饰。然后将经修饰的基因克隆进可复制质粒载体，当转化进宿主微生物体如大肠杆菌后，使得能够产生高于天然催化效率的酶。含有靶变体酶的大肠杆菌细胞也产生其它的天然蛋白，于是变体类型的酶必须经过纯化以与非靶蛋白和一般的细胞结构分开，留下显示出催化效率比天然的高即高于野生型的经纯化的酶。这可根据最适合于给定的具体酶的方法学，在体外适当测定。显示出具有期望水平催化效率的经测定的酶由此被证实为期望的遗传修饰产物，可以用于体外生产方法中，例如用于在体外生成给定的C7-C11 2-酮酸，例如2-酮壬酸，和/或C6-C10醛，例如辛醛，和/或从C6-C10醛制备的产物，例如C6-C10醇、羧酸或烷烃。
上述方法学的一具体应用为生成期望的生物体，用于大规模或其它商业规模发酵生产酶促产物，例如C6-C10醛，或者可以从它制备的C6-C10产物之一。可以通过将编码期望的改良酶的DNA或DNA片段插入已知或据信具有其它期望特征的第二微生物体的基因组中，该期望特征例如为能够在发酵中忍耐抑制剂、能够从特定的含碳底物产生丙酮酸(或乙酰辅酶A)，或者一些其它有利特性。因此，该第二微生物体现在是经遗传修饰的，因为其生成经遗传修饰的酶。
在另一实施方案中，还可能简单地鉴定出具有在期望的总途径中有用的天然酶的微生物体，或者将该生物体本身用作起始微生物体，或者将该微生物体基因组的适当酶编码部分转移进已经鉴定为可用于大规模发酵生产的生物体的基因组中。其中一个实例可以是选择已经产生适合的天然硫胺素依赖型脱羧酶(DC)和天然醇脱氢酶(ADH)的微生物体，并将该微生物体用作起始生物体或者用作转化生物体来制备遗传修饰的微生物体，以比野生型微生物体更高的产量或特异性来生产C6-C10醇。
实施例1
制备经修饰的LeuA(即，“LeuA′”)酶。
本实施例代表了制备工程化LeuA′酶的一个实施方案。这通过以一种大肠杆菌生物体开始来完成，该大肠杆菌经含有修饰LeuA基因的质粒转化以生成2-异丙基苹果酸合成酶变体(LeuA′)用于捕获目的2-酮酸来催化，该2-异丙基苹果酸合成酶变体具有高于平均值的催化效率(Kcat/KM)。为此，经鉴定为适合的特定基因为LeuA；GenBank登记号NC_000913.3基因ID：947465。
在式Kcat/KM中，Kcat为“转换数”，单位＝sec-1；KM为Michaelis-Menten常数；转换数等于VMax/[E]，其中VMax为最大速度，[E]为酶浓度。该等式应用于遵守Michaelis-Menten动力学的反应，通常提供在1秒内转化为产物的底物量(摩尔)。因此，值Kcat/KM表明有效催化能力并通过实验获得。因此具有相对较高Kcat/KM的变体是这样的，它们更有效缩合2-酮酸(图1中中间体I内n＝1-5)和乙酰辅酶A，由此产生相应的2-烷基苹果酸产物(图1中中间体II)，所述2-酮酸可以(在本示例性图1中)包括2-酮丁酸、2-酮异戊酸、2-酮己酸、2-酮庚酸和/或2-酮辛酸。
为了制备LeuA′变体，在指出为Phe-47、Leu-73、His-97、Phe-99、Ser-139、和Asn-167的氨基酸残基位点进行取代。通过在所选生物体如大肠杆菌的已知LeuA基因(GenBank：登记号NC_000913.3基因ID：947465)进行位点特异突变，将这些靶氨基酸的一个或多个转变为氨基酸甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸。还参见，美国专利8,298,798B2。可以将组氨酸“标签”(组氨酸-标签)附着于任何给定蛋白，作为蛋白纯化辅助。“加标签”可以包含在所选序列任一端插入的不同长度序列，并可以包括六(6)个组氨酸和所选的额外氨基酸，在加标签后，通过镍-氨三乙酸(Ni-NTA)层析纯化构成了酶变体(即，经修饰的酶)(Leu A′)并在大肠杆菌DE3细胞中表达的加组氨酸标签的酶。通过体外酶测定法，确定所纯化的变体酶在缩合各种2-酮酸(图1中中间体I内n＝1-5)方面的效率。对于一种可能适合于本测定的测定法，更多的信息参见例如Marcheschi，R.J.；Li，H.；Zhang，K.；Noey，E.L.；Kim，S.；Chaubey，A.；Houk，K.N.；Liao，J.C.“用于碳链延长的合成递归“+1”途径(Synthetic recursive“+1”pathway for carbon chain elongation)，”《ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)》，2012，7：689-697。鉴定并选择显示较高水平催化效率(Kcat/KM)的变体用于生成一种或多种期望的C6-C10醇。基于体外测定法也可以鉴定LeuA′变体的组合，它们一起工作来催化所鉴定的参与C6-C10醇生物合成中的任何或全部2-酮酸的缩合反应。
图2显示了从含碳底物形成2-酮丁酸的两条路线。第一条是通过形成丙酮酸的Wood-Ljungdahl合成气固定途径与随后的丙酮酸至2-酮丁酸途径的结合，第二条是通过形成丙酮酸的糖酵解或戊糖磷酸途径与随后的丙酮酸至2-酮丁酸途径的结合。任一情况下，一旦形成了2-酮丁酸，LeuABCD途径就开始链延长以生成期望的C7-C11 2-酮酸(本实施方案中，2-酮壬酸)，接着该C7-C11 2-酮酸通过(硫胺素依赖型的)脱羧酶脱羧以形成比所脱羧的C7-C11 2-酮酸少一个碳的C6-C10醛(本实施方案中，辛醛)。最终，C6-C10醛通过醇脱氢酶作用，生成相应的C6-C10醇(本实施方案中，1-辛醇)。
实施例2
I.制备对3-己基苹果酸(3-HM)有增加的活性的大肠杆菌LeuB′(异丙基苹果酸脱氢酶)变体。
