CN105255804B - 一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌及其制备方法与应用 - Google Patents

一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的大肠杆菌基因工程菌具有异戊二烯合成途径，同时过表达甲醇脱氢酶基因MDH，6‑磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6‑磷酸‑3‑己酮糖异构酶基因RmpB和甲醇脱氢酶激活蛋白基因Act。同时，本发明还提供了构建该大肠杆菌基因工程菌的方法及应用方法。本发明所提供的大肠杆菌基因工程菌可以甲醇为底物生物合成异戊二烯，具有转化效率高，生产成本低等特点，甲醇‑异戊二烯的转化率可达21.83％。

Description

一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌及其制备 方法与应用
技术领域
本发明涉及一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
中国是世界甲醇大国，产能超过世界的50％，2014年国内产能超过6000万吨，2015年预计会超过6500万吨。根据国际经验，产能利用率保持在81％～82％之间是衡量工业产能是否过剩的临界点。从近年来国内甲醇行业平均开工率数据来看，我国甲醇开工率一直在60％以下，2013年甲醇平均开工率为57.13％，处于严重过剩的状态。国内甲醇产能过剩，加上进口甲醇价格较低，致使国内甲醇的价格持续下降，2014年维持在1500～2000元/吨左右。
甲醇精细化工产品的生产，能够有效应对甲醇生产过剩的局面，对于我国甲醇工业行业的发展和市场的深化拓展有着重要意义。下游产品比之甲醇有更多的发展空间，能够生产出更多的分支产品，而且下游产品在环保和节能方面与甲醇相比更具优势，更符合世界工业的新理念。基于以上优点，大力研发甲醇下游产品，生产高附加值的精细化工产品是甲醇类产品发展的大趋势。
甲醇的下游产品开发可以通过化学转化和生物转化另种方法实现。化学转化途径，研究较多的是以甲醇为原料制取烯烃、二甲醚、乙酸和甲醛等附加值较低的物质。化学转化离不开贵金属催化剂，提高了生产升本。同时，催化剂的选择性和原料的转化率较低、副产物较多、污染严重等问题的存在严重制约了产业的发展。相比较而言，生物方法污染小、成本较低、可以实现原料的高效转化。
甲醇的生物转化利用处于探索阶段。以甲醇为碳源，通过微生物转化可以获得一些附加值较高的发酵产物。Eugenio实现了以甲醇为碳源，利用工程Pichia pastoris合成乙肝病毒表面抗原。Pichia pastoris在Pichia pastoris体内过表达编码蜱虫蛋白的基因后，可以利用甲醇合成蜱虫疫苗。Stuart等在Pichia pastoris细胞内过表达水蛭素合成基因，发酵4天得到1.5g/L水蛭素。张元兴等采用甲醇甘油混合流加的方法使重组毕赤酵母细胞干重达到162g/L，最终得到1.7g/L的水蛭素；还对发酵液的脱色和水蛭素的分离进行了探讨。一些科研工作者开展了甲醇单细胞蛋白的研究，发现利用甲醇作原料，通过微生物发酵法生产的单细胞蛋白含有丰富的氨基酸，可以作为安全的饲料添加剂。已有的关于甲醇生物利用的研究，主要通过甲基营养型菌株的简单培养来验证少数几种产品的生产。总的来说，研究基础比较薄弱，存在诸多亟待解决的问题。
异戊二烯是战略资源性化工原料，供需不平衡。异戊二烯产量的95％用于合成橡胶，此外，也可应用于高品质航空燃料等领域。目前制作轮胎的主要原料是天然橡胶和合成橡胶(聚异戊橡胶)。聚异戊橡胶因其分子结构及物化性质与天然橡胶相近，是替代天然橡胶制造橡胶轮胎的理想原料。随着我国汽车行业的快速发展，以及我国天然橡胶原料日益短缺，对异戊二烯的需求量不断增加，预计2010年国内异戊二烯需求量将达10.54万吨，2013年增长到31.04万吨，年增速46％左右，然而，我国异戊二烯产量不足，需要大量进口，价格不断攀升，成为制约我国相关产业发展和战略安全的重要原料。
目前，工业上主要是通过化学法从石油基原料中制备异戊二烯。全球异戊二烯主要生产国家或地区主要分布在欧美地区。俄罗斯是异戊二烯生产大国，产量约占全球29％，美国约占18％、日本约占15％。其次为巴西、西欧、加拿大等。俄罗斯等国从战略上考虑，限制异戊二烯生产技术对我国的出口，而我国异戊二烯天然资源匮乏，化学法规模化异戊二烯生产技术在产品成本、纯度等方面尚不成熟，制约着相关产业的发展，自主研发异戊二烯合成技术迫在眉睫。随着化石资源的日益枯竭和价格的不断攀升，拓宽原料来源，利用生物技术制备异戊二烯已成为国际上战略高技术的必争之地。已经报道利用葡萄糖为碳源合成异戊二烯，其产量和产率较低，同时葡萄糖市场价格高于甲醇且波动较大。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌，该大肠杆菌基因工程菌是过表达甲醇脱氢酶基因MDH，6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB和甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT。
优选地，所述甲醇脱氢酶基因MDH，来源于甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethanolicus)，基因登录号GI：662720579；所述6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：40074227；所述6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：40074228；所述甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：22654851。
优选地，还过表达合成异戊二烯的相关基因，具体为脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因dxs，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶dxr，异戊烯基焦磷酸异构酶idi和异戊二烯合成酶基因Isps。
本发明的另一目的是提供一种所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下：
