CN104995293A - 用于在甲醇的存在下提高还原当量的可用性,以及用于生产与此有关的己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺或己内酰胺的微生物体和方法 - Google Patents
用于在甲醇的存在下提高还原当量的可用性,以及用于生产与此有关的己二酸、6-氨基己酸、六亚甲基二胺或己内酰胺的微生物体和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了一种具有可以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的甲醇代谢途径的非天然存在的微生物体。这类还原当量可以被用来增加该微生物生产的有机化合物的产品如己二酸、6-氨基己酸酯、六亚甲基二胺或己内酰胺的收率。本文还提供了使用这类生物以生产己二酸、6-氨基己酸酯、六亚甲基二胺或己内酰胺的方法。
Description
相关申请的参考
本申请要求2013年2月19日提交的美国序列号61/766,620以及2012年12月17日提交的美国序列号61/738,306的权益,其每个以引用方式被整体并入本文。
1.发明概述
本文提供通常涉及能够生产有机化合物的代谢和生物合成过程和微生物体的方法。具体地,本文提供一种具有甲醇代谢途径(MMP)的非天然存在的微生物体(NNOMO),该途径能够在甲醇的存在下提高还原当量的可用性和/或将甲醇转化为甲醛。这样的NNOMO和还原当量可用来增加由该微生物体生产的有机化合物,如己二酸、6-氨基己酸(6-ACA)、六亚甲基二胺(HMDA)和/或己内酰胺的产物收率。本文还提供生产最佳收率的己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺的NNOMO及其方法。
在第一个方面,本文提供一种具有甲醇代谢途径(MMP)的NNOMO,其中所述生物体包括编码MMP酶(MMPE)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性和/或将甲醇转化为甲醛。在某些实施方式中,该MMP包括选自如下的一种或多种酶:甲醇甲基转移酶(EM1);亚甲基四氢叶酸还原酶(EM2);亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EM3);亚甲基四氢叶酸环水解酶(EM4);甲酰四氢叶酸去甲酰酶(EM5);甲酰四氢叶酸合成酶(EM6);甲酸氢化酶(EM15);氢化酶(EM16);甲酸脱氢酶(EM8);甲醇脱氢酶(EM9);甲醛活化酶,(EM10);甲醛脱氢酶(EM11);S-(羟甲基)谷胱甘肽合酶(EM12);谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(EM13);以及S-甲酰基谷胱甘肽水解酶(EM14)。这类生物体,在某些实施方式中,有利地顾及还原当量的生产,该生物体然后可以使用本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP的任一种,将该还原当量用于己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生产。
在一种实施方式中,该MMP包括EM9。在另一实施方式中,该MMP包括EM9和EM10。在其他的实施方式中,该MMP包括EM1和EM2。在一种实施方式中,该MMP包括EM9、EM3、EM4和EM5。在另一实施方式中,该MMP包括EM9、EM3、EM4和EM6。在其他的实施方式中,该MMP包括EM9和EM11。在另一实施方式中,该MMP包括EM9、EM12、EM13和EM14。在其他的实施方式中,该MMP包括EM9、EM13和EM14。在一种实施方式中,该MMP包括EM9、EM10、EM3、EM4和EM5。在另一实施方式中,该MMP包括EM9、EM10、EM3、EM4和EM6。在其他的实施方式中,该MMP包括EM1、EM2、EM3和EM4和EM5。在一种实施方式中,该MMP包括EM1、EM2、EM3、EM4和EM6。在某些上述实施方式中,该MMP进一步包括EM8。在其他的上述实施方式中,该MMP进一步包括和EM15。在仍然其他的上述实施方式中,该MMP进一步包括EM16。在某些实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种编码MMPE。
在第二个方面,本文提供一种具有如下的NNOMO:(1)MMP,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性;以及(2)己二酸途径(AdiP),其中所述生物体包括编码AdiP酶(AdiPE)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以生产己二酸。在某些实施方式中,该AdiP酶选自如下:3-氧代己二酰基-CoA硫解酶(EA1)、3-氧代己二酰基-CoA还原酶(EA2)、3-羟基己二酰基-CoA脱水酶(EA3)、5-羧基-2-戊烯酰基-CoA还原酶(EA4)、己二酰基-CoA水解酶(EA11A)、己二酰基-CoA连接酶(EA11B)、己二酰基-CoA转移酶(EA11C)和磷酸转己二酰酶/己二酸激酶(EA11D)。
在第三个方面,本文提供一种具有如下的NNOMO:(1)MMP,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性;以及(2)6-ACA途径(6-ACAP),其中所述生物体包括编码6-ACAP酶(6-ACAPE)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以生产6-ACA。在某些实施方式中,该6-ACAPE选自如下:EA1、EA2、EA3、EA4、己二酰基-CoA还原酶(醛形成)(EA5)、6-ACA转氨酶(EA6A)和6-ACA脱氢酶(EA6B)。
在第四个方面,本文提供一种具有如下的NNOMO:(1)MMP,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性;以及(2)HMDA途径(HMDAP),其中所述生物体包括编码HMDAP酶(HMDAPE)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以生产HMDA。在某些实施方式中,该HMDAPE选自如下:EA1、EA2、EA3、EA4、EA5、EA6A、EA6B、6-氨基己酰基-CoA/酰基-CoA转移酶(EA7A)、6-氨基己酰基-CoA合酶(EA7B)、6-氨基己酰基-CoA还原酶(醛形成)(EA9)、HMDA转氨酶(EA10A)和HMDA脱氢酶(EA10B)。
在第五个方面,本文提供一种具有如下的NNOMO:(1)MMP,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性;以及(2)己内酰胺途径(CapP),其中所述生物体包括编码CapP酶(CapPE)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以生产己内酰胺。在某些实施方式中,该CapPE选自如下:EA1、EA2、EA3、EA4、EA5、EA6A、EA6B、EA7A和EA7B。在其他的实施方式中,该CapPE选自如下:EA1、EA2、EA3、EA4、EA5、EA6A、EA6B和酰胺水解酶(EA8)。
在其他的实施方式中,单独具有如本文所提供的MMP或组合己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径的该生物体进一步包括甲醛同化途径(FAP),其将如从甲醇的氧化中获得的甲醛用于形成可以被用于,例如生物质的形成的某些中心代谢途径的中间体。在某些实施方式中,该生物体进一步包括FAP,其中所述生物体包括编码甲醛同化途径酶(FAPE)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以生产糖酵解的中间体和/或可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体。在一种实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产糖酵解的中间体。在另一实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体。在一些该实施方式中,该FAP包括6-磷酸己酮糖(H6P)合酶(EF1)、6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2)、二羟基丙酮(DHA)合酶(EF3)或DHA激酶(EF4)。在一种实施方式中,该FAP包括EF1和EF2。在一种实施方式中,该中间体是H6P、6-磷酸果糖(F6P)或其组合。在其他的实施方式中,该FAP包括EF3或EF4。在一种实施方式中,该中间体是DHA、磷酸DHA(DHAP)或其组合。在某些实施方式中,该生物体包括两种外源性核酸,每种编码FAPE。
在某些实施方式中,本文提供一种具有MMP的NNOMO,其中所述生物体包括编码EM9的至少一种外源性核酸,该EM9以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性和/或以足够的量被表达以将甲醇转化为甲醛。在一些实施方式中,该生物体包括编码EM9的至少一种外源性核酸,该EM9以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性。在其他的实施方式中,该生物体包括编码EM9的至少一种外源性核酸,该EM9以足够的量被表达以将甲醇转化为甲醛。在一些实施方式中,该微生物体进一步包括FAP。在某些实施方式中,该生物体进一步包括编码FAPE的至少一种外源性核酸,该FAPE以足够的量被表达以生产糖酵解的中间体。在某些实施方式中,该FAPE选自EF1、EF2、EF3和EF4。
在一些实施方式中,本文提供一种单独具有如本文所提供的MMP或组合AdiP、6-ACAP、HMDAP、CapP和/或FAP的NNOMO,其中所述生物体进一步包括甲酸再利用途径(FRP)。在某些实施方式中,该生物体包括编码FRP酶(FRPE)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以生产甲醛、丙酮酸或乙酰基-CoA。在一些实施方式中,该FRP包括:(1)甲酸还原酶(EFR1);(2)(i)甲酸连接酶(EFR2A)、甲酸转移酶(EFR2B)或甲酸合成酶(EFR2C)和(ii)甲酰基-CoA还原酶(EFR3);(3)(i)甲酰四氢叶酸合成酶(EFR4)、(ii)次甲基四氢叶酸环水解酶(EFR5)、(iii)亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EFR6)和(iv)甲醛形成酶(EFR7)或自发的;(6)(i)EFR4、(ii)EFR5、(iii)EFR6、(iv)甘氨酸分裂系统(EFR8)、(v)丝氨酸羟甲基转移酶(EFR9)和(vi)丝氨酸脱氨酶(EFR10);(7)(i)EFR1、(ii)EFR4、(iii)EFR5、(iv)EFR6、(v)EFR8、(vi)EFR9和(vii)EFR10;(8)(i)EFR2A、EFR2B或EFR2C;(ii)EFR3;(iii)EFR4;(iv)EFR5;(v)EFR6;(vi)EFR8;(vii)EFR9和(viii)EFR10;(9)(i)EFR7或自发的、(ii)EFR4、(iii)EFR5、(iv)EFR6、(v)EFR8、(vi)EFR9和(vii)EFR10;以及(10)(i)EFR4、(ii)EFR5、(iii)EFR6、(iv)亚甲基四氢叶酸还原酶(EFR11)和(v)乙酰基-CoA合酶(EFR12)。在一些实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种外源性核酸,每种编码FRPE。在其他的实施方式中,编码FRPE的该至少一种外源性核酸是异源性核酸。在一些实施方式中,该FRP进一步包括(i)丙酮酸甲酸裂解酶(EFR13);(ii)丙酮酸脱氢酶(EFR14A)、丙酮酸铁氧化还原蛋白氧化还原酶(EFR14B)或丙酮酸:NADP+氧化还原酶(EFR14C);(iii)甲酸脱氢酶(EFR15);或(iv)EFR14A、EFR14B或EFR14C;以及EFR15。
在某些实施方式中,该AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP进一步包括PEP羧化酶(EFR16A)、PEP羧基激酶(EFR16B)、丙酮酸羧化酶(EFR17)、苹果酸脱氢酶(EFR18)、苹果酸酶(EFR19)、富马酸酶(EFR20A)、富马酸还原酶(EFR20B)、琥珀酰-CoA合成酶(EFR20C)、琥珀酰-CoA连接酶(EFR20D)或琥珀酰-CoA转移酶(EFR20E)。
在某些实施方式中,至少一种外源性核酸是异源性核酸。在一些实施方式中,该生物体在基本上厌氧的培养基中。在一些实施方式中,该微生物体是细菌属、酵母属或真菌属。
在一些实施方式中,该生物体进一步包括发生在编码参与所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种蛋白质或酶的一种或多种内源性基因中的一种或多种基因破坏,其中所述一种或多种基因破坏带来了所述微生物体中增加的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺产量。在一些实施方式中,参与该微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种内源性酶具有减毒的酶活性或表达水平。在某些实施方式中,该生物体包括从一种到二十五种基因破坏。在其他的实施方式中,该生物体包括从一种到二十种基因破坏。在一些实施方式中,该生物体包括从一种到十五种基因破坏。在其他的实施方式中,该生物体包括从一种到十种基因破坏。在一些实施方式中,该生物体包括从一种到五种基因破坏。在某些实施方式中,该生物体包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种基因破坏或更多。
在另一方面,本文提供一种生产甲醛的方法,包括在各种条件下培养本文提供的NNOMO达足以生产甲醛的时间。在某些实施方式中,该NNOMO包括编码EM9的外源性核酸。在某些实施方式中,该甲醛被消耗以提供还原当量。在其他的实施方式中,该甲醛被消耗以掺入己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或另一目的产品。
在另一方面,本文提供一种生产糖酵解的中间体和/或可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体的方法,包括在各种条件下培养本文提供的NNOMO达足以生产该中间体的时间段。在某些实施方式中,该NNOMO包括编码EM9的外源性核酸。在某些实施方式中,该甲醛被消耗以提供还原当量。在其他的实施方式中,该甲醛被消耗以掺入己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或另一目的产品。
在其他的方面,本文提供用于生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的方法,包括在各种条件下培养任一种包括MMP和本文提供的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径的NNOMO达足以生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的时间。在一种实施方式中,本文提供用于生产己二酸的方法,包括在各种条件下培养任一种包括MMP和本文提供的AdiP的NNOMO达足以生产己二酸的时间。在另一实施方式中,本文提供用于生产6-ACA的方法,包括在各种条件下培养任一种包括本文提供的6-ACAP的NNOMO达足以生产6-ACA的时间。在另一实施方式中,本文提供用于生产HMDA的方法,包括在各种条件下培养任一种包括MMP和本文提供的HMDAP的NNOMO达足以生产HMDA的时间。在仍然另一实施方式中,本文提供用于生产己内酰胺的方法,包括在各种条件下培养任一种包括MMP和本文提供的CapP的NNOMO达足以生产己内酰胺的时间。在某些实施方式中,该生物体被培养于基本上厌氧的培养基中。在一些实施方式中,该NNOMO进一步包括如本文所提供的,FAP、FRP或其组合。
2.附图说明
图1示出实现从甲醇提取还原当量的示例性代谢途径。所示的酶转换通过如下酶执行:1A)甲醇甲基转移酶(EM1),1B)亚甲基四氢叶酸还原酶(EM2),1C)亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EM3),1D)次甲基四氢叶酸环水解酶(EM4),1E)甲酰四氢叶酸去甲酰酶(EM5),1F)甲酰四氢叶酸合成酶(EM6),1G)甲酸氢化酶(EM15),1H)氢化酶(EM16),1I)甲酸脱氢酶(EM8),1J)甲醇脱氢酶(EM9),1K)甲醛活化酶,(EM10),1L)甲醛脱氢酶(EM11),1M)S-(羟甲基)谷胱甘肽合酶(EM12),1N)谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(EM13)和1O)S-甲酰基谷胱甘肽水解酶(EM14)。在某些实施方式中,步骤K和/或M是自发的。
图2示出示例性AdiP、6-ACAP、HMDAP和CapP,当由本文提供的MMP生产的还原当量可用时,该AdiP、6-ACAP、HMDAP和CapP可以被用来增加从碳水化合物到己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的收率。所示的酶转换通过如下酶执行:2A)3-氧代己二酰基-CoA硫解酶(EA1);2B)3-氧代己二酰基-CoA还原酶(EA2);2C)3-羟基己二酰基-CoA脱水酶(EA3);2D)5-羧基-2-戊烯酰基-CoA还原酶(EA4),2E)己二酰基-CoA还原酶(醛形成)(EA5),2F)6-ACA转氨酶(EA6A)或6-ACA脱氢酶(EA6B);2G)6-氨基己酰基-CoA/酰基-CoA转移酶(EA7A)或6-氨基己酰基-CoA合酶(EA7B);2H)酰胺水解酶(EA8);2J)6-氨基己酰基-CoA还原酶(醛形成)(EA9),2K)HMDA转氨酶(EA10A)或HMDA脱氢酶(EA10B),2L)己二酰基-CoA水解酶(EA11A)、己二酰基-CoA连接酶(EA11B)、己二酰基-CoA转移酶(EA11C)或磷酸转己二酰酶/己二酸激酶(EA11D)。在某些实施方式中,步骤2I反映出自发的环化作用(EA12)。己二酸生产可以通过2A、2B、2C、2D和2L执行。6-ACA生产可以通过2A、2B、2C、2D、2E和2F执行。HMDA生产可以通过2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K执行。己内酰胺生产可以通过2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和自发的环化作用(2I);或2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H执行。
图3示出示例性FAP。该酶转换通过如下酶执行:3A)H6P合酶(EF1),以及3B)6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2)。
图4示出示例性FAP。该酶转换通过如下酶执行:4A)DHA合酶(EF3),以及4B)DHA激酶(EF4)。
图5示出实现CO2、甲酸、甲醛、MeOH、甘油和葡萄糖到己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺的转化的示例性代谢途径。所示的酶转换通过如下酶执行:A)甲醇脱氢酶(EM9)(也见图1,步骤J);B)3-6-磷酸己酮糖合成酶(EF1)(也见图3,步骤A);C)6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2)(也见图3,步骤B);D)DHA合酶(EF3)(也见图4,步骤A);E)甲酸还原酶(EFR1);F)甲酸连接酶(EFR2A),甲酸转移酶(EFR2B)或甲酸合成酶(EFR2C);G)甲酰基-CoA还原酶(EFR3);H)甲酰四氢叶酸合成酶(EFR4);I)次甲基四氢叶酸环水解酶(EFR5);J)亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EFR6);K)甲醛形成酶(EFR7);L)甘氨酸分裂系统(EFR8);M)丝氨酸羟甲基转移酶(EFR9);N)丝氨酸脱氨酶(EFR10);O)亚甲基四氢叶酸还原酶(EFR11);P)乙酰基-CoA合酶(EFR12);Q)丙酮酸甲酸裂解酶(EFR13);R)丙酮酸脱氢酶(EFR14A)、丙酮酸铁氧化还原蛋白氧化还原酶(EFR14B)或丙酮酸:NADP+氧化还原酶(EFR14C);S)甲酸脱氢酶(EFR15);T)PEP羧化酶(EFR16A)或PEP羧基激酶(EFR16B),U)丙酮酸羧化酶(EFR17);V)苹果酸脱氢酶(EFR18);W)苹果酸酶(EFR19);X)富马酸酶(EFR20A)、富马酸还原酶(EFR20B)、琥珀酰-CoA合成酶(EFR20C)、琥珀酰-CoA连接酶(EFR20D)或琥珀酰-CoA转移酶(EFR20E);以及Y)3-氧代己二酰基-CoA硫解酶(EA1:见图2,步骤A)。在一些实施方式中,步骤K是自发的。用于琥珀酰-CoA到己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺的转化的示例性途径可以在图2中被找到。
3.发明详述
3.1定义
如本文所用,术语“非天然存在的”当关于本文提供的微生物体使用时,意指该微生物体具有至少一种通常不会在相关物种的天然存在的菌株(包括相关物种的野生型菌株)中发现的基因改变。基因改变包括,例如,引入编码新陈代谢多肽的可表达的核酸的修饰、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物体遗传物质的其他功能中断。这些修饰包括,例如,相关物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和功能片段。其他修饰包括,例如,其中该修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区域。示例性代谢多肽包含己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径内的酶或蛋白质。
如本文所用,“己二酸”具有化学式-OOC-(CH2)4-COO-(IUPAC名称为己二酸酯),其是己二酸(IUPAC名称为己二酸)的离子形式,以及理解的是,己二酸酯和己二酸可以全文互换使用,指任何其中性或离子形式的化合物,包括其任何盐形式。技术人员可理解的是,具体形式将取决于pH。己二酸的化学结构如下所示:
如本文所用,“6-氨基己酸酯”或“6-ACA”具有化学式–OOC-(CH2)5-NH2,其是6-氨基己酸(IUPAC名称为6-氨基己酸)的离子形式,以及理解的是,6-氨基己酸酯和6-氨基己酸可以全文互换使用,指任何其中性或离子形式的化合物,包括其任何盐形式。技术人员可理解的是,具体形式将取决于pH。氨基己酸的化学结构如下所示:
如本文所用,“六亚甲基二胺”或“HMDA”(IUPAC名称为己烷-1,6-二胺)具有式H2N(CH2)6NH2。HMDA的化学结构如下所示:
如本文所用,“己内酰胺”(IUPAC名称为氮杂环庚烷-2-酮)是6-氨基己酸的内酰胺。己内酰胺的化学结构如下所示:
新陈代谢修饰是指从其天然存在的状态发生改变的生化反应。因此,NNOMO可以具有对编码新陈代谢多肽的核酸或其功能片段的基因修饰。本文披露了示例性新陈代谢修饰。
如本文所用,术语“分离”当关于微生物体使用时,意指当相关微生物体在自然界中被发现时,基本上不含至少一种组分的生物体。该术语包括当在其自然环境中被发现时从部分或全部组分中脱离的微生物体。该术语还包括当其在非天然存在的环境中被发现时从部分或全部组分中脱离的微生物体。因此,当分离的微生物体在自然界中被发现或者当其在非天然存在的环境中培育、储存或生存时,它部分或全部地从其他物质中分离。分离的微生物体的具体例子包括部分纯的微生物体、基本上纯的微生物体和在非天然存在的培养基中培养的微生物体。
如本文所用,术语“微生物体”意在指任何作为包含在古菌域、细菌域或真核域的显微细胞存在的生物体。因此,该术语意包括原核或真核细胞或具有显微尺寸的生物体并包括所有种类的细菌、古菌和真细菌以及真核微生物体(如酵母和真菌)。该术语还包括任何种类的可被培养用于生产生物化学品的细胞培养物。
