CN110462049A - 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其c5-c10化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了基因修饰的LeuCD'酶复合物，利用基因修饰的LeuCD'酶复合物制备C7‑C112‑酮酸的方法，以及包括修饰的LeuCD酶复合物的微生物有机体。本发明公开的基因修饰的LeuCD'酶复合物，制备C7‑C112‑酮酸的方法以及包括修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体可特别用于在体内和体外产生C6‑C10醛、烷烃、醇和羧酸。

Description

通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和其 C5-C10化合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月30日提交的美国临时申请序列号62/402,586和 2016年9月30日提交的美国临时申请序列号62/402,569的权益，这两个申请通过引用整体并入本文。
序列表
该申请通过引用并入2016年8月23日创建并且在2016年9月30日于美国临时申请序列号62/402,569中提交的94,000字节的ASCII文本文件“79046-WO-PCT_SequenceListing.txt”中的材料。
技术领域
本公开一般涉及基因修饰的LeuCD'酶复合物，利用基因修饰的LeuCD' 酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物。
背景技术
对获得和使用化石燃料的未来稀缺性、成本和环境影响的担忧刺激了人们开发廉价可再生生物质作为燃料和由其制造的化学品的替代来源。随着原油价格的上涨，生物基化学品和工业产品已成为其石油衍生产品的有吸引力的替代品。使用厌氧微生物的发酵过程为将生物质和农业废物转化为有用产品提供了有希望的途径，同时解决了处理低价值农产品和食品加工副产品/废物时可能遇到的问题。可由低成本生物质原料制备的一些有用产品是C6-C10醛、C6-C10醇、 C6-C10羧酸和C5-C9烷烃，包括特别是C6-C10醇。
C6-C10醇使用石油化学和天然原料方法生产。石油化学方法基于乙烯低聚反应。例如，齐格勒法在高压下使用铝介导乙烯低聚反应以产生三烷基铝形态。三烷基铝形态在干燥空气下氧化并水解，得到末端醇的泊松分布，其长度范围为C2-C26(仅包括偶数碳链原子)。通过乙烯低聚反应，例如通过Shell高级烯烃方法(即SHOP)产生烯烃的加氢甲酰化，然后还原产生具有奇数碳链原子的醇。天然油(比如，例如棕榈仁和椰子)的脂肪酸通过氢化、酯交换和还原的油脂化学转换的转化也用于产生长链醇，其中大部分醇的碳链长度大于C10。当前生产方法的显著缺点是对窄碳链长度分布缺乏选择性。此外，齐格勒法也不是完美的，因为其副产物是水合氧化铝(即Al2O3·[H2O]x)。因此，需要鉴定产生C6-C10醇、C5-C9烷烃和C6-C10羧酸的更好和更便宜的方法。然而，微生物有机体经常无法以经济上可行的速率或产率生产许多基于石油化学的产品。例如，虽然代谢工程已被广泛用于构建途径和/或将代谢物通向感兴趣的途径，但乙醇是目前使用微生物有机体产生的最常见的生物化学品。在生物燃料和化学工业中，正在积极地寻求经济上可行的生产C6-C10醇和C6-C10羧酸的方法。
通过微生物发酵成功生产天然氨基酸已经引起了对利用氨基酸生物合成途径生产目标化学品(包括较长链醇、烷烃和羧酸)的显著兴趣。特别感兴趣的是2-酮酸，其为氨基酸生物合成中的关键中间体，可用于细胞内化学物质的生物合成。亮氨酸生物合成途径中的三种酶参与延长2-酮酸，并且可以将2-酮丁酸、2-酮异戊酸和/或2-甲基-2-酮戊酸转化为更长链的2-酮酸。这些酶通常被称为异丙基苹果酸合成酶、异丙基苹果酸异构酶和异丙基苹果酸脱氢酶，而不涉及任何特定的微生物有机体。具体而言，在大肠杆菌中，这些酶分别被称为LeuA (GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：947465)、LeuB(GenBank：登录号 NC000913.3基因ID：944798)和LeuCD(GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：945076和基因ID：945642)。通过大肠杆菌的LeuA基因产物的工程化延长细胞内2-酮酸的长度的可行性扩大了可以由2-酮酸产生的生物化学物质的范围。在大肠杆菌中，LeuABCD基因的产物将2-酮酸的长度延长一个碳单位。在亮氨酸生物合成期间观察到这种延长，其中LeuABCD基因的产物共同作用以将2-酮异戊酸(5-碳酸)转化为2-酮异己酸(6-碳酸)。此外，LeuA活性位点的扩增允许将C4酮酸、2-丁酮酸(即2-酮丁酸)递归延长至C9 2-酮酸、2- 酮壬酸(即2-酮壬酸)。然而，需要继续开发LeuABCD基因和使其工程化以允许有效产生C7-C11 2-酮酸并避免在用于延长2-酮酸的途径的后期阶段中的主要瓶颈。
因此，持续需要用于生产更长链醛、烷烃、醇和羧酸的经济上可行且有效的方法。
发明内容
本公开的实施例通过提供基因修饰的LeuCD'酶复合物，利用基因修饰的 LeuCD'酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体来满足那些需要。基因修饰的LeuCD'酶复合物，制备C7-C11 2-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体可用于生产生物基化学品和工业产品作为化石燃料的替代品。本发明公开的基因修饰的 LeuCD'酶复合物，制备C7-C11 2-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体可用于在体内和体外生产更长链的醛、烷烃、醇和羧酸。
根据本公开的实施例，提供了LeuCD'酶复合物。LeuCD'酶复合物包括：(a) LeuC亚基和(b)LeuD亚基。LeuC亚基(a)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuC亚基，其包括与SEQID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和 (2)基因修饰的LeuC亚基，其包括与SEQ IDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、 Leu-411或其组合。LeuD亚基(b)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(2)基因修饰的LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、 His-88或其组合。LeuCD'酶复合物包括(a)(1)和(b)(2)的组合、(a)(2) 和(b)(2)的组合、或(a)(2)和(b)(1)的组合，并且基因修饰的LeuCD' 酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
根据本公开的其他实施例，提供了用于制备C7-C11 2-酮酸的方法。该方法包括在将C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种转化为C7-C11 2-酮酸的条件下，提供 C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种与(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶，(B)至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶，和(C)至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物。基因修饰的 LeuCD'酶复合物包括(1)LeuC亚基和(2)LeuD亚基。LeuC亚基(1)选自由以下组成的群组：(i)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(ii)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQ ID NO:1 具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。LeuD亚基(2)选自由以下组成的群组：(i)天然LeuD亚基，其包括与SEQ IDNO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；(ii)基因修饰的LeuD'亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。基因修饰的LeuCD'酶复合物包括(I)(C) (1)(i)和(I)(C)(2)(ii)的组合、(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(2)(ii) 的组合、或(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(2)(i)的组合，该基因修饰的LeuCD' 酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。通过一种或多种生化反应将C4-C10 2- 酮酸底物中的至少一种转化为C7-C11 2-酮酸。
在本公开的另其他实施例中，提供了包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体。基因修饰的LeuCD'酶复合物包括：(a)LeuC亚基和(b)LeuD 亚基。LeuC亚基(a)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(2)基因修饰的LeuC 亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。LeuD 亚基(b)选自：(1)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(2)基因修饰的LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2 具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。LeuCD'酶复合物包括(a) (1)和(b)(2)的组合、(a)(2)和(b)(2)的组合、或(a)(2)和(b) (1)的组合，并且基因修饰的LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
应当理解，以下概述和详细描述都是示例性和说明性的，并且旨在提供对要求保护的本公开的进一步说明。以下概述和描述均不旨在将本公开的范围限定或限制于概述或描述中提到的特定特征。
附图说明
图1.2-酮酸的伸长。图1显示了通过LeuABCD的递归活性(在大肠杆菌中称为“LeuABCD途径”)的2-酮酸的伸长，如1至3中所示。在伸长后，通过 4中的(硫胺素依赖性)脱羧酶的活性将所得的伸长的2-酮酸(IV)转化为醛 (V)，最后通过醇脱氢酶的活性在5中转化为醇(VI)。
图2.产生1-庚醇的两种途径。图2显示了产生1-庚醇的两种相关但不同的途径。在第一种途径中，Wood-Ljungdahl途径将合成气转化为乙酰辅酶A，另一途径则将乙酰辅酶A转化为丙酮酸。然后，将丙酮酸转化为2-酮丁酸，最后引发LeuABCD途径，其中将2-酮丁酸转化为C7-C11 2-酮酸(在该实施例中为2-酮辛酸)。一旦形成伸长的2-酮酸(2-酮辛酸)，(硫胺素依赖性)脱羧酶将其转化为C6-C10醛(在该实施例中为庚醇)，并且醇脱氢酶将C6-C10醛转化为 C6-C10醇(在该实施例中为1-庚醇)。在第二种途径中，潜在的糖分解代谢途径之一(在该实施例中是糖酵解或戊糖磷酸途径)将C5或C6糖转化为丙酮酸，然后按照与第一种途径中相同的途径序列以得到庚醇。
图3.LeuCD活性位点的同源模型。图3显示了LeuCD活性位点的模型，其形成在LeuC亚基和LeuD亚基的界面处。使用同源建模并使用猪乌头酸酶 (PDB ID代码1ACO)和空肠弯曲杆菌的异丙基苹果酸异构酶小亚基(PDB ID 代码3Q3W)的晶体结构作为模板来创建模型。活性位点用2-己基苹果酸(即 2-HM)和4Fe-4S簇建模。LeuC亚基中残基Val35和Leu-411以及LeuD亚基中Leu-31和His-88的各种组合在本发明公开的基因修饰的LeuCD'酶复合物中被修饰。
图4.异丙基苹果酸异构酶的大亚基中高度保守的氨基酸残基。显示了高度保守的氨基酸残基，这些氨基酸残基是在从大肠杆菌LeuC序列分出的异丙基苹果酸异构酶的大亚基的非冗余蛋白质序列的多达1至60％比对后鉴定的。在蛋白质序列中高度保守的氨基酸残基用阴影表示，并且被认为在2-酮酸伸长期间在LeuC的功能中起重要作用。加框的氨基酸残基被认为形成异丙基苹果酸异构酶的活性位点。
图5.异丙基苹果酸异构酶的小亚基中高度保守的氨基酸残基。显示了高度保守的氨基酸残基，这些氨基酸残基是在从大肠杆菌LeuD序列分出的异丙基苹果酸异构酶的小亚基的非冗余蛋白质序列的多达1至60％比对后鉴定的。在蛋白质序列中高度保守的氨基酸残基用阴影表示，并且被认为在2-酮酸伸长期间在LeuD的功能中起重要作用。加框的氨基酸残基被认为形成异丙基苹果酸异构酶的活性位点。
图6.pZE_LeuABCD-KA6载体。显示了pZE_LeuABCD-KA6载体，其与修饰的载体pOC-CL-###一起用于醇生产研究。
图7.pOC-CL-0###载体。显示了典型的修饰的pOC-CL-###载体，其与pZE_LeuABCD-KA6载体一起用于醇生产研究。
图8.LeuD和LeuC变体盒。图8A显示了LeuD变体基因盒，而图8B显示了LeuC变体基因盒。
图9.含有'+1途径酶以及WT和变体LeuCD酶组合的大肠杆菌的血清瓶发酵的醇滴度的统计分析。图9A显示了使用SAS JMP 11.2.0对含有WT和变体LeuC和LeuD酶的+1途径大肠杆菌菌株产生的庚醇滴度进行的ANOVA分析和学生t检验，其中使用90％置信区间。图9B显示了使用SAS JMP 11.2.0 对含有WT和变体LeuC和LeuD酶的+1途径大肠杆菌菌株产生的辛醇滴度进行的ANOVA分析和学生t检验，其中使用90％置信区间。
具体实施方式
现在将详细参考基因修饰的LeuCD'酶复合物的各种实施例，利用基因修饰的LeuCD'酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体。基因修饰的LeuCD'酶复合物，制备C7-C11 2-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体可用于生产生物基化学品和工业产品，作为化石燃料的替代品。本发明公开的基因修饰的LeuCD' 酶复合物，制备C7-C11 2-酮酸的方法，以及包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体可用于在体内和体外生产更长链烷烃、醇和羧酸。
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“一个”组件的提及包括具有两个或更多个这样的组件的方面，除非上下文另有明确说明。