1)克隆或合成获得甲醇脱氢酶基因MDH，6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB和甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT，并将所得基因与质粒pBAD18酶切回收，目的片段和载体；
2)将步骤1)所得的载体和目的片段按照等摩尔比混合后利用连接酶连接，并转入感受态细胞中，筛选阳性克隆；
3)培养步骤2)所得的阳性克隆，并提取质粒，将步骤1)所述的四个基因连接在质粒pBAD18上，获得重组质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT；
4)构建具有异戊二烯合成途径的重组质粒，并将所得的重组质粒与步骤3)所得的重组质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT，一同转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得大肠杆菌基因工程菌。
优选地，步骤1)所述甲醇脱氢酶基因MDH，来源于甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethanolicus)，基因登录号GI：662720579；所述6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：40074227；所述6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：40074228；所述甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：22654851。
优选地，步骤2)所述连接酶为T4DNA连接酶，连接时间为6～12小时；所述感受态细胞，为经过热激转化的E.coliDH5α感受态细胞；所述筛选，是利用涂布氯霉素或卡那霉素抗性平板过夜培养，PCR筛选。
优选地，步骤4)所述具有异戊二烯合成途径的重组质粒，包含脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因dxs，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶dxr，异戊烯基焦磷酸异构酶idi和异戊二烯合成酶基因Isps。
所述任一大肠杆菌基因工程菌在生产异戊二烯中的应用也在本发明的保护范围之内。
所述应用的步骤如下：
1)活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液，与含有卡那霉素和氯霉素的培养基，按照种子液：培养基＝1～2:100～130的比例接种后培养至OD600在1.8～2，离心获得菌体；
3)向步骤2)所得的菌体重悬后加入新鲜培养基中，并加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终浓度分别为0.05～0.5mM和0.002％～0.02％，然后转入28～30℃，180～220rpm条件下继续培养24～72小时。
优选地，步骤2)所述培养，培养条件为：35℃～37℃，180～220rpm。
在另一种实施方式中，本发明提供的利用上述工程大肠杆菌制备异戊二烯的方法，是将构建好的工程大肠杆菌在适宜的培养基中进行活化获得种子液，将种子液以1～2:100～130的比例接入含有卡那霉素和氯霉素的适宜培养集中，35℃～37℃，180～220rpm条件下培养至OD600在1.8～2之间时回收菌体，回收后的菌体用5mL上述培养基重悬并重新加入含有95mL的盐水瓶中，同时，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终浓度分别为0.05～0.5mM和0.002％～0.02％，诱导目的蛋白进行过量表达。然后转入28～30℃，180～220rpm条件下继续培养24～72小时；定时取培养瓶内培养基上方空气，通过气相检测产物。
发酵生产异戊二烯过程中，大肠杆菌基因工程菌所用的培养基包括各种适于所选用的宿主细胞(大肠杆菌)生长的培养基，碳源优选为低成本的甲醇；不使用其他碳源或有机氮源，其他成分为简单的不做特别的限定，例如氮源可选择无机氮源(氯化铵、硫酸铵等)，优选低成本的无机氮源。
本发明获得的有益效果如下：
本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌具有以甲醇为唯一碳源合成异戊二烯的特点，发酵24h，可以得到343mg/L的异戊二烯，甲醇-异戊二烯的转换率可达到21.83％，转化率为理论转化率的58.64％。
附图说明
图1为以甲醇碳源合成异戊二烯途径的流程图；
(图中，实线代表一步反应，虚线代表多步反应)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
在此，对本发明所使用的合成途径(图1)进行说明。
本发明所使用的合成途径包括甲醇代谢途径和异戊二烯合成途径。
以下提及的磷酸戊糖途径和糖酵解途径是大肠杆菌细胞内本身具有的代谢途径。
本发明中的甲醇代谢途径，其重要的反应为：利用甲醇脱氢酶激活蛋白ACT激活甲醇脱氢酶MDH的酶活；利用甲醇脱氢酶MDH将甲醇氧化为甲醛；利用6-磷酸己酮糖合成酶RmpA，由甲醛和磷酸戊糖途径产生的5-磷酸木酮糖反应生成6-磷酸己酮糖；利用6-磷酸己酮糖异构酶RmpB，将由6-磷酸己酮糖生成6-磷酸呋喃果糖。
6-磷酸呋喃果糖由大肠杆菌本身具有的6-磷酸果糖激酶Pfk和果糖-二磷酸醛缩酶Fba转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛经过糖酵解途径作用后生成丙酮酸。
本发明中所述的具有异戊二烯途径，是指过表达脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因dxs，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶dxr，异戊烯基焦磷酸异构酶idi和异戊二烯合成酶基因Isps，过表达上述基因的重组质粒的构建过程参见专利CN102559769A。
实施例1基因的获取
