CN115992125A - 酶的组合、表达载体、工程菌株以及它们的应用和生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，公开了酶的组合、表达载体、工程菌株以及它们的应用和生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法，该组合包含将5‑甲羟戊酸磷酸转化为异戊烯基磷酸的酶以及将异戊烯基磷酸转化为异戊烯醇的酶。在该酶的组合的作用下，能够在胞内或胞外实现异戊烯醇和/或异戊二烯的生产，为异戊烯醇或异戊二烯的生产提供了新的途径。

Description

酶的组合、表达载体、工程菌株以及它们的应用和生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种酶的组合、一种表达载体、一株工程菌株以及它们的在生产异戊烯醇和/或异戊二烯中的应用和一种生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法。

背景技术

异戊二烯是一种重要的平台化合物，其95％用于合成橡胶，全球每年约生产80万吨的聚异戊二烯，同时异戊二烯还广泛应用于医药、香料和航空燃料等领域。在工业上异戊二烯的来源主要是通过从石油碳5馏分分离中获得。碳5馏分是石脑油裂解制乙烯的副产物，其中异戊二烯的质量分数仅为15％左右。此外还可以通过化学法如石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法，异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)等合成。

异戊烯醇是一种重要的有机合成中间体，可用于减水剂和杀虫剂的合成。同时异戊烯醇还具有很高的能量密度，很好的低温流动性，有可能发展成为下一代生物液体燃料。异戊烯醇目前主要采用化学法合成，即通过异丁烯和甲醛缩合而成，工业上采用此法生产异戊烯醇的公司有德国的BASF和日本的Kuraray。

现有生产方法的主要问题是石油基原料的不可再生性，高温高压能耗高，工艺流程复杂，收率低，废液造成环境污染，对设备要求高等。随着石油资源的日益枯竭和价格的不断攀升，原料来源必将成为石油基异戊二烯和异戊烯醇的重要瓶颈。因此，从环境保护及可持续发展角度，寻找替代石油基来源的新的异戊二烯和异戊烯醇生产途径，是今后异戊二烯和异戊烯醇工业生产的重要发展趋势。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的异戊二烯和/或异戊烯醇生产的途径，具体提供一种酶的组合、一种表达载体、一株工程菌株以及它们的在生产异戊烯醇和/或异戊二烯中的应用和一种生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种酶的组合，该组合包含将5-甲羟戊酸磷酸转化为异戊烯基磷酸的酶以及将异戊烯基磷酸转化为异戊烯醇的酶。

本发明第二方面提供一种表达载体，所述载体包含编码如上所述的酶的组合的基因。

本发明第三方面提供一株工程菌株，所述工程菌株包含编码如上所述的酶的组合的基因或如上所述的表达载体。

优选地，所述工程菌株还包含编码甲羟戊酸途径和/或甲羟戊酸衍生途径中的酶的基因；

其中，所述甲羟戊酸途径包含以下酶：甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合酶；

所述甲羟戊酸衍生途径包含以下酶：甲羟戊酸转化为异戊烯醇的酶以及任选的第二脱水酶。

本发明第四方面提供如上所述的酶的组合、或如上所述的表达载体、或如上所述的工程菌株在生产异戊烯醇和/或异戊二烯中的应用。

本发明第五方面提供一种生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法，该方法包括在产生异戊烯醇和/或异戊二烯的条件下，将甲羟戊酸转化为异戊烯醇，和/或将所述异戊烯醇转化为异戊二烯。

本发明第六方面提供一种生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法，该方法包括在产生异戊烯醇和/或异戊二烯的条件下和足以产生异戊烯醇和/或异戊二烯的时间内培养如上所述的工程菌株。

本发明提供了一种生产异戊烯醇或异戊二烯的新途径，通过所述酶的组合能够在生物体内或反应器内生产异戊烯醇或异戊二烯。

该途径在微生物体内表达时，还能够与其他能够生产异戊烯醇或异戊二烯的途径协同，显著提高异戊烯醇或异戊二烯的产量。

本发明所述的工程菌株能够利用比如葡萄糖和甲羟戊酸等作为原料，用于生产异戊烯醇或异戊二烯，使用本发明优选的工程菌株能够进一步提高异戊烯醇和/或异戊二烯的产量。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供一种酶的组合，该组合包含5-甲羟戊酸磷酸转化为异戊烯基磷酸的酶以及将异戊烯基磷酸转化为异戊烯醇的酶。

