CN117603942A - 一种丙二酰辅酶a脱羧酶突变体及其高效合成乙酰辅酶a的方法 - Google Patents
一种丙二酰辅酶a脱羧酶突变体及其高效合成乙酰辅酶a的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种丙二酰辅酶A脱羧酶突变体及其高效合成乙酰辅酶A的方法，属于酶工程技术领域。本发明的丙二酰辅酶A脱羧酶突变体RsMCDS268E/R385L的比酶活可到达456.7U/mg，该突变体具有酶活性高、稳定性好的特点。将重组丙二酰辅酶A脱羧酶级联酰基辅酶A合成酶SsACS应用于乙酰辅酶A生产中，优化反应条件，重组丙二酰辅酶A脱羧酶野生型RsMCD催化1h得到的乙酰辅酶A产量为39.3g/L，转化率98.4％；本发明的突变酶催化0.5h得到的乙酰辅酶A产量为39.8g/L，转化率99.8％。本发明为乙酰辅酶A的生物催化合成提供了优质丙二酰辅酶A脱羧酶突变体及其高效制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种丙二酰辅酶A脱羧酶突变体及其高效合成乙酰辅酶A的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术
乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)，是细胞内关键的代谢中间物，是脂肪酸β氧化及糖酵解后产生的丙酮酸氧化脱羧的产物，直接参与三羧酸循环(TCA)、脂肪酸、糖类和氨基酸等物质的代谢过程。乙酰辅酶A在工业上多用于各种高价值产物如脂肪酸、聚酮类化合物、萜类化合物和黄酮类化合物等的生产，在药物、抗生素、疾病治疗等方面具有重要意义，但其昂贵的价格为研究和生产带来了一定的阻碍。
丙二酰辅酶A脱羧酶(Malonyl-CoADecarboxylase，MCD)是维持细胞内脂质代谢的关键酶，能够催化丙二酰辅酶A脱羧形成乙酰辅酶A和二氧化碳，普遍存在于原核生物到哺乳动物的各种生物体中。大部分丙二酰辅酶A脱羧酶为四聚体，也存在二聚体，其单体均包含一个N-端螺旋结构域和一个C-端催化结构域，螺旋结构域参与MCD的寡聚化，催化结构域与N-乙酰转移酶(GNAT)超家族具有结构同源性。
由于大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，蛋白表达量高，是目前应用最广泛的表达载体，因此，利用重组丙二酰辅酶A脱羧酶，通过酶促反应实现乙酰辅酶A的高效合成对其工业化生产具有重要意义。
发明内容
乙酰辅酶A作为一种中间代谢产物，存在细胞内难以高浓度积累，化学合成专一性不高，生物法合成供体不易得等问题，本发明提供一种来源于根瘤菌属(Rhizobium sp.)的丙二酰辅酶A脱羧酶(Malonyl-CoADecarboxylase,MCD)，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。所述丙二酰辅酶A脱羧酶应用于乙酰辅酶A的生产中。
本发明提供了一种丙二酰辅酶A脱羧酶突变体，所述突变体为，将来源于根瘤菌属(Rhizobium sp.)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位、第385位、第251位的氨基酸中的一个或多个进行突变之后得到的。
所述丙二酰辅酶A脱羧酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶；或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的丙二酰辅酶A脱羧酶；或与SEQ ID NO.2所示的编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列的丙二酰辅酶A脱羧酶基因。
在本发明的一种实施方式中，所述至少一个突变包括取代、缺失或添加。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位、第385位、第251位的氨基酸中的至少一个进行取代得到的。
本发明提供了一种丙二酰辅酶A脱羧酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸得到的；命名为RsMCDS268E；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第385位的精氨酸突变为亮氨酸得到的；命名为RsMCDR385L；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸，同时将第385位的精氨酸突变为亮氨酸得到的；命名为RsMCDS268E/R385L；其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第251位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为RsMCDT251A。
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸，同时将第251位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为RsMCDS268E/T251A。
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第251位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第385位的精氨酸突变为亮氨酸得到的；命名为RsMCDR385L/T251A。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于根瘤菌属(Rhizobium sp.)的丙二酰辅酶A脱羧酶亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了编码上述突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET系列载体或、pRSF系列载体或pGEX系列载体为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET-28(a)、pET-21(a)、pRSF-Duet-1或pGEX-6P-1为表达载体。