在各种实施例中，公开了具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的 LeuCD'酶复合物。在某些实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包含在细胞提取物中，所述细胞提取物来自过表达基因修饰的LeuCD'酶复合物的细胞。在实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包括许多LeuCD酶复合物的改变的氨基酸序列。在实施例中，改变的氨基酸序列已经被鉴定为：在将较长链的2-烷基苹果酸(例如C4-C6 2-烷基苹果酸)异构化为其相应的3-烷基苹果酸时，与野生型大肠杆菌LeuCD酶复合物(LeuC：EcoGene登录号EG11576，基因ID 945076；和LeuD：EcoGene登录号EB11575，基因ID：945642)相比较，表现出改善的活性和催化效率(即，kcat/Km)。野生型LeuC序列(SEQ ID NO:1) 和野生型LeuD序列(SEQ ID NO:2)内的各种位点已被鉴定为是获得改进的关键。LeuC的野生型序列内的位点包括Val-35、Leu-411及其组合。LeuD的野生型序列内的位点包括Leu-31、His-88及其组合。在每次改变中，都存在变化，其中：丙氨酸或甘氨酸取代LeuC的Val-35；缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代LeuC 的Leu-411；缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代LeuD的Leu-31；和/或丝氨酸或丙氨酸取代LeuD的His-88。取代可以在LeuC或LeuD中的单位点(即构成三碱基对的单个氨基酸)取代到LeuC和LeuD内的各种多位点(例如2至4个位点) 取代之间变化。SEQ ID NO:3-37显示了产生的LeuC和LeuD变体的氨基酸序列，其包括一个或多个指定的取代。
在实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包括(a)LeuC亚基和(b)LeuD 亚基。在一些实施例中，LeuC亚基(a)选自由以下组成的群组：(1)天然 LeuC亚基，其包括与SEQ IDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(2) 基因修饰的LeuC亚基，其包括与SEQ IDNO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、 Leu-411或其组合。如本文使用的术语，在一些实施例中，“同源性”是指序列中列出的一定百分比的或更多的氨基酸在其给定位置的相同或功能对应。在其他实施例中，(1)天然LeuC亚基包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同源性的氨基酸序列，而(2)基因修饰的LeuC亚基包括与SEQ ID NO:1具有至少 90％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。在基因修饰的LeuCD'酶复合物的一些实施例中，LeuD亚基(b)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(2)基因修饰的LeuD 亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。在其他实施例中，(1)天然LeuD亚基包括与SEQ ID NO:2具有至少 90％同源性的氨基酸序列，而(2)基因修饰的LeuD亚基包括与SEQ ID NO:2 具有至少90％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。在一些实施例中，LeuCD' 酶复合物包括(a)(1)和(b)(2)的组合、(a)(2)和(b)(2)的组合、或(a)(2)和(b)(1)的组合。重要的是，基因修饰的LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
在基因修饰的LeuCD'酶复合物的某些实施例中，LeuC的氨基酸序列的至少一个修饰(a)(2)选自由以下组成的群组：(i)丙氨酸取代Val-35；(ii)甘氨酸取代Val-35；(iii)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；(iv)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；(v)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代 Leu-411；以及(vi)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。在基因修饰的 LeuCD酶复合物的其他实施例中，LeuD的氨基酸序列的至少一个修饰(b)(2) 选自由以下组成的群组：(i)丙氨酸取代Leu-31；(ii)甘氨酸取代Leu-31；(iii) 缬氨酸取代Leu-31；(iv)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；(v)甘氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88；(vi)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代 His-88；以及(vii)缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。
在一些实施例中，LeuCD'酶复合物包含(a)(1)和(b)(2)的组合，并且(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。在其他实施例中，LeuCD'酶复合物包含(a)(2)和(b)(2)的组合，并且(a)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，并且其中(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。在一些实施例中，LeuCD'酶复合物包含(a)(2)和(b)(2)的组合，(a)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411，(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
如本文所用，当氨基酸序列具有一定百分比的或更高的同一性时，例如，至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性时，两种蛋白质(或蛋白质的区域)基本上是同源的。如本领域已知的，可以确定同源性百分比。例如，为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对 (例如，可以在第一和第二氨基酸序列中的一个或两个中引入间隙以用于最佳比对，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略不计)。然后，比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置处相同的氨基酸残基占据时，那么分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸“同一性”等同于氨基酸“同源性”)。如本领域所知，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数，其中考虑到了需要引入以用于最佳比对两个序列的间隙的数量和每个间隙的长度。通常使用序列分析软件测量多肽的序列同源性。
当同源用于蛋白质或肽时，认识到不同的残基位置通常可以因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被化学性质相似(例如电荷或疏水性)的具有侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代彼此不同的情况下，可以向上调节序列同一性百分比或同源性程度以修正取代的保守性质。进行这种调节的方式是本领域技术人员已知的。以下六组各自含有彼此保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
例如，具有LeuC或LeuD功能的氨基酸序列可以通过使用这些蛋白质的氨基酸序列作为查询对非冗余蛋白质序列(nr)数据库进行蛋白质-蛋白质BLAST (blastp)搜索来鉴定。可以使用默认参数在国家生物技术信息中心(NCBI)网站(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)上进行搜索。从大肠杆菌LeuC序列分出的异丙基苹果酸异构酶的大亚基的氨基酸序列的多达1至60％的比对显示：超过 80％的序列具有显示的284个氨基酸残基(在图4中显示为阴影序列)。基于这些观察结果，图4中阴影的残基可被认为是赋予LeuC功能(包括折叠酶、底物结合、特异性、催化等)的必需氨基酸残基，其方式与在大肠杆菌LeuC中的方式相同。另外，并且不受理论束缚，据信异丙基苹果酸异构酶(LeuCD) 的活性位点包括其大亚基(LeuC)的以下氨基酸残基：V32-S37、D62-N64、 G106-V110、G127-T131、C220-M222、G345-T348、G406-A412、S428-N431 和G434-Q436(如图4中加框所示)。
类似地，从大肠杆菌LeuD序列分出的异丙基苹果酸异构酶的小亚基的氨基酸序列的多达60％的比对显示：超过80％的序列具有显示的101个氨基酸残基(在图5中显示为阴影序列)。基于这些观察结果，图5中阴影的残基可被认为是赋予LeuD功能(包括折叠酶、底物结合、特异性、催化等)的必需氨基酸残基，其方式与在大肠杆菌LeuD中的方式相同。另外，并且不受理论束缚，据信异丙基苹果酸异构酶(LeuCD)的活性位点包括其小亚基(LeuD)的以下氨基酸残基：T22-D23、P27-L31和G83-E87(如图5中加框区域所示)。
在实施例中，被认为不是异丙基苹果酸异构酶的功能所必需的氨基酸残基 (例如，图4中LeuC的没有阴影的残基，和图5中LeuD的没有阴影的残基) 可以保守或非保守地取代，并且与野生型大肠杆菌LeuCD相比，这种氨基酸取代不会显著降低修饰的异丙基苹果酸异构酶的功能特性。在实施例中，被认为不形成异丙基苹果酸异构酶的活性位点，但仍被认为是异丙基苹果酸异构酶的功能所必需的氨基酸的氨基酸残基(例如，图4中LeuC的有阴影但没加框的残基，和图5中Leu5的有阴影但没加框的残基)可以被保守取代，并且与野生型大肠杆菌LeuCD相比，这种氨基酸取代不会显著降低修饰的异丙基苹果酸异构酶的功能特性。在实施例中，除了本文所述的那些特定的氨基酸取代之外，被认为形成异丙基苹果酸异构酶的活性位点的氨基酸残基的大多数保守和非保守氨基酸取代(例如，图4中LeuC的有阴影并加框的残基，和图5中LeuD的有阴影并加框的残基)与野生型大肠杆菌LeuCD相比，将可能降低修饰的异丙基苹果酸异构酶的功能特性。据信具有所述取代的异丙基苹果酸异构酶的基因修饰的大和/或小亚基将赋予异丙基苹果酸异构酶活性。换句话说，据信与野生型大肠杆菌LeuCD相比，本文所述的氨基酸取代不会显著降低修饰的异丙基苹果酸异构酶的功能特性。
与大肠杆菌的野生型LeuCD酶复合物相比，本发明公开的基因修饰的 LeuCD'酶复合物具有改善的性质，例如，在异构化更长链2-烷基苹果酸如C5-C6 2-烷基苹果酸时改善的活性和催化效率(即kcat/Km)，其可以通过基因修饰以本文所述的多种方式中的一种产生。本文所用的术语“基因修饰的”或“修饰的”是指具有有意改变的氨基酸序列的本发明公开的基因修饰的LeuCD'酶复合物的群组，即“非野生型”氨基酸序列，或者是指具有(至少)针对本文所述的特定的修饰的LeuCD'酶复合物已经有意改变的基因组的微生物有机体(取决于作为形容词的任一术语的放置)，或两者。这种改变可以通过重组技术完成，其中一个或多个基因从不同的第二微生物有机体转移到靶微生物有机体中。可以使用转移至靶微生物有机体中的全合成DNA以常规方法完成重组技术。这种改变也可以通过工程技术完成，其中通常通过定点诱变改变靶微生物有机体内的核酸，导致至少一个核酸转化为不同的核酸，并因此修饰一种或多种酶。也可以采用上述方法和整个申请中描述的方法的任何组合。因此，应当理解，本发明公开的基因修饰的LeuCD'酶复合物可以在体内(即通过基因修饰的微生物有机体)，或在体外使用。
在实施例中，提供了制备C7-C11 2-酮酸的方法。在实施例中，制备C7-C11 2- 酮酸的方法包括提供C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种与一系列酶，所述酶包括基因修饰的LeuCD酶复合物。在一些实施例中，该方法包括通过提供起始底物和一系列作用于底物或其产物的酶来制备C7-C11 2-酮酸。在一些实施例中，该系列酶包括本公开的基因修饰的LeuCD酶复合物。在一些实施例中，该系列酶最终将底物转化为所需的C7-C11 2-酮酸。如本文所用，术语“底物”或“合适的底物”是指通过酶的作用转化或意图转化为另一种化合物的任何物质或化合物。该术语不仅包括单一化合物，还包括化合物的组合，例如溶液、混合物和含有至少一种底物或其衍生物的其它物质。此外，术语“底物”不仅包括提供适合用作起始材料的碳源的化合物，例如任何生物质衍生的糖，还包括用于与如本文所述的代谢工程微生物有机体相关的途径的中间物和终产物代谢物。
在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法还包括利用甚至进一步的其他酶和生化反应将C7-C11 2-酮酸转化为所需的C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸或 C5-C9烷烃。这些方法可以在非天然存在的，即基因工程细胞的所述实施例中的一个中以生物合成方式进行。例如，在说明性的非限制性实施例中，这些方法可以在非天然存在的微生物有机体中进行。或者，在其他说明性的非限制性实施例中，C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃可以通过体外方法产生，通常从不包括微生物有机体的起始点开始。
在制备C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃的方法的一些实施例中，通过一种或多种酶的作用和一种或多种生化反应，将选择的含碳底物首先转化为丙酮酸，再从丙酮酸转化为2-酮丁酸，或者转化为2-酮异戊酸(图2)。更具体地，在实施例中，含碳底物在一种或多种生化反应中提供有和/或与一种或多种酶接触，使得其转化为2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基 -2-酮戊酸。然后，通过酶、酶复合物、基因修饰的酶、基因修饰的酶复合物或其组合的作用，在“+1”途径中(或LeuABCD途径，因为其针对大肠杆菌微生物有机体命名)，2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸可以通过链伸长转化为C7-C112-酮酸。“+1”途径的迭代部分(或大肠杆菌中LeuABCD途径的迭代部分)是非天然亮氨酸途径的一部分(图1)。在实施例中，能够实现该链伸长的酶在本文中被鉴定为构成：异丙基苹果酸合成酶(例如，天然的2-异丙基苹果酸合成酶，如LeuA(GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：947465)，和/ 或具有异丙基苹果酸合成酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合成酶，例如 LeuA'，(例如，如Marcheschi等人《用于碳链伸长的合成递归“+1”途径(A syntheticrecursive"+1"pathway for carbon chain elongation)》ACS chemical biology 2012,7,689-697，其通过引用整体并入))；异丙基苹果酸脱氢酶(例如天然异丙基苹果酸脱氢酶，如LeuB(GenBank：登录号NC 000913.3基因ID： 944798)，和/或具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶，如LeuB'(例如，如Sanghani等人在W02015089127A1中所述，其通过引用整体并入))；和/或LeuCD复合物(例如，天然LeuCD复合物(即，两种酶，一起称为异丙基苹果酸异构酶复合物)(分别为GenBank：登录号NC 000913.3 基因ID：945076和基因ID：945642)，和/或基因修饰的LeuCD'，如上所述)。在实施例中，基因修饰的LeuCD'复合物如前文所述。如本领域普通技术人员所知，可以在LeuABCD途径中的任何点处添加合适的底物，包括中间物和终产物代谢物(如图1所示)。
