CN102559769B - 一种制备异戊二烯的重组细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了从丙酮酸和3-磷酸甘油醛生物合成异戊二烯的方法、重组细胞，其中丙酮酸和3-磷酸甘油醛最终是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得。
Description
技术领域
本发明涉及异戊二烯化合物的制备领域，特别涉及利用重组细胞生物法制备异戊二烯的领域。
背景技术
异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95％用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。
目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。
生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)，之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。因此增加异戊二烯前体物质DMAPP的含量是提高异戊二烯产量的重要因素之一。
微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
目前，随着分子生物学技术的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。例如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了50微克/克干细胞/天的产率(Pia Lindberg等，2009)，但藻类生长缓慢、生物量低下是利用藻类制备异戊二烯的瓶颈问题。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而利用工程菌发酵生产异戊二烯(美国专利公开，2009/0203102)。该工程菌中获得外源MVA途径时需要转入多达8个异源基因，由于过多的异源基因才表达可能会导致细胞自身代谢的紊乱，影响细胞的正常生长代谢，最终导致目标产物产量低下。
发明内容
本发明提出利用可再生资源葡萄糖为原料，通过生物催化剂制备异戊二烯，建立可持续发展的异戊二烯合成工艺路线。
本发明主要通过基因工程手段提高甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径中限速酶活性(脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi))，增加异戊二烯的合成前体物DMAPP，再利用植物异戊二烯合成酶将DMAPP催化合成目标产物异戊二烯。最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种异戊二烯生物合成代谢途径。
本研究方法是利用大肠杆菌原有的MEP代谢途径，避免了由于过多外源基因的表达而导致细胞自身的代谢的影响，同时通过高效表达代谢途径的限速酶基因，优化MEP代谢途径，提高DMAPP的含量，组合植物的异戊二烯合成酶基因，最终在大肠杆菌中构建生物基异戊二烯合成途径。
更具体地，本发明提供以下各项：
1、一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括：在重组细胞体内，通过基因工程手段提高甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径中的3个限速酶(即脱氧木酮糖5-磷酸合成酶(dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶(dxr)和异戊烯基焦磷酸异构酶(idi))的活性，再通过表达外源的植物异戊二烯合成酶基因(IspS)合成异戊二烯的步骤。
2、根据第1项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶和异戊烯基焦磷酸异构酶活性的提高是通过过表达内源或外源的脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)和异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)实现的。
3、根据第2项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)是来源于：1)埃希氏菌属大肠杆菌，或2)来源于其他细菌，优选枯草芽孢杆菌，或3)和dxs基因同源性超过70％的核酸序列，或4)来源于其它生物体，和dxs基因没有明显的同源性，但和dxs基因具有相同或相似功能的核酸序列。
4、根据第2项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)是来源于：1)埃希氏菌属大肠杆菌，或2)来源于其他细菌，优选枯草芽孢杆菌，或3)和dxr基因同源性超过70％的核酸序列，或4)来源于其它生物体，和dxr基因没有明显的同源性，但和dxr基因具有相同或相似功能的核酸序列。
5、根据第2项所述的方法，其中所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)是来源于：1)埃希氏菌属大肠杆菌，或2)来源于其他细菌，或3)来源于酵母，优选酿酒酵母，或4)和idi基因同源性超过70％的核酸序列，或5)来源于其它生物体，和idi基因没有明显的同源性，但和idi基因具有相同或相似功能的核酸序列。
6、根据第1或2项所述的方法，其中所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶和异戊烯基焦磷酸异构酶这三种酶活性的提高可增加异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的含量。
7、根据第1项所述的方法，其中所述异戊二烯合成酶基因(IspS)是来源于：1)植物，优选杨树，或2)和IspS基因同源性超过70％的核酸序列，或3)来源于其它生物体，和IspS基因没有明显的同源性，但和IspS基因具有相同或相似功能的核酸序列。
8、重组细胞，其中过表达脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)、异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)以及异戊二烯合成酶基因(IspS)。
9、根据第8项所述的重组细胞，其优选为细菌细胞，更优选为埃希氏菌属大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。
10、根据第1项所述的方法、根据第8或9项所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物包括：异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
附图简述
图1是利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛生物合成异戊二烯代谢途径示意图；