应当理解的是，5-甲羟戊酸磷酸转化为异戊烯基磷酸的酶以及将异戊烯基磷酸转化为异戊烯醇的酶可以单独存在，也可以同时存在，本领域技术人员可以根据需要进行选择。

本发明中涉及的酶或基因可以是直接来源于生物体的，也可以是经过人工优化后的，本领域技术人员可以根据需要选择具体的酶或基因，并对其进行合理的优化或调整。可以采用本领域常规的生物学手段进行优化。所述酶可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

本领域技术人员可用公知的人工化学合成的方法来合成有关氨基酸或核苷酸序列。

所述酶还可以是经过修饰的酶，比如可以采用本领域常见的标签对氨基酸序列进行添加修饰，举例来说，可以通过在氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

所述酶还可以连接信号序列，所述信号序列可以来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，但不限于此。

编码酶的核酸的来源可以不受特别的限制，可以包括，例如，其中编码基因产物能够催化所参照的反应的任何物种。此类物种包括原核生物体和真核生物体，包括但不限于，细菌(包括古细菌和真细菌)和真核生物(包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物(包括人))。此类来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以及本发明公开的或作为相应基因的来源生物体可获得的其他示例性物种在现在可以获得的物种的全基因组序列的情况下，对于相关或关系较远的物种中的一种或多种基因，鉴定编码具有特定酶活力的酶的基因，包括例如已知基因的同源、直向同源物、旁系同源物和非直向同源基因置换，和生物体之间遗传改变的互换，是本领域中常规的和公知的。因此，能够实现本发明关于特定生物体诸如大肠杆菌所描述的生物合成的代谢途径可以容易地应用于其他微生物，同样地包括原核和真核生物。本领域技术人员将知晓在一个生物体中举例说明的代谢途径可以同样地应用于其他生物体。

优选地，所述将5-甲羟戊酸磷酸转化为异戊烯基磷酸的酶为磷酸甲羟戊酸脱羧酶。

优选地，磷酸甲羟戊酸脱羧酶为erg19基因编码的磷酸甲羟戊酸脱羧酶。

优选地，磷酸甲羟戊酸脱羧酶来自于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，比如可以为Gene ID:855779所示的基因编码的磷酸甲羟戊酸脱羧酶或该酶R74H突变后的酶。

优选地，所述将异戊烯基磷酸转化为异戊烯醇的酶为异戊烯醇磷酸水解酶。

优选地，所述异戊烯醇磷酸水解酶为aphA基因编码的异戊烯醇磷酸水解酶。

优选地，所述异戊二烯磷酸水解酶来源于枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，比如可以为来自大肠杆菌的GenBank No.X86971.1。

优选地，该组合还包含甲羟戊酸激酶(MVK)。

优选地，甲羟戊酸激酶(MVK)为erg12基因编码的甲羟戊酸激酶。

优选地，甲羟戊酸激酶(MVK)来自于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，比如可以为Gene ID 855248所示基因编码的酶。

优选地，该组合还包含HMG-CoA合成酶(HMGS，acetyl-CoA acetyltransferase/HMG-CoA reductase)和HMG-CoA还原酶(HMGR，HMG-CoA synthase)。

优选地，所述HMG-CoA合成酶为mvaS基因编码的HMG-CoA合成酶。

优选地，所述HMG-CoA合成酶来自于粪肠球菌Enterococcus faecalis，比如可以为GenBank No.AAG02439所示的酶。

优选地，所述HMG-CoA还原酶为mvaE基因编码的HMG-CoA还原酶。

优选地，所述HMG-CoA还原酶来自于粪肠球菌Enterococcus faecalis，比如可以为GenBank No.AAG02438所示的酶。

优选地，该组合还包含将异戊烯醇转化为异戊二烯的酶。

优选地，所述将异戊烯醇转化为异戊二烯的酶为脱水酶。

优选地，所述脱水酶为油酸水合酶和/或芳樟醇脱水酶。

优选地，所述油酸水合酶为ohyA基因编码的油酸水合酶。

优选地，所述油酸水合酶来自于脑膜脓毒性黄杆菌Elizabethkingiameningoseptica，比如可以为GenBank No.ACT54545.1所示的酶。