如本文所用,术语“CoA”或者“辅酶A”意在指有机辅因子或者辅基(酶的非蛋白质部分),它的存在为许多酶(脱辅基酶)的活性所需以形成活性酶系统。辅酶A在某些缩合酶中起作用,在乙酰基或者其他酰基基团转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其他乙酰基化中起作用。
如本文所用,术语“基本上厌氧”当关于培养或培育条件使用时意指氧量少于液体培养基内溶解的氧的饱和量的约10%。该术语还意在包括在小于约1%的氧的气氛中保持的液体或固体培养基的密封室。
如本文所用,术语“基因破坏”或其语法上的等同物,意指使所编码的基因产物无活性或减弱的基因改变。该基因改变可以是,例如,整个基因的缺失、转录或翻译所需的调节序列的缺失、导致截短的基因产物的基因的一部分的缺失或者通过使所编码的基因产物失活或减弱的任何各种突变策略。基因破坏的一种特别有用的方法是完全的基因缺失,因为它减少或消除了本文所提供的NNOMO中遗传回复的发生。基因破坏还包括无效突变,这指基因或包含基因的区域内导致该基因不被转录成RNA和/或翻译成功能性基因产物的突变。这类无效突变可以产生于许多类型的突变,包括,例如,失活点突变、基因的一部分的缺失、整个基因缺失或染色体片段的缺失。基因破坏的表型效果可以是无效突变,其可以起因于许多类型的突变,包括失活点突变、整个基因缺失和染色体片段或整个染色体的缺失。特异性反义核酸化合物和酶抑制剂,如抗生素,也可以产生无效突变体表型,因此等同于基因破坏。
如本文所用,术语“生长偶联”当关于生化产品的生产使用时意指在微生物体的生长期期间,相关生化产品的生物合成产生。在具体的实施方式中,生长偶联生产可以是强制性的,这意味着相关生物化学品的生物合成是在微生物体的生长期期间而产生的强制性产品。术语“生长偶联”当关于生物化学品的消耗使用时意指在微生物体的生长期期间,相关生物化学品被消耗。
如本文所用,术语“减毒”或其语法上的等同物意指使削弱、降低或减少酶或蛋白质的活性或量。如果酶或蛋白质的活性或量的减毒引起该活性或量下降到低于给定途径发挥功能所需的临界水平,则该减毒可以模拟完全破坏。然而,模拟完全破坏的酶或蛋白质的活性或量的减毒仍能足以使单独的途径继续发挥功能。例如,内源性酶或蛋白质的减毒可以足以模拟相同的酶或蛋白质的完整破坏,以用于本文提供的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产品的生产,但酶或蛋白质的其余活性或量仍能足以维持其他途径,如对宿主微生物体生存、繁殖或生长至关重要的途径。酶或蛋白质的减毒也可以按足以增加本文提供的脂肪醇、脂肪醛或脂肪酸产品的收率的量,削弱、降低或减少该酶或蛋白质的活性或量,但并不一定模拟该酶或蛋白质的完全破坏。
如本文所用,“外源”意指有关分子或有关活性被引入宿主微生物。分子可以例如,通过将编码核酸引入宿主遗传物质,如通过整合入宿主染色体或作为非染色体遗传物质(如质粒)被引入。因此,当关于编码核酸的表达使用时,该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物体。当关于生物合成活性使用时,该术语指被引入宿主有关生物体的活性。来源可以是例如,表达引入宿主微生物体后有关活性的同源或异源编码核酸。因此,术语“内源”指在宿主内存在的有关分子或活性。同样,当关于编码核酸的表达使用时,该术语指包含在微生物体体内编码核酸的表达。术语“异源”指来自与有关物种不同的来源的分子或活性而“同源”指来自宿主微生物体的分子或活性。因此,本文提供的编码核酸的外源性表达可以利用异源编码核酸和同源编码核酸的其一或两者。
理解的是,当微生物体内包含一种以上的外源性核酸时,所述一种以上的外源性核酸指相关的编码核酸或者生物合成活性,如上文所讨论。进一步理解的是,如本文所披露,这类一种以上的外源性核酸可以被引入在单独的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或者在其组合上的宿主微生物体,并且仍然被看作是一种以上的外源性核酸。例如,如本文所披露,微生物体可被设计以表达两种或者两种以上的编码所需的途径酶或者蛋白质的外源性核酸。在两种编码所需活性的外源性核酸被引入宿主微生物的情况下,理解的是,该两种外源性核酸可以作为单一核酸被引入例如,在单一质粒上、在单独的质粒上,可以被整合入位于单个位点或者多个位点的宿主染色体,以及仍然被看作是两种外源性核酸。同样,理解的是,两种以上的外源性核酸可以任何所需的组合形式被引入例如,在单一质粒上、在单独的质粒上的宿主生物,可以被整合入位于单一位点或者多个位点的宿主染色体,以及仍然被看作是两种或者两种以上的外源性核酸,例如三种外源性核酸。因此,相关的外源性核酸或者生物合成活性的数量指编码核酸的数量或者生物合成活性的数量,而非被引入宿主生物的单独的核酸的数量。
本文提供的NNOMO可以包含稳定的基因改变,这指可以培养超过五代而无改变损失的微生物体。一般地,稳定的基因改变包括持续超过10代的修饰,具体地,稳定的修饰将持续超过约25代,以及更具体地,稳定的基因修饰将超过50代,包括永久地。
本领域的技术人员会理解所述基因改变(包括本文示例性的新陈代谢修饰)是关于合适的宿主生物(如大肠杆菌)及其相应的新陈代谢反应或所需的新陈代谢途径的所需的遗传物质(如基因)的合适的来源生物体描述的。然而,如果有各种各样的生物体的完整的基因组测序和基因组学领域的高水平技能,本领域的技术人员将能够很容易地将本文提供的教诲和指导应用于基本上所有的其他生物体。例如,本文示例性的大肠杆菌新陈代谢改变可以通过纳入来自非相关物种的物种的相同或类似的编码核酸很容易地应用到其他物种。一般地,这类基因改变包括例如,物种同系物的基因改变,以及具体地,直系同源、旁系同源或非直系同源基因置换。
直系同源是通过垂直传递相关且导致不同的生物体内基本上相同或相似的功能的一种或多种基因。例如,小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶因环氧化物水解的生物体功能可以被认为是直系同源。例如,当基因共有足够量的序列相似性以表明它们是同源的或者通过进化自共同的祖先相关时,所述基因通过垂直传递相关。如果基因共有足够量的三维结构但不一定共有序列相似性以表明它们进化自共同的祖先达到基本序列相似性无法识别的程度,也认为它们是直系同源。直系同源的基因可以编码具有约25%到100%氨基酸序列一致性的序列相似性的蛋白质。如果编码共有的氨基酸相似性小于25%的蛋白质的基因其三维结构也显示出相似性,则所述基因也可以被认为通过垂直传递产生。酶类的丝氨酸蛋白酶家族的成员(包括组织型纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶)被认为通过垂直传递产生自共同的祖先。
直系同源包括通过例如,进化在结构或整体活性方面趋异的基因或其编码基因产物。例如,当一种物种编码显示两种功能的基因产物以及当这类功能在第二个物种内已经分为不同的基因时,这三个基因及其相应的产物被认为是直系同源。对于生化产品的生产,本领域的技术人员会理解含待引入或破坏的新陈代谢活性的直系同源的基因将被选择用于该NNOMO的构建。显示各自活性的直系同源的例子是当两个或两个以上物种之间或一个单一物种内部不同的活性已经分为不同的基因产物的情况。具体的例子是弹性蛋白酶蛋白质水解和纤维蛋白溶酶原蛋白质水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)分离为作为纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶的不同分子。第二个例子是支原体5'-3'核酸外切酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的核酸外切酶和聚合酶其一或两者的直系同源,反之亦然。
相反,旁系同源是通过例如,复制然后进化趋异相关的同系物并具有相似或共同的,但不完全相同的功能。旁系同源可以源自例如,相同物种或源自不同的物种。例如,微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源,因为它们代表两种不同的酶类,协同进化自共同的祖先,催化不同的反应并在相同的物种内具有不同的功能。旁系同源是来自彼此具有显著的序列相似性的相同物种的蛋白质,这表明它们是同源的或通过协同进化自共同的祖先而相关。旁系同源蛋白质家族的群体包括HipA同系物、荧光素酶基因、肽酶以及其他。
非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因,可以替代一种不同的物种内有关基因功能。替代包括例如,能够在起源物种内执行与所述不同的物种内所述有关功能相比基本上相同或相似的功能。虽然一般地,非直系同源基因置换可看作是与编码有关功能的已知基因结构相关,不过结构相关性差但功能相似的基因及其相应的基因产物仍然会如本文所用,落入所述术语的含义之内。功能相似性要求例如,与编码试图被替代的功能的基因相比,在非直系同源基因产物的活性位点或结合区域具有至少一些结构相似性。因此,直系同源基因包括例如,旁系同源或不相关的基因。
因此,识别和构建本文提供的具有己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成能力的NNOMO时,本领域的技术人员会将本文提供的教诲和指导应用于特定的物种并会理解新陈代谢修饰的识别可以包括直系同源的识别和包含或灭活。如果编码催化相似或基本上相似的新陈代谢反应的酶的旁系同源和/或非直系同源基因置换存在于参照微生物体内,本领域的技术人员还可以利用这些进化上相关的基因。
直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换可以通过本领域的技术人员熟知的方法确定。例如,对两种多肽的核酸或氨基酸序列的检验将揭示所比较的序列之间的序列一致性和相似性。基于这种相似性,本领域的技术人员可以确定相似性是否足够高以表明蛋白质是通过进化自共同的祖先而相关的。本领域的技术人员熟知的算法(如Align、BLAST、Clustal W以及其他)比较并确定原始序列相似性或一致性,以及还确定序列内空隙的存在或大小,其可以被赋予权数或得分。这类算法在本领域也已知并同样适用于确定核苷酸序列的相似性或一致性。足够的相似性以确定相关性的参数的计算基于熟知的用于计算统计相似性的方法或在随机多肽中发现相似匹配的几率以及确定的所述匹配的程度。如果需要,两个或两个以上序列的计算机对比还可以由本领域的技术人员进行可视优化。相关的基因产物或蛋白质应该具有高度的相似性,例如,25%到100%的序列一致性。不相关的蛋白质可以具有一致性,所述一致性基本上与预计将发生的几率相同,如果扫描一个具有相当规模的数据库(约5%)。5%到24%之间的序列可代表或不代表足以得出所比较的序列具有相关性的结论的同源性。在给定数据集的大小的情况下,可以进行额外的确定这种匹配的程度的统计分析,以确定这些序列的相关性。
用于使用例如,所述BLAST算法确定两个或两个以上序列的相关性的示例性参数可以如下文描述。简言之,氨基酸序列比对可以使用BLASTP版本2.0.8(1999年1月5日)以及以下参数执行:矩阵:0 BLOSUM 62;空位开放:11;空位延伸:1;x_dropoff:50;期望值:10.0;序列长度:3;过滤器:开。核酸序列比对可以使用BLASTN版本2.0.6(1998年9月16日)以及以下参数执行:匹配:1;错配:-2;空位开放:5;空位延伸:2;x_dropoff:50;期望值:10.0;序列长度:11;过滤器:关。本领域的技术人员会知道对以上参数作何修改会例如,增加或减少比较的严格性,以及确定两个或两个以上序列的相关性。
原料指作为原材料,被用于生物体的培育(包括工业培育过程)的物质。当关于用细胞培养微生物体(如发酵过程)使用时,该术语指被用来为该细胞提供碳或其他能源的原材料。“再生”原料指一种可再生能源,例如衍生自活的有机体或其代谢副产物的材料,包括衍生自生物质的材料,通常由未充分利用的组分(例如糠)组成。专门作为可再生原料培育的农产品包括,例如玉米、大豆和棉花(主要在美国);亚麻籽和油菜籽(主要在欧洲);巴西的甘蔗和东南亚的棕榈油。因此,该术语包含横跨该星球的衍生自农业或动物产品的一批碳水化合物、脂肪和蛋白质。
生物质指任何衍生自植物的有机物质。在后发酵处理的情况下,生物质可以用来指在发酵过程中所产生的微生物细胞块。在可持续的基础上可用于能量的生物质包含草本和木本能源作物、农业食品和饲料作物、农作物废弃物和残留物、木材废料和残留物、水生植物,以及包含一些市政废物的其他废料。生物质原料组合物、用途、分析方法和理论收率可容易地从美国能源部获得以及可被发现和描述于,例如URL1.eere.energy.gov/biomass/information_resources.html,它包含描述超过150种示例性生物质源的数据库。可以作为原料,被用于本文提供的方法的示例性生物质类型包含纤维素生物质、半纤维素生物质和木素原料或原料的木素部分。这类生物质原料包含,例如用作碳源的碳水化合物底物(如葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、淀粉等)。
以下是本文所用的缩写及其相应的化合物或组合物名称的列表。这些缩写被用于整个本申请和附图中(原文语法错误?)。理解的是,本领域的普通技术人员可以容易地通过这类命名法识别这些化合物/组合物。MeOH或MEOH=甲醇;Fald=甲醛;GLC=葡萄糖;G6P=6-磷酸葡萄糖;H6P=6-磷酸己酮糖;F6P=6-磷酸果糖;FDP=二磷酸果糖或1,6-二磷酸果糖;DHA=二羟基丙酮;DHAP=磷酸二羟丙酮;G3P=和-3-磷酸甘油醛;PYR=丙酮酸;糖3=阿拉伯糖;ACCOA=乙酰基-CoA;AACOA=乙酰乙酰-CoA;FTHF=甲酰基四氢叶酸;THF=四氢叶酸;E4P=4-磷酸赤藓糖:Xu5P=5-磷酸木酮糖;Ru5P=5-磷酸核酮糖;S7P=7-磷酸景天庚酮糖:R5P=5-磷酸核糖;OAA=草酰乙酸;MAL=苹果酸、6-ACA=6-氨基己酸酯、HMDA=六亚甲基二胺。
还理解的是,途径中多个步骤的关联可以通过将其步骤标识符相连接(有或没有空格或标点)来指示;例如,以下在描述包括步骤W、步骤X、步骤Y和步骤Z的4步途径时是等效的:步骤WXYZ或W、X、Y、Z或W;X;Y;Z或W-X-Y-Z。
3.2利用甲醇的新陈代谢生产的还原当量的微生物体
本文提供经设计以改善还原当量的可用性的NNOMO和MMP,其可以被用于产物分子的生产。示例性产物分子包含,不限于,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺,虽然有了本文提供的启示和教导,本领域的技术人员将认识到,在其生产中利用还原当量的任何产物分子可以显示出通过本文提供的生物合成途径而提高的产量。
己二酸(一种具有146.14分子量的二羧酸)是一种具有商业意义的化合物。其主要用途是生产通过用HMDA缩合己二酸而制成的尼龙6,6,线型聚酰胺,其主要被采用用于制造不同种类的纤维。己二酸的其他用途包含其在增塑剂、不饱和聚酯和聚酯多元醇中的用途。额外的用途包含用于聚氨酯、润滑剂组分的生产的用途以及作为食品成分作为调味剂和凝胶佐剂的用途。
在历史上,使用氧化从各种脂肪中制备己二酸。用于己二酸合成的目前的商业化过程依赖于使用过量的强硝酸对KA油(环己酮(酮或K组分),以及环己醇(醇或A组分)的混合物);或纯的环己醇的氧化。该主题存在若干变体,其不同于用于KA或环己醇的生产的途径。例如,苯酚是KA油生产中的替代性原材料,以及已经对用于从苯酚到己二酸的合成的过程进行了描述。其他版本的这种过程倾向使用非硝酸的氧化剂,如过氧化氢、空气或氧。
己内酰胺是一种有机化合物,其是6-氨基己酸(ε-氨基己酸、氨基己酸)的内酰胺。替代性地,可以考虑到己酸的环酰胺。己内酰胺的主要工业用途是作为单体用于尼龙-6的生产。大多数己内酰胺经由使用羟基硫酸铵的肟化过程,继之以使用Beckmann重排过程步骤的催化重排而从环己酮合成。
需要开发用于有效地生产商业量的化合物(如己二酸和己内酰胺,以及6-ACA和HMDA)的方法。
相应地,本文提供根据本文所述的方法生产的生物来源的己二酸以及包括该生物来源的己二酸或使用其获得的生物基产品。该生物基产品可以包括至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%生物来源的己二酸。该生物基产品可以包括作为重复单元的一部分所述生物来源的己二酸。该生物基产品可以是通过模制该生物基产品而获得的模制产品。
本文还提供根据本文所述的方法生产的生物来源的己内酰胺以及包括该生物来源的己内酰胺或使用其获得的生物基产品。该生物基产品可以包括至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%生物来源的己内酰胺。该生物基产品可以包括作为重复单元的一部分所述生物来源的己内酰胺。该生物基产品可以是通过模制该生物基产品而获得的模制产品。
本文还提供根据本文所述的方法生产的生物来源的6-ACA以及包括该生物来源的6-ACA或使用其获得的生物基产品。该生物基产品可以包括至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%生物来源的6-ACA。该生物基产品可以包括作为重复单元的一部分所述生物来源的6-ACA。该生物基产品可以是通过模制该生物基产品而获得的模制产品。
本文还提供根据本文所述的方法生产的生物来源的HMDA以及包括该生物来源的HMDA或使用其获得的生物基产品。该生物基产品可以包括至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%生物来源的HMDA。该生物基产品可以包括作为重复单元的一部分所述生物来源的HMDA。该生物基产品可以是通过模制该生物基产品而获得的模制产品。
甲醇是可以经由催化,衍生自合成气体组分CO和H2的相对廉价的有机原料。甲醇可以被用作还原当量的来源以增加从碳水化合物到产品分子的摩尔收率。
甲醇可以被用作用于通过采用如本文所述的(例如图1-5中所示的)一种或多种甲醇代谢酶生产化学品(如己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺和其中间体)的氧化还原、能量和碳源。在大多数生产宿主中,通过采用甲醇脱氢酶(图5,步骤A(也见图1,步骤J))连同用于甲醛同化的途径,甲醇可以进入中心新陈代谢。可以利用从甲醇氧化生产的甲醛的一种示例性FAP如图5中所示,其涉及甲醛和5-磷酸-D-核酮糖的缩合以通过H6P合酶形成H6P(图5,步骤B(也见图3,步骤A))。为了最大活性,该酶可以使用Mg2+或Mn2+,虽然其他的金属离子是有用的以及甚至非金属离子依赖性机制被考虑到。H6P通过6-磷酸-3-己酮糖异构酶被转化为F6P(图5,步骤C(也见图3,步骤B))。涉及对从甲醇氧化生产的甲醛的解毒和同化的另一示例性途径通过DHA继续进行。DHA合酶(图5,步骤D(也见图4,步骤A))是一种转酮醇酶,其首先将甘油醛基团从-5-磷酸木酮糖转移到甲醛,导致DHA和-3-磷酸甘油醛(G3P)(其是糖酵解中的中间体)的形成。从DHA合酶获得的DHA然后可以进一步被磷酸化以通过DHA激酶形成DHAP。DHAP可以,如经由异构化为G3P被同化为糖酵解和若干其他的途径。替代性地,DHA和G3P可以通过F6P醛缩酶被转化以形成F6P。
通过组合用于甲醇氧化(图5,步骤A(也见图1,步骤J))和甲醛同化(本文也称为甲醛固定)(图5,步骤B和C(也见图3,步骤A和B)或图5,步骤D(也见图4,步骤A))的途径,可以实现针对己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺及其中间体的产品/mol甲醇的改善的摩尔收率。
可以使用图5中所示的甲酸再利用(本文也称为甲酸同化)途径的一种,通过捕获途径中间体的转化(如丙酮酸到乙酰基-CoA)中损失的一些碳,进一步增加若干底物(包含甲醇)上的收率。例如,通过丙酮酸到乙酰基-CoA的转化(图5,步骤R)生成的CO2可以经由甲酸脱氢酶被转化为甲酸(图5,步骤S)。替代性地,直接形成甲酸而非CO2的丙酮酸甲酸裂解酶可以被用来将丙酮酸转化为乙酰基-CoA(图5,步骤Q)。甲酸可以通过使用如下被转化为甲醛:1)甲酸还原酶(图5,步骤E);2)甲酰基-CoA合成酶、转移酶或连接酶连同甲酰基-CoA还原酶(图5,步骤F-G);或3)甲酰四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环水解酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和甲醛形成酶(图5,步骤H-I-J-K)。替代性地,亚甲基-THF到甲醛的转化将自发地发生。替代性地,甲酸可以通过分别使用图5,步骤H-I-J-L-M-N或图5,步骤H-I-J-O-P将其转化为丙酮酸或乙酰基-CoA而被再利用。当甲酸是外部的碳源时,甲酸再利用还是有用的。例如,甲酸可以从CO2到甲酸的有机催化、电化学或光电化学转化中获得。用于本申请方法的替代性甲醇源是CO2到甲醇的有机催化、电化学或光电化学转化。通过组合用于甲醇氧化(图5,步骤A)、甲醛同化(图5,步骤B和C或步骤D)和甲酸再利用的途径,可以实现针对己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的甚至更高的mol产品/mol甲醇摩尔收率。通过组合用于甲醛同化和甲酸再利用的途径,附加底物上的收率增加也是可得的,包含但不限于葡萄糖、甘油、蔗糖、果糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖。
在众多工程途径中,还原当量不足或还原当量消耗为副产物阻碍了基于碳水化合物原料的最大产品收率的实现。甲醇是一种相对廉价的有机原料,其可以被用来通过采用如图1中所示的一种或多种甲醇代谢酶而生成还原当量。还原当量也可以通过分别采用酶类——氢化酶和一氧化碳脱氢酶而从氢和一氧化碳中提取。该还原当量然后被传送到受体,如被氧化的铁氧化还原蛋白、被氧化的醌类、被氧化的细胞色素、NAD(P)+、水或过氧化氢,以分别形成被还原的铁氧化还原蛋白、被还原的醌类、被还原的细胞色素、NAD(P)H、H2或水。被还原的铁氧化还原蛋白、被还原的醌类和NAD(P)H是特别有用的,因为它们可以作为用于各种Wood-Ljungdahl途径、还原TCA循环或产品途径酶的氧化还原载体。通过甲醇、氢和一氧化碳的新陈代谢生产的还原当量可以被用来为若干己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径提供动力。在一些实施方式中,由通过一种或多种该MMP的甲醇的新陈代谢生产的还原当量然后可以被用来为,例如,图2中所示的葡萄糖到己二酸、6-ACA、HMDA和己内酰胺生产途径提供动力。
合成被还原的发酵产品(如己二酸、6-ACA、HMDA和己内酰胺)的微生物细胞的每C-mol底物的产品收率受碳水化合物原料中不足的还原当量的限制。还原当量或电子可以通过使用图1所述的一种或多种酶而从甲醇中提取。该还原当量然后被传送到受体,如被氧化的铁氧化还原蛋白、被氧化的醌类、被氧化的细胞色素、NAD(P)+、水或过氧化氢,以分别形成被还原的铁氧化还原蛋白、被还原的醌类、被还原的细胞色素、NAD(P)H、H2或水。被还原的铁氧化还原蛋白、被还原的醌类和NAD(P)H是特别有用的,因为它们可以作为用于各种Wood-Ljungdahl途径、还原TCA循环或产品途径酶的氧化还原载体。
显示了关于从甲醇到额外的氧化还原可用性如何可以改善被还原的产品(如己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺)的收率的具体实施例。
经由图2中所示的途径,补充有该氧化TCA循环的反应(如柠檬酸合酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶)的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的最大理论收率是1.09mol/mol。
1 C6H12O6→1.09 C4H10O2+1.64 CO2+0.55 H2O
当糖和甲醇两种原料均是可用的时,甲醇可以被利用以通过采用图1中所示的一种或多种酶生成还原当量。从甲醇生成的还原当量可以被利用以为,如图2中所示的葡萄糖到己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产途径提供动力。理论上,将保存葡萄糖中的全部碳,因此导致最大理论收率,以如图2中所示,在有氧或厌氧的条件下按2mol己二酸/mol葡萄糖从葡萄糖生产己二酸:
10 CH3OH+3 C6H12O6=6 C4H10O2+8 H2O+4 CO2
以类似的方式,6-ACA、HMDA或己内酰胺的最大理论收率可以使用图1和2中所示的反应,达到2mol/mol葡萄糖。
C6H12O6+0.667 CH3OH+1.333 CO2→2 C4H6O4+1.333 H2O
C6H12O6+2 CH3OH→2 C4H8O3+2 H2O