图2是载体构建示意图(pYJM6质粒图谱)；
图3是载体构建示意图(pYJM11质粒图谱)；
图4显示通过本发明的重组细胞发酵生产异戊二烯的产量；
图5是Populus alba ispS mRNA(optimized sequence)1683bp；
图6是Populus alba x Populus tremula ispS mRNA(sequence)；
图7是Populus nigra mRNA for isoprene synthase(IspS gene)。
具体实施方式
以下将以实施例方式，详细描述本发明：
实施例1
通过在大肠杆菌中共同过量表达来源于E.coli的脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)和异戊二烯合成酶基因(IspS)，利用葡萄糖降解中间产物丙酮酸和3-磷酸甘油醛生物合成异戊二烯。
1.1外源基因的克隆和表达载体的构建
1.1.1外源基因的克隆
1.1.1.1E.coli脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因的克隆
提取E.coli(ATCC No.10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，GenBank登记号：6059543。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为：
Ds-L：5’-CGCGGATCCGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCGA-3’
DS-R：5’-CATGGAGCTCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATT-3
1.1.1.2E.coli的脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因的克隆
提取E.coli(ATCC No.10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因dxr，GenBank登记号：945019。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。扩增引物序列为：
Dr-L：5’-CGCGGATCCGAAGCAACTCACCATTCTGG-3’
Dr-R：5’-CCCAAGCTT TCAGCTTGCGAGACGCAT-3’
1.1.1.3E.coli的异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆
提取E.coli(ATCC No.10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi，GenBank登记号：949020。再利用胶回收试剂盒回收目的基因。
扩增引物序列为：
IDI-L：5’-GGGTTTCATATGATGCAAACGGAACACGTCAT-3’
IDI-R：5’-GGGTTTCATATGTTATTTAAGCTGGGTAAAT-3’
1.1.1.4植物来源异戊二烯合成酶基因的克隆
利用化学合成方法(上海捷瑞生物工程有限公司，上海市松江区九亭镇同利路433号)合成植物来源(Populus alba x Populus tremula；Populusnigra；Populus alba)IspS基因，并经过密码子优化，序列见附图5所示(SEQ ID NO：1)。
扩增Populus alba IspS基因的引物序列为：
IspS 1-F：5‘-GGAAGATCTCAGATGTAGCGTGTCCACCGAA-3’
IspS 1-R：5’-CCGCTCGAGTAGCGTTCAAACGGCAGAATC-3’
扩增Populus nigra IspS基因(附图7，SEQ ID NO：3)的引物序列为：
IspS2-L：5’-GGAAGATCTCGCGACCGAACTGCTGTGCCT-3’
IspS2-R：5’-CCGCTCGAGTTAACGTTCGAACGGCAGGATC-3’
扩增Populus alba x Populus tremula IspS基因(附图6，SEQ ID NO：2)的引物序列为：
IspS3-F：5‘-GGAAGATCTCGAAGCCAGACGGTCTGCCAA-3’
IspS3-R：5’-CCGCTCGAGTTATCTCTCAAAGGGTAG-3’
1.1.2表达载体的构建
1.1.2.1pYJM1载体的构建
将胶回收后的dxs基因与pACYCDuet-1载体(Novagen)分别用BamHI和SacI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM1(pACY-dxs)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.2pYJM2载体的构建
将胶回收后的dxr基因与pACYDuet-1载体用BamHI和HindIII进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM2(pACY-dxr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.3pYJM3载体的构建
以pYJM2质粒载体为模板，扩增含有T7启动子的dxr基因即：T7-dxr；用相同的限制性酶(PstI和HindIII)酶切pYJM1与T7dxr，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL-1卡那霉素素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM3(pACY-dxs-T7dxr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
扩增T7dxr基因的引物序列为：
T7dr2-L：5’-GCGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGGAAT-3’
Dr2-R：5′ATTTGCGGCCGC TTATGTGAGTATTGAATTGACGTAT 3’
1.1.2.4pYJM4载体的构建
将胶回收后的idi基因与pYJM3载体分别用NdeI进行单酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM4(pACY-dxs-T7dxr-idi)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.5pYJM5载体的构建
将胶回收后的ispS基因与pACYDuet-1载体(Novagen)分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM5(pACY-ispS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.6pYJM6载体的构建