优选地，所述芳樟醇脱水酶为linD基因编码的芳樟醇脱水酶。

优选地，所述芳樟醇脱水酶来自于卡斯特兰尼氏菌Castellanielladefragrans，比如可以为GenBank No.FR669447所示的酶。

所述酶的组合可以在胞外催化生产异戊烯醇和/或异戊二烯，也可以通过将相关基因构建表达载体，进而获得工程菌株的方式便于后续通过发酵的方法一步生成异戊烯醇和/或异戊二烯。

本发明第二方面提供一种表达载体，所述载体包含编码如上所述的酶的组合的基因。

在本发明中，可以在本领域已知的各种载体中完成拼接，构建表达载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等。所述载体优选为可在受体菌中过量表达的诱导型载体。

本领域技术人员可以根据想要构建的工程菌株，选择合适的载体，比如当所述受体菌为大肠杆菌时，载体优选为pACYCduet-1、pCOLADuet-1、pETduet、pTrcHis2B、pET30a、pET28a、pET24a、pET21a、pET22b、pET32a、pET14a、pBAD和pCold I中的至少一种；当所述受体菌为枯草芽孢杆菌时，载体优选为pMA5、pHY300PLK、pAXO1、pHTHisQ和pHTHisR中的至少一种。

表达载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性载体，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得表达载体。

本发明第三方面提供一株工程菌株，所述工程菌株包含编码如上所述的酶的组合的基因或如上所述的表达载体。

可以通过本领域常规的方法将如上所述的表达载体转化、转导或者转染到受体菌中，如热激法、氯化钙法和电转化法等。

所述受体菌可以为本领域常规的受体菌，比如可以为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，得到的工程菌株也对应相应的菌株种类。

当所述受体菌为大肠杆菌时，优选地，所述受体菌选自E.coliDH5α、E.coliBL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/plysS、E.coli Rosetta、E.coli Rosetta(DE3)、E.coli JM109、E.coli JM110和E.coli TOP10中的至少一种。

当所述受体菌为枯草芽孢杆菌时，优选地，所述受体菌为枯草芽孢杆菌BS1012、BS168、WB600N和WB800N中的至少一种。

应当理解的是，所述工程菌株中具备维持正常生长代谢的途径，比如糖酵解途径等，使得工程菌株能够以葡萄糖为碳源，进行成长代谢。

所述工程菌株还可以含有其他能够生产异戊二烯和/或异戊烯醇的途径，比如，还可以含有甲羟戊酸途径和其衍生途径等，优选地，所述工程菌株还包含编码甲羟戊酸途径和/或甲羟戊酸衍生途径中的酶的基因。

当工程菌株中含有至少两个能够生产异戊二烯和/或异戊烯醇的途径时，如果有功能重叠的酶，可以根据需要选择使用至少一种酶，具体的酶可以相同或者不同。

所述甲羟戊酸途径或其衍生途径的酶的来源可以不受特别的限制，可以来源于同一种生物，也可以来自于多种生物，比如可以为酿酒酵母、粪肠球菌等等。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述甲羟戊酸途径包含以下酶：甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(PMD)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI)和异戊二烯合酶。

优选地，编码甲羟戊酸激酶的基因为erg12基因。

优选地，erg12基因来自于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，比如可以为GeneID 855248所示的基因。

优选地，编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因为erg8基因。

优选地，erg8基因来自于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，比如可以为GeneID:855260所示的基因。

优选地，编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因为erg19基因。

优选地，erg19基因来自于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，比如可以为GeneID:855779所示的基因或该基因编码的酶R74H突变后相应的基因。

优选地，编码异戊烯基焦磷酸异构酶的基因为idi1基因。

优选地，idi1基因来自于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，比如可以为GeneID:855986所示的基因。