在通过LeuABCD途径的递归活性生物合成2-酮壬酸期间，形成了作为LeuB底物的各种长度3-烷基苹果酸。为了2-酮壬酸的有效生物合成，期望LeuB有效地捕获3-乙基苹果酸(中间体III，n＝2；图1)、3-丙基苹果酸(中间体III，n＝3；图1)、3-丁基苹果酸(3-BM；中间体III，n＝4；图1)、3-戊基苹果酸(中间体III，n＝5；图1)以及3-己基苹果酸(3-HM；中间体III，n＝6；图1)用于催化。天然LeuB在捕获较长的非天然3-烷基苹果酸底物方面是相对无效率的。为了改善天然LeuB捕获3-己基苹果酸用于催化的效率，采用以下描述的蛋白工程技术修饰天然LeuB的活性位点。
从LeuB结构模型鉴定形成大肠杆菌LeuB的3-异丙基苹果酸结合位点的残基，该LeuB结构模型通过同源模拟并将氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)异丙基苹果酸脱氢酶(蛋白数据库(PDB)编码1A05)的晶体结构模型用作模板来构建的，如Imada，K.；Inagaki，K.；Matsunami，H.；Kawaguchi，H.；Tanaka，H.；Tanaka，N.；Namba，K.“与3-异丙基苹果酸复合的3-异丙基苹果酸脱氢酶分辨率结构：Glu88在独特的底物识别机制中的作用(Structure of 3-isopropylmalate dehydrogenase in complex with3-isopropyl-malate atresolution：the role of Glu88in the unique substrate-recognitionmechanism)，”《结构(Structure)》，1998，6：971-982所报道的。选择Leu-96和Val-198用于修饰并制备变体，其中一个或二者分别被缬氨酸、丙氨酸和/或甘氨酸所替换，如表1中所显示的。
表1
*通过对野生型氨基酸序列进行的修饰来标识酶。每一个的名称包括作为野生型酶的氨基酸的缩写的第一字母；数字为其在氨基酸序列内的位置；以及最后的字母，其为在该位置取代的氨基酸的缩写。L＝亮氨酸；A＝丙氨酸；G＝甘氨酸；以及V＝缬氨酸。
例如，酶L96A是通过将大肠杆菌异丙基苹果酸脱氢酶中Leu-96取代为丙氨酸而制备的；酶L96G是通过将Leu-96取代为甘氨酸而制备的；以及酶L96G/V198A是通过将Leu-96取代为甘氨酸和Val-198取代为丙氨酸而制备的。表1中剩下的LeuB变体根据所取代的氨基酸命名。
表达、纯化并接着评价每一工程化的LeuB变体对三种底物的活性，它们为3-异丙基苹果酸(3-IPM)、3-丁基苹果酸(3-BM)和3-己基苹果酸(3-HM)。3-IPM为LeuB的天然底物，于生物合成亮氨酸期间在微生物体内形成。3-BM和3-HM为LeuB的非天然底物，将在C7-C112-酮酸如2-酮壬酸生物合成期间在细胞内形成。
在两步骤中采用高通量酶测定法进行LeuB变体评价，如以下描述的。开始，将所有的变体都测试对单一高浓度的3-IPM、3-BM和3-HM的活性。在初始评价后，在选择数量的变体上进行详细动力学分析以确定最大速率(Kcat)、Michaelis-Menten常数(KM)、和酶的催化效率(Kcat/KM)。
在将所有的或者一些3-烷基苹果酸底物如3-HM转化为相应的C7-C11 2-酮酸方面比野生型酶更有效的(更高kcat/KM)的LeuB′变体是所期望的，因为它们改善了相关“+1”途径的总体效率。
II.LeuB(异丙基苹果酸脱氢酶)及其工程化变体在大肠杆菌中的异源表达。
为了评价表1中列出的野生型LeuB和工程化LeuB′变体的底物特异性，将所有蛋白的基因分别表达进大肠杆菌细胞，并从细胞分离蛋白产物。为了获得蛋白产物，从EcoGene网站(http：//ecogene.org)下载LeuB基因序列(EcoGene登记号EG11577(序列表，SEQ ID 1)。在LeuB基因开放阅读框中最后氨基酸密码子后添加额外11个氨基酸的密码子。这些额外氨基酸包括6个组氨酸加5个额外氨基酸，作为组氨酸标签附着以帮助在采用Ni-NTA层析的单一步骤中纯化蛋白。化学合成带有11个额外氨基酸的整个LeuB序列的基因序列，克隆进pETDuet-1载体(EMD Biosciences)T7聚合酶启动子下游，并由合成基因组学公司(Synthetic Genomics Inc.)(SanDiego，CA)测序。注意到本文包括的序列表都没有显示所用的组氨酸标签，其在本例中为Gly-Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser。
在以丙氨酸、缬氨酸和/或甘氨酸的密码子替换所选氨基酸(Leu-96和/或V-198)的密码子之后，也化学合成表1中列出的LeuB′变体的基因(序列表，SEQ ID2至SEQ ID10)，并克隆进pETDuet-1载体。将含有LeuB或其变体基因的pETDuet-1载体转化进大肠杆菌，表达LeuB或其变体，并最终纯化，如下文所描述的。
A.大肠杆菌的转化利用从EMD Biosciences获得的感受态BL21(DE3)细胞进行大肠杆菌表达研究。按试剂盒说明书进行转化，包括将50微升(μL)等份的感受态细胞与1μL载体混合。利用氨苄青霉素为标记物筛选带有LeuB表达载体的细胞。
B.LeuB及其变体在大肠杆菌中的表达：在含有每毫升100微克(μg/mL)氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选带有LeuB或其变体的表达载体的大肠杆菌转化子。将这些平板在37摄氏度(℃)温浴16小时(h)。将转化子的单一菌落转移进含有100μg/mL氨苄青霉素的50毫升(mL)的Lysogeny Broth(LB)培养基中，开始起子培养，以每分钟220转(rpm)摇动于37℃温浴过夜。第二天，将7mL的起子培养物接种进800mLTerrific Broth(TB)中，让培养物在37℃温浴，直至培养物在600纳米(nm)的光密度(OD600nm)处达到0.5。以最终浓度1毫摩尔(mM)添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，以诱导LeuB或LeuB变体(LeuB′)基因的表达，并将培养物转移至15℃培养箱16小时。16小时结束时，以8000rpm离心来沉淀细胞。将细胞沉淀物分为两等份，在纯化前于-80℃保存过夜。