以pYJM5质粒载体为模板，扩增含有T7启动子的ispS基因即：T7-ispS；将胶回收后的T7-ispS基因与pYJM4载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM6(pACY-dxs-T7dxr-idi-T7ispS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.2E.coli pYJM6重组菌株的构建
将pYJM6重组质粒热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pYJM6的工程大肠杆菌E.coli pYJM6。
1.3SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达
将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的接种量接种到10mL LB液体培养液中(内含34μg·mL-1氯霉素)，37℃，225rpm振荡培养2h，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1，然后转入30℃，225rpm继续培养3-4h，诱导表达目的蛋白。取出诱导后的培养物，12000g离心2min，收集菌体，菌体细胞用0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤一次，按1∶10的比例再用此缓冲液重悬细胞，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min，瞬时高速离心，10％SDS-PAGE电泳检测，即可检测到目标蛋白的表达。
1.4工程大肠杆菌的培养
将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的比例接种到含有34μg·mL-1氯霉素M9液体培养液中，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1～1.0mmol·L-1，然后转入在30℃，225rpm条件下，继续培养24-72h。
1.5工程菌发酵试验
挑取单克隆到50ml M9种子培养基(1L M9salts：20g Glucose，6gNa2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5g NaCl，0.24g MgSO4，121℃高压蒸汽灭菌15min。)中。将种子按10％的接种量接种至含有3L发酵培养基(29.4g K2HPO4.3H2O；6.3g citric acid.H2O；0.9g柠檬酸铁铵；1.2ml浓硫酸；60g葡萄糖，(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.185mg；ZnSO4.7H2O 0.145mg；H3BO41.235mg；CuSO4.5H2O 0.125mg；MnCl2.4H2O 0.79mg，6ml 1MMgSO4，2850ml蒸馏水)的5L小型发酵罐中，通气量2.5L/min，转速400rpm，37℃培养至OD600约为0.6时，0.1mM-1mM IPTG，37℃诱导表达，以氨水调pH，控制pH在7.0。得到的异戊二烯产物通过GC-MS对其进行定性和定量分析。
检测条件：分析仪器：Agilent 7890A GC，色谱柱：HP-AL/S，25m×320μm×8μm。检测器：FID。
气相色谱条件：进样口温度：200℃，压力：15psi，检测器FID温度：250℃；程序升温：初始温度50℃，保持3min；10℃/min，升至70℃，保持12min；10℃/min，升至150℃，保持1min。
得到的异戊二烯产物通过GC-MS对其进行定量分析(GC-MS分析方法参见：Julsing，M.K.，Rijpkema，M.，Woerdenbag，H.J.，Quax，W.J.，Kayser，O.Functional analysis of genes involved in the biosynthesis of isoprene inBacillus subtilis.Appl Microbiol Biotechnol 2007Jul；75(6)：1377-84)。发酵目标异戊二烯产物累计含量达9.52mg/L。
实施例2
通过在大肠杆菌中共同过量表达来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)和脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，大肠杆菌(E.coli)或酿酒酵母异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)、植物来源异戊二烯合成酶基因(IspS)(Populus alba x Populustremula；Populus nigra；Populus alba)，利用葡萄糖降解中间产物丙酮酸和3-磷酸甘油醛生物合成异戊二烯。
2.1外源基因的克隆和表达载体的构建
2.1.1外源基因的克隆
2.1.1.1Bacillus subtilis的脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因基因的克隆
提取Bacillus subtilis(ATCC NO.23857)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因(dxs)，GenBank登记号：938609。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为
Ds2-L：5′CGCGGATCCGGATCTTTTATCAATACAGGACCCG-3′
Ds2-R：5’GCGTCGACTTATGATCCAATTCCTTTGTGTG-3’
2.1.1.2Bacillus subtilis脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因的克隆
提取Bacillus subtilis的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因(dxr)，GenBank登记号：939636。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为
Dr2-L：5′-CGGGATCCG AAAAATATTTGTCTTTTAGGAGCA-3’
Dr2-R：5′-CCCAAGCTT TTATGTGAGTATTGAATTGACGTAT-3’
2.1.1.3S.cerevisiae异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆
提取S.cerevisiae(ATCC No.26108TM)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增异戊烯基焦磷酸异构酶基因(idi)，GenBank登记号：855986。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。