示例性通量分布可以证实从葡萄糖和甘油到己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的最大理论收率如何可以通过实现甲醛的同化,甲酸再利用和还原当量从外部源(如氢)的提取得以增加。组合用于甲醛同化、甲酸再利用、还原当量提取和产品合成的途径使得葡萄糖和甘油上己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的最大理论收率化学计量学成为可能。在某些实施方式中,实现这类最大收率化学计量学可能需要还原当量的一些氧化(如,H2+1/2O2→H2O,CO+1/2O2→CO2,CH4O+1.5O2→CO2+2H2O,C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O)以为底物到产品途径提供足以运行的能量。然而,如果有足够的还原当量可用,实现用于甲醛同化、甲酸再利用、还原当量提取和产品合成的途径甚至可以导致直接从CO2到己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺及其中间体的生产。
本文提供的途径,以及尤其是本文展示的具体组合中所示范的途径,优于部分地基于申请人的途径分级的其他途径,该分级基于包含如下的特性:最大理论己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺收率;最大碳通量;最大还原当量产量;最小CO2产量;途径长度;非天然步骤数量;热力学可行性;作用于途径底物或结构上类似的底物,以及具有用目前表征的酶的步骤的酶的数量,以及进一步地,后者途径通过,除了需要最少数量的非天然步骤之外,还具有已知作用于途径底物或结构上类似的底物的大多数酶,以及来自中心新陈代谢的最少的步骤总数,甚而更受偏爱。
在第一个方面,本文提供一种具有MMP的NNOMO,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性。在其他的实施方式中,该MMPE以足够的量被表达以将甲醇转化为甲醛。在某些实施方式中,该MMP包括选自如下的一种或多种酶:EM1;EM2;EM3;EM4;EM5;EM6;EM15;EM16;EM8;EM9;EM10;EM11;EM12;EM13;以及EM14。这类生物体,在某些实施方式中,有利地顾及还原当量的生产,该生物体然后可以使用本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP的任一种,将该还原当量用于己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生产。
在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N和1O其任何组合,其中1A是EM1;1B是EM2;1C是EM3;1D是EM4;1E是EM5;1F是EM6;1G是EM15;1H是EM16,1I是EM8;1J是EM9;1K是EM10;1L是EM11;1M是EM12;1N是EM13;以及1O是EM14。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
在一种实施方式中,该MMP包括1A。在另一实施方式中,该MMP包括1B。在另一实施方式中,该MMP包括1C。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1D。在一种实施方式中,该MMP包括1E。在另一实施方式中,该MMP包括1F。在另一实施方式中,该MMP包括1G。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1H。在一种实施方式中,该MMP包括1I。在另一实施方式中,该MMP包括1J。在另一实施方式中,该MMP包括1K。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1L。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1M。在另一实施方式中,该MMP包括1N。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1O。两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种或十五种MMPE 1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N和1O的任何组合也被考虑到。
在一些实施方式中,该MMP是图1中所描述的MMP。
在一个方面,本文提供一种具有MMP的NNOMO,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性,其中所述MMP包括:(i)1A和1B、(ii)1J;或(iii)1J和1K。在一种实施方式中,该MMP包括1A和1B。在另一实施方式中,该MMP包括1J。在一种实施方式中,该MMP包括1J和1K。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D和1E。在一些实施方式。该MMP包括1A、1B、1C、1D和1F。在一些实施方式中,该MMP包括1J、1C、1D和1E。在一种实施方式中,该MMP包括1J、1C、1D和1F。在另一实施方式中,该MMP包括1J和1L。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1J、1M、1N和1O。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1N和1O。在一些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E。在一种实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
在某些实施方式中,该MMP包括1I。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1I。在一些实施方式。该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1I。在一些实施方式中,该MMP包括1J、1C、1D、1E和1I。在一种实施方式中,该MMP包括1J、1C、1D、1F和1I。在另一实施方式中,该MMP包括1J、1L和1I。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1N、1O和1I。在一些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I。在一种实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
在某些实施方式中,该MMP包括1G。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1G。在一些实施方式。该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1G。在一些实施方式中,该MMP包括1J、1C、1D、1E和1G。在一种实施方式中,该MMP包括1J、1C、1D、1F和1G。在另一实施方式中,该MMP包括1J、1L和1G。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G。在某些实施方式中,该MMP包括1J,1N,1O和1G。在一些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G。在一种实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
在某些实施方式中,该MMP包括1G和1H。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H。在一些实施方式。该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H。在一些实施方式中,该MMP包括1J、1C、1D、1E、1G和1H。在一种实施方式中,该MMP包括1J、1C、1D、1F、1G和1H。在另一实施方式中,该MMP包括1J、1L、1G和1H。在仍然另一实施方式中,该MMP包括1J、1M、1N、1O、1G和1H。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1N、1O、1G和1H。在一些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H。在一种实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
在某些实施方式中,从甲醛到5-羟甲基谷胱甘肽的形成是自发的(见,如图1,步骤M)。在一些实施方式中,从甲醛到5-羟甲基谷胱甘肽的形成通过EM12催化(见,如图1,步骤M)。在某些实施方式中,从甲醛到亚甲基-THF的形成是自发的(见,如图1,步骤K)。在某些实施方式中,从甲醛到亚甲基-THF的形成通过EM10催化(见,如图1,步骤K)。
在某些实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体包括两种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体包括三种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体包括四种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体包括五种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体包括六种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体包括七种外源性核酸,每种均编码MMPE。
包括MMP以及经设计以包括MMPE(如本文提供的那些)的任何非天然存在的真核生物可以经设计以进一步包括一种或多种AdiPE、6-ACAPE、HMDAPE或CapPE。这类生物体可以进一步经设计以包括如本文所提供的,FAP、FRP或FAP和FRP两者。
在一种实施方式中,该NNOMO进一步包括AdiP,其中所述生物体包括编码AdiPE的至少一种外源性核酸,该AdiPE以足够的量被表达以生产己二酸。在某些实施方式中,该AdiPE选自EA1、EA2、EA3、EA4、EA11A、EA11B、EA11C和EA11D。
在另一实施方式中,该NNOMO进一步包括6-ACAP,其中所述生物体包括编码6-ACAPE的至少一种外源性核酸,该6-ACAPE以足够的量被表达以生产6-ACA。在某些实施方式中,该6-ACAPE选自EA1、EA2、EA3、EA4、EA5、EA6A和EA6B。
在一种实施方式中,该NNOMO进一步包括HMDAP,其中所述生物体包括编码HMDAPE的至少一种外源性核酸,该HMDAPE以足够的量被表达以生产HMDA。在某些实施方式中,该HMDAPE选自EA1、EA2、EA3、EA4、EA5、EA6A、EA6B、EA7A、EA7B、EA9、EA10A和EA10B。
在其他的实施方式中,该NNOMO具有CapP,其中所述生物体包括编码CapPE的至少一种外源性核酸,该CapPE以足够的量被表达以生产己内酰胺。在某些实施方式中,该CapPE选自EA1、EA2、EA3、EA4、EA5、EA6A、EA6B、EA7A和EA7B。在其他的实施方式中,该CapPE选自EA1、EA2、EA3、EA4、EA5、EA6A、EA6B和EA8。
在一些实施方式中,具有己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径的该NNOMO包含AdiPE、6-ACAPE、HMDAPE或CapPE组。
用于将从琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA到各种产品(如己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺)的途径设计进入微生物体的酶、基因和方法现在是本领域已知的,用于葡萄糖到磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸、草酰乙酸到琥珀酰CoA、磷酸烯醇丙酮酸到丙酮酸以及丙酮酸到乙酰基-CoA的转化的酶现在也是本领域已知的(见,如美国公开号2011/0201089和WO 2012/135789,以引用方式被整体并入本文)。AdiPE、6-ACAPE、HMDAPE或CapPE组表示可以如图2中所示,将琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA分别转化为己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的一群酶。当利用碳水化合物基原料时,从如本文所披露的MMP获得的附加还原当量改善了所有这些产品的收率。
用于琥珀酰-CoA或乙酰基CoA到己二酸的转化的示例性酶包含EA1(图2,步骤A)、EA2(图2,步骤B)、EA3(图2,步骤C)、EA4(图2,步骤D)、EA11A、EA11B、EA11C和EA11D(图2,步骤L)。
在一个方面,本文提供一种NNOMO,包括(1)MMP,其中所述生物体包括以足够的量编码MMPE,以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的至少一种外源性核酸;以及(2)AdiP,其中所述生物体包括编码AdiPE的至少一种外源性核酸,该AdiPE以足够的量被表达以生产己二酸。在一种实施方式中,编码该MMPE的该至少一种外源性核酸以足以增加由该非天然微生物体生产的己二酸的量的量,在甲醇的存在下,提高还原当量的可用性。在一些实施方式中,该MMP包括如上或本文其他处所述的MMPE的任何各种组合。
在某些实施方式中,(1)该MMP包括:1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合,其中1A是EM1;1B是EM2;1C是EM3;1D是EM4;1E是EM5;1F是EM6;1G是EM15;1H是EM16,1I是EM8;1J是EM9;1K是自发的或EM10;1L是EM11;1M是自发的或EM12;1N是EM13以及1O是EM14;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D或2L或其任何组合,其中2A是EA1;2B是EA2;2C是EA3;2D是EA4;以及2L是EA11A、EA11B、EA11C或EA11D。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2L是EA11A。在其他的实施方式中,2L是EA11B。在一些实施方式中,2L是EA11C。在另一实施方式中,2L是EA11D。
在一种实施方式中,该AdiP包括2A。在另一实施方式中,该AdiP包括2B。在实施方式中,该AdiP包括2C。在另一实施方式中,该AdiP包括2D。在另一实施方式中,该AdiP包括2L。两种、三种、四种或五种AdiPE2A、2B、2C、2D和2L的任何组合也被考虑到。在一些实施方式中,2L是EA11A。在其他的实施方式中,2L是EA11B。在一些实施方式中,2L是EA11C。在另一实施方式中,2L是EA11D。
在一些实施方式中,该MMP是图1中所描述的MMP,以及该AdiP是图2中所描述的AdiP。
根据图2,将琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA转化为己二酸的示例性AdiPE组包含2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,2L是EA11A。在其他的实施方式中,2L是EA11B。在一些实施方式中,2L是EA11C。在另一实施方式中,2L是EA11D。
在一种实施方式中,(1)该MMP包括1A和1B;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J和1K;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1E;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1F;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1E;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1F;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J和1L;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N和1O;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N和1O;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该AdiP包括2A、2B、2C、2D和2L。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2L是EA11A。在其他的实施方式中,2L是EA11B。在一些实施方式中,2L是EA11C。在另一实施方式中,2L是EA11D。
在一种实施方式中,该NNOMO包括(1)MMP,其包括1A和1B;1J;1J和1K;1A、1B、1C、1D和1E;1A、1B、1C、1D和1F;1J、1C、1D和1E;1J、1C、1D和1F;1J和1L;1J、1M、1N和1O;1J、1N和1O;1J、1K、1C、1D和1E;1J、1K、1C、1D和1F;1I;1A、1B、1C、1D、1E和1I;1A、1B、1C、1D、1F和1I;1J、1C、1D、1E和1I;1J、1C、1D、1F和1I;1J、1L和1I;1J、1M、1N、1O和1I;1J、1N、1O和1I;1J、1K、1C、1D、1E和1I;1J、1K、1C、1D、1F和1I;1G;1A、1B、1C、1D、1E和1G;1A、1B、1C、1D、1F和1G;1J、1C、1D、1E和1G;1J、1C、1D、1F和1G;1J、1L和1G;1J、1M、1N、1O和1G;1J、1N、1O和1G;1J、1K、1C、1D、1E和1G;1J、1K、1C、1D、1F和1G;1G和1H;1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;1J、1C、1D、1E、1G和1H;1J、1C、1D、1F、1G和1H;1J、1L、1G和1H;1J、1M、1N、1O、1G和1H;1J、1N、1O、1G和1H;1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;或1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)AdiP。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
本文提供的任何MMP可以组合本文提供的任何AdiP。
在某些实施方式中,该AdiP进一步包括图5中所描述的酶。在一种实施方式中,该AdiP进一步包括5T、5U、5V、5W和/或5X,其中5T是PEP羧化酶(EFR16A)或PEP羧基激酶(EFR16B);5U是丙酮酸羧化酶(EFR17);5V是苹果酸脱氢酶(EFR18);5W是苹果酸酶(EFR19);以及5X是富马酸酶(EFR20A)、富马酸还原酶(EFR20B)、琥珀酰-CoA合成酶(EFR20C)、琥珀酰-CoA连接酶(EFR20D)或琥珀酰-CoA转移酶(EFR20E)。在一种实施方式中,该AdiP包括5T。在另一实施方式中,该AdiP包括5U。在另一实施方式中,该AdiP包括5V。在其他的实施方式中,该AdiP包括5W。在另一实施方式中,该AdiP包括5X。在另一实施方式中,该AdiP包括5Y。在一些实施方式中,该AdiP包括5T、5V和5X。在另一实施方式中,该AdiP包括5U、5V和5X。在另一实施方式中,该AdiP包括5W和5X。在一种实施方式中,5T是EFR16A。在其他的实施方式中,5T是EFR16B。在一些实施方式中,5X是EFR20A。在其他的实施方式中,5X是EFR20B。在其他的实施方式中,5X是EFR20C。在一种实施方式中,5X是EFR20D。在另一实施方式中,5X是EFR20E。
用于琥珀酰-CoA或乙酰基CoA到6-ACA的转化的示例性酶包含EA1(图2,步骤A)、EA2(图2,步骤B)、EA3(图2,步骤C)、EA4(图2,步骤D)、EA5(图2,步骤E)和EA6A或EA6B(图2,步骤F)。
在另一方面,本文提供一种NNOMO,包括(1)MMP,其中所述生物体包括以足够的量编码MMPE,以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的至少一种外源性核酸;以及(2)6-ACAP,其中所述生物体包括编码6-ACAPE的至少一种外源性核酸,该6-ACAPE以足够的量被表达以生产6-ACA。在一种实施方式中,编码该MMPE的该至少一种外源性核酸以足以增加由该非天然微生物体生产的6-ACA的量的量,在甲醇的存在下,提高还原当量的可用性。在一些实施方式中,该MMP包括如上或本文其他处所述的MMPE的任何各种组合。
在某些实施方式中,(1)该MMP包括:1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合,其中1A是EM1;1B是EM2;1C是EM3;1D是EM4;1E是EM5;1F是EM6;1G是EM15;1H是EM16,1I是EM8;1J是EM9;1K是自发的或EM10;1L是EM11;1M是自发的或EM12;1N是EM13以及1O是EM14;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E或2F或其任何组合,其中2A是EA1;2B是EA2;2C是EA3;2D是EA4;2E是EA5以及2F是EA6A或EA6B。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2F是EA6A。在其他的实施方式中,2F是EA6B。
在一种实施方式中,该6-ACAP包括2A。在另一实施方式中,该6-ACAP包括2B。在实施方式中,该6-ACAP包括2C。在另一实施方式中,该6-ACAP包括2D。在一种实施方式中,该6-ACAP包括2E。在仍然另一实施方式中,该6-ACAP包括2F。两种、三种、四种、五种或六种6-ACAPE 2A、2B、2C、2D、2E和2F的任何组合也被考虑到。
在一些实施方式中,该MMP是图1中所描述的MMP,以及该6-ACAP是图2中所描述的6-ACAP。
根据图2,将琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA转化为6-ACA的示例性6-ACAPE组包含2A、2B、2C、2D、2E和2F。
在一种实施方式中,(1)该MMP包括1A和1B;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J和1K;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1E;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1F;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1E;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1F;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J和1L;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N和1O;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N和1O;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该6-ACAP包括2A、2B、2C、2D、2E和2F。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2F是EA6A。在其他的实施方式中,2F是EA6B。
