CN109097378B

CN109097378B - 一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用

Info

Publication number: CN109097378B
Application number: CN201810916774.7A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 李美洁; 张海波; 吴桐
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2038-08-13
Also published as: CN109097378A

Abstract

本发明公开了一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用，属于基因工程技术领域。该异戊二烯合酶基因IspS_ib的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，异戊二烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供了一种含有所述异戊二烯合酶基因的原核表达载体以及由该原核表达载体以及甲羟戊酸途径下游表达载体共转化获得产异戊二烯工程菌，本发明还提供了一种发酵生产异戊二烯的方法以及上述异戊二烯合酶基因、异戊二烯合酶、具有异戊二烯合酶活性的酶、其原核表达载体及其工程菌在生产异戊二烯中的应用。本发明所提供的异戊二烯合酶酶活性较高且对底物DMAPP的亲和力高。

Description

一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法（包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法）和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。以可再生的生物质为原料，利用生物转化技术合成异戊二烯，因具有可持续性、环境友好、品质优异等优势，已成为国际上的研究热点。

生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。目前，将大肠杆菌中的MEP途径过表达，或者直接导入外源MVA途径，同时导入植物来源的异戊二烯合酶，通过发酵可以实现异戊二烯的生物合成。但是，目前所构建的异戊二烯工程菌其产量和产率都没有达到工业生产的需求。

在异戊二烯代谢途径中，异戊二烯合酶是一个非常重要的限制性酶。在异戊二烯工程菌中DMAPP过量累积，另外在体外酶反应体系中，异戊二烯合酶的加入量是MVA途径另外一个限制酶异戊烯焦磷酸异构酶（isopentenyl pyrophosphate isomerase，IDI）的8倍，是其他酶的16倍，另外目前所研究报道的异戊二烯合酶其活性都比较低，对底物DMAPP的亲和力都比较低，这些都证明了异戊二烯在代谢途径中是一个非常重要的关键酶。目前，来自于白杨（Populus alba）和葛根（Pueraria montana）的异戊二烯合酶常应用于异戊二烯的生物合成。另外，利用来自于毛果杨（Populus trichocarpa）和蓝桉（Eucalyptus globulus）的异戊二烯合酶也有报道，而且其异戊二烯产量相对有所提高。但是，目前文献报道的这些异戊二烯合酶在代谢途径中都严重阻滞代谢流，离实现工业化生产距离还较远，寻找新物种来源的异戊二烯合酶是非常必要的。因此，对不同物种来源的异戊二烯合酶进行筛选分析，对其活性进行检测，构建异戊二烯工程菌，对比其异戊二烯产量，最终筛选得到异戊二烯产量高的异戊二烯合酶，这对于最终在工业上实现异戊二烯的生物合成是至关重要的。

发明内容

为解决现有异戊二烯合酶的活性较低且对底物DMAPP的亲和力较低以及它们在代谢途径中都严重阻滞代谢流的问题，本发明提供了一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种编码异戊二烯合酶的异戊二烯合酶基因IspS_ib，该异戊二烯合酶基因IspS_ib的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述异戊二烯合酶基因IspS_ib来源于甘薯（Ipomoea batatas）。

本发明还提供了一种上述异戊二烯合酶基因IspS_ib合成的异戊二烯合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了在上述异戊二烯合酶的氨基酸序列上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的具有异戊二烯合酶活性的酶。

本发明还提供了一种含有所述异戊二烯合酶基因IspS_ib的原核表达载体。

进一步地，所述原核表达载体还含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE和3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS。

本发明还提供了一种产异戊二烯工程菌，该工程菌以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主菌，由上述原核表达载体以及甲羟戊酸途径下游表达载体共转化获得；所述甲羟戊酸途径下游表达载体外源表达甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII。

进一步地，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII均来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

更进一步地，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的Genebank登录号为AAG02439；所述3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的Genebank登录号为AAG02438；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12的Genebank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的Genebank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的Genebank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1的Genebank登录号为855986。