在本发明中，还可以采用Lego DNA assembling方法，将Saccharomycescerevisiae(ATCC 204508)的erg12、erg8、erg19和idi1基因克隆到pTrcHis2B(Invitrogen)中得到pTrcLow，详见文献(JIANG X,YANG J,ZHANG H,et al.Invitro assembly of multiple DNA fragments using successive hybridization[J].PloS One,2012,7(1):e30267)。

优选地，异戊二烯合酶为ispS基因编码的异戊二烯合酶。

优选地，所述异戊二烯合酶来源于杨树(具体比如为银白杨Populus alba)、甘薯Ipomoea batatas、葛根PuerariaLobata、刺槐Robiniapseudoacacia、蓝桉Eucalyptusglobulus、毛竹Phyllostachyspubescens、夏橡Quercusrobur、散尾葵Chrysalidocarpuslutescens或槲栎Quercusaliena Bl.，比如为GenBank No.AB198180所示的酶。

优选地，所述甲羟戊酸衍生途径包含以下酶：甲羟戊酸转化为异戊烯醇的酶以及任选的第二脱水酶。

优选地，所述将甲羟戊酸转化为异戊烯醇的酶为甲羟戊酸-3-激酶和甲羟戊酸-3-磷酸脱羧酶，和/或脂肪酸脱羧酶。

优选地，编码甲羟戊酸-3-激酶的基因为pmd_ta基因或pmd_sm基因。

优选地，编码所述甲羟戊酸-3-激酶的pmd_ta基因来自于嗜酸嗜热菌Thermophilusacidophilum，比如可以编码GenBank NC_002578.1所示的酶。

优选地，编码所述甲羟戊酸-3-激酶的pmd_sm基因来自于缓症链球菌Streptococcusmitis，比如可以编码GenBank NC_013853.1所示的酶。

优选地，所述甲羟戊酸-3-磷酸脱羧酶为pmd_sm基因编码的甲羟戊酸-3-磷酸脱羧酶。

优选地，编码所述甲羟戊酸-3-磷酸脱羧酶的pmd_sm基因来自于缓症链球菌Streptococcus mitis，比如可以编码GenBank NC_013853.1所示的酶。

优选地，所述脂肪酸脱羧酶为oleT基因编码的脂肪酸脱羧酶。

优选地，所述脂肪酸脱羧酶来自于海鲜球菌Jeotgalicoccus sp.ATCC8456，比如可以为GenBank No.HQ709266.1所示的酶。

优选地，所述第二脱水酶为油酸水合酶和/或芳樟醇脱水酶。

编码所述酶的基因在第一方面已经进行了说明，在此不再赘述。

在一些情况下，异戊烯醇或异戊二烯生物合成可以通过，例如，来自催化类似的但不相同的代谢反应以代替上述反应的一种或多种旁系同源酶的表达实现。因为在不同的生物体之间存在有代谢网络问的某些差异，因此本领域技术人员将理解不同生物体之间的实际基因利用可以发生变化。

本发明第四方面提供如上所述的酶的组合、或如上所述的表达载体、或如上所述的工程菌株在生产异戊烯醇和/或异戊二烯中的应用。

本发明还涉及如上所述的酶的组合或如上所述的表达载体在提高微生物生产异戊烯醇和/或异戊二烯产量中的应用。

应当理解的是，所述微生物中可以含有第三方面所述的甲羟戊酸途径或其衍生途径。

本发明第五方面提供一种生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法，该方法包括在产生异戊烯醇和/或异戊二烯的条件下，将甲羟戊酸转化为异戊烯醇，和/或将所述异戊烯醇转化为异戊二烯。

可以采用化学法或者生物法实现异戊烯醇和/或异戊二烯的生产，优选在第一方面所述酶的组合和/或第三方面所述的工程菌的存在下实现异戊烯醇和/或异戊二烯的生产。

本领域技术人员可以根据酶或工程菌株的种类选择在产生异戊烯醇和/或异戊二烯的条件，包括温度、pH和反应顺序及时间。

本领域技术人员知晓根据酶的种类以及工程菌株内包含的代谢途径不同，添加不同的底物(比如可以为葡萄糖、醋酸或其盐(比如钠盐)、氨基酸、酵母粉、甲羟戊酸等)用于异戊烯醇和/或异戊二烯的生产，并能够合理调整底物浓度。