本发明还提供了表达上述突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、毕赤酵母为宿主细胞。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为，以pET-28a(+)为载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶或SEQ ID NO.3所示的RsMCDS268E/R385L丙二酰辅酶A脱羧酶突变体或上述丙二酰辅酶A脱羧酶突变体。
本发明还提供构建所述重组菌的方法，包括如下步骤：将丙二酰辅酶A脱羧酶基因与载体pET-28a(+)连接，将获得的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌。
本发明还提供了一种提高丙二酰辅酶A脱羧酶酶活的方法，所述方法为，将来源于根瘤菌属(Rhizobium sp.)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位、第385位、第251位的氨基酸中的一个或多个进行突变。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第385位的精氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第251位的苏氨酸突变为丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸，同时将第385位的精氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸，同时将第251位的苏氨酸突变为丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第251位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第385位的精氨酸取代为亮氨酸。
本发明还提供了一种可溶性表达丙二酰辅酶A脱羧酶的方法，所述方法为，采用所述重组细胞发酵制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述方法将所述重组大肠杆菌接种到培养基中，0.5mM IPTG，17℃诱导培养16h。
在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种到培养基中，培养温度为17℃，培养时间为16h，诱导条件为0.5mM IPTG。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
本发明还提供了一种用于催化合成乙酰辅酶A的酶制剂，所述酶制剂中含有上述丙二酰辅酶A脱羧酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂为液态制剂，所述液态制剂中含有所述的丙二酰辅酶A脱羧酶突变体及辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述酶制剂为所述丙二酰辅酶A脱羧酶的冻干粉，含有所述丙二酰辅酶A脱羧酶及其保护剂。
本发明还提供了一种制备乙酰辅酶A的方法，所述方法为，采用所述的丙二酰辅酶A脱羧酶突变体，或所述重组细胞，以丙二酰辅酶A为底物，催化制备得到乙酰辅酶A；或级联酰基辅酶A合成酶，以辅酶A、丙二酸和ATP为底物，催化制备得到乙酰辅酶A。
在本发明的一种实施方式中，所述酰基辅酶A合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述丙二酸的添加量为80mM；辅酶A的添加量为：40mM；ATP的添加量为：80mM。
本发明还提供了一种制备乙酰辅酶A的方法所述方法包括以下步骤：
(1)构建同时表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶或上述突变体、及氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的酰基辅酶A合成酶SsACS的重组细胞，所述重组细胞是以pET28为载体，过表达了所述丙二酰辅酶A脱羧酶或其突变体，以pET21为载体，过表达了所述酰基辅酶A合成酶，所述重组细胞是以E.coli BL21(DE3)为表达宿主；
(2)将步骤(1)制备得到的重组细胞破碎后得到的粗酶液为催化剂，以丙二酸、ATP和辅酶A为底物，催化制备得到乙酰辅酶A本发明还提供了上述丙二酰辅酶A脱羧酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述酶制剂在制备乙酰辅酶A或含有乙酰辅酶A的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述方法用于高效合成乙酰辅酶A并获得高产量。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
有益效果
(1)本发明通过序列比对选择了一种来源于根瘤菌属(Rhizobium sp.)的可能为丙二酰辅酶A脱羧酶的假定蛋白基因，该基因所表达的蛋白尚未被表征，使其在Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达，并对该重组酶进行了表征，获得了高效表达及高酶活的重组丙二酰辅酶A脱羧酶，为下游分离制备重组丙二酰辅酶A脱羧酶减少了成本。该重组丙二酰辅酶A脱羧酶应用于乙酰辅酶A生产中。