在一种实施方式中,该NNOMO包括(1)MMP,其包括1A和1B;1J;1J和1K;1A、1B、1C、1D和1E;1A、1B、1C、1D和1F;1J、1C、1D和1E;1J、1C、1D和1F;1J和1L;1J、1M、1N和1O;1J、1N和1O;1J、1K、1C、1D和1E;1J、1K、1C、1D和1F;1I;1A、1B、1C、1D、1E和1I;1A、1B、1C、1D、1F和1I;1J、1C、1D、1E和1I;1J、1C、1D、1F和1I;1J、1L和1I;1J、1M、1N、1O和1I;1J、1N、1O和1I;1J、1K、1C、1D、1E和1I;1J、1K、1C、1D、1F和1I;1G;1A、1B、1C、1D、1E和1G;1A、1B、1C、1D、1F和1G;1J、1C、1D、1E和1G;1J、1C、1D、1F和1G;1J、1L和1G;1J、1M、1N、1O和1G;1J、1N、1O和1G;1J、1K、1C、1D、1E和1G;1J、1K、1C、1D、1F和1G;1G和1H;1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;1J、1C、1D、1E、1G和1H;1J、1C、1D、1F、1G和1H;1J、1L、1G和1H;1J、1M、1N、1O、1G和1H;1J、1N、1O、1G和1H;1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;或1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)6-ACAP。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
本文提供的任何MMP可以组合本文提供的任何6-ACAP。
在某些实施方式中,该6-ACAP进一步包括图5中所描述的酶。在一种实施方式中,该6-ACAP进一步包括5T、5U、5V、5W和/或5X,其中5T是PEP羧化酶(EFR16A)或PEP羧基激酶(EFR16B);5U是丙酮酸羧化酶(EFR17);5V是苹果酸脱氢酶(EFR18);5W是苹果酸酶(EFR19);以及5X是富马酸酶(EFR20A)、富马酸还原酶(EFR20B)、琥珀酰-CoA合成酶(EFR20C)、琥珀酰-CoA连接酶(EFR20D)或琥珀酰-CoA转移酶(EFR20E)。在一种实施方式中,该6-ACAP包括5T。在另一实施方式中,该6-ACAP包括5U。在另一实施方式中,该6-ACAP包括5V。在其他的实施方式中,该6-ACAP包括5W。在另一实施方式中,该6-ACAP包括5X。在另一实施方式中,该6-ACAP包括5Y。在一些实施方式中,该6-ACAP包括5T、5V和5X。在另一实施方式中,该6-ACAP包括5U、5V和5X。在另一实施方式中,该6-ACAP包括5W和5X。在一种实施方式中,5T是EFR16A。在其他的实施方式中,5T是EFR16B。在一些实施方式中,5X是EFR20A。在其他的实施方式中,5X是EFR20B。在其他的实施方式中,5X是EFR20C。在一种实施方式中,5X是EFR20D。在另一实施方式中,5X是EFR20E。
用于将琥珀酰-CoA或乙酰基CoA转化为HMDA的示例性酶包含EA1(图2,步骤A)、EA2(图2,步骤B)、EA3(图2,步骤C)、EA4(图2,步骤D)、EA5(图2,步骤E)和EA6A或EA6B(图2,步骤F)、EA7A或EA7B(图2,步骤G)、EA9(图2,步骤J)和EA10A或EA10B(图2,步骤K)。
在另一方面,本文提供一种NNOMO,包括(1)MMP,其中所述生物体包括以足够的量编码MMPE,以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的至少一种外源性核酸;以及(2)HMDAP,其中所述生物体包括编码HMDAPE的至少一种外源性核酸,该HMDAPE以足够的量被表达以生产HMDA。在一种实施方式中,编码该MMPE的该至少一种外源性核酸以足以增加由该非天然微生物体生产的HMDA的量的量,在甲醇的存在下,提高还原当量的可用性。在一些实施方式中,该MMP包括如上或本文其他处所述的MMPE的任何各种组合。
在某些实施方式中,(1)该MMP包括:1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合,其中1A是EM1;1B是EM2;1C是EM3;1D是EM4;1E是EM5;1F是EM6;1G是EM15;1H是EM16,1I是EM8;1J是EM9;1K是自发的或EM10;1L是EM11;1M是自发的或EM12;1N是EM13以及1O是EM14;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J或2K或其任何组合,其中2A是EA1;2B是EA2;2C是EA3;2D是EA4;2E是EA5以及2F是EA6A或EA6B;2G是EA7A或EA7B;2J是EA9;2K是EA10A或EA10B。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2F是EA6A。在其他的实施方式中,2F是EA6B。在一些实施方式中,2G是EA7A。在其他的实施方式中,2G是EA7B。在一些实施方式中,2K是EA10A。在其他的实施方式中,2K是EA10B。
在一种实施方式中,该HMDAP包括2A。在另一实施方式中,该HMDAP包括2B。在实施方式中,该HMDAP包括2C。在另一实施方式中,该HMDAP包括2D。在一种实施方式中,该HMDAP包括2E。在仍然另一实施方式中,该HMDAP包括2F。在另一实施方式中,该HMDAP包括2G。在一种实施方式中,该HMDAP包括2J。在仍然另一实施方式中,该HMDAP包括2K。两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种HMDAPE2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K的任何组合也被考虑到。
在一些实施方式中,该MMP是图1中所描述的MMP,以及该HMDAP是图2中所描述的HMDAP。
根据图2,将琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA转化为HMDA的示例性HMDAPE组包含2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。
在一种实施方式中,(1)该MMP包括1A和1B;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J和1K;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1E;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1F;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1E;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1F;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J和1L;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N和1O;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N和1O;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该HMDAP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2J和2K。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2F是EA6A。在其他的实施方式中,2F是EA6B。在一些实施方式中,2G是EA7A。在其他的实施方式中,2G是EA7B。在一些实施方式中,2K是EA10A。在其他的实施方式中,2K是EA10B。
在一种实施方式中,该NNOMO包括(1)MMP,其包括1A和1B;1J;1J和1K;1A、1B、1C、1D和1E;1A、1B、1C、1D和1F;1J、1C、1D和1E;1J、1C、1D和1F;1J和1L;1J、1M、1N和1O;1J、1N和1O;1J、1K、1C、1D和1E;1J、1K、1C、1D和1F;1I;1A、1B、1C、1D、1E和1I;1A、1B、1C、1D、1F和1I;1J、1C、1D、1E和1I;1J、1C、1D、1F和1I;1J、1L和1I;1J、1M、1N、1O和1I;1J、1N、1O和1I;1J、1K、1C、1D、1E和1I;1J、1K、1C、1D、1F和1I;1G;1A、1B、1C、1D、1E和1G;1A、1B、1C、1D、1F和1G;1J、1C、1D、1E和1G;1J、1C、1D、1F和1G;1J、1L和1G;1J、1M、1N、1O和1G;1J、1N、1O和1G;1J、1K、1C、1D、1E和1G;1J、1K、1C、1D、1F和1G;1G和1H;1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;1J、1C、1D、1E、1G和1H;1J、1C、1D、1F、1G和1H;1J、1L、1G和1H;1J、1M、1N、1O、1G和1H;1J、1N、1O、1G和1H;1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;或1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)HMDAP。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
本文提供的任何MMP可以组合本文提供的任何HMDAP。
在某些实施方式中,该HMDAP进一步包括图5中所描述的酶。在一种实施方式中,该HMDAP进一步包括5T、5U、5V、5W和/或5X,其中5T是PEP羧化酶(EFR16A)或PEP羧基激酶(EFR16B);5U是丙酮酸羧化酶(EFR17);5V是苹果酸脱氢酶(EFR18);5W是苹果酸酶(EFR19);以及5X是富马酸酶(EFR20A)、富马酸还原酶(EFR20B)、琥珀酰-CoA合成酶(EFR20C)、琥珀酰-CoA连接酶(EFR20D)或琥珀酰-CoA转移酶(EFR20E)。在一种实施方式中,该HMDAP包括5T。在另一实施方式中,该HMDAP包括5U。在另一实施方式中,该HMDAP包括5V。在其他的实施方式中,该HMDAP包括5W。在另一实施方式中,该HMDAP包括5X。在另一实施方式中,该HMDAP包括5Y。在一些实施方式中,该HMDAP包括5T、5V和5X。在另一实施方式中,该HMDAP包括5U、5V和5X。在另一实施方式中,该HMDAP包括5W和5X。在一种实施方式中,5T是EFR16A。在其他的实施方式中,5T是EFR16B。在一些实施方式中,5X是EFR20A。在其他的实施方式中,5X是EFR20B。在其他的实施方式中,5X是EFR20C。在一种实施方式中,5X是EFR20D。在另一实施方式中,5X是EFR20E。
用于琥珀酰-CoA或乙酰基CoA到己内酰胺的转化的示例性酶包含EA1(图2,步骤A)、EA2(图2,步骤B)、EA3(图2,步骤C)、EA4(图2,步骤D)、EA5(图2,步骤E)和EA6A或EA6B(图2,步骤F)、EA7A或EA7B(图2,步骤G),以及该途径可以可选地包含自发的环化作用(图2,步骤I)。其他的用于琥珀酰-CoA或乙酰基CoA到己内酰胺的转化的示例性酶包含EA1(图2,步骤A)、EA2(图2,步骤B)、EA3(图2,步骤C)、EA4(图2,步骤D)、EA5(图2,步骤E)和EA6A或EA6B(图2,步骤F)、EA7A或EA7B(图2,步骤G)、EA8(图2,步骤H)。
在另一方面,本文提供一种NNOMO,包括(1)MMP,其中所述生物体包括以足够的量编码MMPE,以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的至少一种外源性核酸;以及(2)CapP,其中所述生物体包括编码CapPE的至少一种外源性核酸,该CapPE以足够的量被表达以生产己内酰胺。在一种实施方式中,编码该MMPE的该至少一种外源性核酸以足以增加由该非天然微生物体生产的己内酰胺的量的量,在甲醇的存在下提高还原当量的可用性。在一些实施方式中,该MMP包括如上或本文其他处所述的MMPE的任何各种组合。
在某些实施方式中,(1)该MMP包括:1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合,其中1A是EM1;1B是EM2;1C是EM3;1D是EM4;1E是EM5;1F是EM6;1G是EM15;1H是EM16,1I是EM8;1J是EM9;1K是自发的或EM10;1L是EM11;1M是自发的或EM12;1N是EM13以及1O是EM14;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G或2H或其任何组合,其中2A是EA1;2B是EA2;2C是EA3;2D是EA4;2E是EA5以及2F是6-氨基己酸酯转氨酶或6-氨基己酸酯脱氢酶;2G是EA7A或EA7B;以及2H是EA8。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2F是6-氨基己酸酯转氨酶。在其他的实施方式中,2F是6-氨基己酸酯脱氢酶。在一些实施方式中,2G是EA7A。在一种实施方式中,2G是EA7A。在另一实施方式中,2G是EA7B。
在一种实施方式中,该CapP包括2A。在另一实施方式中,该CapP包括2B。在实施方式中,该CapP包括2C。在另一实施方式中,该CapP包括2D。在一种实施方式中,该CapP包括2E。在另一实施方式中,该CapP包括2F。在另一实施方式中,该CapP包括2G。在一种实施方式中,该CapP包括2H。在一种实施方式中,该CapP包括2H。两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种CapPE 2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G和2H的任何组合也被考虑到。
在一些实施方式中,该MMP是图1中所描述的MMP,以及该CapP是图2中所描述的CapP。
根据图2,将琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA转化为己内酰胺的示例性CapPE组包含(i)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G;以及(ii)2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。
在一种实施方式中,(1)该MMP包括1A和1B;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J和1K;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1E;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1F;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1E;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1F;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J和1L;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N和1O;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N和1O;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2G。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2F是6-氨基己酸酯转氨酶。在其他的实施方式中,2F是6-氨基己酸酯脱氢酶。在一些实施方式中,2G是EA7A。在一种实施方式中,2G是EA7A。在另一实施方式中,2G是EA7B。在一些实施方式中,该途径包含自发的环化作用以将6-氨基己酰基-CoA转化为己内酰胺(图2,步骤I)。
在一种实施方式中,(1)该MMP包括1A和1B;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J和1K;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1E;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D和1F;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1E;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1F;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J和1L;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N和1O;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N和1O;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该CapP包括2A、2B、2C、2D、2E、2F和2H。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,2F是6-氨基己酸酯转氨酶。在其他的实施方式中,2F是6-氨基己酸酯脱氢酶。
在一种实施方式中,该NNOMO包括(1)MMP,其包括1A和1B;1J;1J和1K;1A、1B、1C、1D和1E;1A、1B、1C、1D和1F;1J、1C、1D和1E;1J、1C、1D和1F;1J和1L;1J、1M、1N和1O;1J、1N和1O;1J、1K、1C、1D和1E;1J、1K、1C、1D和1F;1I;1A、1B、1C、1D、1E和1I;1A、1B、1C、1D、1F和1I;1J、1C、1D、1E和1I;1J、1C、1D、1F和1I;1J、1L和1I;1J、1M、1N、1O和1I;1J、1N、1O和1I;1J、1K、1C、1D、1E和1I;1J、1K、1C、1D、1F和1I;1G;1A、1B、1C、1D、1E和1G;1A、1B、1C、1D、1F和1G;1J、1C、1D、1E和1G;1J、1C、1D、1F和1G;1J、1L和1G;1J、1M、1N、1O和1G;1J、1N、1O和1G;1J、1K、1C、1D、1E和1G;1J、1K、1C、1D、1F和1G;1G和1H;1A、1B、1C、1D、1E、1G和1H;1A、1B、1C、1D、1F、1G和1H;1J、1C、1D、1E、1G和1H;1J、1C、1D、1F、1G和1H;1J、1L、1G和1H;1J、1M、1N、1O、1G和1H;1J、1N、1O、1G和1H;1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;或1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)CapP。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
本文提供的任何MMP可以组合本文提供的任何CapP。
在某些实施方式中,该CapP进一步包括图5中所描述的酶。在一种实施方式中,该CapP进一步包括5T、5U、5V、5W和/或5X,其中5T是PEP羧化酶(EFR16A)或PEP羧基激酶(EFR16B);5U是丙酮酸羧化酶(EFR17);5V是苹果酸脱氢酶(EFR18);5W是苹果酸酶(EFR19);以及5X是富马酸酶(EFR20A)、富马酸还原酶(EFR20B)、琥珀酰-CoA合成酶(EFR20C)、琥珀酰-CoA连接酶(EFR20D)或琥珀酰-CoA转移酶(EFR20E)。在一种实施方式中,该CapP包括5T。在另一实施方式中,该CapP包括5U。在另一实施方式中,该CapP包括5V。在其他的实施方式中,该CapP包括5W。在另一实施方式中,该CapP包括5X。在另一实施方式中,该CapP包括5Y。在一些实施方式中,该CapP包括5T、5V和5X。在另一实施方式中,该CapP包括5U、5V和5X。在另一实施方式中,该CapP包括5W和5X。在一种实施方式中,5T是EFR16A。在其他的实施方式中,5T是EFR16B。在一些实施方式中,5X是EFR20A。在其他的实施方式中,5X是EFR20B。在其他的实施方式中,5X是EFR20C。在一种实施方式中,5X是EFR20D。在另一实施方式中,5X是EFR20E。
本文还提供示例性途径,其将从甲醇氧化生产的甲醛(如图1中所提供,步骤J)用于可以被用于生物质的形成的某些中心代谢途径的中间体的形成。可以利用从甲醇氧化生产的甲醛(如图1中所提供)的一种示例性FAP如图3中所示,其涉及甲醛和5-磷酸-D-核酮糖的缩合以通过EF1形成H6P(图3,步骤A)。为了最大活性,该酶可以使用Mg2+或Mn2+,虽然其他的金属离子是有用的以及甚至非金属离子依赖性机制被考虑到。H6p通过EF2被转化为F6P(图3,步骤B)。涉及对从甲醇氧化生产的甲醛(如图1中所提供)的解毒和同化的另一示例性途径如图4中所示以及通过DHA继续进行。EF3是一种特殊的转酮醇酶,其首先将甘油醛基团从-5-磷酸木酮糖转移到甲醛,导致DHA和-3-磷酸甘油醛(G3P)(其是糖酵解中的中间体)的形成(图4,步骤A)。从DHA合酶获得的DHA然后可以进一步被磷酸化以通过EF4形成DHAP(图4,步骤B)。DHAP可以被同化进入糖酵解和若干其他的途径。图3和4中提供的途径显示,碳被同化,参与最终产品,而非将甲醛转化为甲酸和CO2废气。
在某些实施方式中,该FAP包括EF1和EF2。在其他的实施方式中,该FAP包括EF3。在其他的实施方式中,该FAP包括EF3和EF4。在一些实施方式中,该FAP包括EF1、EF2和EF3。在其他的实施方式中,该FAP包括EF1、EF2、EF3和EF4。本文提供的这类FAP(以及FAPE)可以与本文提供的任何AdiP、6-ACAP、HMDAP、CapP、MMP或FRP组合使用。
因此,在一种实施方式中,单独具有如本文所提供的MMP或组合己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径的生物体进一步包括FAP,其将如从甲醇的氧化中获得的甲醛用于形成可以被用于,例如生物质的形成的某些中心代谢途径的中间体。在一些实施方式中,该FAP包括3A或3B,其中3A是EF1以及3B是EF2。在其他的实施方式中,该FAP包括4A或4B,其中4A是EF3以及4B是EF4。
在某些实施方式中,本文提供一种具有MMP的NNOMO,其中所述生物体包括编码EM9(1J)的至少一种外源性核酸,该EM9以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性和/或以足够的量被表达以将甲醇转化为甲醛。在一些实施方式中,该生物体包括编码EM9的至少一种外源性核酸,该EM9以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性。在其他的实施方式中,该生物体包括编码EM9的至少一种外源性核酸,该EM9以足够的量被表达以将甲醇转化为甲醛。在一些实施方式中,该微生物体进一步包括FAP。在某些实施方式中,该生物体进一步包括编码FAPE的至少一种外源性核酸,该FAPE以足够的量被表达以生产糖酵解的中间体和/或可以被用于,例如生物质的形成的代谢途径的中间体。在某些实施方式中,该FAPE选自EF1(3A)、EF2(3B)、EF3(4A)和EF4(4B)。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。在一些实施方式中,该NNOMO进一步包括FRP。
在一些实施方式中,编码EM9的外源性核酸以足够的量被表达以在培养基或细胞内,生产大于或等于1μM、10μM、20μM或50μM或其范围的量的甲醛。在其他的实施方式中,编码EM9的外源性核酸能够在培养基或细胞内,生产大于或等于1μM、10μM、20μM或50μM或其范围的量的甲醛。在一些实施方式中,该范围从1μM到50μM或更大。在其他的实施方式中,该范围从10μM到50μM或更大。在其他的实施方式中,该范围从20μM到50μM或更大。在其他的实施方式中,甲醛生产的量是50μM或更大,例如,55mM、60μM、65mM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM或100μM。在具体的实施方式中,甲醛生产的量超过阴性对照(如不包括该外源性核酸的同种类生物体(如野生型微生物体或其对照微生物体))的量或与其形成对比。在某些实施方式中,该EM9选自本文提供的那些,例如,如实施例I中所示范(见图1,步骤J)。在某些实施方式中,甲醛生产的量通过全细胞测定法,如实施例I中所提供的测定法(见图1,步骤J)或通过本文提供的或本领域另外已知的另一测定法确定。在某些实施方式中,该全细胞中缺乏甲醛利用活性。