C.LeuB及其变体的纯化将来自400mL表达培养物的大肠杆菌细胞沉淀悬浮在含有1μg/mL DNAse(Thermo Fisher Scientific，Inc.，Rockford，IL)、1μg/mL溶菌酶(ThermoFisher Scientific，Inc.，Rockford，IL)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、以及蛋白酶抑制剂混合物(RPI Corp.，Mount Prospect，IL)的B-PER试剂(ThermoFisher Scientific，Inc.，Rockford，IL)中。室温下轻轻摇晃悬浮液30分钟(min)，以15,000倍重力(xg)离心20min来沉淀细胞碎片。分离上清液，用经平衡缓冲液(50mM磷酸钠，pH 8.0，含有300mM氯化钠、20mM咪唑、50μL蛋白酶抑制剂混合物以及15体积百分比(vol％)甘油)预平衡的5mL Co-NTA树脂(ThermoFisher Scientific，Inc.，Rockford，IL)温浴。在4℃温浴1h时间后，以5体积的平衡缓冲液洗涤LeuB结合树脂。然后以含有200mM咪唑的平衡缓冲液从Co-NTA树脂洗脱LeuB及其变体。最终将洗脱的蛋白对磷酸盐缓冲盐水透析，并以20vol％甘油溶液在-20℃保存。
III.确定野生型和工程化LeuB变体的底物特异性。
在两步骤中采用高通量酶测定法进行LeuB变体评价，如以下描述的。开始，筛选所有的变体对单一高浓度的3-IPM、3-BM和3-HM的活性。在初始评价后，在选择数量的变体上进行详细动力学分析以确定最大速率(kcat)、Michaelis-Menten常数(KM)、和变体酶的催化效率(kcat/KM)。
改动适合的分光光度LeuB酶测定法以适应于96孔板中高通量形式，用于评价LeuB及其变体(显示在表1中)对3-异丙基苹果酸(3-IPM)、3-丁基苹果酸(3-BM)和3-己基苹果酸(3-HM)的动力学。参见，例如Hsu，Y.；Kohlhaw，G.B.“酿酒酵母中亮氨酸的生物合成。β-异丙基苹果酸脱氢酶的纯化和表征(Leucine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae.Purification and characterization of beta-isopropylmalate dehydrogenase)，”《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，1980，255：7255-7260。在这些实验中确定了变体对三种底物氧化脱羧的稳态动力学参数(kcat、KM和kcat/KM)。
A.用于鉴定功能性LeuB变体的HTP筛选测定：
该HTP筛选测定法涉及将750微摩尔(μM)的3-IPM、1mM 3-BM或1mM 3-HM与2mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)在LeuB测定缓冲液(50mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)，pH 8.0，含有30mM氯化钾(KCl)和5mM氯化镁(MgCl2))中25℃温浴。通过在25℃添加稀释在测定缓冲液中含有0.3微克(μg)至1.1μg LeuB变体的工作酶储备液起始反应，该测定缓冲液含有1mM DTT和每毫升1毫克(mg/mL)的牛血清白蛋白(BSA)。将含有200μL反应混合物的微孔板以2500x g离心15秒(sec)，反应混合物的吸光度变化在经25℃预平衡的BioTekTM微孔板检测仪上于340nm以分光光度法跟踪。酶反应的起始速率从340nm处NADH生成的速率并采用NADH的消光系数(6.22每毫摩尔每厘米(mM-1cm-1))来计算。所有变体的活性都以存在于反应混合物中的酶的量归一化，并表达为纳摩尔每分钟每微克(nmol.min-1.μg-1)(表2)。用于归一化活性的蛋白浓度采用660nm总蛋白测定试剂盒并采用BSA作为标准物来确定，该试剂盒从PierceBiotechnology Inc.TM获得，可从Thermo Fisher Scientific，Inc.公司购得。
B.用于确定LeuB变体对3-IPM、3-BM和3-HM氧化脱羧的动力学参数的HTP LeuB酶测定法：
该HTP动力学测定法涉及8个不同浓度的3-IPM(0至1.2mM)或3-BM(0至2mM)或3-HM(0至2mM)与2mM NAD+在LeuB测定缓冲液(50mM HEPES，pH 8.0，含有30mM KCl和5mM MgCl2)中于25℃温浴。通过添加在含有1mM DTT和1mg/mL BSA的测定缓冲液中预稀释的0.008μg至0.5μgLeuB变体起始反应。将含有200μL反应混合物的微孔板以2500x g离心15sec，吸光度变化在保持25℃的BioTekTM微孔板检测仪上于340nm以分光光度法跟踪。酶反应的起始速率从340nm处NADH生成的速率并采用NADH的消光系数(6.22mM-1cm-1)来计算。利用采用GraphPad PrismTM软件进行的非线性回归将数据拟合至Michaelis-Menten等式，来确定3-烷基苹果酸的氧化脱羧动力学参数(kcat、KM和kcat/KM)。表3列出了野生型和工程化变体对三种底物的动力学参数。采用从Pierce Biotechnology Inc.TM获得的660nm总蛋白测定试剂盒、将BSA用作标准物来确定反应混合物中酶的量。