(2)本发明成功构建了能高效表达目的基因的重组菌株E.coli BL21/pET28a-RsMCD。重组菌表达的粗酶液经过His-Trap HP层析柱纯化后得到重组纯酶。纯酶的最适反应pH为7.5，且在该pH条件下酶活最稳定，在pH 7.5时，残余相对比酶活高于90％。纯酶的最适反应温度为50℃，但在该温度下酶稳定性差，酶活下降较快，在35℃时酶活略低于50℃但稳定性最好。在50℃、pH 7.5的反应条件下，丙二酰辅酶A脱羧酶的比酶活可到达289.1U/mg，丙二酰辅酶A脱羧酶突变体RsMCDS268E/R385L的比酶活可到达456.7U/mg。重组丙二酰辅酶A脱羧酶及其突变体具有酶活性高、稳定性好的特点。
(3)将重组丙二酰辅酶A脱羧酶应用于乙酰辅酶A生产中，将丙二酰辅酶A脱羧酶RsMCD与来自链霉菌属的酰基辅酶A合成酶SsACS在同一细胞内共同表达，以丙二酸、辅酶A和ATP为底物，能够高效合成乙酰辅酶A并获得高产量，在目前已进行的实验条件下，，重组丙二酰辅酶A脱羧酶野生型RsMCD催化1h得到的乙酰辅酶A产量为39.3g/L，转化率98.4％；RsMCDS268E/R385L突变酶催化0.5h得到的乙酰辅酶A产量为39.8g/L，转化率99.8％。较化学法或生物法制备乙酰辅酶A，该重组丙二酰辅酶A脱羧酶及其突变体更高效地产生乙酰辅酶A且反应体系简单，绿色环保。
附图说明
图1：Rhizobium sp.MCD与其它已知的丙二酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列比对图。
图2：纯化得到的重组酶的SDS-PAGE图；M：marker，1：丙二酰辅酶A脱羧酶RsMCD。
图3：RsMCD催化后得到的产物的HPLC结果图；CK：未添加酶的空白对照，Sample：经过RsMCD催化后的反应样品，Standard：乙酰辅酶A标准品。
图4：RsMCD和SsACS共同催化后得到的产物的HPLC结果图；CK：未添加酶的空白对照，Sample：经过RsMCD和SsACS催化后的反应样品。
图5：以不同构建方式表达酰基辅酶A合成酶和丙二酰辅酶A脱羧酶后粗酶液催化生成乙酰辅酶A的转化率。
图6：以不同浓度的E.coli BL21/pET28-SsACS+pET21-RsMCD细胞破碎后的粗酶液作为催化剂催化生成乙酰辅酶A的转化率。
具体实施方式
技术术语：
丙二酰辅酶A脱羧酶：术语“丙二酰辅酶A脱羧酶”是指如酶命名法所定义的EC4.1.1.9类中的酶。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定“丙二酰辅酶A脱羧酶的活性。在一方面，本发明的所述丙二酰辅酶A脱羧酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶；或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的丙二酰辅酶A脱羧酶；或与SEQ ID NO.2所示的编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列的丙二酰辅酶A脱羧酶基因。
表达：术语“表达”包括涉及丙二酰辅酶A脱羧酶突变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码本发明的丙二酰辅酶A脱羧酶突变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指在多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有丙二酰辅酶A脱羧酶活性。在一方面，本发明的所述片段包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶；或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的丙二酰辅酶A脱羧酶；或与SEQ ID NO.2所示的编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％序列的丙二酰辅酶A脱羧酶基因。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
宿主细胞可以是在丙二酰辅酶A脱羧酶突变体的重组生产中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
乙酰辅酶A：一种有机物，化学式为C23H38N7O17P3S，是一种辅酶A的衍生物。
酶制剂：指酶经过提纯、加工后的具有催化功能的生物制品，主要用于催化生产过程中的各种化学反应，具有催化效率高、高度专一性、作用条件温和、降低能耗、减少化学污染等特点，其应用领域遍布食品(面包烘烤业、面粉深加工、果品加工业等)、纺织、饲料、洗涤剂、造纸、皮革、医药以及能源开发、环境保护等方面。酶制剂来源于生物，一般地说较为安全，可按生产需要适量使用。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
Luria-Bertani(LB)培养基：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
丙二酰辅酶A脱羧酶的酶活测定
由于乙酰辅酶A在紫外254nm处有较好的响应值，丙二酰辅酶A脱羧酶的酶活测定利用高效液相色谱检测乙酰辅酶A；
反应体系为：3mM MgCl2、100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5mM丙二酰辅酶A、10％(w/v)甘油、5nM丙二酰辅酶A脱羧酶，pH 8.0，反应体系为200μL；
反应条件：在1.5mL离心管中置于恒温金属浴中35℃反应10分钟，加200μL甲醇终止反应，室温下静置30min，12,000×g离心10min去除变性的蛋白沉淀，取上清液为样品。
利用安捷伦1260液相色谱仪和Waters C18色谱柱检测丙二酰辅酶A，流动相A液为含0.1％三氟乙酸的超纯水，B液为含0.1％三氟乙酸的甲醇。检测条件为：进样10μL，10％-67％B液进行梯度洗脱，时间为20min，流速为1mL/min，柱温30℃，紫外254nm处检测。并用乙酰辅酶A标准品绘制标准曲线，通过峰面积与标曲能计算出乙酰辅酶A的含量，进一步计算出丙二酰辅酶A脱羧酶的酶活及比酶活。