在某些实施方式中,编码EM9的外源性核酸以足够的量被表达以在培养基或细胞内生产至少1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、15X、20X、30X、40X、50X、100X或更多倍的甲醛。在其他的实施方式中,编码EM9的外源性核酸能够在培养基或细胞内生产至少1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、15X、20X、30X、40X、50X、100X或其范围的量的甲醛。在一些实施方式中,该范围从1X到100X。在其他的实施方式中,该范围从2X到100X。在其他的实施方式中,该范围从5X到100X。在其他的实施方式中,该范围从10X到100X。在其他的实施方式中,该范围从50X到100X。在一些实施方式中,甲醛生产的量是至少20X。在其他的实施方式中,甲醛生产的量是至少50X。在具体的实施方式中,甲醛生产的量超过阴性对照(如不包括该外源性核酸的同种类生物体(如野生型微生物体或其对照微生物体))的量或与其形成对比。在某些实施方式中,该EM9选自本文提供的那些,例如,如实施例I中所示范(见图1,步骤J)。在某些实施方式中,甲醛生产的量通过全细胞测定法,如实施例I中所提供的测定法(见图1,步骤J)或通过本文提供的或本领域另外已知的另一测定法确定。在某些实施方式中,该全细胞中缺乏甲醛利用活性。
在一个方面,本文提供一种NNOMO,包括(1)MMP,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被编码以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性和/或以足够的量被表达以将甲醇转化为甲醛;以及(2)FAP,其中所述生物体包括编码FAPE的至少一种外源性核酸,该FAPE以足够的量被表达以生产糖酵解的中间体和/或可以被用于,例如生物质的形成的代谢途径的中间体。在一些实施方式中,该生物体包括编码EM9的至少一种外源性核酸,该EM9以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性。在其他的实施方式中,该生物体包括编码EM9的至少一种外源性核酸,该EM9以足够的量被表达以将甲醇转化为甲醛。在具体的实施方式中,该MMP包括EM9(1J)。在某些实施方式中,该FAPE是3A,以及该中间体是H6P、F6P或其组合。在其他的实施方式中,该FAPE是3B,以及该中间体是H6P、F6P或其组合。在仍然其他的实施方式中,该FAPE是3A和3B,以及该中间体是H6P、F6P或其组合。在一些实施方式中,该FAPE是4A,以及该中间体是DHA、DHAP或其组合。在其他的实施方式中,该FAPE是4B,以及该中间体是DHA、DHAP或其组合。在仍然其他的实施方式中,该FAPE是4A和4B,以及该中间体是DHA、DHAP或其组合。在一种实施方式中,编码该MMPE的该至少一种外源性核酸,在甲醇的存在下,足以提高还原当量的可用性以及足以增加甲醛同化以增加该非天然微生物体对本文所述的己二酸、6-ACA、HMDA,己内酰胺或其他产品的产量。在一些实施方式中,该MMP包括如上或本文其他处所述的MMPE的任何各种组合。
在某些实施方式中,(1)该MMP包括:1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合,其中1A是EM1;1B是EM2;1C是EM3;1D是EM4;1E是EM5;1F是EM6;1G是EM15;1H是EM16,1I是EM8;1J是EM9;1K是自发的或EM10;1L是EM11;1M是自发的或EM12;1N是EM13以及1O是EM14;以及(2)该FAP包括3A、3B或其组合,其中3A是EF1以及3B是EF2。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,该中间体是H6P。在其他的实施方式中,该中间体是F6P。在仍然其他的实施方式中,该中间体是H6P和F6P。
在一种实施方式中,该FAP包括3A。在另一实施方式中,该FAP包括3B。在一种实施方式中,该FAP包括3A和3B。
在一些实施方式中,该MMP是图1中所描述的MMP和图3中所描述的FAP。根据图3,将5-磷酸-D-核酮糖和甲醛转化为F6P(经由H6P)的示例性FAPE组包含3A和3B。
在具体的实施方式中,(1)该MMP包括1J;以及(2)该FAP包括3A和3B。在其他的实施方式中,(1)该MMP包括1J和1K;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1E;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1F;以及(2)该FAP包括3A和3B。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J和1L;以及(2)该FAP包括3A和3B。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N和1O;以及(2)该FAP包括3A和3B。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N和1O;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1I;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1I;以及(2)该FAP包括3A和3B。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1I;以及(2)该FAP包括3A和3B。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I;以及(2)该FAP包括3A和3B。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1I;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1G;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1G;以及(2)该FAP包括3A和3B。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1G;以及(2)该FAP包括3A和3B。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G;以及(2)该FAP包括3A和3B。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1G;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该FAP包括3A和3B。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L、1G和1H;以及(2)该FAP包括3A和3B。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O、1G和1H;以及(2)该FAP包括3A和3B。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O、1G和1H;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该FAP包括3A和3B。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在一些实施方式中,该中间体是H6P。在其他的实施方式中,该中间体是F6P。在仍然其他的实施方式中,该中间体是H6P和F6P。
在某些实施方式中,(1)该MMP包括:1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O或1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、1K、1L、1M、1N或1O其任何组合,其中1A是EM1;1B是EM2;1C是EM3;1D是EM4;1E是EM5;1F是EM6;1G是EM15;1H是EM16,1I是EM8;1J是EM9;1K是自发的或EM10;1L是EM11;1M是自发的或EM12;1N是EM13以及1O是EM14;以及(2)该FAP包括4A、4B或其组合,其中4A是EF3以及4B是EF4。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在一些实施方式中,该中间体是DHA。在其他的实施方式中,该中间体是DHAP。在仍然其他的实施方式中,该中间体是DHA和DHAP。
在一种实施方式中,该FAP包括4A。在另一实施方式中,该FAP包括4B。在一种实施方式中,该FAP包括4A和4B。
在一些实施方式中,该MMP是图1中所描述的MMP和图4中所描述的FAP。根据图4,将-5-磷酸木酮糖和甲醛转化为DHAP(经由DHA)的示例性FAPE组包含4A和4B。
在具体的实施方式中,(1)该MMP包括1J;以及(2)该FAP包括4A和4B。在其他的实施方式中,(1)该MMP包括1J和1K;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1E;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D和1F;以及(2)该FAP包括4A和4B。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J和1L;以及(2)该FAP包括4A和4B。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N和1O;以及(2)该FAP包括4A和4B。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N和1O;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1I;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1I;以及(2)该FAP包括4A和4B。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1I;以及(2)该FAP包括4A和4B。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I;以及(2)该FAP包括4A和4B。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1I;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E和1G;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F和1G;以及(2)该FAP包括4A和4B。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L和1G;以及(2)该FAP包括4A和4B。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G;以及(2)该FAP包括4A和4B。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O和1G;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该FAP包括4A和4B。在另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1L、1G和1H;以及(2)该FAP包括4A和4B。在仍然另一实施方式中,(1)该MMP包括1J、1M、1N、1O、1G和1H;以及(2)该FAP包括4A和4B。在某些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1N、1O、1G和1H;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E、1G和1H;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一种实施方式中,(1)该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F、1G和1H;以及(2)该FAP包括4A和4B。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在一些实施方式中,该中间体是DHA。在其他的实施方式中,该中间体是DHAP。在仍然其他的实施方式中,该中间体是DHA和DHAP。
本文提供的任何MMP可以组合本文提供的任何FAP。此外,本文提供的任何MMP可以组合本文提供的任何己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径和任何FAP。在其他的实施方式中,这些途径可以进一步组合本文提供的任何FRP。
本文还提供生产甲醛的方法,包括培养本文提供的一种具有MMP的NNOMO。在一些实施方式中,该MMP包括1J。在某些实施方式中,该生物体被培养于基本上厌氧的培养基中。在具体的实施方式中,该甲醛是一种被消耗(同化)于本文所述的己二酸、6-ACA、HMDA、己内酰胺及其他产品的生产的中间体。
本文还提供生产糖酵解的中间体和/或可以被用于,例如生物质的形成的代谢途径的中间体的方法,包括在各种条件下培养如本文提供的具有MMP和FAP的NNOMO达足以生产该中间体的时间段。在一些实施方式中,该中间体是H6P。在其他的实施方式中,该中间体是F6P。在仍然其他的实施方式中,该中间体是H6P和F6P。在一些实施方式中,该中间体是DHA。在其他的实施方式中,该中间体是DHAP。在仍然其他的实施方式中,该中间体是DHA和DHAP。在一些实施方式中,该MMP包括1J。在某些实施方式中,该生物体被培养于基本上厌氧的培养基中。这类生物质也可以被用于生产本文其他处提供的任何产品(如该生物基产品)的法。
在某些实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在一些实施方式中,该生物体包括两种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在一些实施方式中,该生物体包括三种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在其他的实施方式中,该生物体包括四种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在一些实施方式中,该生物体包括八种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在其他的实施方式中,该生物体包括五种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在一些实施方式中,该生物体包括六种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在其他的实施方式中,该生物体包括七种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在一些实施方式中,该生物体包括八种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在其他的实施方式中,该生物体包括九种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶。在某些实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种均编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶;以及该生物体进一步包括两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括两种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括三种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括四种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括五种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括六种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括七种外源性核酸,每种均编码MMPE。
在一些实施方式中,该生物体包括两种或更多外源性核酸,每种均编码FAPE。在一些实施方式中,该生物体包括两种外源性核酸,每种均编码FAPE。在某些实施方式中,该生物体包括两种外源性核酸,每种均编码FAPE;以及该生物体进一步包括两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括两种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括三种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括四种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括五种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括六种外源性核酸,每种均编码MMPE。在某些实施方式中,该生物体进一步包括七种外源性核酸,每种均编码MMPE。
在一些实施方式中,编码MMPE的该至少一种外源性核酸是异源性核酸。在其他的实施方式中,编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶的该至少一种外源性核酸是异源性核酸。在其他的实施方式中,编码FAPE的该至少一种外源性核酸是异源性核酸。在某些实施方式中,编码MMPE的该至少一种外源性核酸是异源性核酸,以及编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶的该至少一种外源性核酸是异源性核酸。在其他的实施方式中,编码MMPE的该至少一种外源性核酸是异源性核酸,以及编码FAPE的该至少一种外源性核酸是异源性核酸。
在某些实施方式中,该生物体在基本上厌氧的培养基中。
在一些实施方式中,本文提供一种包括MMP的NNOMO。在某些实施方式中,本文提供一种包括FAP的NNOMO。在其他的实施方式中,本文提供FRP。在一些实施方式中,本文提供一种包括AdiP的NNOMO。在其他的实施方式中,本文提供一种包括6-ACAP的NNOMO。在其他的实施方式中,本文提供HMDAP。在仍然其他的实施方式中,本文提供CapP。一种包括本文提供的各种FAP、FRP、MMP、AdiP,6-ACAP,HMDAP或CapP的一种、两种、三种、四种或五种的任何组合的NNOMO也被考虑到。在一种实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP和AdiP。在另一实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP、FAP和AdiP。在其他的实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP、FAP、FRP和AdiP。在一种实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP和6-ACAP。在另一实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP、FAP和6-ACAP。在其他的实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP、FAP、FRP和6-ACAP。在一种实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP和HMDAP。在另一实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP、FAP和HMDAP。在其他的实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP、FAP、FRP和HMDAP。在一种实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP和CapP。在另一实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP、FAP和CapP途径。在其他的实施方式中,一种NNOMO包括本文提供的MMP、FAP、FRP和CapP。示例性MMP、FAP、AdiP、6-ACAP、HMDAP和CapP被提供于图1-5和本文其他处。
在某些实施方式中,本文提供的该NNOMO包括编码MMP、FAP、FRP、AdiP、6-ACAP、HMDAP和/或CapP酶或蛋白质的至少一种外源性核酸。在一些实施方式中,该NNOMO包括编码MMP酶或蛋白质的一种外源性核酸。在一些实施方式中,该NNOMO包括编码FAP酶或蛋白质的一种外源性核酸。在一些实施方式中,该NNOMO包括编码FRP酶或蛋白质的一种外源性核酸。在一些实施方式中,该NNOMO包括编码AdiP酶或蛋白质的一种外源性核酸。在一些实施方式中,该NNOMO包括编码6-ACAP酶或蛋白质的一种外源性核酸。在一些实施方式中,该NNOMO包括编码HMDAP酶或蛋白质的一种外源性核酸。在一些实施方式中,该NNOMO包括编码CapP酶或蛋白质的一种外源性核酸。在某些实施方式中,该外源性核酸是异源性核酸。
在某些实施方式中,本文提供一种具有FAP和FRP的NNOMO。在某些实施方式中,该生物体包括(i)编码FAPE的至少一种外源性核酸,其中所述FAP包括3A(也见5B)、3B(也见5C)或4A(也见5D)或其任何组合,其中3A是3-6-磷酸己酮糖合酶(EF1),其中3B是6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2),其中4A是DHA合酶(EF3)。在某些实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的MMP。在其他的实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。在一些实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的MMP和AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。
在某些实施方式中,该生物体包括编码FRP酶(FRPE)的至少一种外源性核酸,其中所述FRP包括5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、5L、5M、5N、5O或5P或其任何组合,其中5E是甲酸还原酶(EFR1),5F是甲酸连接酶(EFR2A)、甲酸转移酶(EFR2B)或甲酸合成酶(EFR2C),其中5G是甲酰基-CoA还原酶(EFR3),其中5H是甲酰四氢叶酸合成酶(EFR4),其中5I是次甲基四氢叶酸环水解酶(EFR5),其中5J是亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EFR6),其中5K是甲醛形成酶(EFR7)或自发的,其中5L是甘氨酸分裂系统(EFR8),其中5M是丝氨酸羟甲基转移酶(EFR9),其中5N是丝氨酸脱氨酶(EFR10),其中5O是亚甲基四氢叶酸还原酶(EFR11),其中5P是乙酰基-CoA合酶(EFR12)。在某些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产甲醛。在某些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在某些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产乙酰基-CoA。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的MMP。在其他的实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。在一些实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的MMP和AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。