在实施例中，具有异丙基苹果酸合成酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合成酶可以如上所述，和/或如Marcheschi等人《用于碳链伸长的合成递归“+1”途径(A syntheticrecursive"+1"pathway for carbon chain elongation)》ACS chemical biology 2012,7,689-697所述，其通过引用整体并入。在某些实施例中，具有异丙基苹果酸合成酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合成酶可包含在一个或多个称为Phe-47、Leu-73、His-97、Phe-99、Ser-139、Asn-167、Pro-169、Asn-197 和/或Gly-462的氨基酸残基点处具有取代的LeuA'变体。然后，用氨基酸甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸取代这些靶向氨基酸中的一个或多个，这可以通过选定有机体的已知异丙基苹果酸合成酶的定点诱变来进行，例如大肠杆菌的LeuA基因(GenBank：登录号NC_000913.3基因ID：947465)。在某些方面，基因修饰的LeuA'可包括以下取代组合：丙氨酸取代His-97，甘氨酸取代 Ser-139，甘氨酸取代Asn-167，丙氨酸取代Pro-169和天冬氨酸取代Gly-462。这些基因修饰的LeuA'变体在捕获感兴趣的2-酮酸用于催化时比野生型酶更有效(更高的kcat/Km)，因此可以提高相关“+1”途径的整体效率。
在实施例中，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶可以如Sanghani等人在W02015089127A1中所述，其通过引用整体并入。在某些实施例中，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶可包含在称为Leu-96和Val-198的一个或多个氨基酸残基点处具有取代的 LeuB'变体。然后，用氨基酸甘氨酸、丙氨酸和/或缬氨酸取代这些靶向氨基酸中的一个或多个，这可以通过选定有机体的已知异丙基苹果酸合成酶的定点诱变来进行，例如大肠杆菌的LeuB基因(GenBank：登录号NC_000913.3基因 ID：944798)。在某些方面，基因修饰的LeuB'可包括以下取代：甘氨酸取代 Leu-96；丙氨酸取代Val-198；丙氨酸取代Leu-96和丙氨酸取代Val-198；甘氨酸取代Leu-96和丙氨酸取代Val-198；甘氨酸取代Leu-96和甘氨酸取代Val-198'；或丙氨酸取代Leu-96。在将3-HM转化为相应的C7-C11 2-酮酸时，这些基因修饰的LeuB'变体比野生型酶更有效(更高的kcat/Km)，因此可以提高相关“+1”途径的整体效率。
在2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸的链伸长后，C7-C11 2-酮酸可以通过至少一种酶，例如硫胺素依赖性脱羧酶的作用转化为C6-C10醛(例如，具有脱羧酶活性的天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶)。具体地，2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸可以提供有和/或与具有脱羧酶活性的天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶接触。在天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶作用于C7-C11 2-酮酸的实施例中，天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶将C7-C11 2-酮酸转化为比被转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛。在实施例中，硫胺素依赖性脱羧酶具有硫胺素依赖性脱羧酶活性。关于具有硫胺素依赖性脱羧酶活性的硫胺素依赖性脱羧酶的修饰和选择的进一步公开内容包括在共同未决的国际公开号WO 2015/089127中，其通过引用整体并入本文。
C6-C10醛可以在各种工业应用中原样使用，或者可以用作生产其他化学品的中间体和/或原料。例如，C6-C10醛可以提供有和/或与醇脱氢酶(例如，天然的(登录号NC_001145.3，基因ID：855368)和/或基因修饰的醇脱氢酶接触)，从而将C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇。在实施例中，醇脱氢酶具有醇脱氢酶活性。或者，C6-C10醛可以提供有和/或与醛脱氢酶(例如，天然的和/或基因修饰的醛脱氢酶(登录号NM_000689.4))接触，从而将其转化为相应的C6-C10羧酸。在实施例中，醛脱氢酶具有醛脱氢酶活性。最后，C6-C10醛可以与脂肪醛脱羰酶(例如，天然和/或基因修饰的脂肪醛脱羰酶(登录号NM_100101.3)) 接触，从而将其转化为相应的Cn-1烷烃。在实施例中，脂肪醛脱羰酶具有脂肪醛脱羰酶活性。
在优选的实施例中，制备了C6-C10产物，例如C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃并具有理想的高特异性。作为目标产物，基于总产物重量(即重量％)，该高特异性可以是，例如，优选至少百分之二十五(即，25％)，更优选至少40％，还更优选至少50％，最优选至少70％。
如上所述，本文所述的方法可以在体内或体外进行。体内方法可优选用于商业规模生产，但在一些情况下，体外方法可适用于商业规模生产。在实施例中，出于实验室和一般研究目的，例如，用于进行酶测定，体外方法可能是特别方便的。例如，可以制备用于大规模或商业规模发酵生产酶促产物的理想微生物有机体，例如C6-C10醇或C6-C10醇的组合。这种制备可以通过将编码所需酶的DNA或DNA片段从第一微生物有机体插入第二微生物有机体的基因组中来进行。在实施例中，使用重组技术，已知或认为宿主微生物有机体具有一种或多种所需的代谢途径和/或其他所需特征，例如对C6-C10产物的生长抑制的抗性。一般而言，体内方法采用微生物有机体的野生型代谢途径，首先将合适的含碳底物转化为丙酮酸，然后在不同数量的生化反应中将丙酮酸转化为2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸。
例如，本发明公开的基因修饰的LeuCD'酶复合物可以用作和/或表达为微生物有机体中代谢途径的一部分，其通过合成代谢(例如，Wood-Ljungdahl) 或分解代谢(例如，糖酵解、或戊糖磷酸途径)途径产生乙酰辅酶A(图2)。然后，可以通过至少一种酶，例如硫胺素依赖性脱羧酶(例如，具有脱羧酶活性的天然和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶)的作用将C7-C11 2-酮酸转化为少一个碳的相应C6-C10醛。在一些实施例中，C6-C10醛可以进一步与适当的酶反应以形成C6-C10醇、C6-C10羧酸或相应的C5-9烷烃。由于本文所述的氨基酸序列的特定改变，因此本文所述的基因修饰的LeuCD'酶复合物在对各种底物的特异性方面提供了一些显著差异，并且这种特异性改变在产物产率和减少或消除不需要的和/或竞争性副产物方面提供了重要的优势。例如，与野生型大肠杆菌LeuCD酶复合物相比，基因修饰的LeuCD'酶复合物在将较长链的2-烷基苹果酸如C4-C6 2-烷基苹果酸异构化为其相应的3-烷基苹果酸时表现出改善的活性和催化效率(即kcat/Km)。
在一些实施例中，所选择的微生物有机体可具有Wood-Ljungdahl途径，也称为“合成气(合成气)固定途径”，其中将合成气转化为乙酰辅酶A，如图2 所示。这可以通过某些产生乙酸盐的细菌属进行，例如梭菌属(Clostridium)，包括但不限于特别是杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)(即C.Ijungdahlii)。在 Wood-Ljungdahl途径中，将合成气转化为乙酰辅酶A通常包括通过两种酶，即一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的作用将二氧化碳还原成一氧化碳，然后还原成乙酰辅酶A。一氧化碳脱氢酶催化二氧化碳的还原和乙酰辅酶A合成酶，将所得的一氧化碳与甲基结合形成乙酰辅酶A。从这点开始，乙酰辅酶A继续另一途径，其中通过PFO还原(即，铁氧还蛋白氧化还原酶)将其转化为丙酮酸。在替代实施例中，合适的(例如，非合成气)含碳底物，例如C5或C6糖 (例如，葡萄糖、蔗糖、戊糖或其组合)可以通过糖分解代谢途径中的一种直接被转化为丙酮酸，例如糖酵解或戊糖磷酸途径，如图2所示。这些途径可以存在于微生物有机体中，包括例如梭菌、大肠杆菌(即E.coli)、固氮螺菌、芽孢杆菌、酵母菌和棒状杆菌。
在合成气或非合成气底物转化为丙酮酸后，丙酮酸可以首先通过PC(即丙酮酸羧化酶)；AAT(即天冬氨酸氨基转移酶)；ThrABC(包括：ThrA，其为双功能性天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶；ThrB，其为高丝氨酸激酶；和ThrC，其为苏氨酸合成酶)；和ASD(即天冬氨酸半醛脱氢酶)被转化为L-苏氨酸。然后，可以通过Ilva(即苏氨酸脱水酶)将L-苏氨酸转化为2-酮丁酸。在替代实施例中，丙酮酸可以通过llvBN/llvGM、llvC和llvD的作用被转化为2-酮异戊酸。在某些实施例中，丙酮酸可以在不同数量的生化反应中转化为2-甲基-2- 酮戊酸。
在产生2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸后，亮氨酸生物合成途径中天然“+1”途径部分(或大肠杆菌中的天然LeuABCD部分)的基因修饰作用以通过一种或多种生化反应进行C7-C11 2-酮酸转化。在体内方法中，涉及若干生化反应并使用至少一种天然或修饰的(即内源或外源)酶、酶复合物或其组合(在文中，LeuABCD途径的基因修饰的酶或酶复合物统称为“Leu A'、Leu B' 和Leu CD'”，而LeuABCD途径的天然酶和酶复合物称为“LeuA、LeuB、LeuC 和LeuD”)。在实施例中，LeuABCD途径的天然和/或基因修饰的酶将2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸转化为所需的C7-C11 2-酮酸(图1)。例如，在实施例中，因为通过递归途径发生链伸长，2-酮丁酸首先被转化为2-酮戊酸，然后转化为2-酮己酸，然后转化为2-酮庚酸或直至2-酮十一烷酸，即，期望的 C7-C11 2-酮酸，这取决于期望的最终产物。在替代实施例中，2-酮异戊酸首先转化为2-酮异己酸，然后转化为2-酮异庚酸等。实现这种链伸长的天然酶和/或基因修饰的酶可包括2-异丙基苹果酸合成酶(例如，天然的2-异丙基苹果酸合成酶如天然的leuA和/或具有异丙基苹果酸合成酶活性的基因修饰的2-异丙基苹果酸合成酶例如具有异丙基苹果酸合成酶活性的基因修饰的LeuA')、异丙基苹果酸脱氢酶(例如，天然的异丙基苹果酸脱氢酶如天然的leuB和/或具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶例如具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的LeuB')，和/或异丙基苹果酸异构酶(例如，天然的异丙基苹果酸异构酶如天然的leuCD和/或具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶例如具有异丙基苹果酸异构酶活性的LeuCD')。在一些实施例中，仅对一种酶、酶复合物或其组合进行基因修饰。例如，在具体的实施例中，仅对LeuCD'进行基因修饰以从2-酮丁酸或2-酮异戊酸开始获得可接受的和/或期望的C7-C11 2-酮酸的产生。
关于非天然亮氨酸生物合成途径中该部分的修饰的进一步公开内容包括在共同未决的国际WO2015089127中，其通过引用整体并入本文。在某些实施例中，可以使用基因修饰的LeuA(即LeuA')、基因修饰的LeuB(即LeuB')、基因修饰的LeuCD'(即，如前所述的LeuCD')或其组合，如引用的专利申请中所述。例如，可以对LeuA(GenBank登录号NC_000913.3基因ID：947465) 进行基因修饰以产生具有高于平均的催化效率(kcat/Km)的异丙基苹果酸合成酶变体(LeuA')以捕获感兴趣的2-酮酸用于催化。在某些实施例中，组合使用天然Leu A、基因修饰的LeuA'、天然LeuB、基因修饰的LeuB、天然LeuCD 和基因修饰的LeuCD'。
一旦形成伸长的C7-C11 2-酮酸，可以原样使用，或转化为C6-C10醛。对于这种转化，使用天然或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶，产生具有比被转化的 C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛。C6-C10醛具有广泛的适用性，例如，作为生产C6-C10醇、C6-C10羧酸、C5-C9烷烃及其组合的起始底物或中间物，如上所述。图1中示出了C6-C10醇的制备。
为了使非天然有机体能够进行如上文所定义的体内转化的一部分，例如，以产生C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃，需要进行类似本文所述的方案。通常，工作实例显示基因修饰，其涉及进行工程化以改变给定密码子中的一个或多个核酸碱基从而改变密码子编码的氨基酸。这可以简单地用于产生修饰酶，例如出于体外测定目的。相反，为更大规模生产菌株可以优选改变宿主微生物有机体的基因组。