定义丙二酰辅酶A脱羧酶的酶活力单位为：每分钟内催化1μmol底物转化为乙酰辅酶A所需的酶量为一个酶活力单位，即1U＝1μmol/min。
计算公式为酶活(U)＝(mAU*s×0.4×1000)/(7290×808×T)，其中，mAU*s为液相检测的乙酰辅酶A峰面积，7290为乙酰辅酶A标曲的斜率，808为乙酰辅酶A的分子量，0.4为反应体系加入等体积甲醇终止反应后总体积0.4mL，T为时间(min)。
比酶活＝活力(U)/蛋白质量(mg)
实施例1：重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-RsMCD的构建
本发明的来自根瘤菌属(Rhizobium sp.)的酶的氨基酸序列与来自Rhizobiumetli,Agrobacterium vitis和Rhodopseudomonas palustris等的丙二酰辅酶脱羧酶进行对比(图1)，发现该假定蛋白具有丙二酰辅酶A脱羧酶保守的序列和活性位点，推测其具有丙二酰辅酶A脱羧酶的功能。
(1)重组质粒pET28a-RsMCD的构建
将来自Rhizobium sp.的编码丙二酰辅酶A脱羧酶RsMCD的氨基酸序列(如SEQ IDNO.1所示)送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行密码子优化后(如SEQ ID NO.2所示)，克隆至载体pET-28a(+)，克隆位点为BamH I/Xho I，载体抗性为卡那霉素抗性，获得重组质粒pET28a-RsMCD，-20℃保存。
SEQ ID NO.1：
MLQSITDRGRQLLFSGSRMPQIAAEADLHTLCEMLLSSRGEASGMALAAEIFDRWSTLGGDGQQAFFRMLHEKFGPDTGRLDQAIEIYRSDKSSASIIKLHQAAESRRQELLRRLNHAPNGTAKLVRMREHLLASSDRSEGYHALDADFTHLFGSWFNRGFLTLRPIDWSTPASILEKIIQYEAVHEIAGWEELRRRLAPADRRCFAFFHPRLADEPLVFVEVALTRSMPRAIADVLDEGREQISADQATTAVFYSISNCQDGLRGISFGNFLIKQVVDDLRRDFPGLKNFVTLSPVPGFARWLSRVRGVGADGALGDEELETLRLLDDPDWAANEDAATEVERILLPLAARYFLVERTPEGRPLDPVARFHLGNGARLERLNFRGDRSSKAMHQAHGLMVNYLYELEDIIANHEALAQRGEVIASTGVRSLLKKKDESRGHRPDGSRKFGQIISSTLGGGRK
SEQ ID NO.2：
atgctgcagagcattaccgatcgcggccgtcagctgctgtttagcggcagccgcatgccgcagattgcggcggaagcggatctgcataccctgtgcgaaatgctgct
gagcagccgcggcgaagcgagcggcatggcgctggcggcggaaatttttgatcgctggagcaccttaggcggcgatggtcagcaagcgttttttcgcatgctgcat
gaaaaatttggcccggataccggccgcctggatcaagcgattgaaatttatcgcagcgataaaagcagcgcgagcattattaaactgcatcaagcggcggaaagcc
gccgccaagaactgctgcgccgcctgaaccatgcgccgaacggcaccgcgaaactggtgcgcatgcgcgaacatctgctggcgagcagcgatcgcagcgaagg
ctatcatgcgctggatgcggattttacccatctgtttggcagctggtttaaccgcggctttctgaccctgcgcccgattgattggagcaccccggcgagcattctggaaa
aaattattcagtatgaagcggtgcatgaaattgcgggctgggaagaactgcgccgtcgcctggcgccggcggatcgccgctgctttgcgttttttcatccgcgcctggc
ggatgaaccgctggtgtttgtggaagtggcgctgacccgcagcatgccgcgcgcgattgcggatgtgctggatgaaggccgcgaacagattagcgcggatcaagc
gaccaccgcggtgttttatagcattagcaactgccaagatggcctgcgcggcattagctttggcaactttctgattaaacaagtggtggatgatctgcgccgcgattttcc
gggcctgaaaaactttgtgaccctgagcccggtgccgggttttgcgcgttggttaagccgcgtgcgcggcgtgggcgcggatggcgcgctgggcgatgaagaact
ggaaaccctgcgcctgctggatgatccggattgggcggcgaacgaagatgcggcgaccgaagtggaacgcattctgctgccgctggcggcgcgctattttctggtg
gagcgtaccccggaaggccgtccgttagatccggtggcgcgctttcatctgggcaacggcgcgcgcctggaacgcctgaactttcgcggcgatcgcagcagcaaa
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cggcgtgcgcagcctgctgaaaaagaaagatgaaagccgcggccatcgcccggatggcagccgcaaatttggtcagattattagcagtacgctgggcggtggccg
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(2)重组菌的构建