在一种实施方式中,该FAP包括3A。在一种实施方式中,该FAP包括3B。在一种实施方式中,该FAP包括4A。在一种实施方式中,该FRP包括5E。在一种实施方式中,该FRP包括5F。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。在一种实施方式中,该FRP包括5G。在一种实施方式中,该FRP包括5H。在一种实施方式中,该FRP包括5I。在一种实施方式中,该FRP包括5J。在一种实施方式中,该FRP包括5K。在一些实施方式中,5K是自发的。在一种实施方式中,该FRP包括5L。在一种实施方式中,该FRP包括5M。在一种实施方式中,该FRP包括5N。在一种实施方式中,该FRP包括5O。在一种实施方式中,该FRP包括5P。3A、3B、4A、5E、5F、5G、5H、5I、5J、5K、5L、5M、5N、5O或5P的两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种途径酶的任何组合也被考虑到。
在一个方面,本文提供一种具有FAP和FRP的NNOMO,其中所述生物体包括(i)编码FAPE的至少一种外源性核酸,其中所述FAP包括:(5)3A和3B;或(2)4A;以及(ii)编码FRPE的至少一种外源性核酸,其中所述FRP包括选自如下的途径:(3)5E;(4)5F和5G;(5)5H、5I、5J和5K;(6)5H、5I、5J、5L、5M和5N;(7)5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(8)5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(9)5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N;以及(10)5H、5I、5J、5O和5P。在某些实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在一些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产甲醛。在其他的实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在某些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产乙酰基-CoA。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的MMP。在其他的实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。在一些实施方式中,该NNOMO进一步包括本文提供的MMP和3AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。
在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5E。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5F和5G。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5H、5I、5J和5K。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5H、5I、5J、5O和5P。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。
在某些实施方式中,该FAP包括4A。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5E。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5F和5G。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5H、5I、5J和5K。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5H、5I、5J、5O和5P。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。
在某些实施方式中,该FRP进一步包括5Q、5R或5S或其任何组合,其中5Q是丙酮酸甲酸裂解酶(EFR13);5R是丙酮酸脱氢酶(EFR14A)、丙酮酸铁氧化还原蛋白氧化还原酶(EFR14B)或丙酮酸:NADP+氧化还原酶(EFR14C);以及5S是甲酸脱氢酶(EFR15)。因此,在某些实施方式中,该FRP包括5Q。在某些实施方式中,该FRP包括5R。在某些实施方式中,该FRP包括5S。在某些实施方式中,该FRP包括5R和5S。在一些实施方式中,5R是EFR14A。在其他的实施方式中,5R是EFR14B。在其他的实施方式中,5R是EFR14C。
在某些实施方式中,FRP包括5Q;或5R和5S,以及该FAP包括3A和3B。在某些实施方式中,FRP包括5Q;或5R和5S,以及该FAP包括4A。在某些实施方式中该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5Q和5E。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5Q、5F和5G。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5Q、5H、5I、5J和5K。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5Q、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5Q、5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5Q、5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5Q、5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5Q、5H、5I、5J、5O和5P。在某些实施方式中该FAP包括4A,以及该FRP包括5Q和5E。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5Q、5F和5G。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5Q、5H、5I、5J和5K。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5Q、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5Q、5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5Q、5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5Q、5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5Q、5H、5I、5J、5O和5P。在某些实施方式中该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5R、5S和5E。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5R、5S、5F和5G。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5R、5S、5H、5I、5J和5K。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5R、5S、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5R、5S、5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5R、5S、5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5R、5S、5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括3A和3B,以及该FRP包括5R、5S、5H、5I、5J、5O和5P。在某些实施方式中该FAP包括4A,以及该FRP包括5R、5S和5E。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5R、5S、5F和5G。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5R、5S、5H、5I、5J和5K。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5R、5S、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5R、5S、5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5R、5S、5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5R、5S、5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N。在某些实施方式中,该FAP包括4A,以及该FRP包括5R、5S、5H、5I、5J、5O和5P。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。在一些实施方式中,5R是EFR14A。在其他的实施方式中,5R是EFR14B。在其他的实施方式中,5R是EFR14C。
在某些实施方式中,该FAP是图3中所描述的途径。在某些实施方式中,该FAP是图4中所描述的途径。在某些实施方式中,该FAP是图5中所描述的途径。在某些实施方式中,该FRP是图5中所描述的途径。在某些实施方式中,该FAP和该FRP是图5中所描述的途径。
在某些实施方式中,本文提供一种具有FAP、FRP和MMP的NNOMO。在一些实施方式中,该生物体包括(i)编码FAPE的至少一种外源性核酸,其中所述FAP包括:(1)3A和3B;或(2)4A;(ii)编码FRPE的至少一种外源性核酸,其中所述FRP包括选自如下的途径:(3)5E;(4)5F和5G;(5)5H、5I、5J和5K;(6)5H、5I、5J、5L、5M和5N;(7)5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(8)5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(9)5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N;以及(10)5H、5I、5J、5O和5P,以及(iii)编码MMPE的至少一种外源性核酸,其中所述MMP包括选自如下的途径:(1)1J;(2)1A和1B;(3)1A、1B和1C;(4)1J、1K和1C;(5)1J、1M和1N;(6)1J和1L;(7)1A、1B、1C、1D和1E;(8)1A、1B、1C、1D和1F;(9)1J、1K、1C、1D和1E;(10)1J、1K、1C、1D和1F;(11)1J、1M、1N和1O;(12)1A、1B、1C、1D、1E和1G;(13)1A、1B、1C、1D、1F和1G;(14)1J、1K、1C、1D、1E和1G;(15)1J、1K、1C、1D、1F和1G;(16)1J、1M、1N、1O和1G;(17)1A、1B、1C、1D、1E和1I;(18)1A、1B、1C、1D、1F和1I;(19)1J、1K、1C、1D、1E和1I;(20)1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(21)1J、1M、1N、1O和1I。在某些实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在一些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产甲醛。在其他的实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在某些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产乙酰基-CoA。在一些实施方式中,该MMP酶以足够的量被表达以生产甲醛和/或在甲醇的存在下生产或提高还原当量的可用性。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在某些实施方式中,NNOMO进一步包括本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。
在某些实施方式中,该MMP包括1A。在某些实施方式中,该MMP包括1B。在某些实施方式中,该MMP包括1C。在某些实施方式中,该MMP包括1D。在某些实施方式中,该MMP包括1E。在某些实施方式中,该MMP包括1F。在某些实施方式中,该MMP包括1G。在某些实施方式中,该MMP包括1H。在某些实施方式中,该MMP包括1I。在某些实施方式中,该MMP包括1J。在某些实施方式中,该MMP包括1K。在某些实施方式中,该MMP包括1L。在某些实施方式中,该MMP包括1M。在某些实施方式中,该MMP包括1N。在某些实施方式中,该MMP包括1O。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在某些实施方式中,该MMP包括1J。在某些实施方式中,该MMP包括1A和1B。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B和1C。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1K和1C。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1M和1N。在某些实施方式中,该MMP包括1J和1L。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D和1E。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D和1F。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D和1E。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D和1F。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1M、1N和1O。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1G。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1G。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1G。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1G。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1M、1N、1O和1G。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D、1E和1I。在某些实施方式中,该MMP包括1A、1B、1C、1D、1F和1I。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1E和1I。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1K、1C、1D、1F和1I。在某些实施方式中,该MMP包括1J、1M、1N、1O和1I。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。
在某些实施方式中,本文提供一种具有FAP、FRP和MMP的NNOMO。在一些实施方式中,该生物体包括(i)编码FAPE的至少一种外源性核酸,其中所述FAP包括:(1)3A和3B;或(2)4A,(ii)编码FRPE的至少一种外源性核酸,其中所述FRP包括选自如下的途径:(3)5E;(4)5F和5G;(5)5H、5I、5J和5K;(6)5H、5I、5J、5L、5M和5N;(7)5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(8)5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(9)5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N;以及(10)5H、5I、5J、5O和5P,以及(iii)编码MMPE(如甲醇氧化途径酶)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以在甲醇的存在下生产甲醛,其中所述MMP包括1J(也见5A)。在某些实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在一些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产甲醛。在其他的实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在某些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产乙酰基-CoA。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。在某些实施方式中,NNOMO进一步包括本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。
在某些实施方式中,本文提供一种具有FAP和MMP的NNOMO。在一些实施方式中,该生物体包括(i)编码FAPE的至少一种外源性核酸,其中所述FAP包括:(1)3A和3B;或(2)4A;以及(ii)编码(如甲醇氧化途径酶)MMPE的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以在甲醇的存在下生产甲醛,其中所述MMP包括1J。在某些实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在某些实施方式中,NNOMO进一步包括本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。
在某些实施方式中,本文提供一种具有FAP、FRP和MMP的NNOMO。在某些实施方式中,该生物体进一步包括1H或1P,其中1H是氢化酶(EM16)以及1P是将CO转化为CO2的一氧化碳脱氢酶。在一些实施方式中,该生物体包括(i)编码FAPE的至少一种外源性核酸,其中所述FAP包括:(1)3A和3B;或(2)4A,(ii)编码FRPE的至少一种外源性核酸,其中所述FRP包括选自如下的途径:(3)5E;(4)5F和5G;(5)5H、5I、5J和5K;(6)5H、5I、5J、5L、5M和5N;(7)5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(8)5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(9)5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N;以及(10)5H、5I、5J、5O和5P;以及(iii)编码MMP酶的至少一种外源性核酸,其中所述MMP包括选自如下的途径:(1)1J;(2)1A和1B;(3)1A、1B和1C;(4)1J、1K和1C;(5)1J、1M和1N;(6)1J和1L;(7)1A、1B、1C、1D和1E;(8)1A、1B、1C、1D和1F;(9)1J、1K、1C、1D和1E;(10)1J、1K、1C、1D和1F;(11)1J、1M、1N和1O;(12)1A、1B、1C、1D、1E和1G;(13)1A、1B、1C、1D、1F和1G;(14)1J、1K、1C、1D、1E和1G;(15)1J、1K、1C、1D、1F和1G;(16)1J、1M、1N、1O和1G;(17)1A、1B、1C、1D、1E和1I;(18)1A、1B、1C、1D、1F和1I;(19)1J、1K、1C、1D、1E和1I;(20)1J、1K、1C、1D、1F和1I;以及(21)1J、1M、1N、1O和1I。在某些实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在一些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产甲醛。在其他的实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在某些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产乙酰基-CoA。在一些实施方式中,该MMP酶以足够的量被表达以生产甲醛和/或在甲醇的存在下生产或提高还原当量的可用性。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。在一些实施方式中,1K是自发的。在其他的实施方式中,1K是EM10。在一些实施方式中,1M是自发的。在其他的实施方式中,1M是EM12。在某些实施方式中,NNOMO进一步包括本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。
在某些实施方式中,本文提供一种具有FAP、FRP和MMP的NNOMO。在某些实施方式中,该生物体进一步包括1H或1P,其中1H是氢化酶(EM16)以及1P是将CO转化为CO2的一氧化碳脱氢酶。在一些实施方式中,该生物体包括(i)编码FAPE的至少一种外源性核酸,其中所述FAP包括:(1)3A和3B;或(2)4A,其中3A是3-6-磷酸己酮糖合酶,其中3B是6-磷酸-3-己酮糖异构酶,其中4A是DHA合酶,(ii)编码FRPE的至少一种外源性核酸,其中所述FRP包括选自如下的途径:(3)5E;(4)5F和5G;(5)5H、5I、5J和5K;(6)5H、5I、5J、5L、5M和5N;(7)5E、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(8)5F、5G、5H、5I、5J、5L、5M和5N;(9)5K、5H、5I、5J、5L、5M和5N;以及(10)5H、5I、5J、5O和5P,以及(iii)编码MMPE(如甲醇氧化途径酶)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以在甲醇的存在下生产甲醛,其中所述MMP包括1J。在某些实施方式中,该FAPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在一些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产甲醛。在其他的实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产丙酮酸。在某些实施方式中,该FRPE以足够的量被表达以生产乙酰基-CoA。在一些实施方式中,5K是自发的。在一些实施方式中,5F是EFR2A。在其他的实施方式中,5F是EFR2B。在其他的实施方式中,5F是EFR2C。在某些实施方式中,NNOMO进一步包括本文提供的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP。