本发明第六方面提供一种生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法，该方法包括在产生异戊烯醇和/或异戊二烯的条件下和足以产生异戊烯醇和/或异戊二烯的时间内培养如上所述的工程菌株。

本领域技术人员可以根据本领域常规的培养方法培养上述工程菌株，还可以对其进行诱导或者组成型表达，获得前几个方面所述的酶，从而实现异戊烯醇和/或异戊二烯的获取。

其中，所述诱导表达的条件可以为常规的条件，例如，当所述宿主细胞为大肠杆菌时，所述诱导表达的条件可以为：使用液体培养基，在35-37℃、150-250rpm下培养至OD₆₀₀为0.4-0.8，之后加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4-0.6mmol/L，并在25-32℃的条件下进行诱导表达。

所述液体培养基可以为本领域常规使用的培养基，比如可以为M9发酵培养基。M9发酵培养基优选包含：磷酸氢二钠5-7g/L，磷酸二氢钾2-4g/L，氯化铵0.5-1.5g/L，氯化钠0.1-1g/L，硫酸镁0.5-1.5mM，酵母粉3-7g/L，葡萄糖15-25g/L。

工程菌株能够利用常规的碳源和氮源进行生长，并产生异戊烯醇和/或异戊二烯，在工程菌株生长代谢过程中，还可以添加其他底物，比如甲羟戊酸等进行异戊烯醇和/或异戊二烯的生产。

应当理解的是，该液体培养基中还含有适量的抗生素，具体的抗生素种类可以根据工程菌株内含有的表达载体的种类选择，并根据实际情况调整抗生素的浓度。

本领域技术人员可以根据需要选择合适的生产容器，在此不再赘述。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

没有特殊说明的情况下，采用本领域常规的手段进行操作。

没有特殊说明的情况下，使用的试剂和材料可以通过商购获得。

M9发酵培养基包含：磷酸氢二钠6g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，氯化钠0.5g/L，硫酸镁1mM，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L。

实施例1

本实施例用于说明采用质粒pACYC-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm-ohyA构建的重组菌株。

质粒pACYC-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm-ohyA构建过程如下：

(1)来自于粪肠球菌(E.faecalis)mvaE基因(acetyl-CoA acetyltransferase/HMG-CoA reductase,GenBank No.AAG02438)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。mvaE和载体pACYDuet-1采用Fermentas公司的限制性内切酶NcoI和BamHI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，mvaE和pACYDuet-1按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用mvaE基因的特异性引物mvaE-F(SEQ ID NO.1：CATGCCATGGAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC)和mvaE-R(SEQ ID NO.2：CGCGGATCCTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGCGCGGATCCTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAG)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pACY-mvaE。

(2)来自于粪肠球菌(E.faecalis)mvaS基因(HMG-CoA synthase,GenBankNo.AAG02439)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。mvaS和载体pACY-mvaE采用Fermentas公司的限制性内切酶SacI和PstI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，mvaS和载体pACY-mvaE按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用mvaS基因的特异性引物mvaS-F(SEQ ID NO.3：CCAGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAAATTA)和mvaS-R(SEQ ID NO.4：CAACTGCAGTTAGTTTCGATAAGAGCGAACG)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pACY-mvaE-mvaS。

(3)来自于T.acidophilum的pmd_ta基因(GenBank NC_002578.1)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。pmd_ta和载体pACY-mvaE-mvaS采用Fermentas公司的限制性内切酶PvuI和AatII进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，pmd_ta和载体pACY-mvaE-mvaS按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用pmd_ta基因的特异性引物pmdta-F(SEQ ID NO.5：gagaCGATCGTAAGAAGGAGATATACTCATGACCTACCG)和pmdta-R(SEQ ID NO.6：gagaGACGTCTTATTCCGGACGACGGTGCCAAGCACCAC)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pACY-mvaE-mvaS-pmd_ta。