取1μL质粒加入100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰浴30min后，置于42℃金属浴热击90s，热击后迅速置于冰上3～5min，向离心管中加入700μL LB液体培养基，37℃，200rpm，振荡培养1h。取50μL菌液涂布于含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养(约10h)。
制备得到重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCD。
实施例2：丙二酰辅酶A脱羧酶的突变设计与构建
丙二酰辅酶A脱羧酶的活性口袋位于两条平行链β4和β5之间，选择相互作用或活性口袋中的残基进行突变。具体过程如下：
(1)设计表1所示的引物，以pET28a-RsMCD质粒为模板，通过全质粒PCR单点突变得到突变体，再对获得的正突变体进行组合突变。
表1：丙二酰辅酶A脱羧酶突变设计所用引物
PCR扩增的反应体系为：2×PrimeSTAR 25μL、pET28a-RsMCD质粒1μL、ddH2O 10μL、引物各2μL。PCR程序：98℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min，16℃10min。
(2)PCR结束后的每个PCR小管中加入3μL 10×Quickcut Green Buffer，混匀。用1％琼脂糖凝胶电泳验证条带大小是否正确，并进行产物纯化。
(3)利用Vazyme单片段同源重组试剂盒按照说明书对得到的DNA片段和线性化载体pET28a进行同源重组，将同源重组体系加入100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，感受态细胞悬液中，冰浴30min后，置于42℃金属浴热击90s，热击后迅速置于冰上3～5min，向离心管中加入700μL LB液体培养基，37℃，200rpm，振荡培养1h。
取50μL菌液涂布于含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养(约10h)。挑取单菌落于5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基试管中，37℃，200rpm，振荡培养约12h，提取质粒进行测序，验证是否正确。
分别制备得到含有不同突变体的重组菌：
E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDA173C、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDP211C、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDT251A、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDN259L、E.coliBL21(DE3)/pET28a-RsMCDS268E、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDV292S、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDD366N、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDR370N、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDR385L、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDL404R、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDS268E /R385L、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDA173C/P211C、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDR385L /T251A、E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCDS268E/T251A。
实施例3：重组丙二酰辅酶A脱羧酶及其突变体的表达纯化
具体步骤如下：
(1)分别挑取实施例2制备得到的阳性克隆单菌落于5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基试管中，37℃，200rpm，振荡培养约8h；分别制备得到种子液。
(2)分别将上述种子液按照1％(v/v)的接种量接种至250mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基摇瓶中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600达到0.6～0.8后(约2h左右)，将摇瓶置于冰水混合物中冷却10min，0.5mM IPTG，17℃诱导，诱导培养约16h后，6,000×g离心10min收集菌体，并用生理盐水洗涤两次。
用蛋白纯化缓冲液A(100mM HEPSE，500mM NaCl，10％(w/v)甘油，pH 7.5)将菌体重悬，在冰浴条件下用超声破碎仪对细胞进行破碎，将破碎液于10,000×g、4℃离心30min，除去细胞碎片，将上清液用0.22μm水系滤头过滤，分别制备得到粗酶液。
(3)粗酶液用HisTrap HP柱(GE Healthcare，芝加哥，美国)进行纯化。首先，用蛋白纯化缓冲液A平衡5个柱体积。上样后，用5％的蛋白纯化缓冲液B(100mM HEPSE，500mMNaCl，10％(w/v)甘油，1M咪唑，pH 7.5)洗杂蛋白，然后用30％的蛋白纯化缓冲液B洗脱目的蛋白并收集。