在某些实施方式中,本文提供一种具有FAP、FRP、MMP(如甲醇氧化途径,包括1J)、氢化酶、一氧化碳脱氢酶或上述的任何组合的NNOMO,其中该生物体进一步包括AdiP。在其他的实施方式中,本文提供一种具有FAP、FRP、MMP(如甲醇氧化途径,包括1J)、氢化酶、一氧化碳脱氢酶或上述的任何组合的NNOMO,其中该生物体进一步包括6-ACAP。在其他的实施方式中,本文提供一种具有FAP、FRP、MMP(如甲醇氧化途径,包括1J)、氢化酶、一氧化碳脱氢酶或上述的任何组合的NNOMO,其中该生物体进一步包括HMDAP。在其他的实施方式中,本文提供一种具有FAP、FRP、MMP(如甲醇氧化途径,包括1J)、氢化酶、一氧化碳脱氢酶或上述的任何组合的NNOMO,其中该生物体进一步包括CapP。
在一些实施方式中,生产自本文提供的某些NNOMO中的EM9的甲醛(图1,步骤J)被用于生成能量、氧化还原和/或生物质的形成。两种这类途径如图3中所示。附加地,若干生物体将称作“丝氨酸循环”的替代性途径用于甲醛同化。这些生物体包含甲基营养生物体、扭脱甲基杆菌AM1和另一,嗜有机甲基杆菌。这种循环的净平衡是2mol的甲醛和1mol的CO2固定进入1mol的3-磷酸甘油酸,其被用于生物合成,耗费2mol ATP并将2mol的NAD(P)H氧化。
在丝氨酸途径的第一个反应中,甲醛与甘氨酸反应以形成丝氨酸。该反应通过丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)(一种将四氢叶酸(THF)作为辅因子的酶)催化。这导致5,10-亚甲基四氢叶酸的形成。该反应期间,将甲醛从5,10-亚甲基四氢叶酸转移到甘氨酸,形成L-丝氨酸。在下一步骤中,通过丝氨酸-乙醛酸氨基转移酶这种酶,将乙醛酸作为氨基基团受体使丝氨酸进行氨基转移,以生产羟基丙酮酸和甘氨酸。通过羟基丙酮酸还原酶将羟基丙酮酸还原为甘油酸酯。甘油酸酯2-激酶催化从ATP到磷酸基团的加成以生产2-磷酸甘油酸。
该2-磷酸甘油酸的一些通过磷酸甘油酸变位酶被转化为3-磷酸甘油酸,其是中心代谢途径的中间体并被用于生物合成。该2-磷酸甘油酸的其余部分通过烯醇酶被转化为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP羧化酶然后催化二氧化碳的固定,其偶联于PEP到草酰乙酸的转化,该草酰乙酸通过苹果酸脱氢酶(一种NAD连接酶)被还原为苹果酸。在一些实施方式中,外源性苹果酸脱氢酶基因是德氏根霉(Rhizopus delemar)苹果酸脱氢酶基因,其编码在WO2013112939中被披露为SEQ ID NO:167的氨基酸序列或其变体。苹果酸通过苹果酸硫激酶被活化为苹果酰基辅酶A以及通过苹果酰基辅酶A裂解酶被裂解为乙酰基CoA和乙醛酸。这两种酶(苹果酸硫激酶和苹果酰基辅酶A裂解酶),以及羟基丙酮酸还原酶和甘油酸酯-2-激酶,唯一存在于包含该丝氨酸途径的甲基营养生物体中。
在拥有异柠檬酸裂解酶(乙醛酸循环的一种关键酶)的生物体中,乙酰基CoA通过乙醛酸循环被转化为乙醛酸。然而,如果该酶丢失,其便通过另一未知的途径被转化(deVries等人,FEMS Microbiol Rev,6(1):57-101(1990))。所得的乙醛酸可以作为用于丝氨酸-乙醛酸氨基转移酶的底物,再生成甘氨酸并关闭该循环。
理解的是,本文披露的,如实施例中所述的以及图1、2、3、4和5的途径中示范的任何途径可用以生成一种根据需要生产任何途径中间体或者产品的NNOMO。这类中间体或产品的非限制性实施例是己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。如本文所披露,生产中间体的这类微生物体可以与另一种表达下游途径酶的微生物体组合使用,以生产所需的产品。然而,理解的是,生产己二酸、6-ACA、HMDA或CapP中间体的非天然存在的真核生物可用以将该中间体作为所需的产品来生产。
在某些实施方式中,一种单独包括本文提供的MMP和己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径或组合本文提供的FAP和/或FRP的NNOMO进一步包括一种或多种基因破坏。在某些实施方式中,该一种或多种基因破坏带来了该生物体中增加的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺产量。在其他的实施方式中,一种包括本文提供的MMP、FAP和/或FRP的NNOMO进一步包括一种或多种基因破坏。在一些实施方式中,该基因破坏是在编码参与所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2、氨基酸或其任何组合的天然生产的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在一种实施方式中,该基因破坏是在编码参与乙醇的天然生产的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在另一实施方式中,该基因破坏是在编码参与甘油的天然生产的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在其他的实施方式中,该基因破坏是在编码参与乙酸的天然生产的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在另一实施方式中,该基因破坏是在编码参与乳酸的天然生产的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在一种实施方式中,该基因破坏是在编码参与甲酸的天然生产的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在另一实施方式中,该基因破坏是在编码参与CO2的天然生产的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在其他的实施方式中,该基因破坏是在编码参与所述微生物体对氨基酸的天然生产的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在一些实施方式中,该蛋白质或酶是丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、甘油脱氢酶、甘油-3-磷酸酶、3-磷酸甘油脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸:醌氧化还原酶、丙酮酸甲酸裂解酶、醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸-裂解酶-2-丁酮酸甲酸-裂解酶、丙酮酸转运蛋白、一元羧酸转运蛋白、NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、丙酮酸激酶或其任何组合。在某些实施方式中,该一种或多种基因破坏带来了该生物体中增加的甲醛产量。在另一实施方式中,该基因破坏是在编码参与天然甲醛利用途径的蛋白质和/或酶的内源性基因中。在某些实施方式中,该生物体包括从一种到二十五种基因破坏。在其他的实施方式中,该生物体包括从一种到二十种基因破坏。在一些实施方式中,该生物体包括从一种到十五种基因破坏。在其他的实施方式中,该生物体包括从一种到十种基因破坏。在一些实施方式中,该生物体包括从一种到五种基因破坏。在某些实施方式中,该生物体包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种基因破坏或更多。
在其他的实施方式中,一种单独包括本文提供的MMP和己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径或组合本文提供的FAP和/或FRP的NNOMO进一步包括参与所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种内源性蛋白质或酶,其中所述一种或多种内源性蛋白质或酶具有减毒的蛋白质或酶活性和/或表达水平。在一些实施方式中,一种单独包括本文提供的MMP和FAP或组合本文提供的FRP的NNOMO进一步包括参与所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种内源性蛋白质或酶,其中所述一种或多种内源性蛋白质或酶具有减毒的蛋白质或酶活性和/或表达水平。在一种实施方式中,该内源性蛋白质或酶是丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶、甘油脱氢酶、甘油-3-磷酸酶、3-磷酸甘油脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸:醌氧化还原酶、丙酮酸甲酸裂解酶、醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸-裂解酶-2-丁酮酸甲酸-裂解酶、丙酮酸转运蛋白、一元羧酸转运蛋白、NADH脱氢酶、细胞色素氧化酶、丙酮酸激酶或其任何组合。
在适当的培养条件下,与不包含这类代谢改变的菌株相比,本文提供的每种非天然存在的改变导致,例如在该微生物体的指数生长期期间,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的增加的产量和提高的水平。适当的条件包含,例如,本文披露的那些条件,包含诸如特定碳源或反应物可用性和/或适应性进化的条件。
在某些实施方式中,本文提供具有增加,例如,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的产量,例如,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生长偶联的产量的基因改变(如基因破坏)的NNOMO。产品生产可以,例如通过,如本文所披露的,对细胞代谢途径的基因改变,强制性地与该微生物体的指数生长期联系起来。该基因改变可以增加生长期期间,所需的产品的产量甚或使所需的产品成为强制性产品。适当的条件包含,例如,本文披露的那些条件,包含诸如特定碳源或反应物可用性和/或适应性进化的条件。
鉴于本文所提供的教诲和指导,本领域的技术人员将理解的是,为了引入代谢改变,如酶的减毒,破坏参与反应的一种或多种酶的催化活性必定是必需的。替代性地,代谢改变可以包括破坏酶活性或最大活性所必需的调节蛋白或辅因子的表达。此外,酶反应所必需的辅因子的遗传损失也可以与对编码酶的基因的破坏有相同的效果。破坏可以通过各种方法而发生,包括,例如编码基因的缺失或一种或多种编码基因序列中基因改变的纳入。靶向破坏的编码基因可以是编码参与催化活性的酶的基因的一种、一些或全部。例如,在单一酶参与靶向催化活性的情况下,破坏可以通过降低或消除所编码的基因产品的催化活性的基因改变而发生。类似地,在该单一酶是多聚体(包括异聚体)的情况下,破坏可以通过降低或破坏所编码的基因产品的一种或所有亚基的功能的基因改变而发生。活性的破坏可以通过形成活性复合物所需的一种或多种亚基的结合活性的缺失,通过多聚体复合物的催化亚基的破坏或两者而完成。也可以靶向多聚蛋白关联和活动的其他功能,以破坏本文提供的代谢反应。这类其他功能为本领域技术人员所熟知。类似地,靶酶活性可以通过破坏修饰和/或活化该靶酶的蛋白质或酶(例如将脱辅基酶转化为全酶所需的分子)的表达而降低或消除。此外,单一多肽或多聚体复合物的一些或所有功能可以根据本发明进行破坏,以降低或消除参与本文所提供的反应或代谢修饰的一种或多种酶的催化活性。类似地,只要靶向反应被减少或消除,参与本文所提供的反应或代谢修饰的一些或所有酶可以被破坏。
鉴于本文所提供的教诲和指导,本领域的技术人员将理解的是,酶反应可以通过减少或消除由共同基因和/或由该基因的展示类似或基本上相同的活性的一种或多种直系同源物编码的反应而被破坏。共同基因和所有直系同源物两者的减少可以导致靶反应的任何催化活性的完全取消。然而,共同基因或一种或多种直系同源物的破坏可以导致足以促进生长与产物生物合成的偶联的靶反应的催化活性的降低。这里所示范的是编码各种代谢修饰的催化活性的共同基因及其直系同源物。本领域的技术人员将理解的是,可以在本文所提供的方法中实践对编码靶向代谢反应的酶的一些或全部基因的破坏,并将其纳入本文所提供的NNOMO中以实现己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的产量增加或生长偶联产品的生产。
鉴于本文所提供的教诲和指导,本领域的技术人员将理解的是,酶活性或表达可以使用公知的方法来减毒。如果酶的活性或量的降低引起该酶的活性下降到低于途径发挥功能通常所需的临界水平,则该降低可以模拟基因的完全破坏。通过非使用基因破坏的各种技术对酶活性的降低对生物体的生存性可能是重要的。导致基因破坏的相似或相同效果的降低酶活性的方法包括但不限于:减少基因转录或翻译;使mRNA、蛋白质或催化性RNA脱稳定化;以及使影响酶活性或动力学的基因突变(见,Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory,纽约(2001);以及Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,马里兰州巴尔的摩(1999))。自然或强加的调节控制也能完成酶减毒,包含:启动子更换(见,Wang等人,Mol.Biotechnol.52(2):300-308(2012));转录因子的缺失或改变(Dietrick等人,Annu.Rev.Biochem.79:563-590(2010);以及Simicevic等人,Mol.Biosyst.6(3):462-468(2010));抑制RNA或肽,例如siRNA、反义RNA、RNA或肽/小分子结合的适体、核酶、人工适体酶和核糖开关的引入(Wieland等人,Methods56(3):351-357(2012);O’Sullivan,Anal.Bioanal.Chem.372(1):44-48(2002);以及Lee等人,Curr.Opin.Biotechnol.14(5):505-511(2003));以及降低或破坏酶活性的药物或其他化学品(例如酶抑制剂、抗生素或靶特异性药物)的添加。
本领域技术人员也将理解和认识到酶的减毒可以按不同的水平进行。例如,按基因水平,引起部分或完全的无效表型的突变,如基因破坏;或引起掩盖基因产品活性的上位遗传效应的突变(Miko,Nature Education 1(1)(2008)),可以用来使酶减毒。按基因表达水平,对于减毒的方法包括:将转录偶联到内源性或外源性诱导剂,如异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG),然后在生产阶段期间添加少量的或不添加诱导剂(Donovan等人,J.Ind.Microbiol.16(3):145-154(1996);以及Hansen等人,Curr.Microbiol.36(6):341-347(1998));引入或修饰基因的正负调节剂;修饰整合有基因的真核染色体区域中的组蛋白乙酰化/脱乙酰化(Yang等人,Curr.Opin.Genet.Dev.13(2):143-153(2003)以及Kurdistani等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4(4):276-284(2003));引入转位以破坏启动子或调节基因(Bleykasten-Brosshans等人,C.R.Biol.33(8-9):679-686(2011);以及McCue等人,PLoS Genet.8(2):e1002474(2012));翻转转位元件或启动子区域的取向,以便调节相邻基因的基因表达(Wang等人,Genetics 120(4):875-885(1988);Hayes,Annu.Rev.Genet.37:3-29(2003));在二倍体生物中,删除导致杂合性缺失的一种等位基因(Daigaku等人,MutationResearch/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis600(1-2)177-183(2006));引入提高RNA降解的核酸(Houseley等人,Cell,136(4):763-776(2009);或在细菌中,例如,引入转运信使RNA(tmRNA)标签,这可导致RNA降解和核糖体失速(Sunoharan等人,RNA 10(3):378-386(2004);以及Sunoharan等人,J.Biol.Chem.279:15368-15375(2004))。按翻译水平,衰减可以包含:引入稀有密码子以限制翻译(Angov,Biotechnol.J.6(6):650-659(2011));引入阻断翻译的RNA干扰分子(Castel等人,Nat.Rev.Genet.14(2):100-112(2013);以及Kawasaki等人,Curr.Opin.Mol.Ther.7(2):125-131(2005));修饰编码序列外的区域,例如将二级结构引入到非翻译区(UTR)中以阻断翻译或降低翻译效率(Ringnér等人,PLoS Comput.Biol.1(7):e72(2005));为了快速转录物降解,添加RNA酶位点(Pasquinelli,Nat.Rev.Genet.13(4):271-282(2012);以及Arraiano等人,FEMS Microbiol.Rev.34(5):883-932(2010));引入反义RNA低聚物或反义转录物(Nashizawan等人,Front.Biosci.17:938-958(2012));引入RNA或肽适体、核糖酶、人工适体酶、核开关(Wieland等人,Methods 56(3):351-357(2012);O’Sullivan,Anal.Bioanal.Chem.372(1):44-48(2002);以及Lee等人,Curr.Opin.Biotechnol.14(5):505-511(2003));或引入涉及可以防止或减少翻译的RNA结构、可以通过小分子的存在或不存在来控制的翻译调节元件(Araujo等人,Comparative and Functional Genomics,Article ID 475731,8pages(2012))。按酶定位和/或寿命的水平,酶减毒可以包含:为了更快的蛋白质周转,添加降解标签(Hochstrasser,Annual Rev.Genet.30:405-439(1996);以及Yuan等人,PLoS One 8(4):e62529(2013));或添加定位标签,其导致真核细胞中,该酶被分泌或定位于亚细胞区室中,其中该酶将不能够与其正常底物反应(Nakai等人Genomics 14(4):897-911(1992);以及Russell等人,J.Bact.189(21)7581-7585(2007))。按翻译后调节的水平,酶减毒可以包含:增加已知抑制剂的细胞内浓度;或修饰翻译后修饰的位点(Mann等人,NatureBiotech.21:255-261(2003))。按酶活性的水平,酶减毒可以包含:添加内源或外源性抑制剂,如酶抑制剂、抗生素或靶特异性药物,以降低酶活性;限制必需辅因子(如维生素B12)对于需要辅因子的酶的可用性;螯合酶活性所需的金属离子;或引入显性失活突变。以上所述的减毒技术的适用性可取决于给定的宿主微生物是原核的还是真核的,并且理解的是,本领域技术人员可以容易地确定何种对于给定的宿主来说是适当的技术。
在一些实施方式中,可以基于所需产品的生长偶联形成而使用微需氧的设计。为了检验这一点,可以通过按网络中可行的不同的生物质形成率,首先最大化以及,随后最小化产品收率来为每个策略构建生产锥体。如果突变网络的所有可能的表型的最右边界是单点,这意味着按网络中可能的最大生物质形成率,存在产品的独特最佳收率。在其他情况下,可行的表型的最右边的边界是垂直线,表示在最大生物质的点,网络可以在所计算的范围内制成任何量的产品,包括该垂直线的最底部点上的最低量。为这类设计给出低优先级。
通过本文披露的方法(如OptKnock框架)确认的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺-生产策略通常基于其(i)理论收率,以及(ii)生长偶联己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的形成特点而进行评级。
本文所提供的己二酸-、6-ACA-、HMDA-或己内酰胺-生产策略可以被破坏,以增加己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的产量。相应地,本文还提供了一种具有将己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产与生物体的生长偶联的代谢修饰的NNOMO,其中该代谢修饰包含对选自本文提供的编码蛋白质和/或酶的基因的一种或多种基因进行破坏。
如果确定菌株设计没有充分地增加己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的产量和/或将产品的形成与生物质形成偶联,则该菌株的每个都可以补充有额外的缺失。替代性地,不知其在生长条件具备显著活性的一些其他的酶可以因适应性进化或随机突变而变得有活性。这些活性也可以被敲除。然而,本文提供的基因缺失允许菌株的构建,该菌株表现出3己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的高收率产量,包含己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生长偶联生产。
在另一方面,本文提供一种用于生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的方法,包括在各种条件下培养包括本文提供的MMP和己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径的任一种NNOMO达足以生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的时间段。在某些实施方式中,该生物体被培养于基本上厌氧的培养基中。
在一种实施方式中,本文提供用于生产己二酸的方法,包括在各种条件下培养本文提供的生物体(如一种单独包括本文提供的MMP和AdiP或组合FAP和/或FRP的NNOMO)达足以生产己二酸的时间段。在一些实施方式中,该方法包括培养一种包括如下的NNOMO达足以生产己二酸的时间段:(1)MMP,其中所述生物体包括以足够的量编码MMPE,以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的至少一种外源性核酸;以及(2)AdiP,包括编码AdiPE的至少一种外源性核酸,该AdiPE以足够的量被表达以生产己二酸。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括如本文所提供的,包含编码FAPE的至少一种外源性核酸的FAP;以及/或如本文所提供的,包含编码RFPE的至少一种外源性核酸的FRP。
在另一实施方式中,本文提供用于生产6-ACA的方法,包括在各种条件下培养本文提供的生物体(如一种单独包括本文提供的MMP和6-ACAP或组合FAP和/或FRP的NNOMO)达足以生产6-ACA的时间段。在一些实施方式中,该方法包括培养一种包括如下的NNOMO达足以生产6-ACA的时间段:(1)MMP,其中所述生物体包括以足够的量编码MMPE,以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的至少一种外源性核酸;以及(2)6-ACAP,包括编码6-ACAPE的至少一种外源性核酸,该6-ACAPE以足够的量被表达以生产6-ACA。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括如本文所提供的,包含编码FAPE的至少一种外源性核酸的FAP;以及/或如本文所提供的,包含编码RFPE的至少一种外源性核酸的FRP。
在其他的实施方式中,本文提供用于生产HMDA的方法,包括在各种条件下培养本文提供的生物体(如一种单独包括本文提供的MMP和HMDAP或组合FAP和/或FRP的NNOMO)达足以生产HMDA的时间段。在一些实施方式中,该方法包括培养一种包括如下的NNOMO达足以生产HMDA的时间段:(1)MMP,其中所述生物体包括以足够的量编码MMPE,以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的至少一种外源性核酸;以及(2)HMDAP,包括编码HMDAPE的至少一种外源性核酸,该HMDAPE以足够的量被表达以生产HMDA。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括如本文所提供的,包含编码FAPE的至少一种外源性核酸的FAP;以及/或如本文所提供的,包含编码RFPE的至少一种外源性核酸的FRP。