本发明还提供了上述异戊二烯合酶基因IspS_ib、异戊二烯合酶、具有异戊二烯合酶活性的酶、异戊二烯合酶基因IspS_ib的原核表达载体以及产异戊二烯工程菌在生产异戊二烯中的应用。具体地，上述异戊二烯合酶基因IspS_ib在生产异戊二烯中的应用；上述异戊二烯合酶在生产异戊二烯中的应用；上述具有异戊二烯合酶活性的酶在生产异戊二烯中的应用；上述异戊二烯合酶基因IspS_ib的原核表达载体生产异戊二烯中的应用；上述产异戊二烯工程菌在生产异戊二烯中的应用。

本发明还提供了一种利用上述产异戊二烯工程菌发酵生产异戊二烯的方法，该方法是挑取产异戊二烯工程菌单菌落于含有34 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37ºC摇床过夜培养活化，活化完成后转接至发酵培养基中进行扩大培养，培养至OD600为0.6-0.8后进行IPTG诱导，于30ºC摇床培养48 h，获得异戊二烯。

本发明还提供了一种上述异戊二烯合酶体外催化二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP合成异戊二烯的方法，所述方法的外反应体系为：50 mM pH值为8.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、20 mM KCl、56 mM MgCl₂、5%（v/v）甘油、5 mM DTT、1 mM DMAPP和1 μg 异戊二烯合酶；体外反应体系配制完成后于42ºC孵育，获得异戊二烯。

本发明提供的异戊二烯合酶来源于甘薯（Ipomoea batatas）。

本发明所提供的表达纯化方法，可获得纯化的异戊二烯合酶。本发明所提供的酶反应体系，可对异戊二烯合酶的酶学性质进行分析，可应用于不同来源异戊二烯酶学性质的分析。

本发明有益效果：

本发明所提供的异戊二烯合酶酶活性较高且对底物DMAPP的亲和力高，显著优于现有的来自于白杨的异戊二烯合酶，并且该合酶能够缓解阻滞代谢流，具有较好的应用前景。

本发明所提供的异戊二烯工程菌具有较高的异戊二烯产量，异戊二烯产量最高可达503 mg/L，其异戊二烯产量是对照菌株的1.8倍，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为构建的载体pACY-IspS_ib的质粒图谱。

图2为构建的载体pACY-IspS_pa的质粒图谱。

图3为构建的载体pACY-MvaE-MvaS-IspS_ib的质粒图谱。

图4为SDS-PAGE以及western-blot检测表达和纯化的IspS_ib（A）以及IspS_pa（B）。

图5为IspS_ib在不同PH条件下的酶活。

图6为IspS_ib在不同温度条件下的酶活。

图7为IspS_ib酶活对金属离子的依赖性，其中（A）是在不同金属离子条件下IspS_ib的酶活，（B）是不同浓度Mg²⁺浓度条件下IspS_ib的酶活。

图8为IspS_ib（A）以及IspS_pa（B）热稳定性的检测。

图9为不同底物DMAPP浓度下IspS_ib（A）以及IspS_pa（B）的酶活。

图10为异戊二烯工程菌的异戊二烯产量，其中IspS_pa指工程菌LMJ0的异戊二烯产量，IspS_ib指工程菌LMJ11的异戊二烯产量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。

实施例1：基因的获得和载体的构建

（1）外源基因的获得

通过优化设计获得如SEQ ID NO.2所示的一种编码异戊二烯合酶（氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）的异戊二烯合酶基因IspS_ib，该基因来源于甘薯（Ipomoea batatas）。来自于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶基因（IspS_ib）由金唯智公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-IspS_ib载体。

（2）pACY-IspS_ib表达载体的构建

以pUC-IspS_ib为模版，引物1IspS_ib-F和引物2IspS_ib-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增IspS_ib片段，其PCR扩增体系如下所示：

PCR程序为：94ºC 3 min；30 ×（94ºC 10 s，55ºC 30 s，72ºC 1 min）；72ºC 5min；4ºC ∞

其引物序列如下所示：

IspS_ib-F：5’-GGAGATATACATATGAGTAGCGCCCAGAATC-3’（SEQ ID NO.3）

IspS_ib-R：5’-ATCCAATTGAGATCTATGATGATGATGATGATGTGCTTCAACCGGATT-3’ （SEQID NO.4）

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（碧云天，货号D0056）进行胶回收纯化。

利用限制性内切酶1Bgl II（Thermo，货号FD）和限制性内切酶2Nde I（Thermo，货号FD0583）同时双酶切pACYCDuet-1质粒（Novagen, 货号71147-3）和PCR产物，其酶切体系为：