用Sephadex G-25脱盐柱对镍柱纯化后的酶液进行脱盐处理，除去酶液中的咪唑。先分别用超纯水和蛋白纯化缓冲液A冲洗平衡3个柱体积，上样，再用蛋白纯化缓冲液A洗脱蛋白，脱盐后的纯酶液进行SDS-PAGE电泳，观察条带结果确定是否获得单一的目的纯化蛋白，分别制备得到：野生型的RsMCD纯酶(图2)，以及突变体RsMCDA173C纯酶、RsMCDP211C纯酶、RsMCDT251A纯酶、RsMCDN259L纯酶、RsMCDS268E纯酶、RsMCDV292S纯酶、RsMCDD366N纯酶、RsMCDR370N纯酶、RsMCDR385L纯酶、RsMCDL404R纯酶、RsMCDS268E/R385L纯酶、RsMCDA173C/P211C纯酶、RsMCDR385L/T251A纯酶、RsMCDS268E/T251A纯酶。
实施例4：丙二酰辅酶A脱羧酶功能的验证
利用测定酶活的测定方法，对RsMCD催化后得到的产物进行验证和鉴定，具体步骤如下：
反应体系为：200μL，3mM MgCl2、100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5mM丙二酰辅酶A、10％(w/v)甘油、5nM实施例3制备得到的野生型的丙二酰辅酶A脱羧酶纯酶RsMCD；
反应条件：pH 8.0的条件下，置于1.5mL离心管中，恒温金属浴中35℃反应30分钟，加200μL甲醇终止反应，室温下静置30min，12,000×g离心10min去除变性的蛋白沉淀，取上清液为样品。利用安捷伦1260液相色谱仪和Waters C18色谱柱检测乙酰辅酶A，结果如图3所示。
结果显示：与空白对照相比，反应样品在8.2min多出一个色谱峰，与乙酰辅酶A标准品的保留时间相同，确定为乙酰辅酶A的色谱峰，产物为乙酰辅酶A。
说明该假定蛋白为丙二酰辅酶A脱羧酶，能够催化丙二酰辅酶A脱羧形成乙酰辅酶A。
实施例5：丙二酰辅酶A脱羧酶及其突变体酶活测定
由于乙酰辅酶A在紫外254nm处有较好的响应值，丙二酰辅酶A脱羧酶的酶活测定利用高效液相色谱检测乙酰辅酶A，检测实施例3制备得到的丙二酰辅酶A脱羧酶突变体纯酶的比酶活。结果如表2所：
表2：丙二酰辅酶A脱羧酶及其突变体的比酶活
结果显示，其中正突变体RsMCDS268E/R385L比酶活达到387.8U/mg，后续研究以RsMCDS268E/R385L为研究对象。
实施例6：丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体酶活最适pH
在不同pH的条件下测定了实施例3制备得到的重组丙二酰辅酶A脱羧酶纯酶(野生型)及其突变体RsMCDS268E/R385L纯酶的最适反应pH，具体的反应体系同实施例4，区别在于，分别调节pH为6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0，在35℃反应10min后加200μL甲醇终止反应；不同pH下测得的重组丙二酰辅酶A脱羧酶野生型酶及突变体RsMCDS268E/R385L的比酶活，结果如表3所示。
表3：重组丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体在不同pH下的比酶活
结果显示，该酶在中性条件下酶活较高，最适pH为7.5，在碱性条件下酶活大幅度下降。
实施例7：丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体酶活最适温度
在不同温度的条件下测定了实施例3制备得到的重组丙二酰辅酶A脱羧酶纯酶(野生型)及其突变体RsMCDS268E/R385L纯酶的最适反应温度，具体的反应体系同实施例4，区别在于，分别在温度为20℃、30℃、35℃、40℃、50℃进行反应，pH为8.0，反应10min后加200μL甲醇终止反应。不同温度下测得的重组丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体的比酶活如表4所示。
表4：重组丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体在不同温度下的比酶活
结果显示，该酶在50℃条件下酶活最高。
实施例8：丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体酶活pH稳定性
将实施例3制备得到的重组丙二酰辅酶A脱羧酶纯酶及其突变体RsMCDS268E/R385L纯酶在不同pH的蛋白纯化缓冲液A中于35℃处理1h后，用于不同pH的反应液中进行反应测定比酶活。在不同pH下的残余相对比酶活如表5所示。
表5：重组丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体在不同pH下保温1h后的残余相对比酶活
结果显示，在pH 7.5时稳定性最好，相对比酶活高于90％，且突变体的稳定性较野生型更好。
实施例9：丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体酶活温度稳定性
将实施例3制备得到的重组丙二酰辅酶A脱羧酶纯酶及其突变体RsMCDS268E/R385L纯酶在不同温度的蛋白纯化缓冲液A中于处理1h后，用于不同温度的反应液中进行反应测定比酶活。在不同温度下的残余相对比酶活如表6所示。
表6：重组丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体在不同温度下保温1h后的残余酶活力
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结果显示，在35℃条件下酶的稳定性最好，相对比酶活高于90％，且突变体的稳定性较野生型更好。
实施例10：重组丙二酰辅酶A脱羧酶级联酰基辅酶A合成酶催化合成乙酰酰辅酶A
以丙二酸和辅酶A作为起始底物，级联酰基辅酶A合成酶SsACS(氨基酸序列如SEQID NO.5所示，同实施例1和实施例3的方法制备得到纯酶)和丙二酰辅酶A脱羧酶RsMCD(实施例3得到的野生型的纯酶)催化后得到的产物进行验证和鉴定，具体步骤如下：