本实施例中，获取来源于甲基营养型芽孢杆菌的甲醇脱氢酶基因MDH(基因登录号GI：662720579)的基因序列；6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA(基因登录号GI：40074227)的基因序列；6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB(基因登录号GI：40074228)的基因序列；甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT(基因登录号GI：22654851)的基因序列。对以上基因的原有序列进行密码子优化后由苏州金唯智生物科技有限公司合成。优化后甲醇脱氢酶基因MDH的序列如SEQ ID NO.1所示；优化后6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA的序列如SEQ ID NO.2所示；优化后6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB的序列如SEQ ID NO.3所示；优化后甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT的序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2重组质粒的制备
通过用EcoRI及SacI对实施例1中获得的甲醇脱氢酶基因MDH与质粒pBAD18进行酶切，用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切产物回收后，将载体：目的片段按摩尔比为1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6小时，获得重组质粒pBAD18-1；
通过用SacI及KpnI对实施例1中获得的6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA与质粒pBAD18-1进行酶切，用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切产物回收后，将载体：目的片段按摩尔比为1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6小时，获得重组质粒pBAD18-2；
通过用SalI及SphI对实施例1中获得的6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB与质粒pBAD18-2进行酶切，用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切产物回收后，将载体：目的片段按摩尔比为1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6小时，获得重组质粒pBAD18-3；
通过用SphI对实施例1中获得的甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT与质粒pBAD18-3进行酶切，用胶回收试剂盒回收目的片段，酶切产物回收后，将载体：目的片段按摩尔比为1:1的比例混合，加入T4DNA连接酶后在16℃下连接6小时，获得重组质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT。
实施例3将质粒pBAD18-3与异戊二烯合成质粒导入大肠杆菌E.coli JM109(DE3)合成异戊二烯
将实施例2所得的重组质粒pBAD18-3与异戊二烯合成质粒同时加入到E.coliJM109(DE3)感受态细胞中；冰浴20min，冰浴后的感受态细胞放入42℃水浴锅热激45s，热激后立即冰浴2min；在超净台内，加入600μl灭菌的LB液体培养基到感受态细胞所在的离心管内；将离心管置于37℃摇床培养1h；摇床培养后，500rpm离心2min，用移液枪吸出上清液，留少许上清液重悬细胞，并涂布于含有卡那霉素和氯霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
将获得的工程菌株单克隆加入含有卡那霉素和氯霉素的适宜培养基中，在37℃，180rpm条件下进行活化获得种子液，将种子液以1:100的比例接入以上培养集中继续培养。菌体浓度生长至OD600为2左右，在无菌环境下回收菌体。回收后的菌体用5mL培养基进行重悬，加入含有95mL培养基的500mL体积的盐水瓶中，同时加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终浓度分别为0.05mM和0.02％，并利用丁基橡胶塞密封。转入30℃，180rpm条件下继续培养，诱导目的蛋白进行过量表达。培养24小时后，取培养瓶内培养基上方空气，通过气相检测产物。
经检测，异戊二烯的产量为217mg/L，甲醇到异戊二烯转化率为9.4％。
实施例4将质粒pBAD18-3与异戊二烯合成质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)合成异戊二烯
将实施例2所得的重组质粒pBAD18-3与异戊二烯合成质粒同时加入到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中；冰浴20min，冰浴后的感受态细胞放入42℃水浴锅热激45s，热激后立即冰浴2min；在超净台内，加入600μl灭菌的LB液体培养基到感受态细胞所在的离心管内；将离心管置于37℃摇床培养1h；摇床培养后，500rpm离心2min，用移液枪吸出上清液，留少许上清液重悬细胞，并涂布于含有卡那霉素和氯霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
将获得的工程菌株单克隆加入含有卡那霉素和氯霉素的适宜培养基中，在37℃，180rpm条件下进行活化获得种子液，将种子液以1:100的比例接入以上培养集中继续培养。菌体浓度生长至0D600为2左右，在无菌环境下回收菌体。回收后的菌体用5mL培养基进行重悬，加入含有95mL培养基的500mL体积的盐水瓶中，同时加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终浓度分别为0.05mM和0.02％，并利用丁基橡胶塞密封。转入30℃，180rpm条件下继续培养，诱导目的蛋白进行过量表达。培养24小时后，取培养瓶内培养基上方空气，通过气相检测产物。
经检测，异戊二烯的产量为297mg/L，甲醇到异戊二烯转化率为12.9％，相对于实施例3中的工程菌，产量和转化率分别提高了36.8％和37.2％。