酶切体系置于37 ºC孵育1h。进行胶回收纯化，利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

连接体系置于22 ºC孵育30 min。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到34mg/mL 氯霉素的 LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒 pACY-IspS_ib（图1），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

（3）pACY-IspS_pa表达载体的构建（对照）

以pACY-MvaE-MvaS-IspS_pa质粒（引用自Yang J, Xian M, Su S, Zhao G, Nie Q,Jiang X, Zheng Y, Liu W. Enhancing production of bio-isoprene using hybridMVA pathway and isoprene synthase in E. coli. PLoS One.2012;7:e33509.）为模版，引物1IspS_pa-F和引物2IspS_pa-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增IspS_pa片段，扩增体系同上，对PCR产物进行胶回收纯化。其引物序列如下所示：

IspS_pa-F：5’- GGAGATATACATATGAGATGTAGCG-3’ （SEQ ID NO.5）

IspS_pa-R：

5’-ATCCAATTGAGATCTTTAATGATGATGATGATGATGTGCGCGTTCAAACGGCAGAA-3’ （SEQID NO.6）

利用限制性内切酶1Bgl II（Thermo，货号FD）和限制性内切酶2Nde I（Thermo，货号FD0583）同时双酶切pACYCDuet-1质粒和PCR产物，酶切体系同上，分别进行胶回收纯化，利用DNA连接酶进行连接，连接体系同上，连接产物转化Escherichia coli DH5α感受态，涂布到34 mg/mL 氯霉素的 LB 固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pACY-IspS_pa（图2），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

（4）pACY-MvaE-MvaS-IspS_ib表达载体的构建

以pUC-IspS_ib为模版，引物1IspS_ib-F（同上）和引物2IspS-R，扩增IspS_ib片段，扩增体系同上，PCR产物进行胶回收纯化。其引物序列如下所示：

IspS-R：5’- GCCGGCAGATCTTTA -3’ （SEQ ID NO.7）

利用限制性内切酶1Bgl II（Thermo，货号FD）和限制性内切酶2Nde I（Thermo，货号FD0583）同时双酶切pACY-MvaE-MvaS-IspS_pa质粒和PCR产物，酶切体系同上，分别进行胶回收纯化，利用DNA连接酶进行连接，连接体系同上，连接产物转化Escherichia coli DH5α感受态（唯地生物，货号DL1001），涂布到34 mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pACY-MvaE-MvaS-IspS_ib（图3），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

实施例2：重组菌株的构建

（1）LMJ-ib重组菌株的构建

将pACY-IspS_ib重组质粒转化Escherichia coli BL21(DE3) 感受态细胞，涂布到34 mg/mL氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pACY-IspS_ib的工程大肠杆菌LMJ-ib。

（2）LMJ-pa重组菌株的构建

将pACY-IspS_pa重组质粒转化Escherichia coli BL21(DE3) 感受态细胞，涂布到34 mg/mL氯霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pACY-IspS_ib的工程大肠杆菌LMJ-pa。

（3）LMJ11重组菌株的构建

将pACY-MvaE-MvaS-IspS_ib重组质粒和下游途径质粒pTrc-low（引用自Yang J,Xian M, Su S, Zhao G, Nie Q, Jiang X, Zheng Y, Liu W. Enhancing production ofbio-isoprene using hybrid MVA pathway and isoprene synthase in E. coli. PLoSOne.2012;7:e33509.）共转化Escherichia BL21(DE3) 感受态细胞，涂布到34 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有载体pACY-MvaE-MvaS-IspS_ib和载体pTrc-low的工程大肠杆菌LMJ11。

（4）LMJ0重组菌株的构建

将pACY-MvaE-MvaS-IspS_pa质粒和下游途径质粒pTrc-low 共转化EscherichiaBL21(DE3) 感受态细胞，涂布到34 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有载体pACY-MvaE-MvaS-IspS_pa和载体pTrc-low的工程大肠杆菌LMJ0，作为对照菌株。