(4)来自于S.mitis的pmd_sm基因(GenBank NC_013853.1)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。pmd_sm和载体pACY-mvaE-mvaS-pmd_ta采用Fermentas公司的限制性内切酶BglII和PvuI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，pmd_sm和载体pACY-mvaE-mvaS-pmd_ta按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用pmd_sm基因的特异性引物pmdsm-F(SEQ ID NO.7：gagaAGATCTATAAGAAGGAGATATACTCATGGACCGTG)和pmdsm-R(SEQ ID NO.8：gagaCGATCGTTAGCAGCAACCGTCCTGAGACAGGTCTT)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pACY-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm。

(5)来自于Elizabethkingiameningoseptica的ohyA基因(GenBankNo.ACT54545.1)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。ohyA和载体pACY-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm采用Fermentas公司的限制性内切酶AatII和XhoI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，ohyA和载体pACY-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用ohyA基因的特异性引物ohyA-F(SEQ ID NO.9：gagaGACGTCATAAGAAGGAGATATACTCATGAACCCGATCACCTCTAAATTCG)和ohyA-R(SEQ ID NO.10：gagaCTCGAGTTAACCACGGATACCTTTAACCCATTCACGGAATTTGTTAACGT)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pACY-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm-ohyA。

重组菌株采用宿主大肠杆菌BL21(DE3)，通过转化的方式携带MVA衍生途径的质粒pACYC-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm-ohyA。

联产异戊二烯和异戊烯醇的方法按以下步骤进行：

将重组菌株接种到100ml含有Cm抗生素(34mg/L)的M9发酵培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃，180rpm振荡培养；生长至OD_600nm＝0.6时，向摇瓶中都添加终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，于30℃，转速为180rpm摇床中诱导培养。

诱导发酵24h后，取1ml顶空发酵气体，用于气相色谱检测异戊二烯，异戊二烯产量为0.9mg/L。

取10ml发酵液，用10ml乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至1ml，用于气相色谱检测异戊烯醇，异戊烯醇产量为8mg/L。

实施例2

本实施例用于说明采用质粒pACYC-mvaE-mvaS、pET-erg12和pCola-pmd*-aphA-linD构建的重组菌株。

质粒pACYC-mvaE-mvaS、pET-erg12和pCola-pmd*-aphA-linD构建过程如下：

首先，质粒pACYC-mvaE-mvaS构建过程如下：

(1)来自于粪肠球菌(E.faecalis)mvaE基因(acetyl-CoA acetyltransferase/HMG-CoA reductase,GenBank No.AAG02438)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。mvaE和载体pACYDuet-1采用Fermentas公司的限制性内切酶NcoI和BamHI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，mvaE和pACYDuet-1按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用mvaE基因的特异性引物mvaE-F(CATGCCATGGAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC)和mvaE-R(CGCGGATCCTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGCGCGGATCCTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAG)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pACY-mvaE。

(2)来自于粪肠球菌(E.faecalis)mvaS基因(HMG-CoA synthase,GenBankNo.AAG02439)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。mvaS和载体pACY-mvaE采用Fermentas公司的限制性内切酶SacI和PstI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，mvaS和载体pACY-mvaE按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用mvaS基因的特异性引物mvaS-F(CCAGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAAATTA)和mvaS-R(CAACTGCAGTTAGTTT CGATAAGAGCGAACG)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pACY-mvaE-mvaS。

其次，pET-erg12构建过程如下：来自于酿酒酵母的erg12基因(GeneID855248)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。erg12和载体pETduet-1采用Fermentas公司的限制性内切酶SacI和PstI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，erg12和载体pETduet-1按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用erg12基因的特异性引物erg12-F(SEQ ID NO.11：GCCGACGTCTTATTTATCAAGATAAGTT)和erg12-R(SEQ IDNO.12：GCGACGTCACCGTTTACACAGCATCCG)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pET-erg12。

第三，pCola-pmd*-aphA-linD构建过程如下：

(1)来自于Castellanielladefragrans的linD基因(GenBank No.FR669447)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。linD和载体pColaduet-1采用Fermentas公司的限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，linD和载体pColaduet-1按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用通用引物acyduetup1(ggatctcgacgctctccct)和duetdown1(ttgtacacggccgcataatc)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pCola-linD。