实施例5将质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT与异戊二烯合成质粒导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)合成异戊二烯
将实施例2所得的重组质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT与异戊二烯合成质粒同时加入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中；冰浴20min，冰浴后的感受态细胞放入42℃水浴锅热激45s，热激后立即冰浴2min；在超净台内，加入600μl灭菌的LB液体培养基到感受态细胞所在的离心管内；将离心管置于37℃摇床培养1h；摇床培养后，500rpm离心2min，用移液枪吸出上清液，留少许上清液重悬细胞，并涂布于含有卡那霉素和氯霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
将获得的工程菌株单克隆加入含有卡那霉素和氯霉素的适宜培养基中，在37℃，180rpm条件下进行活化获得种子液，将种子液以1:100的比例接入以上培养集中继续培养。菌体浓度生长至0D600为2左右，在无菌环境下回收菌体。回收后的菌体用5mL培养基进行重悬，加入含有95mL培养基的500mL体积的盐水瓶中，同时加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终浓度分别为0.05mM和0.02％，并利用丁基橡胶塞密封。转入30℃，180rpm条件下继续培养，诱导目的蛋白进行过量表达。培养24小时后，取培养瓶内培养基上方空气，通过气相检测产物。
经检测，异戊二烯的产量为343mg/L，甲醇到异戊二烯转化率为21.83％。相对于实施例中4中没有过表达甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT的工程菌，产量和转化率分别提高了32.32％和69.22％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照上述实施例对本发明进行了详细地说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种催化甲醇制备异戊二烯的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，具有异戊二烯合成途径，同时，过表达甲醇脱氢酶基因MDH，6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB和甲醇脱氢酶激活蛋白基因ACT，所述甲醇脱氢酶基因MDH，来源于甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)，基因登录号GI：662720579；所述6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：40074227；所述6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：40074228；所述甲醇脱氢酶激活蛋白ACT基因，来源于甲基营养型芽孢杆菌，基因登录号GI：AY128667.1；所述具有异戊二烯合成途径，是指过表达脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因dxs，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶dxr，异戊烯基焦磷酸异构酶idi和异戊二烯合成酶基因Isps。
2.一种权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)克隆或合成获得甲醇脱氢酶基因MDH，6-磷酸己酮糖合成酶基因RmpA，6-磷酸-3-己酮糖异构酶基因RmpB和甲醇脱氢酶激活蛋白ACT基因，并将所得基因与质粒pBAD18酶切回收，目的片段和载体；
2)将步骤1)所得的载体和目的片段按照等摩尔比混合后利用连接酶连接，并转入感受态细胞中，筛选阳性克隆；
3)培养步骤2)所得的阳性克隆，并提取质粒，将步骤1)所述的四个基因连接在质粒pBAD18上，获得重组质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT；
4)构建具有异戊二烯合成途径的重组质粒，并将所得的重组质粒与步骤3)所得的重组质粒pBAD18-MDH-RmpA-RmpB-ACT，一同转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得大肠杆菌基因工程菌。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述连接酶为T4DNA连接酶，连接时间为6～12小时；所述感受态细胞，为经过热激转化的E.coliDH5α感受态细胞；所述筛选，是利用涂布氯霉素或卡那霉素抗性平板过夜培养，PCR筛选。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述具有异戊二烯合成途径的重组质粒，包含脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因dxs，脱氧木酮糖5-磷酸还原酶dxr，异戊烯基焦磷酸异构酶idi和异戊二烯合成酶基因Isps。
5.权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌在生产异戊二烯中的应用。
6.权利要求5所述应用，其特征在于，步骤如下：
1)活化大肠杆菌基因工程菌，获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液，与含有卡那霉素和氯霉素的培养基，按照种子液：培养基＝1～2:100～130的比例接种后培养至OD600在1.8～2，离心获得菌体；
3)向步骤2)所得的菌体重悬后加入新鲜培养基中，加入诱导剂IPTG和阿拉伯糖至终浓度分别为0.05～0.5mM和0.002％～0.02％，然后转入28～30℃，180～220rpm条件下继续培养24～72小时。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，步骤2)所述培养，培养条件为：35℃～37℃，180～220rpm。
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