实施例3：外源蛋白的表达以及纯化

（1）外源蛋白的表达

挑取实施例2获得的LMJ-ib或者LMJ-pa单菌落于3 ml含有34 mg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37ºC摇床过夜培养活化。转接至100 ml含有34 mg/mL氯霉素的LB液体培养基中进行扩大培养，培养至OD600为0.6-0.8，0.5 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）诱导，于30ºC摇床培养6 h，5000 × g，4ºC，离心15 min，弃上清液，用磷酸缓冲液（PBS）洗涤两次，最后用10 mL western/IP细菌裂解液（碧云天，货号P0013）重悬，置于冰上。取少量进行SDS-PAGE检测，IspS_ib和IspS_pa蛋白成功在大肠杆菌中表达，具体结果见图4。

（2）外源蛋白的纯化

将置于冰上的细菌裂解液8000 × g，4ºC，离心20-30 min，收集上清并置于冰水浴或冰上。利用His标签蛋白纯化试剂盒（碧云天，货号P2226）纯化蛋白。

取3 ml混合均匀的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin装柱，然后用2ml western/IP细菌裂解液平衡2-3次后加入以上步骤所的到的10ml细菌裂解液上清，混合均匀，可置于摇床上增加结合效率，或4度放置过夜，将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，，可以把穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。

使用3 ml非变性洗涤液进行洗涤以去除杂蛋白，重复洗涤5次。使用2 ml非变性洗脱液将目标蛋白洗脱下来，重复洗脱5次，将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为外源表达蛋白溶液。

使用Amicon Ultra-15系列Ultracel-30超滤管（Millipore）对获得的蛋白溶液进行浓缩去盐，以50 mM HEPES缓冲液（PH=7.8）作为置换缓冲液，每次离心条件为5000 × g，30 min。

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，货号P0012S）测定最终获得的蛋白浓度。

取少量纯化的蛋白进行SDS-PAGE以及western分析，IspS_ib和IspS_pa蛋白成功纯化，具体结果见图4。

实施例4: 酶学性质分析

初步酶反应体系（100 μL）为：50 mM HEPES 缓冲液（PH=7.8）、20 mM KCl、20 mMMgCl₂、5% v/v甘油、5 mM DTT、1 mM DMAPP、1 μg 酶，反应体系置于2 mL玻璃小瓶中，体系配置完成后，立即用橡胶塞密封，37 ºC孵育10 min，取500 μL顶空气体进行气相色谱检测。

（1）最适PH值分析

用不同PH值的缓冲液对酶活性进行分析，包括50 mM 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（PH=3，5，6），50 mM HEPES 缓冲液（PH=6.8，7.8），50 mM 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（PH=8.6，9.2，9.8，10.6），以及50 mM NaOH 溶液。根据上述酶活体系进行反应，测其异戊二烯产量，计算酶活性，以最高酶活为100%，计算不同PH下的相对活性，做PH-相对酶活曲线。

本发明所述异戊二烯合酶最适PH为8.6，具体结果见图5。

（2）最适反应温度分析

对上述酶活体系，分别在20ºC，25ºC，30ºC，35ºC，37ºC，40ºC，42ºC，45ºC，50ºC，55ºC等不同温度下反应，测其异戊二烯产量，计算酶活性，以最高酶活为100%，计算不同反应温度下的相对活性，做温度-相对酶活曲线。

结果显示，本发明所述异戊二烯合酶最适反应温度为42ºC，具体结果见图6。

（3）不同金属离子对酶活性的分析

对上述酶活体系，分别加入不同的金属离子（20 mM），Mg²⁺，Mn²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Zn² ⁺，Ni²⁺ 和 Ca²⁺，测其异戊二烯产量，计算酶活性，以最高酶活为100%，计算不同金属离子的相对活性，做金属离子-相对酶活曲线。

结果显示，本发明所述 Mg²⁺对异戊二烯合酶酶活性是必需的，具体结果见图7A。对 Mg²⁺不同浓度对酶活性影响进行分析，1 mM，2 mM，5 mM，10 mM，20 mM，50 mM，100 mM，200 mM，500 mM，测其异戊二烯产量，计算酶活性，以最高酶活为100%，计算不同浓度Mg²⁺的相对活性，做Mg²⁺浓度-相对酶活曲线。结果显示，本发明所述异戊二烯合酶在Mg²⁺浓度为56mM时，异戊二烯合酶酶活是最高的，具体结果见图7B。