C.结果与讨论
为了改善生成2-酮壬酸的“+1”途径的效率，有利的是异丙基苹果酸脱氢酶会有效催化所有的中间体3-烷基苹果酸的氧化脱羧。用于评价LeuB变体的三种底物为这些中间体3-烷基苹果酸的代表，即3-异丙基苹果酸(3-IPM)为预期在“+1”重复途径的较早循环中形成的较短3-烷基苹果酸底物的代表；3-丁基苹果酸(3-BM)为中间长度3-烷基苹果酸以及形成的代表；以及3-己基苹果酸(3-HM)将由LeuB氧化脱羧形成2-酮壬酸。
最初，LeuB′变体针对3-IPM、3-BM和3-HM中每一个的单一高浓度筛选活性(表2)。
表2.野生型LeuB和LeuB′变体的评价。
*如HTP筛选测定法中所描述，确定LeuB变体对三种底物3-异丙基苹果酸(3-IPM)、3-丁基苹果酸(3-BM)、和3-己基苹果酸(3-HM)的特异活性。所显示的特异活性为来自筛选测定的重复实验均值。两值之间的范围小于20％。
ND＝实验条件下未检出。
尽管不希望被任何理论所束缚，显示在表2中的结果还是可以解释为，提示以较小疏水侧链氨基酸如缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代Leu-96和/或Val-198可以在某些情况下降低对3-IPM的酶活性，同时增加对3-HM的酶活性。
变体L96A、L96G、V198A、L96A/V198A、L96G/V198A、和L96G/V198G表现出比野生型酶更高的对3-HMe的活性，接受进一步的动力学分析。这种分析提示，野生型LeuB在捕获其天然底物3-IPM用于催化方面是高度有效的。如表3中所显示的，发现野生型酶的催化效率高于3-HM的1,000倍，以及捕获3-BM的效率是两底物的中间值。因此，当重复“+1”途径用于延长2-酮丁酸至C7-C112-酮酸、如本例中2-酮壬酸时，野生型LeuB酶逐渐变成了较差的催化剂。
以逐渐变小的残基如丙氨酸(L96A)或甘氨酸(L96G)取代大肠杆菌LeuB中Leu-96，导致捕获带有较长烷基链的底物的效率改善，同时在捕获带有较短烷基链的底物方面效率降低。L96A变体在捕获3-IPM方面比野生型酶大约4倍无效，而在捕获3-BM方面稍差(见表3)。L96G变体在捕获3-IPM方面效率比野生型酶低100倍，而在捕获3-HM方面比野生型酶高80倍。这提示Leu-96阻断了捕获较长烷基苹果酸，例如3-HM。
以较小氨基酸残基如丙氨酸取代大肠杆菌LeuB中Val-198改善了酶在捕获较长3-烷基苹果酸如3-HM方面的催化效率，同时降低了捕获较短烷基苹果酸如3-IPM的效率。从V198A变体的相对效率来看这是明显的，当与野生型LeuB的效率比较时，V198A变体催化3-HM的转化高5倍，催化3-IPM的转化低1,000倍(见表3)。
表3.工程化LeuB酶的底物特异性
3-IPM＝3-异丙基苹果酸；3-BM＝3-丁基苹果酸；以及3-HM＝3-己基苹果酸。对于对底物之一有高Michaelis-Menten常数(KM)的LeuB′变体，仅报告了催化效率(kcat/KM)。显示了来自最少3个独立实验的均值±标准差(S.D.)。
*表明活性低，因此没有计算该参数。
还注意到以较小疏水残基取代Leu-96和Val-98会增加捕获3-HM的效率，同时降低捕获3-IPM的效率。与野生型酶相比，L96A/V198A和L96G/V198A变体在捕获3-HM方面分别表现出高12倍或102倍的效率(表3)，而在同时，这些变体对于3-IPM是非常差的催化剂，这从与野生型LeuB酶相比时下降超过3000倍可明显看出。
这些数据显示，经遗传修饰的LeuB′酶通常以比野生型酶更高的催化效率运转，以催化3-丁基苹果酸形成2-酮庚酸，或者催化3-己基苹果酸形成2-酮壬酸，如所显示的。还可推断，其在催化3-戊基苹果酸形成2-酮辛酸方面是更有效的。最终，它还以更高的催化效率进行这些转化的组合。
LeuB′变体上的动力学数据提示，通过野生型Leu酶和一种或多种列在表3中的变体的共表达，将会通过“+1”途径的重复实现一种有效形成C7-C11 2-酮酸、例如但不限于2-酮壬酸的方法。
实施例3
制备经修饰的LeuCD(即，“LeuCD′”)酶。
在本实施例3的实施方案中，描述一种类似于实施例1中用于LeuA′酶的方法。该方法从一种大肠杆菌生物体开始，该大肠杆菌生物体由含有LeuC和LeuD基因的质粒转化，结果其生成经修饰的2-异丙基苹果酸异构酶复合体，该异构酶复合体在将由LeuA′生成的2-烷基苹果酸(图1中，中间体II中n＝1-5)异构化为它们相应的3-烷基苹果酸(图1中，中间体III中n＝1-5)方面有更高的催化效率(kcat/KM)。通过改变从GenBank获得的LeuC和LeuD基因(LeuC：GenBank登记号NC 000913.3基因ID：945076；以及LeuD：GenBank登记号NC 000913.3，基因ID：945642)一些遗传密码子，即，取代氨基酸序列中的一个或多个氨基酸，合成经修饰的LeuC和LeuD基因。通过采用定点突变取代LeuC和/或LeuD活性位点内的和/或附近的一个或多个残基，来制备每一工程化变体。.每一经修饰的酶在大肠杆菌DE3细胞中表达为带组氨酸标签的蛋白，接着采用Ni-NTA层析来纯化。纯化的变体酶在异构化各种2-烷基苹果酸方面的效率通过例如可以用于测定顺乌头酸酶的体外偶联酶测定法来确定。参见，例如，Han，D.；Canali，R.；Garcia，J.；Aguilera，R.；Gallaher，T.K.；Cadenas，E.“过氧化亚硝酸盐灭活顺乌头酸酶的位点和机制：由柠檬酸盐和谷胱甘肽调节(Sites and mechanisms of aconitase inactivation byperoxynitrite：Modulation by citrateand glutathione)，”《生物化学(Biochemistry)》，2005，44：11986-11996。鉴定并选择显现出比天然酶复合体更高的催化效率(kCAT/KM)的变体，用于生成C6-C10醇，例如1-辛醇。基于体外测定法，还鉴定了LeuCD′变体的组合，它们一起工作来催化参与生物合成可应用的C7-C11 2-酮酸如2-酮壬酸的全部中间体2-烷基苹果酸(图1中，中间体II中n＝1-5)的异构化。