为体外酶生产而设计的以下方法可以如本领域技术人员通常理解的那样进行。通常，使用合适的数据库如GenBank以获得野生型酶的遗传密码，然后鉴定适于修饰的密码子。该鉴定可以用作本领域已知的蛋白质工程化方法的基础，其中计算机分子建模识别并且还能够区分可以有效地使用酶/底物界面的修饰的结构位置。然后，使用分子生物学技术进行给定的理想修饰，其中核酸碱基的改变通过定点诱变完成。之后，变体型酶可以使用重组方法在从细胞中分离的合适的宿主如大肠杆菌中产生，并且可以用作表现出高于野生型的催化效率的全细胞提取物。或者，可以对变体酶进行纯化以分离出非靶向蛋白质，留下纯化酶，其表现出高于野生型的催化效率。这可以根据最适合给定特定酶的方法，在体外适当地测定。因此显示具有所需水平的催化效率的测定酶被证实是理想的基因修饰的产物，并且可以用于体外生产方法，例如用于体外生产和/ 或转化给定的C7-C11 2-酮酸(例如2-酮壬酸)、C6-C10醛(例如辛醛)和/或由C6-C10醛制备的产物(例如C6-C10醇、羧酸或C5-C9烷烃)。
在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法包括：在C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种转化为C7-C11 2-酮酸的条件下，(I)提供C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种与(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶(例如，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的天然2-异丙基苹果酸合成酶(如天然 LeuA)和/或基因修饰的2-异丙基苹果酸合成酶(如基因修饰的LeuA'))，(B) 至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶(例如，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的天然异丙基苹果酸脱氢酶(如天然LeuB)和/或基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶(如基因修饰的LeuB'))，和(C)至少一种具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的LeuCD'酶复合物。在一些实施例中，该方法可以进一步包括天然LeuCD酶复合物。在一些实施例中，通过一种或多种生化反应将至少一种C4-C10 2-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸。生化反应可以独立地发生在基因修饰的微生物有机体内部或外部。在某些实施例中，C4-C10 2-酮酸底物包括2-酮丁酸。在其他实施例中，C4-C10 2-酮酸底物包括2-酮异戊酸。在更进一步的实施例中，C4-C10 2-酮酸底物包括2-甲基-2-酮戊酸。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的一些实施例中，至少一种基因修饰的LeuCD' 酶复合物包括(1)LeuC亚基和(2)LeuD亚基。在一些实施例中，LeuC亚基 (1)选自由以下组成的群组：(i)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(ii)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。在某些实施例中，LeuC 亚基(1)选自由以下组成的群组：(i)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO: 1具有至少90％同源性的氨基酸序列；和(ii)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。在一些实施例中， LeuD亚基(2)选自由以下组成的群组：(i)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和(ii)基因修饰的LeuD'亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。在某些实施例中，LeuD亚基(2)选自由以下组成的群组：(i)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少90％同源性的氨基酸序列；和(ii)基因修饰的 LeuD'亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少90％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88 或其组合。LeuC、LeuC'、LeuD和LeuD'亚基可以如前所述。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的一些实施例中，至少一种基因修饰的LeuCD' 酶复合物包括：包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性(或在某些实施例中 90％)的氨基酸序列的天然LeuC亚基和包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰(其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合)的基因修饰的LeuD'亚基的组合；包括与 SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰(其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合)的基因修饰的LeuC'亚基和包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列和至少一个修饰(其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代 Leu-31、His-88或其组合)的基因修饰的LeuD'亚基的组合；和/或包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列和至少一个修饰(其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合)的基因修饰的LeuD'亚基和包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性 (或在某些实施例中90％)的氨基酸序列的天然LeuD亚基的组合。基因修饰的 LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的某些实施例中，LeuC'的至少一个修饰(I)(C) (1)(ii)选自由以下组成的群组：(a)丙氨酸取代Val-35；(b)甘氨酸取代Val-35； (c)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；(d)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；(e)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411；以及(f)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。在基因修饰的LeuCD'酶复合物的其他实施例中，LeuD'的氨基酸序列的至少一个修饰(I)(C)(2)(ii)选自由以下组成的群组：(a)丙氨酸取代Leu-31；(b)甘氨酸取代Leu-31；(c)缬氨酸取代Leu-31；(d)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；(e)甘氨酸取代Leu-31 和丙氨酸取代His-88；(f)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；和(g) 缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的一些实施例中，至少一种基因修饰的LeuCD' 酶复合物包含(I)(C)(1)(i)和(I)(C)(1)(ii)的组合，并且其中(I) (C)(2)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。在制备C7-C11 2-酮酸的方法的其他实施例中，至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I) (C)(1)(ii)和(I)(C)(1)(ii)的组合，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。在制备C7-C11 2-酮酸的方法的一些实施例中，至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(ii)和 (I)(C)(1)(ii)的组合，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411，并且其中(I)(C)(2)(ii) 的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的一些实施例中，该方法还包括：(II)在C7-C11 2-酮酸被转化为比被转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下，向C7-C11 2-酮酸提供具有硫胺素依赖性脱羧酶活性的硫胺素依赖性脱羧酶(例如，具有硫胺素依赖性脱羧酶活性的天然的和/或基因修饰的硫胺素依赖性脱羧酶)。
在制备C7-C11 2-酮酸的方法的其他实施例中，该方法甚至还包括：(III)在将C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇的条件下，向C6-C10醛提供具有醇脱氢酶活性的醇脱氢酶(例如，具有醇脱氢酶活性的天然和/或基因修饰的醇脱氢酶)。在其他实施例中，该方法包括：(III)在将C6-C10醛转化为相应的C6-C10羧酸的条件下，向C6-C10醛提供具有醛脱氢酶活性的醛脱氢酶(例如，具有醛脱氢酶活性的天然和/或基因修饰的醛脱氢酶)。在某些实施例中，该方法包括：(III) 在将C6-C10醛转化为相应的Cn-1烷烃的条件下，向C6-C10醛提供具有脂肪醛脱羰酶活性的脂肪醛脱羰酶(例如，具有脂肪醛脱羰酶活性的天然和/或基因修饰的脂肪醛脱羰酶)。
为了使非天然有机体能够进行如上文所定义的体内转化的一部分，例如，以产生C6-C10醛和/或C6-C10醇，希望执行类似下文描述的方案。通常，本文包括的实例涉及LeuCD酶工程化以改变氨基酸，从而修饰酶功能，特别是活性和 /或特异性。氨基酸的这种改变可以用于产生用于小规模目的的修饰酶，例如，用于体外测定，或者可以是基因组修饰的基础，从而产生适合于更大规模生产的微生物有机体菌株。
该方法可以如本领域技术人员所理解的那样进行。通常，使用合适的数据库如GenBank以获得天然酶的遗传密码，然后鉴定适于修饰的密码子。该鉴定可以用作本领域已知的蛋白质工程化方法的基础，其中计算机分子建模识别并且还能够区分可以有效地使用酶/底物界面的修饰的结构位置。然后，使用称为定点诱变的分子生物学技术进行给定的理想修饰。之后，将修饰基因克隆到复制质粒载体中，当转化到宿主微生物有机体如大肠杆菌或梭菌属中时，能够产生对天然或非天然底物具有高于天然的催化效率的酶。必须从大肠杆菌或梭菌细胞中分离变体型酶，无需纯化或纯化后使用，以产生含酶溶液，其将对天然或非天然底物表现出高于天然的，即高于野生型的催化效率。可以根据适合于特定酶的方法，在体外适当地测定催化效率。由此，显示具有所需水平的催化效率的测定酶被证实是理想的基因修饰产物，并且可以用于体外生产方法。例如，这种酶可用于体外生产给定的C7-C112-酮酸和/或C6-C10醛，和/或由C6-C10醛制成的产物，例如C6-C10醇、羧酸或C5-C9烷烃。
上述方法的特定应用是产生所需的微生物有机体，用于大规模或以其它方式商业规模发酵生产酶促产物，例如C6-C10醛或可由其制备的C6-C10产物中的一种。这种制备可以通过将编码所需改良酶的DNA或DNA片段插入已知或认为具有其他所需特征的第二微生物有机体的基因组中来进行，例如在发酵过程中产物的抗生长抑制作用的能力，由特定的含碳底物产生丙酮酸(或乙酰辅酶 A)的能力，或其它有利性状。因此，现在对第二微生物有机体进行基因修饰，因为其产生基因修饰酶。
在另一个实施例中，还可以简单地鉴定具有可用于所需途径的天然酶的微生物有机体，并且使用该微生物有机体本身作为起始微生物有机体，或将该微生物有机体的基因组的适当的酶编码部分转移到已经被鉴定为可用于大规模发酵生产的有机体的基因组中。该方面的一个实例是选择产生合适的天然硫胺素依赖性脱羧酶(即DC)和天然醇脱氢酶(即ADH)的微生物有机体。然后，该微生物有机体可以用作起始有机体或转化有机体，以制备基因修饰的微生物有机体，从而以比野生型微生物有机体更高的产率或特异性产生C6-C10醇。
因此，在一些实施例中，提供了包括具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体。在包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体的一些实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包括：(a)LeuC 亚基；和(b)LeuD亚基。LeuC亚基(a)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性(或在某些实施例中 90％)的氨基酸序列；和(2)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQ IDNO:1 具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合。LeuD亚基(b)选自由以下组成的群组：(1)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2 具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列；和(2)基因修饰的LeuD'亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。基因修饰的LeuCD'酶复合物在微生物有机体中表达并具有异丙基苹果酸异构酶活性。在某些实施例中，微生物是大肠杆菌。在其他实施例中，微生物是梭菌属。
在包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体的一些实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包括以下的组合：(a)(1)包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列的天然LeuC亚基；和(b)(2)基因修饰的LeuD'亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。在包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体的一些实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包括以下的组合：(a)(2)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQ ID NO: 1具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合；和(b) (2)基因修饰的LeuD'亚基，其包括与SEQ IDNO:2具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合。在包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体的一些实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包括以下的组合：(a)(2)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合；和(b) (1)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性(或在某些实施例中90％)的氨基酸序列。