（4）热稳定性分析

将实施例3纯化获得的异戊二烯合酶IspS_ib和IspS_pa，分别在30ºC、40ºC、50ºC孵育10 min、20 min、40 min、60 min，然后以上述酶活体系进行反应，测其异戊二烯产量，计算酶活性，以最高酶活为100%，计算不同时间处理后酶的相对活性，做处理时间-相对酶活曲线。

结果显示，本发明所述异戊二烯合酶IspS_ib热稳定性比常用的异戊二烯合酶IspS_pa较低，具体结果见图8。针对热稳定性低进行的研究（包括酶工程等），将是进一步研究的重点，以进一步提高工程菌异戊二烯产量。

（5）米氏常数测定

本发明对异戊二烯合酶IspS_ib和IspS_pa的米氏常数进行了检测对比。具体实验方法为，对上述反应体系，加入不同浓度的底物DMAPP，0 µM，25 µM，50 µM，0.1 mM，0.2 mM，0.3 mM，0.4 mM，0.5 mM，0.6 mM，0.8 mM，1 mM，4 mM，8 mM 和 15 mM。分别测其异戊二烯产量，计算酶活，具体结果见图9，根据origin软件的Lineweaver–Burk plot analysis功能预测其K _m值和k _cat值。

结果显示，本发明所述来自于甘薯的异戊二烯合酶IspS_ib其K _m值为0.2 mM，k _cat值为0.34 s^-1。而来自于白杨的异戊二烯合酶IspS_pa的K _m值为0.2 mM，k _cat值为0.15 s^-1。说明本发明所述 IspS_ib相比于IspS_pa其酶活性高，对底物亲和力高。

实施例5：工程菌的发酵培养

挑取实施例2获得的工程大肠杆菌LMJ11以及LMJ0单菌落于3 ml含有34 mg/mL氯霉素和100 mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37ºC摇床过夜培养活化。转接至100 ml发酵培养基中进行扩大培养，培养至OD600为0.6-0.8，IPTG诱导，于30ºC摇床培养48 h，取顶空气体1 ml，利用气相色谱进行产物异戊二烯的检测。

结果表明，本发明构建的异戊二烯工程菌产量是503 mg/L，是对照菌株（LMJ0）异戊二烯产量的1.8倍，具体结果见图10。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方

法及应用

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 548

<212> PRT

<213> 甘薯（Ipomoea batatas ）异戊二烯合酶（IspSib）

<400> 1

Met Ser Ser Ala Gln Asn Gln Glu Thr Ala Arg Arg Ser Ala Asn Tyr

1 5 10 15

Gln Pro Ser Ser Trp Ser Tyr Asp Glu Tyr Leu Val Asp Thr Thr Thr

20 25 30

Asn Asp Ser Lys Leu Arg Ile Gln Glu Asp Ala Arg Lys Lys Leu Glu

35 40 45

Glu Glu Val Arg Asn Val Leu Glu Asp Gly Lys Leu Glu Thr Leu Ala

50 55 60

Leu Leu Glu Leu Ile Asp Asp Ile Gln Arg Leu Gly Leu Gly Tyr Lys

65 70 75 80

Phe Arg Glu Ser Thr Ser Thr Ser Leu Ala Met Leu Lys Met Ser Val

85 90 95

Gly Gln Glu Ala Ser Asn Ser Ser Leu His Ser Cys Ser Leu Tyr Phe

100 105 110

Arg Leu Leu Arg Glu His Gly Phe Asp Ile Thr Pro Asp Val Phe Glu

115 120 125

Lys Phe Lys Asp Glu Asn Gly Lys Phe Lys Asp Ser Ile Ala Lys Asp

130 135 140

Val Arg Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ser Phe Leu Gly Phe Glu