扩增引物序列为
IDI2-L：5’-GGGTTTCATATGACTGCCGACAACAATAGTA-3’
IDI2-R：5’-GGGTTTCAT TTATAGCATTCTATGAATTT-3’
2.1.2表达载体的构建
2.1.2.1pYJM7载体的构建
将胶回收后的Bacillus subtilis dxs基因与pACYDuet-1载体(Novagen)分别用BamHI和SacI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM7(pACY-Bdxs)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
2.1.2.2pYJM8载体的构建
将胶回收后的Bacillus subtilis dxr基因与pACYDuet-1载体(Novagen)分别用BamHI和HindIII进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM8(pACY-Bdxr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
2.1.2.3pYJM9载体的构建
以pYJM8质粒载体为模板，扩增含有T7启动子的dxr基因即：T7-Bdxr；用相同的限制性酶(PstI和HindIII)酶切pYJM7与T7dxr，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL-1卡那霉素素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM9(pACY-Bdxs-T7Bdxr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
2.1.2.4pYJM10载体的构建
将胶回收后的idi基因与pYJM9载体分别用NdeI进行单酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM10(pACY-Bdxs-T7Bdxr-idi)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
2.1.2.5pYJM11载体的构建
以pYJM5质粒载体为模板，扩增含有T7启动子的ispS基因即：T7-ispS；将胶回收后的T7-ispS基因与pYJMl0载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM11(pACY-Bdxs-T7Bdxr-idi-T7ispS)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
2.2E.coli pYJM11重组菌株的构建
将pYJM11重组质粒热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pYJM11的工程大肠杆菌E.coli pYJM11。
2.3工程大肠杆菌的培养
将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的比例接种到含有34μg·mL-1氯霉素M9液体培养液中，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mmol·L-1～1.0mmol·L-1，然后转入在30℃，225rpm条件下，继续培养24-72h。
2.4异戊二烯产物测定
得到的异戊二烯产物通过GC-MS对其进行定量分析(GC-MS分析方法参见：Julsing，M.K.，Rijpkema，M.，Woerdenbag，H.J.，Quax，W.J.，Kayser，O.Functional analysis of genes involved in the biosynthesis of isoprene inBacillus subtilis.Appl Microbiol Biotechnol 2007Jul；75(6)：1377-84)。发酵条件和检测条件同上。
如图4所示，发酵目标产物异戊二烯的含量达到：289mg/L。
Claims (4)
1.一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括：在大肠杆菌中，通过基因工程手段提高脱氧木酮糖5-磷酸合成酶dxs，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶dxr和异戊烯基焦磷酸异构酶idi的活性，再通过表达外源的植物异戊二烯合成酶基因IspS合成异戊二烯的步骤；所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因GenBank登记号：938609，所述脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因GenBank登记号：939636，所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因GenBank登记号：855986，所述异戊二烯合成酶基因如SEQ ID NO：1所示。
2.重组细胞，其中过表达脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因dxs、脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因dxr、异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi以及异戊二烯合成酶基因IspS；所述脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因GenBank登记号：938609，所述脱氧木酮糖5-磷酸还原酶基因GenBank登记号：939636，所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因GenBank登记号：855986，所述异戊二烯合成酶基因如SEQID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的方法在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物包括：异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光刻胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
4.根据权利要求2所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物包括：异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光刻胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
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