在包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体的一些实施例中， LeuC'的至少一个修饰选自由以下组成的群组：(a)丙氨酸取代Val-35；(b)甘氨酸取代Val-35；(c)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；(d)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；(e)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代 Leu-411；以及(f)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。在包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体的其他实施例中，LeuD'的氨基酸序列的至少一个修饰选自由以下组成的群组：(a)丙氨酸取代Leu-31；(b)甘氨酸取代 Leu-31；(c)缬氨酸取代Leu-31；(d)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88； (e)甘氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88；(f)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；以及(g)缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。
在包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体的一些实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(a)(1)和(b)(2)的组合，其中(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。在包括基因修饰的LeuCD' 酶复合物的微生物有机体的一些实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包含 (a)(2)和(b)(2)的组合，其中(a)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，并且其中(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。在包括基因修饰的LeuCD'酶复合物的微生物有机体的一些实施例中，基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(a)(2)和(b)(2)的组合，其中(a) (2)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411，并且其中(b)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
实例
实例1：制备对2-己基苹果酸(2-HM)具有增加的活性的基因修饰的LeuCD' 酶复合物。
在通过LeuABCD途径的递归活性进行2-酮壬酸生物合成期间，形成不同长度的2-烷基苹果酸作为LeuCD的底物。为了有效地生物合成2-酮壬酸，期望LeuCD有效捕获2-乙基苹果酸(中间体II，n＝1；图1)、2-丙基苹果酸(2-IPM；中间体II，n＝2；图1)、2-丁基苹果酸(中间体II，n＝3；图1)、2-戊基苹果酸 (中间体II，n＝4；图1)和2-己基苹果酸(2-HM；中间体II，n＝5；图1)用于催化。天然LeuCD在捕获较长的非天然2-烷基苹果酸底物方面效率较低。为了提高天然LeuCD捕获2-己基苹果酸用于催化的效率，如下文所述，使用蛋白工程化技术修饰天然LeuCD酶复合物的活性位点。
大肠杆菌异丙基苹果酸异构酶(LeuCD)是由称为LeuC的50kDa亚基和称为LeuD的22.4kDa亚基组成的异二聚体。两个亚基聚集在一起形成在二聚体界面处具有活性位点的功能性酶。位于大肠杆菌LeuCD的2-异丙基苹果酸结合位点内层的残基通过同源建模构建的LeuCD的结构模型鉴定，并将猪乌头酸酶(蛋白质数据库(PDB)代码1ACO)和空肠弯曲杆菌(PDB ID代码3Q3W) 的异丙基苹果酸异构酶小单位的晶体结构模型作为模板(图2)。最初，使用分子建模程序MOE(Chemical Computing Group公司Montreal Canada)分别构建 LeuC和LeuD亚基的模型，分别将猪乌头酸酶(PDB代码1ACO)和空肠弯曲杆菌的小亚基(PDB ID代码3Q3W)作为模板。通过将两个亚基模型覆盖在乌头酸酶的两个结构域上来产生功能性复合物。将存在于猪乌头酸酶晶体结构模型的活性位点中的4Fe-4S簇和反式乌头酸酶用作模板以构建在活性位点内结合的LeuCD与底物2-异丙基苹果酸和2-己基苹果酸的动力学合格模型。发现 LeuC和Leu-31中的残基Val-35和Leu-411以及LeuD中的His-88接近底物的异丙基和己基，并且选择用于修饰(图2)。将这些残基中的每一个修饰成具有较小疏水侧链的氨基酸残基，以为较大的烷基让出空间。如表1所示，设计了 15种变体用于评估。
表1：通过共表达各种LeuC和LeuD亚基产生的LeuCD变体以及LeuCD 变体的活性.
*LeuC和LeuD亚基通过对野生型氨基酸序列的修饰来鉴定。这些特定基因修饰的符号以及本说明书中公开的基因修饰的类似符号遵循工业标准，其中氨基酸修饰被定义为原始单字母氨基酸代码，其后是氨基酸位置，然后是新的氨基酸单字母代码。L＝亮氨酸；A＝丙氨酸；G＝甘氨酸；V＝缬氨酸；S＝丝氨酸； I＝异亮氨酸。
将工程化LeuCD变体中的每一个表达、分离，然后在不进一步纯化的情况下评估对2-异丙基苹果酸(即2-IPM)、2-丁基苹果酸(即2-BM)和2-己基苹果酸(即2-HM)的活性，如下所述。2-IPM是LeuCD的天然底物，并且在亮氨酸的生物合成期间在微生物有机体中形成。2-BM和2-HM是LeuCD的非天然底物，其将在C7-C11 2-酮酸，例如2-酮壬酸生物合成期间在细胞内形成。
使用下述酶测定法分两步进行LeuCD'变体的评估。最初测试变体对单一高浓度2-IPM、2-BM和2-HM的活性。该测定涉及将LeuCD反应与LeuB反应偶联。因此，在测定期间，2-IPM最初通过LeuCD被异构化为3-异丙基苹果酸 (3-IPM)，然后其通过测定混合物中存在的LeuB酶立即转化为4-甲基-2-酮戊酸。同样，在涉及2-BM或2-HM作为底物的测定中，在测定中形成的最终产物分别是2-酮庚酸或2-酮壬酸。LeuCD变体的活性根据偶联测定中产生的相应 2-酮酸的量计算。LeuCD'变体在将全部或部分2-烷基苹果酸底物(如2-HM) 转化为相应的C7-C11 2-酮酸方面具有比野生型酶更高的活性，这是令人满意的，因为他们提高了整体效率并避免图1的相关“+1”LeuABCD途径的瓶颈。在初步评估之后，对选定数量的LeuCD变体进行更详细的动力学分析，以确定最大速率(即kcat)、米氏(Michaelis-Menten)常数(即KM)和酶对一些底物的的催化效率(即kcat/KM)。
实例2：LeuCD变体在大肠杆菌中的表达。
为了评估表1中列出的野生型LeuCD和工程化LeuCD'变体的底物特异性，将每种复合物的基因分别表达到大肠杆菌细胞中。从大肠杆菌基因组网站 EcoGene(http://ecogene.org)下载LeuC(EcoGene登录号EG11576(序列表， SEQ ID 1)和LeuD(EcoGene登录号EG11575)的基因序列。包含6个组氨酸的13个额外氨基酸的密码子融合在LeuC基因序列的Met-1密码子的上游。这种修饰允许在N-末端表达具有13个额外氨基酸的His-标记的LeuC。出于克隆目的，向所得修饰基因中加入另外的碱基以分别在5'和3'末端引入NcoI和SacI 限制性位点。化学合成整个DNA序列，并由SGI公司在NcoI和SacI位点处将其克隆到大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1(购自EMD Biosciences)中。向下载的LeuD基因序列中加入另外的碱基以分别在5'和3'末端引入NdeI和XhoI限制性位点。同样地，化学合成所得到的修饰基因并由SGI公司在NdeI和XhoI限制性位点处克隆到大肠杆菌表达载体pETDuet-1载体中。同样地，化学合成另外的LeuC和LeuD变体的基因并分别克隆到pRSFDuet和pETDuet载体中。
通过用单独的LeuC和LeuD亚基表达载体共转染他们，在大肠杆菌BL21 (DE3)(购自EMD Biosciences)细胞中产生全功能异丙基苹果酸异构酶(即 LeuCD)。通过共转染大肠杆菌细胞中LeuC和LeuD变体载体的不同组合产生不同的LeuCD变体。表1显示了用于在大肠杆菌中产生相应的LeuCD变体的LeuC和LeuD载体组合。应注意，本文包括的序列表中没有一个显示使用的组氨酸标签，在这种情况下，其为Gly-Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser。
使用标准程序用LeuC和LeuD表达载体共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上选择携带表达载体的细胞。通过将单个转化体菌落转移到50mL含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基中并在37℃下以220rpm振荡温育过夜来开始起子培养。第二天，将7mL起子培养物接种到800mL超级肉汤(TB) 中，并将培养物在37℃温育直至其OD600nm达到0.5。加入终浓度为1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以诱导LeuCD复合物或其变体的表达，并将培养物转移至15℃培养箱中，持续16小时。在16小时后，将培养物以8000转/分钟(rpm)离心以使细胞造粒。将细胞团块分成4个等分试样并储存在-80℃直至破碎以分离LeuCD复合物。
将LeuCD复合物在厌氧室(从COY Lab Products(美国，密歇根州)获得) 中从细胞团块中分离，保持在98％氮气和2％氢气下。将[0055]中制备的大肠杆菌沉淀悬浮于含有0.2mM硫酸亚铁铵、10mM DTT、30mM KCl、5mM MgCl2和蛋白酶抑制剂混合物(从SIGMA-ALDRICH,USA，美国获得)的50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中。向细胞中加入2.5gm 0.1mm玻璃珠，并在Geno 研磨机上以1750转破碎细胞3分钟。通过离心沉淀细胞碎片和玻璃珠，并将上清液与等体积的50％甘油混合并在-20℃下厌氧储存。
使用来自产生LeuCD变体的细胞的全细胞裂解物进行每种LeuCD变体的功能评估。为了比较每种LeuCD复合物的催化效率，使用装配有荧光检测器的 Labchip GX II(PerkinElmer公司马萨诸塞州，沃尔瑟姆)上的微流体毛细管电泳，测定全细胞裂解物中LeuC和LeuD变体的量。使用制造商提供的试剂和方案制备细胞裂解物用于毛细管电泳。简而言之，将4μL细胞提取物的等分试样与14μL变性缓冲液混合。将混合物在100℃加热5分钟并使其冷却至室温。冷却后，向混合物中加入70μL无菌水，并使用PerkinElmer提供的方案进行分析。LabChip GX II软件分析并报告了每个样品中检测到的LeuC和LeuD的大小、相对浓度和纯度。将来自含有空载体的细胞的细胞提取物作为阴性对照，用于鉴定提取物中的LeuC和LeuD蛋白。将由Pierce Biotechnology(伊利诺伊州，罗克福德)提供的分析级牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(2mg/mL)用作定量的标准。在所有含有LeuCD复合物的提取物中，LeuC亚基是限制性亚基。每种LeuCD提取物的活性相对于提取物中存在的LeuC的量标准化。
实例3：确定野生型和工程化LeuCD'变体的底物特异性。
开发了高通量LeuCD酶测定法，用于针对对2-异丙基苹果酸(即2-IPM)、 2-丁基苹果酸(2-BM)和2-己基苹果酸(即2-HM)的活性，筛选和动力学评估实例1和2中制备的LeuCD'变体。偶联测定包括将LeuCD反应与LeuB反应偶联。因此，在测定期间，2-IPM最初通过LeuCD被异构化为3-异丙基苹果酸 (3-IPM)，然后其通过测定混合物中存在的LeuB酶立即转化为4-甲基-2-酮戊酸。同样，在涉及2-BM或2-HM作为底物的测定中，在测定中形成的最终产物分别是2-酮庚酸或2-酮壬酸。LeuCD变体的活性根据偶联测定中产生的相应 2-酮酸的量计算。
用于筛选每种变体活性的HTP LeuCD偶联测定涉及将表达LeuCD变体的细胞的全细胞裂解物与2.6mM 2-异丙基苹果酸(即2-IPM)、2-丁基苹果酸(即 2-BM)或2-己基苹果酸(即2-HM)在混合物中温育，所述混合物含有以下： 20μg野生型LeuB、16μg LeuB的L96G/V198A变体、5mM NAD+、10mM DTT、 20μg牛血清白蛋白、30mM KCl、5mM MgCl2和50mM HEPESpH 8。总测定体积为100μL，并在室温下在COY室中以厌氧方式进行1小时。加入等体积的含20％甲酸和10％甲醇的混合物终止反应。使用与AB Sciex 5500 QTrap质谱仪偶联的Agilent 1290 Infinity uHPLC，对偶联测定中形成的2-酮酸进行定量。在反相条件下，在Waters Acquity HSS T3 1.8μM 3.0x 150mm反相柱上分离2- 酮酸后，通过在负模式下操作的单四极选择离子监测方法在质谱仪中进行检测和定量。定量基于来自定制合成的分析级标准参考物质的每种2-酮酸的外部校准曲线，除了4-甲基-2-氧代戊酸，其可从Sigma-Aldrich商购获得。
用全细胞裂解物中LeuC亚基的量标准化活性。2-IPM是LeuCD的天然底物，对其的活性表明，工程化酶能够在2-酮丁酸伸长至2-KN期间催化“+1”途径的早期循环。2-BM和2-HM是LeuCD的非天然底物。对2-HM活性高于野生型LeuCD的LeuCD变体能够通过在2-KN形成期间使“+1”途径的后续循环更有效来改善辛醇产率。HTP测定涉及将LeuCD活性与“+1”LeuABCD途径中的下一个酶，异丙基苹果酸脱氢酶(即LeuB)的活性偶联。因此，通过LeuCD分别由2-IPM、2-BM或2-HM产生的3-异丙基苹果酸(即3-IPM)、3-丁基苹果酸或3-己基苹果酸(即3-HM)被LeuB氧化脱羧为2-酮异己酸、2-酮庚酸和2-酮壬酸(即2-KN)。然后，使用LC/MS对所有三种2-酮酸进行定量。