实施例4
制备经修饰的DC(“DC′”，硫胺素依赖型脱羧酶)酶。
在本实施例4的实施方案中，采用类似于实施例1中所描述的为LeuA′酶所使用的方法。该方法从工程化酮异戊酸脱羧酶(例如，来自乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis)菌株IFPL730，GenBank登记号AJ746364.1GI：51870501)或者硫胺素二磷酸依赖的苯丙酮酸脱羧酶(例如，来自酿酒酵母(基因YDR380W)或巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)(GeneBank登记号L26240.1)开始。通过采用位点特异突变将起始氨基酸转变为甘氨酸、丙氨酸或缬氨酸，来取代活性位点内的和/或附近的一个或多个氨基酸，由此制备每一工程化变体。鉴定并选择对较小的2-酮酸(图1中，中间体I中n＝1-5)表现出相对较低的催化效率(kCAT/KM)但对C7-C112-酮酸如2-酮壬酸保留或显示出相对较高效率的变体，用于生成期望的C6-C10醇，例如1-辛醇。(注意到，对于苯丙酮酸脱羧酶的情况，工程化酶通常可以在催化苯丙酮酸的转化方面比野生型酶差。每一经修饰的酶表达为带组氨酸标签的蛋白，在大肠杆菌DE3细胞中异源表达，并采用Ni-NTA层析纯化。通过体外偶联酶测定法，确定纯化的变体酶在期望的C7-C112-酮酸如2-酮壬酸脱羧形成比所转化的C7-C112-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛如辛醛中的效率。可以用于本目的的一种适合的测定方法在例如Zhang，K.；Sawaya，M.R.；Eisenberg，D.S.；Liao，J.C.“用于生物合成非天然醇类的扩展代谢(Expanding metabolism for biosynthesisof nonnatural alcohols)，”《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，2008，105：20653-20658中有描述。
实施例5
制备经修饰的ADH(“ADH′”，醇脱氢酶)酶。
本制备可以以类似于实施例1中所描述的用于LeuA′酶的方式来完成。在本例中，该方法以工程化人(GenBank登记号NP_000662.3GI：71565154)或大肠杆菌(GenBank登记号NC_000913.3基因ID：944988)第三类醇脱氢酶开始，该酶能够还原C6-C10醛如辛醛为相应的C6-C10醇，如1-辛醇。在某些实施方案中，该起始醇脱氢酶可以为来自酿酒酵母的ADH。接着，通过采用位点特异突变取代所选的醇脱氢酶如第三类醇脱氢酶的活性位点内的和/或附近的一个或多个氨基酸残基，可以制备每一工程化变体。工程化酶在将所选的C6-C10醛如辛醛还原为相应的C6-C10醇如1-辛醇方面具有比天然酶更高的催化效率(kcat/KM)。然后每一经修饰的酶表达为带组氨酸标签的蛋白，在大肠杆菌DE3细胞中异源表达，并采用Ni-NTA层析纯化。通过体外酶测定法，确定所纯化的变体酶在还原C6-C10醛方面的效率。适合的测定方法在例如Sanghani，P.C.；Stone，C.L.；Ray，B.D.；Pindel，E.V.；Hurley，T.D.；Bosron，W.F.“人谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶的动力学机制(Kinetic mechanism of human glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase)，”《生物化学(Biochemistry)》，2000，39：10720-10729中有描述。鉴定并选择对C6-C10醛显示较高催化效率(kcat/KM)的变体，用于C6-C10醇生产。

Claims (8)

1.一种制备C7-C11 2-酮酸的方法，包括让选自2-酮丁酸和2-酮异戊酸的底物与
(1)天然或经遗传修饰的LeuA酶；
(2)经遗传修饰的LeuB′酶，其中所述酶
(a)从大肠杆菌获得并具有对应于序列表SEQ ID 1的氨基酸序列；所述酶经修饰，是因为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸独立地取代Leu-96、Val-198、或其组合；或
(b)所述酶具有与序列表SEQ ID 1的所述氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列；所述酶与(a)中一样经修饰；以及
(3)天然或经遗传修饰的LeuCD′酶复合体；
在所述2-酮丁酸或2-酮异戊酸通过一个或多个步骤转化为C7-C11 2-酮酸的条件下接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述氨基酸序列
(1)在Leu-96被甘氨酸取代而被修饰；
(2)在Val-198被丙氨酸取代而被修饰；