反应体系为：200μL，3mM MgCl2、100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5mM辅酶A、10mM丙二酸、10mM ATP、10％(w/v)甘油、10uM RsMCD、10uM SsACS；
反应条件：pH 8.0的条件下，置于1.5mL离心管中，恒温金属浴中35℃反应30分钟，加200μL甲醇终止反应，室温下静置30min，12,000×g离心10min去除变性的蛋白沉淀，取上清液为样品。利用安捷伦1260液相色谱仪和Waters C18色谱柱检测乙酰辅酶A，结果如图4所示。
结果显示：级联酰基辅酶A合成酶SsACS和丙二酰辅酶A脱羧酶RsMCD共同催化后的反应产物的保留时间与乙酰辅酶A标准品相同，确定为乙酰辅酶A的色谱峰，产物为乙酰辅酶A。
说明级联酰基辅酶A合成酶SsACS和丙二酰辅酶A脱羧酶RsMCD，能够催化丙二酸和辅酶A合成乙酰辅酶A。
实施例11：重组丙二酰辅酶A脱羧酶级联酰基辅酶A合成酶催化合成乙酰酰辅酶A条件的优化
为降低工业生产成本，利用重组菌株细胞超声破碎并除去细胞碎片后的粗酶液进行催化反应，结果表明粗酶液能得到与纯酶相同的催化效果，转化率均高于98％。
(1)制备酰基辅酶A合成酶SsACS和丙二酰辅酶A脱羧酶RsMCD重组菌
取1μL pET28a-RsMCD(实施例1制备得到的野生型质粒)或pET28a-SsACS质粒(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，同实施例1)分别加入100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰浴30min后，置于42℃金属浴热击90s，热击后迅速置于冰上3～5min，向离心管中加入700μL LB液体培养基，37℃，200rpm，振荡培养1h。取50μL菌液涂布于含有50μg/mL硫酸卡那霉素的LB固体培养基平板上。倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养(约10h)，分别制备得到重组菌：E.coli BL21(DE3)/pET28a-RsMCD和E.coli BL21(DE3)/pET28a-SsACS。
分别挑取固体培养基平板上的单菌落于5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基试管中，37℃，200rpm，振荡培养约8h；分别制备得到种子液。
分别将上述种子液按照1％(v/v)的接种量接种至250mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基摇瓶中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600达到0.6～0.8后(约2h左右)，将摇瓶置于冰水混合物中冷却10min，0.5mM IPTG，17℃诱导，诱导培养约16h后，6,000×g离心10min收集菌体，并用生理盐水洗涤两次。
(2)粗酶液的制备
蛋白纯化缓冲液A(100mM HEPSE，500mM NaCl，10％(w/v)甘油，pH 7.5)将菌体重悬(菌体终浓度为50g/L)，在冰浴条件下用超声破碎仪对细胞进行破碎，将破碎液于10,000×g、4℃离心30min，除去细胞碎片，将上清液用0.22μm水系滤头过滤，分别制备得到粗酶液：酰基辅酶A合成酶SsACS粗酶液和丙二酰辅酶A脱羧酶RsMCD粗酶液。
(3)不同构建方式对转化率的影响
具体方法同步骤(1)～(2)，区别在于，调整载体为不同的质粒，并调整载体上不同酶的连接方式，分别制备得到重组载体：pET28-SsACS、pET21-RsMCD、pET28-SsACS-SD-RsMCD、pET28-RsMCD及分别制备得到重组菌株：E.coli BL21/pET28-SsACS/pET21-RsMCD、E.coli BL21/pET28-SsACS、E.coli BL21/pET28-RsMCD、E.coli BL21/pET28-SsACS-SD-RsMCD(其中SD序列为：GAAGGAGATATACC)；并且分别制备得到粗酶液1～7：
粗酶液1：由同时含有pET28-SsACS和pET21-RsMCD两个质粒的重组菌株E.coliBL21/pET28-SsACS/pET21-RsMCD制备的粗酶液；
粗酶液2：由E.coli BL21/pET28-SsACS-SD-RsMCD制备的粗酶液；
粗酶液3～7：由E.coli BL21/pET28-SsACS和E.coli BL21/pET28-RsMCD分别按照菌体浓度比为1:1、2:1、3:1、1:2、1:3制备得到的粗酶液。
反应体系为：200μL，3mM MgCl2、100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、5mM辅酶A、10mM丙二酸、10mM ATP、10％(w/v)甘油、粗酶液1或2或3或4或5或6或7，pH 8.0，35℃反应；其中，粗酶液的添加量，是以最终菌体的添加量计算的，添加的菌体量最终均为20g/L。
结果显示(图5)，粗酶液1得到的效果是最优的；当SsACS和RsMCD分别构建在不同的载体pET28和pET21上，并将质粒pET28-SsACS、pET21-RsMCD共转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达时，粗酶液用于催化反应能得到最高的转化率98.2％。当SsACS和RsMCD同时构建在载体pET28上，中间添加核糖体结合位点(SD)时，粗酶液用于催化反应的转化率为95.3％。当SsACS和RsMCD都构建在载体pET28上分别表达时，粗酶液用于催化反应的转化率为82.6％-95.5％。
(2)不同菌体量对转化率的影响
反应体系为：200μL，3mM MgCl2、100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、20mM辅酶A、40mM丙二酸、40mM ATP、10％(w/v)甘油pH 8.0，35℃反应。利用E.coli BL21/pET28-SsACS+pET21-RsMCD细胞破碎后的粗酶液1作为催化剂，其中添加的菌体量分别为最终5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L。结果如图6所示。