如表1所示，野生型LeuCD(变体3)对2-IPM和2-BM具有高活性，而对2-HM的活性非常小。表1还强调了13种LeuCD变体在将2-己基苹果酸异构化为3-己基苹果酸时具有比野生型LeuCD高2至340倍的活性。LeuC亚基内的残留Val-35和LeuD内的Leu-31对于改善对2-HM的活性具有重大影响。例如，变体1(即V35A-LeuC+wt LeuD)和6(即wt LeuC+L31G-LeuD)对2-HM 的活性比野生型LeuCD(即变体3)分别高出63和341倍。虽然LeuC和LeuD 中的V35A和L31G取代分别增加了对2-HM的活性，但他们显著降低了对 2-IPM的活性。总之，数据表明，变体1和6在2-酮丁酸伸长期间在“+1”途径早期循环中的效果明显低于野生型酶，但在2-酮丁酸伸长为2-酮壬酸的后期阶段期间的效率将高出60至350倍。表达野生型LeuCD和变体1或6将改善2- 酮丁酸酯到C7-C11 2-酮酸以及最终C6-C10醇的伸长。
实例4：对2-己基苹果酸(2-HM)显示高特异性的LeuCD变体的催化效率的测定
在初始评估之后，对野生型LeuCD和选定数量的变体进行更详细的动力学分析以确定最大速率(即kcat)、米氏常数(即KM)，以及酶对2-IPM、2-BM和2-HM的催化效率(即kcat/KM)。使用上述HTP酶测定法进行动力学测定，稍作修改。在动力学参数测定期间，2-IPM、2-BM和2-HM浓度分别为0至0.625mM、 0至5mM和0至1.6mM。测定进行30分钟，并调节野生型或LeuCD变体提取物的量以将底物消耗限制在20％以下。对于最大速率(kcat)计算，酶反应中存在的LeuCD复合物的量基于使用在Labchip GX II(Perkin Elmer公司马萨诸塞州，沃尔瑟姆)上的微流体毛细管电泳测定的LeuC的量来确定。通过使用Graphpad Prizm软件将测定中的活性拟合至米氏方程来计算动力学参数。
表2.LeuCD复合物的动力学参数。
如表2中所强调的，野生型LeuCD复合物(变体3)在催化其天然底物2-IPM 方面是高效的。野生型酶不太优选其非天然底物2-BM和2-HM，如其较低的 kcat/KM值所证实。2-HM是最不优选的底物。所有LeuCD变体，变体1、5、6、 9、59和61显示出与野生型酶相比，对2-HM的催化效率提高5至480倍。动力学数据还表明，变体5在催化2-BM异构化方面比2-HM更有效(kcat/KM)，而变体6、9和61在催化2-HM方面比2-BM更有效。变体1和59在催化2-BM 和2-HM的异构化方面显示出非常相似的效率。
实例5：使用野生型LeuCD及其变体联合'+1途径'酶在大肠杆菌的工程菌株中体内生产C4-C8醇
菌株构建
在工程化大肠杆菌(E.coli)MG1655菌株中评估LeuCD变体对醇产生的影响。修改MG1655菌株以改善线性醇生产，使得能够从Plac启动子表达基因并赋予克隆稳定性。线性醇生产的改进涉及敲低ilvBN和ilvIH基因，以及上调大肠杆菌MG1655中的ilvA基因。敲除ilvBN和IlvIH基因消除了支链醇的产生，而上调ilvA基因增加了2-酮丁酸的产生。通过用强组成型启动子BBa_J23119 和合成核糖体结合位点BBa_B0034替换其天然启动子和核糖体结合位点来实现ilvA的上调。强组成型启动子和合成核糖体结合位点均获自标准生物组件登记册(http://parts.igem.org)，由iGEM(国际基因工程机器大赛)策划的生物部分数据库。如Datsenko和Wanner(PNAS 97(12):6640-6645)所述，通过λ(red) 介导的重组进行ilvBN和ilvIH基因的敲除以及ilvA基因的天然启动子和核糖体结合位点的替换。为了能够从Plac启动子表达基因，使用λDE3溶原化试剂盒 (EMD Millipore Cat#69734)将DE3溶原菌整合到MG1655中。为了确保克隆稳定性，通过λRed介导的同源重组使recA失活。用于醇生产研究的所得菌株的基因型是MG1655(DE3)ΔrecAΔilvBNΔilvIH ilvAup。
载体构建
在评估LeuCD变体在工程化MG1655大肠杆菌菌株中对C4-C8醇生产的影响期间，共表达以下七种酶：i)天然大肠杆菌异丙基苹果酸合成酶(LeuA； GenBank：登录号NC000913.3基因ID：947465)、ii)LeuA*(Marcheschi等人ACS Chem.Biol.2012,7,689-697描述的大肠杆菌IPMS的 H97A/S139G/N167G/P169A/G462D变体)、iii)天然大肠杆菌异丙基苹果酸异构酶(LeuCD；GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：94576和基因ID：945642)、 iv)表3中描述的异丙基苹果酸异构酶变体、v)大肠杆菌异丙基苹果酸脱氢酶 (LeuB；GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：944798)、vi)来自乳酸乳球菌(Lactocossus lactis)的酮异戊酸脱羧酶(KIVD*)的F381L/V461A变体(Zhang 等人PNAS.2008,105,20653-20658所述)以及vii)酿酒酵母乙醇脱氢酶(ADH6； GenBank：登录号NC_001145.3基因ID：855368)。使用Marcheschi等人描述的两种表达载体pZE_LeuABCD-KA6和pZAlac_ilvAleuA(ACSChem.Biol. 2012,7,689-697)在大肠杆菌中表达所有酶。pZE_LeuABCD-KA6从廖博士的小组获得，不经任何进一步修饰即可使用。pZE_LeuABCD-KA6在工程化的MG1655菌株中表达LeuA*(Marcheschi等人ACS Chem.Biol.2012,7,689-697 描述的大肠杆菌IPMS的H97A/S139G/N167G/P169A/G462D变体)、LeuB、 LeuC、LeuD和KiVD*(来自乳酸乳球菌的酮异戊酸脱羧酶的F381L/V461A变体，如Zhang等人PNAS.2008,105,20653-20658所述)。具有Ilva和野生型LeuA 基因拷贝的载体pZAlac_ilvAleuA被修饰以表达本文所述的LeuCD变体基因。构建了包含表3中所示的LeuC和LeuD变体基因的11种载体，用于评估工程化MG1655菌株中对醇组成的影响。图7显示了典型的修饰载体pOC-CL-0###，其与pZE_LeuABCD-KA6一起用于醇生产研究。如图7所示并且在表3中列出，每个pOC-CL-0###载体具有表达给定LeuCD变体的LeuC*和LeuD*基因，天然大肠杆菌异丙基苹果酸异构酶和ilvA基因蛋白。两种载体中的所有基因都在 pLacO1启动子下并使用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。
使用New England Bioscience的Gibson组装技术将LeuC和LeuD变体的基因分两步克隆到pZAlac_ilvAleuA载体中。第一步涉及在pZAlac_ilvAleuA载体的ZraI位点插入LeuD变体基因作为盒(如图8A所示)。LeuD变体基因盒作为Gblock(通过Integrated DNATechnologies)产生，并且在LeuD变体基因的 5'侧具有placO1启动子，核糖体结合位点(rbs)和独特的NheI位点(图8A)。将终止子序列和独特的限制性位点置于LeuD变体基因的3'末端(图8A)。载体构建的第二步涉及使用Gibson组装技术引入LeuC变体基因作为PCR产生的盒(图8B)。由pOC-CL-0###载体鉴定的最终得到的载体中基因的排列如图2 所示。对于醇生产，用含有完整途径的pZE_LeuABCD-KA6载体(图6)和表 3中列出的pOC-CL-0###载体中的一个转化工程化大肠杆菌MG1655菌株 (MG1655(DE3)ΔrecAΔilvBNΔilvIHilvAup)。
表3：构建含有LeuC和LeuD变体基因的载体，用于评估在工程化MG1655 菌株中对醇组成的影响。
变体 LeuC LeuD pOC-CL-0###
1 V35A Wt LeuD pOC-CL-0122
2 V35G Wt LeuD pOC-CL-0123
3 Wt LeuC Wt LeuD pOC-CL-0124
6 Wt LeuC L31G pOC-CL-0112
9 V35A L31G pOC-CL-0113
10 V35G L31V pOC-CL-0127
38 V35A/L411G L31A pOC-CL-0129
39 V35A/L411G L31G pOC-CL-0114
59 Wt LeuC L31V/H88A pOC-CL-0115
61 Wt LeuC L31G/H88A pOC-CL-0128
115 V35G/L411V L31A/H88S pOC-CL-0130
工程化MG1655细胞中的醇生产
在含有100ug/mL氨苄青霉素和25ug/mL卡那霉素的LB琼脂平板上选择用pZE_LeuABCD-KA6和表3中列出的pOC-CL-0###载体中的一个转化 MG1655菌株。使用来自双重抗生素LB琼脂平板的单个菌落启动在含有100 ug/mL氨苄青霉素和25ug/mL卡那霉素的LB培养基中的50mL起子培养物，并在37℃下在设定为200rpm的培养箱振荡器中温育过夜。温育12至16小时后，将含有5mL具有100ug/mL氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的无菌修饰的2XM9培养基(表4中所示的组成)的血清瓶用50μL起子培养物进行接种。
表4：用于证明由重组工程化以含有‘+1途径’与LeuCD变体组合的大肠杆菌产生醇的培养基组成。
将培养物在37℃下以200rpm振荡温育，并在3小时后使用0.1mM IPTG 诱导以表达所有基因。诱导后培养温度降至30℃。诱导后44小时，将他们转移至4℃，持续20至30分钟来收获培养物。然后，将去掉血清瓶的盖子，并将1mL发酵液快速倒入含有1mL饱和氯化钠溶液和2mL分析级甲苯的15mL 锥形管中。将肉汤-氯化钠-甲苯混合物涡旋30秒，并使用WO2016094604 A1 (通过引用整体并入本文)中描述的GC/FID方法，对甲苯提取物进行醇分析。
表5显示了10种LeuCD变体对表达他们以及上述其他基因的菌株中的醇组分的影响。与仅表达野生型LeuCD的菌株相比，几种表达LeuCD变体的细胞产生更高量的庚醇和/或辛醇。这表明本文报道的LeuCD变体使用本文所述的非天然途径克服了产生>C7醇的障碍。对数据的ANOVA分析显示LeuCD变体6和59增加了庚醇滴度(图9A)，而变体6、9、10、38、39和61增加了辛醇滴度(图9B)，其显著高于野生型酶所产生的那些。表达LeuCD变体6、9 或39的细胞产生的辛醇量比WT LeuCD酶高6倍(图9B)。
表5：含有‘+1途径’酶与WT和变体LeuCD酶组合的大肠杆菌的血清瓶发酵的平均醇滴度。
变体# 1-丁醇 1-戊醇 1-己醇 1-庚醇 1-辛醇 总醇
WT 238.5±12.0 139.1±4.8 69.2±1.1 83.9±1.2 2.3±0.2 533.1±18.9
1 242.4±8.1 145.0±7.2 72.4±4.4 87.0±5.4 2.4±0.2 549.2±25.3
2 242.1±8.5 144.9±3.4 72.9±1.2 87.5±2.0 2.4±0.3 549.8±14.1
115 248.6±12.0 144.0±8.6 71.9±3.6 82.8±4.3 2.6±0.1 550.0±28.6
61 252.7±9.8 146.1±6.5 73.5±3.7 85.9±6.5 3.9±0.5 562.2±26.8
10 257.9±7.6 125.6±1.2 58.8±0.7 80.3±1.3 4.1±0.6 526.7±9.8
38 275.0±17.2 142.7±5.1 74.7±1.6 79.8±3.8 5.6±0.7 577.8±27.9
59 302.2±9.4 159.2±5.0 66.8±2.5 95.5±3.9 6.8±0.4 630.6±17.3
6 289.4±6.0 160.3±6.0 72.4±3.7 93.9±4.7 14.2±0.4 630.2±19.6
9 310.2±12.6 158.8±7.9 65.5±4.9 84.8±8.7 15.0±0.8 634.4±34.3
39 292.6±16.2 145.9±10.2 63.0±7.1 76.0±9.2 18.2±1.2 595.7±42.9
*ADH6和kivD也包括在所有菌株构建体中。所有滴度均以毫克每升±标准偏差显示，最少一式三份实验。诱导后44小时测量滴度。
实例6：结果和讨论
为了提高“+1”途径生产2-酮壬酸的效率，异丙基苹果酸异构酶理想地有效地催化所有中间体2-烷基苹果酸异构化成其相应的3-烷基苹果酸。用于评估 LeuCD变体的三种底物表示这些中间体2-烷基苹果酸。更具体地，2-异丙基苹果酸(即2-IPM)表示预期在“+1”迭代途径的早期循环期间形成的较短的2-烷基苹果酸底物；2-丁基苹果酸(即2-BM)和2-己基苹果酸(即2-HM)分别是在形成2-酮壬酸途径的迭代途径中形成的中等至最大的2-烷基苹果酸。对于在体外合成2-酮壬酸的“+1”迭代途径的最佳效率，LeuCD复合物组合需要有效地催化每个中间体2-烷基苹果酸转化为其相应的3-烷基苹果酸。从表2中可以看出，野生型LeuCD复合物的效率随着烷基链的大小增加而降低，其中2-HM是不良底物。在这些条件下，向反应混合物中加入变体6将改善生产2-酮壬酸的途径的效率。
对于“+1”迭代途径的最佳效率，为了在体内制备2-酮壬酸，LeuCD复合物组合需要使其催化每个中间体2-烷基苹果酸转化的效率与细胞内其他酶的效率以及细胞内其他竞争性代谢途径匹配。在这种情况下，表1(或表5)中列出的任何变体可能更适合，即使他们异构化2-HM的效率可能不是最高。
最初，针对对单个高浓度3-IPM、2-BM和3-HM的活性筛选LeuCD'变体，然后确定所选择的几个的催化效率(表1和2)。不希望受任何理论的束缚，表2中所示的结果可以解释为表示用具有较小疏水侧链的氨基酸替换LeuC的 Val-35和/或Leu-411，例如缬氨酸、丙氨酸取代Val-35和/或缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代Leu-411，和/或用具有较小疏水侧链的氨基酸替换LeuD的 Leu-31和/或His-88，例如缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代Leu-31和/或丝氨酸或丙氨酸取代His-88，在一些情况下可同时降低对3-IPM的酶活性，并增加对 3-HM的酶活性。如表1所示，这些变体的各种组合对3-HM表现出比野生型酶更高的活性。该分析表明，野生型LeuCD在捕获其天然底物(即2-IPM) 用于催化方面非常有效，但随着“+1”途径迭代用于将2-酮丁酸伸长至C7-C11 2- 酮酸(例如在这种情况下，2-酮壬酸)，其作为催化剂的活性逐渐降低。变体1 (V35A-LeuC+wt LeuD)、5(wt-LeuC+L31A LeuD)、6(wt-LeuC+ L31G-LeuD)、9(V35A-LeuC+L31G-LeuD)、10(V35A-LeuC+L31V)、18 (L411V-LeuC+L31G-LeuD)、31(V35A/L411V-LeuC+L31V-LeuD)、32 (V35A/L411V-LeuC+L31A-LeuD)、39(W35A/L411G-LeuC+L31G-LeuD)、 59(wt-LeuC+L31V/H88A-LeuD)、61(wt-LeuC+L31G/H88A-LeuD)、64 (wt-LeuC+L31G/H88S-LeuD)和115(V35G/L411V-LeuC+L31A/H88S-LeuD) 对2-HM的活性比野生型LeuCD(变体3)高2至341倍。虽然LeuC和LeuD 中的这些不同取代增加了对2-HM的活性，但他们减少或消除了对2-IPM的活性。总之，数据表明，这些在2-酮丁酸伸长期间在“+1”途径的早期循环中的效率明显低于野生型酶，但在2-酮丁酸伸长至C8-C11 2-酮酸的后期阶段期间的效率将提高2至341倍。表达野生型LeuCD和变体1、5、6、9、10、18、31、 32、39、59、61、64或115将克服2-酮丁酸伸长至C7-C11 2-酮酸以及最终C6-C10醇期间LeuCD相关的瓶颈。