(2)pmd*基因是来自于酿酒酵母的pmd基因(GeneID:855779)突变R74H，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。pmd*和载体pCola-linD采用Fermentas公司的限制性内切酶NdeI和bglII进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，pmd*和载体pCola-linD按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用通用引物duetup2(SEQ ID NO.13：GATTATGCGGCCGTGTACAA)和T7terprimer(SEQ ID NO.14：GCTAGTTATTGCTCAGCGG)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pCola-pmd*-linD。

(3)来自于大肠杆菌的aphA基因(GenBank No.X86971.1)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。aphA和载体pCola-pmd*-linD采用Fermentas公司的限制性内切酶SacI和SalI进行双酶切，酶切条件：37℃，1h。酶切产物经电泳、切胶回收后，采用Fermentas公司的T4 DNA连接酶，aphA和载体pCola-pmd*-linD按照摩尔比5：1混合，16℃连接反应过夜。连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Takara)，采用aphA基因的特异性引物aphA-F(SEQ ID NO.15：GAGCTCATAAGAAGGAGATATACTC)和aphA-R(SEQ ID NO.16：TGTGGCAAGGGTTTGTAGGTAG)对转化子进行菌体PCR鉴定，PCR鉴定呈阳性的重组子再分别进行限制性内切酶图谱鉴定和DNA序列分析，构建成功的质粒命名为pCola-pmd*-aphA-linD。

重组菌株采用宿主大肠杆菌BL21(DE3)，通过转化的方式携带MVA衍生途径的质粒pACYC-mvaE-mvaS、pET-erg12和pCola-pmd*-aphA-linD。

联产异戊二烯和异戊烯醇的方法按以下步骤进行：

将联产菌株接种到100ml含有(34mg/L Cm+100mg/L Amp+50mg/L Kan)抗生素M9发酵培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃，180rpm振荡培养；生长至OD_600nm＝0.6时，向摇瓶中都添加终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，于30℃，转速为180rpm摇床中诱导培养。

诱导发酵24h后，取1ml顶空发酵气体，用于气相色谱检测异戊二烯，异戊二烯产量为1mg/L。

取10ml发酵液，用10ml乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至1ml，用于气相色谱检测异戊烯醇，异戊烯醇产量为200mg/L。

实施例3

本实施例用于说明采用质粒pACYC-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm-ohyA、pET-erg12和pCola-pmd*-aphA-linD构建的重组菌株。

构建一株整合MVA及其衍生途径联产异戊烯醇和异戊二烯的重组菌株。所述重组菌株采用宿主大肠杆菌BL21(DE3)，通过转化的方式携带整合MVA及其衍生途径的质粒pACYC-mvaE-mvaS-pmd_ta-pmd_sm-ohyA、pET-erg12和pCola-pmd*-aphA-linD。质粒构建过程详见实施例1和2。

按照实施例2所述的方法检测异戊二烯和异戊烯醇的产量，经检测，异戊二烯产量为2mg/L，异戊烯醇产量为400mg/L。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司北京化工研究院

中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 酶的组合、表达载体、工程菌株以及它们的应用和生产异戊烯醇和/或异戊

二烯的方法

<130> 72167

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 1

catgccatgg aggaggtaaa aaaacatgaa aacagtagtt attattgatg c 51

<210> 2

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 2

cgcggatcct tattgttttc ttaaatcatt taaaatagcg cggatcctta ttgttttctt 60

aaatcattta aaatag 76

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 3

ccagagctca ggaggtaaaa aaacatgaca attgggattg ataaaatta 49

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 4

caactgcagt tagtttcgat aagagcgaac g 31

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 5

gagacgatcg taagaaggag atatactcat gacctaccg 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 6

gagagacgtc ttattccgga cgacggtgcc aagcaccac 39

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 7

gagaagatct ataagaagga gatatactca tggaccgtg 39

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 8

gagacgatcg ttagcagcaa ccgtcctgag acaggtctt 39

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 9

gagagacgtc ataagaagga gatatactca tgaacccgat cacctctaaa ttcg 54

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 10

gagactcgag ttaaccacgg atacctttaa cccattcacg gaatttgtta acgt 54

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<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 11

gccgacgtct tatttatcaa gataagtt 28

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 12

gcgacgtcac cgtttacaca gcatccg 27

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 13

gattatgcgg ccgtgtacaa 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 14

gctagttatt gctcagcgg 19

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 15

gagctcataa gaaggagata tactc 25

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> The sequence is artificially synthesized.