结果显示，添加5g/L菌体量，反应7.5h时达到最大转化率93.9％；添加10g/L菌体量，反应5h时达到最大转化率95.9％；添加15g/L菌体量，反应2h时达到最大转化率96.9％；添加20g/L或25g/L菌体量，反应0.5h时达到最大转化率98.2％。
实施例12：重组丙二酰辅酶A脱羧酶级联酰基辅酶A合成酶在高产乙酰辅酶A中的应用
具体实施方式同实施例11，区别在于，在最优反应条件下，扩大反应体系至100mL，并提高底物浓度，将RsMCD酶替换为突变体RsMCDS268E/R385L酶，并以原始酶作为对照，反应体系如下：
初始条件为3mM MgCl2、100mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES、40mM辅酶A、80mM丙二酸、80mM ATP、10％(w/v)甘油、pH 8.0，E.coli BL21/pET28-SsACS/pET21-RsMCD或E.coliBL21/pET28-SsACS/pET21-RsMCDS268E/R385L粗酶液(粗酶液的添加量是以菌体的添加量计算的，最终添加的菌体对应的浓度为20g/L鲜菌体)，100rpm，35℃反应，结果如表7所示。
表7：不同反应时间条件下重组丙二酰辅酶A脱羧酶及突变体级联酰基辅酶A合成酶催化高浓度底物转化率及其产量
结果显示，以40mM辅酶A、80mM丙二酸和80mM ATP做为底物，经过SsACS和RsMCD两步催化1h得到的乙酰辅酶A产量为39.3g/L，转化率98.4％；SsACS和RsMCDS268E/R385L催化0.5h得到的乙酰辅酶A产量为39.8g/L，转化率99.8％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种丙二酰辅酶A脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第251位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第385位的精氨酸突变为亮氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸，同时将第385位的精氨酸突变为亮氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸，同时将第251位的苏氨酸突变为丙氨酸得到的；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第251位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第385位的精氨酸突变为亮氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.表达权利要求1所述突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.一种提高丙二酰辅酶A脱羧酶酶活的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第251位的苏氨酸突变为丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第385位的精氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸，同时将第385位的精氨酸突变为亮氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第268位的丝氨酸突变为谷氨酸，同时将第251位的苏氨酸突变为丙氨酸；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶的第251位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第385位的精氨酸突变为亮氨酸。
7.用于催化合成乙酰辅酶A的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂中含有权利要求1所述的丙二酰辅酶A脱羧酶突变体。
8.一种制备乙酰辅酶A的方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的丙二酰辅酶A脱羧酶突变体，或权利要求4或5所述的重组细胞，以丙二酰辅酶A为底物，催化制备得到乙酰辅酶A；或以丙二酸、ATP和辅酶A为底物，同时添加酰基辅酶A合成酶，催化制备得到乙酰辅酶A。
9.一种制备乙酰辅酶A的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建同时表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙二酰辅酶A脱羧酶或权利要求1所述突变体、及氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的酰基辅酶A合成酶SsACS的重组细胞，所述重组细胞是以pET28为载体，过表达了所述丙二酰辅酶A脱羧酶或其突变体，以pET21为载体，过表达了所述酰基辅酶A合成酶，所述重组细胞是以E.coliBL21(DE3)为表达宿主；
(2)将步骤(1)制备得到的重组细胞破碎后得到的粗酶液为催化剂，以丙二酸、ATP和辅酶A为底物，催化制备得到乙酰辅酶A。
10.权利要求1所述的丙二酰辅酶A脱羧酶突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的载体，或权利要求4或5所述的重组细胞，或权利要求7所述的酶制剂在制备乙酰辅酶A或含有乙酰辅酶A的产品中的应用。
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