数据显示，基因修饰的LeuCD'酶通常以比野生型酶更高的催化效率操作，以如所示催化2-己基苹果酸形成3-己基苹果酸，随后形成2-酮壬酸。还可以推断，其将更有效地催化2-戊基苹果酸以形成3-戊基苹果酸，随后形成2-酮辛酸。最后，其还可能以更高的催化效率进行这些转化的组合。
如表5中所示，几种表达LeuCD变体的细胞比仅表达野生型LeuCD的菌株产生更高量的庚醇和/或辛醇。这表明本文报道的LeuCD变体使用本文使用的非天然途径克服了产生>C7醇的障碍。LeuCD变体6和59增加了庚醇滴度，而变体6、9、10、38、39、59和61与野生型酶产生的那些相比增加了辛醇滴度。表达LeuCD变体6、9或39的细胞产生的辛醇量比WT LeuCD酶高>6倍。
保藏信息
在上面公开并在所附权利要求中列举的含有LeuCD变体38 (V35A/L411G-LeuC+L31A-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变体39 (W35A/L411G-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变体10 (V35A-LeuC+L31V-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变体6(wt-LeuC+ L31G-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变体59(wt-LeuC+L31V/H88A-LeuD) 的大肠杆菌、含有LeuCD变体9(V35A-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌和含有LeuCD变体61(wt-LeuC+L31G/H88A-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株，根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约条款，由美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110保藏。保藏日期为2016年9月2日，代表陶氏全球技术公司。自本申请的提交日期之前，每个菌株的25个小瓶的保藏物取自发明人保持的相同保藏物。这些保藏物旨在满足37C.F.R.§1.801-1.809的所有要求。保藏物将在保藏库保存30年，或在最后一次请求后保存5年，或保存长达专利有效期(以较长者为准)，并在此期间根据需要予以更换。含有LeuCD变体38((V35A/L411G-LeuC+ L31A-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2日保藏在ATCC(ATCC 专利保藏号：PTA-123472)。含有LeuCD变体39(W35A/L411G-LeuC+ L31G-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2日保藏在ATCC(ATCC 专利保藏号：PTA-123473)。含有LeuCD变体10(V35A-LeuC+L31V-LeuD) 的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号： PTA-123474)。含有LeuCD变体6(wt-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123475)。含有LeuCD变体59(wt-LeuC+L31V/H88A-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123477)。含有LeuCD 变体9(V35A-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2 日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123478)。含有LeuCD变体61 (wt-LeuC+L31G/H88A-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123479)。
序列表
<110> 陶氏化学公司
Sanghani, Paresh
Greenwalt, Scott
Bhosale, Prakash
Shiue, Eric
<120> 通过对微生物代谢途径的基因修饰来制备伸长的2-酮酸和
其C5-C10化合物的方法
<130> DOW 79046 MA/79046.369
<160> 37
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 466
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
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Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
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435 440 445
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450 455 460
Ile Lys
465
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuC（V35A L411A）
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Ile Lys
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<220>
<223> 合成-修饰的LeuC（V35G L411A）
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuC（V35G L411V）
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465
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 18
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31A）
<400> 18
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ala Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 19
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31A H88A）
<400> 19
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ala Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
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130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 20
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31A H88G）
<400> 20
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 21
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31A H88V）
<400> 21
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1 5 10 15
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65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 22
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31A H88S）
<400> 22
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
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180 185 190
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195 200
<210> 23
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31G）
<400> 23
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
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65 70 75 80
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Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
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180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 24
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31G H88A）
<400> 24
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
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195 200
<210> 25
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31G H88G）
<400> 25
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 26
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31G H88V）
<400> 26
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Gly Gln
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 27
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31G H88S）
<400> 27
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Gly Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
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65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ser Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
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Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 28
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31V）
<400> 28
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Val Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 29
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31V H88A）
<400> 29
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Val Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
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Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 30
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31V H88G）
<400> 30
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Val Gln
20 25 30
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100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 31
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31V H88V）
<400> 31
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 32
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31V H88S）
<400> 32
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1 5 10 15
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65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ser Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 33
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31S）
<400> 33
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 34
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31S H88A）
<400> 34