(3)在Leu-96被丙氨酸取代和在Val-198被丙氨酸取代而被修饰；或
(4)在Leu-96被甘氨酸取代和在Val-198被丙氨酸取代而被修饰。
3.如权利要求1或2所述的方法，还包括让所述C7-C11 2-酮酸与硫胺素依赖型脱羧酶在所述C7-C11 2-酮酸转化为比所转化的所述C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下接触。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括让所述C6-C10醛和至少一种酶接触，所述至少一种酶选自
(1)醇脱氢酶，在让所述C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇的条件下接触；
(2)醛脱氢酶，在让所述C6-C10醛转化为相应的C6-C10羧酸的条件下接触；
(3)脂肪醛脱羧酶，在让所述C6-C10醛转化为相应的C6-C10烷烃的条件下接触；以及
(4)它们的组合。
5.一种表达或过表达酶的微生物体，所述酶为
(1)从大肠杆菌获得并具有对应于序列表SEQ ID 1的氨基酸序列；所述酶经修饰，是因为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸独立地取代Leu-96、Val-198、或其组合；或
(2)具有与序列表SEQ ID 1的所述氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列；所述酶与(1)中一样经修饰。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述氨基酸序列
(1)在Leu-96被甘氨酸取代而被修饰；
(2)在Val-198被丙氨酸取代而被修饰；
(3)在Leu-96被丙氨酸取代和在Val-198被丙氨酸取代而被修饰；或
(4)在Leu-96被甘氨酸取代和在Val-198被丙氨酸取代而被修饰。
7.一种制备C6-C10醛的方法，包括
(1)让含碳底物与一种或多种天然或经遗传修饰的酶在形成2-酮丁酸或2-酮异戊酸的条件下接触；
(2)让所述2-酮丁酸或2-酮异戊酸与
(a)天然或经遗传修饰的LeuA酶；
(b)经遗传修饰的LeuB′酶，其中所述酶为
(i)从大肠杆菌获得并具有对应于序列表SEQ ID 1的氨基酸序列；所述酶经修饰，是因为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸独立地取代Leu-96、Val-198、或其组合；或
(ii)所述酶具有与序列表SEQ ID 1的所述氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列；所述酶与(a)中一样经修饰；以及
(c)天然或经遗传修饰的LeuCD′酶复合体；
在所述2-酮丁酸或2-酮异戊酸通过一个或多个步骤转化为C7-C11 2-酮酸的条件下接触；以及
(3)让所述C7-C11 2-酮酸与天然或经遗传修饰的硫胺素依赖型脱羧酶在所述C7-C11 2-酮酸转化为比所转化的所述C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下接触；
(1)、(2)和(3)的每一个在一个或多个步骤中发生；
其中(1)、(2)和(3)独立地在经遗传修饰的微生物体体内或外部发生。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述经遗传修饰的LeuB′酶以高于野生型LeuB酶的催化效率催化：
(1)3-丁基苹果酸的转化以形成2-酮庚酸；
(2)3-戊基苹果酸的转化以形成2-酮辛酸；
(3)3-己基苹果酸的转化以形成2-酮壬酸；或
(4)它们的组合。
CN201480065279.XA 2013-12-12 2014-12-10 通过微生物代谢途径的遗传修饰制备延长的2-酮酸和由此生成的c6-c10化合物的方法 Pending CN105793431A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361915040P 2013-12-12 2013-12-12
US61/915040 2013-12-12
PCT/US2014/069438 WO2015089127A1 (en) 2013-12-12 2014-12-10 Processes to prepare elongated 2-ketoacids and c6-c10 compounds therefrom via genetic modifications to microbial metabolic pathways

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105793431A true CN105793431A (zh) 2016-07-20

Family

ID=52293198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480065279.XA Pending CN105793431A (zh) 2013-12-12 2014-12-10 通过微生物代谢途径的遗传修饰制备延长的2-酮酸和由此生成的c6-c10化合物的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9951356B2 (zh)
EP (1) EP3080285B1 (zh)
CN (1) CN105793431A (zh)
BR (1) BR112016012712B1 (zh)
CA (1) CA2933470C (zh)