<400> 16

tgtggcaagg gtttgtaggt ag 22

Claims (12)

1.一种酶的组合，其特征在于，该组合包含将5-甲羟戊酸磷酸转化为异戊烯基磷酸的酶以及将异戊烯基磷酸转化为异戊烯醇的酶。

2.根据权利要求1所述的酶的组合，其中，所述将5-甲羟戊酸磷酸转化为异戊烯基磷酸的酶为磷酸甲羟戊酸脱羧酶，优选为erg19基因编码的磷酸甲羟戊酸脱羧酶；和/或

所述将异戊烯基磷酸转化为异戊烯醇的酶为异戊烯醇磷酸水解酶，更优选为aphA基因编码的异戊烯醇磷酸水解酶。

3.根据权利要求1所述的酶的组合，其中，该组合还包含甲羟戊酸激酶；优选地，所述甲羟戊酸激酶为erg 12基因编码的甲羟戊酸激酶；

该组合还包含HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶；

更优选地，所述HMG-CoA合成酶为mvaS基因编码的HMG-CoA合成酶；

更优选地，所述HMG-CoA还原酶为mvaE基因编码的HMG-CoA还原酶。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的酶的组合，其中，该组合还包含将异戊烯醇转化为异戊二烯的酶；

优选地，所述将异戊烯醇转化为异戊二烯的酶为脱水酶，更优选为油酸水合酶和/或芳樟醇脱水酶，进一步优选为ohyA基因编码的油酸水合酶和/或linD基因编码的芳樟醇脱水酶。

5.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含编码权利要求1-4中任意一项所述的酶的组合的基因。

6.一株工程菌株，其特征在于，所述工程菌株包含编码权利要求1-4中任意一项所述的酶的组合的基因或权利要求5中所述的表达载体。

7.根据权利要求6所述的工程菌株，其中，所述工程菌株还包含编码甲羟戊酸途径和/或甲羟戊酸衍生途径中的酶的基因；

其中，所述甲羟戊酸途径包含以下酶：甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、异戊烯基焦磷酸异构酶和异戊二烯合酶；

所述甲羟戊酸衍生途径包含以下酶：甲羟戊酸转化为异戊烯醇的酶以及任选的第二脱水酶；

优选地，所述将甲羟戊酸转化为异戊烯醇的酶为甲羟戊酸-3-激酶和甲羟戊酸-3-磷酸脱羧酶，和/或脂肪酸脱羧酶；

优选地，所述第二脱水酶为油酸水合酶和/或芳樟醇脱水酶。

8.根据权利要求7所述的工程菌株，其中，编码甲羟戊酸激酶的基因为erg12基因；和或

编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因为erg8基因；和或

编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因为erg19基因；和或

编码异戊烯基焦磷酸异构酶的基因为idi1基因；和或

编码异戊二烯合酶的基因为ispS基因；和或

编码甲羟戊酸-3-激酶的基因为pmd_ta基因或pmd_sm基因；

编码甲羟戊酸-3-磷酸脱羧酶的基因为pmd_sm基因；

编码脂肪酸脱羧酶的基因为oleT基因。

9.根据权利要求6-8中任意一项所述的工程菌株，其中，所述工程菌株为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

10.权利要求1-4中任意一项所述的酶的组合、或权利要求5所述的表达载体、或权利要求6-9中任意一项所述的工程菌株在生产异戊烯醇和/或异戊二烯中的应用。

11.一种生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法，其特征在于，该方法包括在产生异戊烯醇和/或异戊二烯的条件下，将甲羟戊酸转化为异戊烯醇，和/或将所述异戊烯醇转化为异戊二烯。

12.一种生产异戊烯醇和/或异戊二烯的方法，其特征在于，该方法包括在产生异戊烯醇和/或异戊二烯的条件下和足以产生异戊烯醇和/或异戊二烯的时间内培养权利要求6-9中任意一项所述的工程菌株。