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 35
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31S H88G）
<400> 35
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ser Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Gly Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 36
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31S H88V）
<400> 36
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ser Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 37
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成-修饰的LeuD（L31S H88S）
<400> 37
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ser Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ser Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200

Claims (25)

1.一种制备C7-C11 2-酮酸的方法，所述方法包括：(I)提供C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种与
(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶；
(B)至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶；和
(C)至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物，其包括：
(1)LeuC亚基，其选自由以下组成的群组：
(i)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(ii)基因修饰的LeuC'亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合；和
(2)LeuD亚基，其选自由以下组成的群组：
(i)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(ii)基因修饰的LeuD'亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合；
在所述C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种转化为所述C7-C11 2-酮酸的条件下；
其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(i)和(I)(C)(2)(ii)的组合、(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(2)(ii)的组合、或(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(2)(i)的组合；其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性；以及其中所述C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种通过一种或多种生化反应转化为所述C7-C112-酮酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：
(a)丙氨酸取代Val-35；
(b)甘氨酸取代Val-35；
(c)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；
(d)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；
(e)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411；以及
(f)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：
(a)丙氨酸取代Leu-31；
(b)甘氨酸取代Leu-31；
(c)缬氨酸取代Leu-31；
(d)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；
(e)甘氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88；
(f)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；以及
(g)缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(i)和(I)(C)(1)(ii)的组合，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(1)(ii)的组合，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(I)(C)(1)(ii)和(I)(C)(1)(ii)的组合，其中(I)(C)(1)(ii)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411，并且其中(I)(C)(2)(ii)的氨基酸序列的至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种包含2-酮丁酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种包含2-酮异戊酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述C4-C20 2-酮酸底物中的至少一种包含2-甲基-2-酮戊酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括：(II)在所述C7-C112-酮酸被转化为比被转化的所述C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下，向所述C7-C11 2-酮酸提供至少一种具有硫胺素依赖性脱羧酶活性的硫胺素依赖性脱羧酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其还包括：(III)在所述C6-C10醛被转化为相应的C6-C10醇的条件下，向所述C6-C10醛提供至少一种具有醇脱氢酶活性的醇脱氢酶。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其还包括：(III)在C6-C10醛被转化为相应的C6-C10羧酸的条件下，向C6-C10醛提供至少一种具有醛脱氢酶活性的醛脱氢酶。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其还包括：(III)在所述C6-C10醛被转化为相应的Cn-1烷烃的条件下，向所述C6-C10醛提供至少一种具有脂肪醛脱羰酶活性的脂肪醛脱羰酶。
14.一种微生物有机体，其包括：
一种基因修饰的LeuCD'酶复合物，其包括：
(a)LeuC亚基，其选自由以下组成的群组：
(1)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(2)基因修饰的LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合；和
(b)LeuD亚基，其选自由以下组成的群组：
(1)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(2)基因修饰的LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合；
其中所述基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(a)(1)和(b)(2)的组合、(a)(2)和(b)(2)的组合、或(a)(2)和(b)(1)的组合，其中所述基因修饰的LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
15.根据权利要求14所述的微生物有机体，其中(a)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：
(i)丙氨酸取代Val-35；
(ii)甘氨酸取代Val-35；
(iii)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；
(iv)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；
(v)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411；以及
(vi)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。
16.根据权利要求14或15所述的微生物有机体，其中(b)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：
(i)丙氨酸取代Leu-31；
(ii)甘氨酸取代Leu-31；
(iii)缬氨酸取代Leu-31；
(iv)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；
(v)甘氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88；
(vi)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；以及
(vii)缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。
17.根据权利要求14所述的微生物有机体，其中所述基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(a)(1)和(b)(2)的组合，并且其中(b)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
18.根据权利要求14所述的微生物有机体，其中所述基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(a)(2)和(b)(2)的组合，其中(a)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，以及其中(b)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
19.根据权利要求14所述的微生物有机体，其中所述基因修饰的LeuCD'酶复合物包含(a)(2)和(b)(2)的组合，其中(a)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411，以及其中(b)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
20.一种LeuCD'酶复合物，其包括：
(a)LeuC亚基，其选自由以下组成的群组：
(1)天然LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(2)基因修饰的LeuC亚基，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸独立地取代Val-35、Leu-411或其组合；和
(b)LeuD亚基，其选自由以下组成的群组：
(1)天然LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(2)基因修饰的LeuD亚基，其包括与SEQ ID NO:2具有至少80％同源性的氨基酸序列和至少一个修饰，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31、His-88或其组合；
其中所述LeuCD'酶复合物包含(a)(1)和(b)(2)的组合、(a)(2)和(b)(2)的组合、或(a)(2)和(b)(1)的组合，其中所述基因修饰的LeuCD'酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
21.根据权利要求20所述的LeuCD'酶复合物，其中(a)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：
(i)丙氨酸取代Val-35；
(ii)甘氨酸取代Val-35；
(iii)丙氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411；
(iv)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；
(v)丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411；以及
(vi)甘氨酸取代Val-35和缬氨酸取代Leu-411。
22.根据权利要求20或21所述的LeuCD'酶复合物，其中(b)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰选自由以下组成的群组：
(i)丙氨酸取代Leu-31；
(ii)甘氨酸取代Leu-31；
(iii)缬氨酸取代Leu-31；
(iv)丙氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；
(v)甘氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88；
(vi)甘氨酸取代Leu-31和丝氨酸取代His-88；以及
(vii)缬氨酸取代Leu-31和丙氨酸取代His-88。
23.根据权利要求20所述的LeuCD'酶复合物，其包含(a)(1)和(b)(2)的组合，并且其中(b)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
24.根据权利要求20所述的LeuCD'酶复合物，其中包含(a)(2)和(b)(2)的组合，并且其中(a)(2)的氨基酸序列的至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35，并且其中(b)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
25.根据权利要求20所述的LeuCD'酶复合物，其包含(a)(2)和(b)(2)的组合，并且其中(a)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是丙氨酸取代Val-35和甘氨酸取代Leu-411，并且其中(b)(2)的氨基酸序列的所述至少一个修饰是甘氨酸取代Leu-31。
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