ES (1) ES2926950T3 (zh)
SA (1) SA516371281B1 (zh)
WO (1) WO2015089127A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110462049A (zh) * 2016-09-30 2019-11-15 陶氏环球技术有限责任公司 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法
CN111201321A (zh) * 2017-09-29 2020-05-26 陶氏环球技术有限责任公司 基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物及用其制备伸长的2-酮酸和c5-c10化合物的方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016094604A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Dow Global Technologies Llc Genetically modified phenylpyruvate decarboxylase, processes to prepare, and uses thereof
CN116376989B (zh) * 2022-04-11 2023-10-24 元素驱动(杭州)生物科技有限公司 一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010045629A2 (en) * 2008-10-18 2010-04-22 The Regents Of The University Of California Production of c5-c8 alcohols using evolved enzymes and metabolically engineered microorganisms

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008308477A1 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Bio Architecture Lab, Inc. Biofuel production
JP5578767B2 (ja) 2008-01-28 2014-08-27 克己 飯田 蒸発装置
EP2464736A4 (en) 2009-08-12 2013-07-31 Gevo Inc PATIENT LOCALIZATION OF CYTOSOLIC ISOBUTANOL FOR THE MANUFACTURE OF ISOBUTANOL
US8372610B2 (en) * 2010-09-15 2013-02-12 Ls9, Inc. Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells
WO2012135731A2 (en) 2011-04-01 2012-10-04 The Regents Of The University Of California Alcohol production from recombinant microorganisms
WO2013123454A1 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 The Regents Of The University Of California Integrated electro-bioreactor
WO2016094604A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Dow Global Technologies Llc Genetically modified phenylpyruvate decarboxylase, processes to prepare, and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010045629A2 (en) * 2008-10-18 2010-04-22 The Regents Of The University Of California Production of c5-c8 alcohols using evolved enzymes and metabolically engineered microorganisms

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.R. SHEN等: "A Synthetic Iterative Pathway for Ketoacid Elongation", 《METHODS IN ENZYMOLOGY》 *
ELIZABETH A FELNAGLE等: "Engineering synthetic recursive pathways to generate non-natural small molecules", 《NATURE CHEMICAL BIOLOGY》 *
RYAN J. MARCHESCHI等: "A Synthetic Recursive "+1" Pathway for Carbon Chain Elongation", 《ACS CHEM BIOL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110462049A (zh) * 2016-09-30 2019-11-15 陶氏环球技术有限责任公司 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法