145 150 155 160

Gly Glu Asn Ile Leu Asp Glu Ala Arg Glu Phe Thr Thr Met His Leu

165 170 175

Asn Asn Ile Lys Asp Lys Val Asn Pro Arg Ile Ala Glu Glu Val Asn

180 185 190

His Ala Leu Glu Leu Pro Leu His Arg Arg Val Glu Arg Leu Glu Ala

195 200 205

Arg Arg Arg Ile Gln Ser Tyr Ser Lys Ser Gly Glu Thr Asn Gln Ala

210 215 220

Leu Leu Thr Leu Ala Lys Ile Asp Phe Asn Thr Val Gln Ala Val Tyr

225 230 235 240

Gln Arg Asp Leu Gln Asp Val Ser Lys Trp Trp Lys Asp Thr Ala Leu

245 250 255

Ala Asp Lys Leu Ser Phe Ala Arg Asp Arg Leu Met Glu Ser Phe Phe

260 265 270

Trp Ala Ile Gly Met Ser Tyr Asp Pro Gln His Ser Lys Ser Arg Glu

275 280 285

Ala Val Thr Lys Thr Phe Lys Leu Val Thr Val Leu Asp Asp Val Tyr

290 295 300

Asp Val Tyr Gly Ser Leu Asp Glu Leu Glu Lys Phe Thr Ala Ala Ala

305 310 315 320

Glu Arg Trp Asp Val Asp Ala Ile Lys Asp Leu Pro Asp Tyr Met Lys

325 330 335

Leu Cys Tyr Leu Ser Leu Phe Asn Thr Val Asn Asp Leu Ala Tyr Asp

340 345 350

Thr Leu Lys Asp Lys Gly Glu Thr Val Ile Pro Ile Met Lys Lys Ala

355 360 365

Trp Ala Asp Leu Leu Lys Ala Phe Leu Gln Glu Ala Gln Trp Ile Tyr

370 375 380

Asn Lys Tyr Thr Pro Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Asn Asn Ala Arg Phe