CN111201321A (zh) * 2017-09-29 2020-05-26 陶氏环球技术有限责任公司 基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物及用其制备伸长的2-酮酸和c5-c10化合物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2933470C (en) 2023-10-03
BR112016012712A2 (pt) 2017-09-26
US9951356B2 (en) 2018-04-24
ES2926950T3 (es) 2022-10-31
EP3080285B1 (en) 2022-07-27
EP3080285A1 (en) 2016-10-19
SA516371281B1 (ar) 2018-09-20
CA2933470A1 (en) 2015-06-18
BR112016012712B1 (pt) 2023-10-03
US20160355850A1 (en) 2016-12-08
WO2015089127A1 (en) 2015-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bailey Toward a science of metabolic engineering
US8163516B2 (en) Selection of ADH in genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol
Blombach et al. Corynebacterium glutamicum tailored for high-yield L-valine production
JP2010525816A (ja) 代謝改変光合成微生物を用いて二酸化炭素を炭化水素に直接変換する方法
JP4573365B2 (ja) 改良された性質を有する形質転換微生物
US20160289708A1 (en) Methods and compositions for production of acetaldehyde
US10260060B2 (en) Genetically modified phenylpyruvate decarboxylase, processes to prepare, and uses thereof
Lee et al. Molecular cloning and biochemical characterization of a novel erythrose reductase from Candida magnoliae JH110
JP2012506716A (ja) グリセロールを化学物質に変換するための微好気性培養
CN105793431A (zh) 通过微生物代谢途径的遗传修饰制备延长的2-酮酸和由此生成的c6-c10化合物的方法
Sun et al. Integration of metabolic pathway manipulation and promoter engineering for the fine‐tuned biosynthesis of malic acid in Bacillus coagulans
CN101748069A (zh) 一种重组蓝藻
KR102149044B1 (ko) 2-히드록시 감마 부티로락톤 또는 2,4-디히드록시-부티레이트 의 제조 방법
CN103725718B (zh) 一种生物法合成乙偶姻及其衍生物的方法
Zhang et al. Synthetic engineering of Corynebacterium crenatum to selectively produce acetoin or 2, 3-butanediol by one step bioconversion method
CN112280725B (zh) 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法
CN113774078B (zh) 一种重组巴斯德毕赤酵母菌株、其构建方法和应用
CN111500614A (zh) 高效催化l-苏氨酸合成2,5-dmp的质粒及其构建与应用
CA3068459A1 (en) Microorganism with stabilized copy number of functional dna sequence and associated methods
Wang et al. Elevated production of 3-hydroxypropionic acid in recombinant Escherichia coli by metabolic engineering
CN113403333A (zh) 一种生物合成乙醇的构建体，菌株以及生产乙醇的方法
Xie Metabolic engineering for optimizing isobutanol production in Synechocystis PCC 6803
KR20120104765A (ko) 2, 3-부탄다이올 생산량 향상을 위한 락테이트 디하이드로겐에이즈가 제거 된 돌연변이 엔테로박터 에어로진스
CN109790554A (zh) 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20210101

AD01 Patent right deemed abandoned