385 390 395 400

Ser Val Ser Gly Cys Val Met Leu Val His Ser Tyr Phe Thr Thr Gln

405 410 415

Asn Ile Thr Lys Glu Ala Ile His Ser Leu Glu Asn Tyr His Asp Leu

420 425 430

Leu Ile Trp Pro Ser Ile Val Phe Arg Leu Ala Asn Asp Leu Ser Ser

435 440 445

Ser Lys Ala Glu Ile Glu Arg Gly Glu Thr Ala Asn Ser Ile Thr Cys

450 455 460

Tyr Met Asn Glu Thr Gly Gln Ser Glu Glu Gln Ala Arg Glu His Ile

465 470 475 480

Ser Lys Leu Ile Asp Glu Cys Phe Lys Lys Met Asn Lys Glu Met Leu

485 490 495

Ala Thr Ser Thr Ser Pro Phe Glu Lys Ser Phe Ile Glu Thr Ala Ile

500 505 510

Asn Leu Ala Arg Ile Ala Leu Cys Gln Tyr Gln Tyr Gly Asp Ala His

515 520 525

Ser Asp Pro Asp Val Arg Ala Arg Asn Arg Ile Val Ser Val Ile Ile

530 535 540

Asn Pro Val Glu

545

<210> 2

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工合成密码子优化的IspSib

<400> 2

atgagtagcg cccagaatca ggaaaccgcc cgtcgcagtg ccaactacca gccgagtagc 60

tggagttatg atgaatatct ggttgatacc accacaaatg atagcaaact gcgtatccag 120

gaagatgccc gcaagaagct ggaagaagaa gtgcgcaatg tgctggaaga cggtaaactg 180

gagaccctgg ccctgctgga actgattgat gacatccagc gtctgggtct gggctataag 240

ttccgtgaga gcaccagcac cagcctggca atgttaaaga tgagcgtggg tcaggaagcc 300

agcaatagta gcttacatag ctgtagtctg tactttcgtc tgctgcgcga acatggcttt 360

gacattaccc cggatgtgtt tgaaaaattt aaagatgaaa atggcaaatt caaagacagc 420

attgccaagg atgtgcgcgg tctgctgagc ctgtatgagg ccagctttct gggttttgaa 480

ggcgagaaca tcctggacga agcccgtgag ttcaccacca tgcatctgaa taatattaaa 540

gacaaggtta acccgcgcat tgccgaagag gttaatcacg ccctggagct gccgctgcat 600

cgtcgtgttg aacgcctgga agcccgccgt cgcattcaga gctacagcaa gagtggcgag 660

accaaccagg cactgctgac cctggccaag atcgacttta acaccgttca ggccgtgtat 720

cagcgcgatt tacaagacgt tagcaaatgg tggaaggata ccgccctggc agataagctg 780

agttttgccc gcgatcgtct gatggagagt ttcttctggg caatcggcat gagctacgac 840

cctcagcaca gcaaaagccg tgaggccgtt accaagacct tcaaactggt gaccgtgctg 900

gacgacgttt atgacgtgta tggcagcctg gatgagctgg aaaaattcac agcagccgcc 960

gagcgttggg acgttgacgc aattaaagac ttaccggact atatgaagtt atgttatctg 1020

agcctgttta acacagtgaa cgatctggca tacgacaccc tgaaggacaa aggtgagacc 1080

gtgatcccga tcatgaaaaa agcttgggct gatttactga aagccttctt acaagaagct 1140

cagtggatct acaacaagta caccccgacc tttgatgaat atttaaataa tgcccgcttt 1200

agcgtgagcg gctgcgttat gctggtgcat agctacttta ccacccagaa tatcaccaaa 1260

gaagctatcc acagtctgga aaactatcac gacctgctga tctggccgag cattgttttt 1320

cgcctggcca atgatctgag cagcagtaag gccgaaatcg aacgcggcga aaccgccaac 1380

agcattacct gctatatgaa cgagaccggc cagagcgaag aacaggcccg tgagcatatt 1440

agcaagctga ttgacgagtg tttcaagaaa atgaacaaag aaatgctggc aacaagcacc 1500

agtcctttcg aaaaaagctt tattgaaacc gccatcaatt tagcacgcat cgccctgtgt 1560

cagtatcagt acggcgatgc ccatagcgat cctgatgtgc gtgcccgtaa tcgtattgtt 1620

agcgttatta ttaatccggt tgaataa 1647

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> IspSib-F

<400> 3

ggagatatac atatgagtag cgcccagaat c 31

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> IspSib-R

<400> 4

atccaattga gatctatgat gatgatgatg atgtgcttca accggatt 48

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> IspSpa-F

<400> 5

ggagatatac atatgagatg tagcg 25

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> IspSpa-R

<400> 6

atccaattga gatctttaat gatgatgatg atgatgtgcg cgttcaaacg gcagaa 56

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> IspS-R

<400> 7

gccggcagat cttta 15

Claims

1.一种编码异戊二烯合酶的异戊二烯合酶基因IspS_ib，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其来源于甘薯（Ipomoea batatas）。

2.一种权利要求1所述异戊二烯合酶基因IspS_ib合成的异戊二烯合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种含有权利要求1所述异戊二烯合酶基因IspS_ib的原核表达载体。

4.根据权利要求3所述的原核表达载体，其特征在于，还含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE和3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS。

5.一种产异戊二烯工程菌，其特征在于，由权利要求4所述原核表达载体以及甲羟戊酸途径下游表达载体共转化获得；所述甲羟戊酸途径下游表达载体外源表达甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII。

6.根据权利要求5所述的产异戊二烯工程菌，其特征在于，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII均来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

7.根据权利要求5所述的产异戊二烯工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE的Genebank登录号为AAG02439；所述3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的Genebank登录号为AAG02438；所述甲羟戊酸激酶基因ERG12的Genebank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8的Genebank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19的Genebank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1的Genebank登录号为855986。

8.权利要求1所述的异戊二烯合酶基因IspS_ib、权利要求2所述异戊二烯合酶、权利要求3或4所述的原核表达载体，以及权利要求5或6或7所述产异戊二烯工程菌在生产异戊二烯中的应用。

9.一种权利要求2所述异戊二烯合酶体外催化二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP合成异戊二烯的方法，其特征在于，外反应体系为：50 mM pH值为8.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、20 mMKCl、56 mM MgCl₂、5% v/v甘油、5 mM DTT、1 mM DMAPP和1 μg 异戊二烯合酶；体外反应体系配制完成后于42℃孵育，获得异戊二烯。