在仍然其他的实施方式中,本文提供用于生产己内酰胺的方法,包括在各种条件下培养本文提供的生物体(如一种单独包括本文提供的MMP和CapP或组合FAP和/或FRP的NNOMO)达足以生产己内酰胺的时间段。在一些实施方式中,该方法包括培养一种包括如下的NNOMO达足以生产己内酰胺的时间段:(1)MMP,其中所述生物体包括以足够的量编码MMPE,以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性的至少一种外源性核酸;以及(2)CapP,包括编码CapPE的至少一种外源性核酸,该CapPE以足够的量被表达以生产己内酰胺。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括如本文所提供的,包含编码FAPE的至少一种外源性核酸的FAP;以及/或如本文所提供的,包含编码RFPE的至少一种外源性核酸的FRP。
在本文提供的方法的某些实施方式中,该生物体进一步包括编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶的至少一种核酸,该酶以足够的量被表达以生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。在一些实施方式中,该核酸是外源性核酸。在其他的实施方式中,该核酸是内源性核酸。在一些实施方式中,该生物体进一步包括本文提供的一种或多种基因破坏,其带来了该生物体中增加的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺产量。在某些实施方式中,该一种或多种基因破坏发生在编码参与所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的蛋白质或酶的内源性基因中。在其他的实施方式中,该生物体进一步包括参与所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种内源性蛋白质或酶,其中所述一种或多种内源性蛋白质或酶具有减毒的蛋白质或酶活性和/或表达水平。在某些实施方式中,该生物体是Crabtree阳性的真核生物,以及该生物体被培养于包括葡萄糖的培养基中。在某些实施方式中,该生物体包括从一种到二十五种基因破坏。在其他的实施方式中,该生物体包括从一种到二十种基因破坏。在一些实施方式中,该生物体包括从一种到十五种基因破坏。在其他的实施方式中,该生物体包括从一种到十种基因破坏。在一些实施方式中,该生物体包括从一种到五种基因破坏。在某些实施方式中,该生物体包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种基因破坏或更多。在某些实施方式中,该NNOMO进一步包括如本文所提供的,包含编码FAPE的至少一种外源性核酸的FAP;以及/或如本文所提供的,包含编码RFPE的至少一种外源性核酸的FRP。
在额外的实施方式中,提供一种具有己二酸、6-ACA、HMDA或CapP、FAP和/或MMP的NNOMO,其中该NNOMO包括编码将底物转化为产品的酶或蛋白质的至少一种外源性核酸。作为举例,在图1中,1J的底物是甲醇,以及该产品是甲醛;1L的底物是甲醛,以及该产品是甲酸;以及诸如此类。本领域技术人员将理解的是,这些仅仅是示例性的以及基于本文的教导,本领域的技术人员可以容易地确定本文披露的适合于生产所需产品并且对其来说,适当的活性可用于底物到产品的转化的任何底物-产品对。因此,本文提供包含编码酶或者蛋白质的至少一种外源性核酸的NNOMO,其中该酶或者蛋白质转化MMP(如图1中所示);己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺(如图2中所示);FAP(如图3-5中所示)和/或FRP(如图5中所示)的底物以及产品。
虽然本文中一般地描述了一种包含AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP、FAP、FRP和/或MMP的微生物体,但是可以理解的是,本文还提供了NNOMO,其包括编码以足够的量被表达以生产AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP、FAP、FRP的中间体;和/或MMP中间体的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP、FAP、FRP和/或MMPE的至少一种外源性核酸。例如,如本文所披露,AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP的示例见图2。因此,除了包含生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP的微生物体,本文还提供一种包括编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径酶的至少一种外源性核酸的NNOMO,其中该微生物体生产AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP中间体。
在一些实施方式中,可以选择碳源和其他细胞摄取源,例如磷酸盐、氨、硫酸盐、氯化物和其他卤素来改变己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺或任何己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺途径中间体中存在的原子的同位素分布。上面列举的各种碳源和其他摄取源在本文中将被统称为“摄取源”。摄取源可以为产品己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺和/或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中间体或者为从己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺途径岔开的反应中生成的副产物中存在的任何原子提供同位素富集。可以针对任何靶原子(包括,例如碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯化物或其他卤素)实现同位素富集。这同样适用于本文提供的MMP、FAP和FRP及其中间体。
在一些实施方式中,可以选择摄取源以改变碳-12、碳-13和碳-14的比率。在一些实施方式中,可以选择摄取源以改变氧-16、氧-17和氧-18的比率。在一些实施方式中,可以选择摄取源以改变氢、氘和氚的比率。在一些实施方式中,可以选择摄取源以改变氮-14和氮-15的比率。在一些实施方式中,可以选择摄取源以改变硫-32、硫-33、硫-34和硫-35的比率。在一些实施方式中,可以选择摄取源以改变磷-31、磷-32和磷-33的比率。在一些实施方式中,可以选择摄取源以改变氯-35、氯-36和氯-37的比率。
在一些实施方式中,靶原子的同位素比率可以通过选择一种或多种吸收源变化为所需的比率。摄取源可以来自天然源(如发现于自然界)或来自人造源,以及本领域技术人员可以选择天然源、人造源或其组合,以实现靶原子的所需同位素比率。人造的摄取源的一个例子包括,例如,至少部分地来自化学反应合成的吸收源。这种同位素富集的摄取源可以从市场上购得或在实验室内制备得到和/或可选地与摄取源的天然源混合以实现所需的同位素比率。在一些实施方式中,通过选择摄取源在自然界中发现所需来源可以获得该摄取源的靶同位素比率。例如,如本文所讨论的,天然源可以是衍生自生物体或通过生物而合成的生物基源;或诸如基于石油的产品的来源;或大气。在一些这样的实施方式中,例如,碳源可以选自衍生自化石燃料的碳源(其碳-14可能相对贫化);或环境或大气碳源,如CO2(其与其衍生自石油的对应物相比,可能具有更大量的碳-14)。
利用本领域已知的技术,如稳定同位素比质谱(SIRMS)和点特异性天然同位素分馏核磁共振(SNIF-NMR),通过质谱法很容易对同位素富集进行评估。这种质谱技术可以结合分离技术,如液相色谱(LC)和/或高效液相色谱法(HPLC)。
不稳定的碳同位素碳-14或放射性碳组成地球大气层中碳原子的大约1/1012以及其具有的半衰期约为5700年。碳储备在上层大气中通过涉及宇宙射线和普通氮(14N)的核反应得以补充。化石燃料中不含碳-14,因为其腐烂发生在很久以前。燃烧化石燃料降低大气中的碳-14组分,即所谓的“休斯效应”。
测定化合物中原子的同位素比率的方法是本领域的技术人员众所周知的。利用本领域已知的技术,如加速质谱(AMS)、稳定同位素比质谱(SIRMS)和点特异性天然同位素分馏核磁共振(SNIF-NMR),通过质谱法很容易对同位素富集进行评估。这种质谱技术可以结合分离技术,如液相色谱(LC)、高效液相色谱法(HPLC)和/或气相色谱法等。
在碳的情况下,在美国,美国材料试验国际协会(ASTM International)开发了ASTM D6866作为用于使用放射性碳测年法测定固体、液体和气体样品的生物基含量的标准化分析方法。该标准基于使用放射性碳测年法测定产品生物基含量。ASTM D6866首次公开于2004年,以及该标准的当前有效版本是ASTM D6866-11(2011年4月1日起生效)。放射性碳测年法(包括本文所述的那些)为本领域的技术人员所熟知。
通过碳-14(14C)与碳-12(12C)的比率估算化合物的生物基含量。具体而言,该现代组分(Fm)根据如下表达式计算:Fm=(S-B)/(M-B),其中B、S和M分别代表空白对照、样品和现代参考物的14C/12C比率。现代组分是样品相对于“现代”的14C/12C比率偏差的量度。现代被定义为被归一化为δ13CVPDB=-19‰的,国家标准局(NBS)草酸I(即标准参考物质(SRM)4990b)的放射性碳浓度(公元1950年)的95%(Olsson,The use of Oxalic acidas a Standard。见Radiocarbon Variations and Absolute Chronology,NobelSymposium,12th Proc.,John Wiley&Sons,纽约(1970))。使用国际上通用的关于被归一化为δ13CVPDB=-19‰的NBS草酸I(SRM 4990b)的比活度的0.95倍的定义,例如通过ASM测量,算得质谱法结果。这相当于1.176±0.010×10-12的绝对(公元1950年)14C/12C比率(Karlen等人,Arkiv Geofysik,4:465-471(1968))。标准计算考虑到同位素彼此间的差分摄取情况,例如,在生物系统中优先摄取C12,然后C13,然后C14,以及这些修正被反映成校正为δ13的Fm。
草酸标准物(SRM 4990b或者HOx 1)从1955年的甜菜作物中制得。虽然当时制有1000磅,但是这种草酸标准物已经不能从市场上购得了。草酸II标准物(HOx 2;N.I.S.T名称为SRM 4990C)从1977年法国的甜菜糖蜜作物中制得。在20世纪80年代初,一组12个实验室测量了这两个标准的比率。草酸II与1的活性比率为1.293±0.001(加权平均)。HOx II的同位素比率是-17.8‰。ASTM D6866-11建议将可用草酸II标准SRM 4990C(HOx2)用作现代标准物(见Mann,Radiocarbon,25(2):519-527(1983)中关于原来与目前可用的草酸标准物的对比讨论)。Fm=0%表示材料中完全没有碳-14原子,从而表明是化石(例如石油基)碳源。Fm=100%(针对1950年后核弹测试向大气中注入碳-14的现象校正之后)表明是完全现代的碳源。正如本文所述,这样的“现代”源包括生物基源。
如ASTM D6866中所述,现代碳百分数(pMC)可能大于100%,这是由于20世纪50年代核试验方案的持续但递减的效果,这导致如ASTMD6866-11中所述的,大气中有相当大量的碳-14富集。因为所有样品碳-14活性参考“炸弹前”(pre-bomb)标准,而因为几乎所有新的生物基产品在后炸弹环境(post-bomb environment)中生产,所以所有的pMC值(同位素组分校正后)必须乘以0.95(自2010年起),以更好地反映样品真实的生物基含量。大于103%的生物基含量表明,要么发生了分析错误,要么生物基碳的来源有些年头。
ASTM D6866相对材料的总有机物含量对生物基含量进行量化,并不考虑存在的无机碳及其他非含碳物质。例如,基于ASTM D6866,具有50%淀粉基材料和50%水的产品将被认为具有的生物基含量=100%(50%有机物含量是100%生物基的)。在另一例子中,具有50%淀粉基材料、25%石油基材料和25%水的产品将具有生物基含量=66.7%(该产品的75%有机物含量,但只有50%是生物基的)。在另一例子中,具有50%有机碳且作为石油基产品的产品将被认为具有的生物基含量=0%(50%有机碳但来自化石源)。因此,基于用于测定化合物或材料的生物基含量的公知方法和公知标准,本领域的技术人员可以很容易地测定生物基含量和/或具有所需的生物基含量的所制备的下游产品。
碳-14测年技术在量化材料生物基含量方面的应用为本领域已知(Currie等人,Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B,172:281-287(2000))。例如,碳-14测年法已被用来量化含对苯二甲酸盐的材料的生物基含量(Colonnan等人,Green Chemistry,13:2543-2548(2011))。值得注意的是,衍生自可再生的1,3-丙二醇的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PPT)聚合物和衍生自石油的对苯二甲酸产生了接近30%的Fm值(即,由于3/11的聚合物碳衍生自可再生的1,3-丙二醇以及8/11衍生自化石端元(end member)对苯二甲酸)(Currie等人,同上文,2000)。与此相反,衍生自可再生的BDO和可再生的对苯二甲酸的聚对苯二甲酸丁二醇酯聚合物产生了超过90%的生物基含量(Colonnan等人,同上文,2011)。
因此,在一些实施方式中,本发明提供了具有反映大气碳(也称为环境碳)摄取源的碳-12、碳-13和碳-14的比率的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中间体。例如,在一些方面,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体可以具有至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或高达100%的Fm值。在一些这类实施方式中,该摄取源是CO2。在一些实施方式中,本发明提供了具有反映石油基碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14的比率的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体。在这方面,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体可以具有小于95%、小于90%、小于85%、小于80%、小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于55%、小于50%、小于45%、小于40%、小于35%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2%或小于1%的Fm值。在一些实施方式中,本发明提供了具有碳-12、碳-13和碳-14的比率的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体,所述比率通过将大气中的碳摄取源与石油基摄取源相结合而获得。利用摄取源的这种组合是碳-12、碳-13和碳-14的比率可以变化的一种途径,以及各自的比率将反映摄取源的比例。
进一步,本发明部分地涉及如本文所披露的生物体生产的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体,以及涉及从中衍生得到的产物,其中己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其中间体与环境中存在的CO2具有差不多相同数值的碳-12、碳-13以及碳-14同位素比率。例如,在某些方面提供生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其中间体,其与环境中存在的CO2具有差不多相同数值的碳-12对碳-13对碳-14同位素比率或本文披露的任何其他比率。理解的是,如本文所披露,产物可以与环境中存在的CO2具有差不多相同数值的碳-12对碳-13对碳-14同位素比率或本文披露的任何比率,其中产物生成自如本文披露的生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其中间体,其中生物来源的产物经化学改性生成最终产品。如本文所述,将己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其中间体的生物来源的产物进行化学改性以生成所需产物的方法为本领域的技术人员熟知。本发明进一步提供与环境中存在的CO2具有差不多相同数值的碳-12对碳-13对碳-14同位素比率的聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、聚氯乙烯(PVC)、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类,其中该聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类直接生成自或组合如本文披露的生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其生物来源的中间体。
己二酸、6-ACA、HMDA和己内酰胺,以及其中间体是在商业以及工业应用中使用的化学品。这类应用的非限制性例子包括生产聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类。而且,己二酸、6-ACA、HMDA和己内酰胺还被作为原料,用于生产各种各样的产品,包括聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类。因此,在某些实施方式中,提供生物基聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类,其包括由本文提供的NNOMO生产的或利用本文披露的方法生产的一种或多种生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其生物来源的中间体。
在一种实施方式中,该产品是聚合物。在一种实施方式中,该产品是塑料。在一种实施方式中,该产品是环氧树脂。在一种实施方式中,该产品是尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)。在一种实施方式中,该产品是纺织品。在一种实施方式中,该产品是聚氨酯。在一种实施方式中,该产品是增塑剂。在一种实施方式中,该产品是不饱和聚酯。在一种实施方式中,该产品是纤维。在一种实施方式中,该产品是聚酯多元醇。在一种实施方式中,该产品是聚氨酯。在一种实施方式中,该产品是润滑剂成分。在一种实施方式中,该产品是PVC。在一种实施方式中,该产品是食品添加剂。在一种实施方式中,该产品是食品成分。在一种实施方式中,该产品是调味剂。在一种实施方式中,该产品是凝胶佐剂。在一种实施方式中,该产品是食品包衣。在一种实施方式中,该产品是食品产品。在一种实施方式中,该产品是口服药物包衣。在一种实施方式中,该产品是口服产品。
如本文所用,术语“生物来源的”指衍生自或合成自生物体以及可以被认为是一种可再生资源,因为它可以由生物体生成。这样一种生物体,尤其是本文披露的微生物体,可以利用原料或生物质,例如,从农业源、植物源、细菌源或动物源获得的糖类或碳水化合物。替代性地,该生物体可以利用大气碳。如本文所用,术语“生物基”指全部或部分地由本文提供的生物来源的化合物组成的如上所述的产物。与生物基或生物来源的产物形成对照的是石油源产物,其中这样一种产物衍生自或合成自石油或石化原料。
在某些实施方式中,提供聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类,其包括生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其生物来源的中间体,其中该生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其生物来源的中间体包含在聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类的生产中所用的全部或部分己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其中间体。因此,在某些方面,提供生物基聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类,其包括如本文披露的至少2%、至少3%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体。附加地,在某些方面,提供生物基聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类,其中在其生产中所用的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体是生物来源的以及石油源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体的组合。例如,生物基聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类可以利用50%生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺以及50%石油源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其他所需比率(如60%/40%、70%/30%、80%/20%、90%/10%、95%/5%、100%/0%、40%/60%、30%/70%、20%/80%、10%/90%)的生物来源的/石油源的前体得以生产,只要产物的至少部分包括由本文披露的微生物所生产的生物体来源的产物。可理解的是,用于利用本文提供的生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体来生产聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯类、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品和口服药物包衣/产品以及诸如此类的方法是本领域熟知的。
在一些实施方式中,本文提供包括生物来源的己二酸的培养基。在一些实施方式中,该生物来源的己二酸通过培养一种具有如本文所提供的MMP和AdiP的NNOMO而得以生产。在某些实施方式中,该生物来源的己二酸具有反映出大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一种实施方式中,该培养基从一种具有MMP和AdiP的NNOMO中分离。
在其他的实施方式中,本文提供生物来源的己二酸。在一些实施方式中,该生物来源的己二酸通过培养一种具有如本文所提供的MMP和AdiP的NNOMO而得以生产。在某些实施方式中,该生物来源的己二酸具有反映出大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一些实施方式中,该生物来源的己二酸具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值。在某些实施方式中,该生物来源的己二酸是培养基的组分。
在某些实施方式中,本文提供一种包括本文提供的生物来源的己二酸(例如通过培养一种具有如本文所提供的MMP和AdiP的NNOMO而生产的生物来源的己二酸)的组合物。在一些实施方式中,该组合物进一步包括非所述生物来源的己二酸的化合物。在某些实施方式中,该非所述生物来源的己二酸的化合物是一种具有如本文所提供的MMP和AdiP的NNOMO的痕量细胞部分。
在一些实施方式中,本文提供一种包括本文提供的生物来源的己二酸的生物基产品。在某些实施方式中,该生物基产品是聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品包衣/产品或口服药物包衣/产品。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少5%生物来源的己二酸。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少10%生物来源的己二酸。在一些实施方式中,该生物基产品包括至少20%生物来源的己二酸。在其他的实施方式中,该生物基产品包括至少30%生物来源的己二酸。在一些实施方式中,该生物基产品包括至少40%生物来源的己二酸。在其他的实施方式中,该生物基产品包括至少50%生物来源的己二酸。在一种实施方式中,该生物基产品包括作为重复单元的一部分所述生物来源的己二酸。在另一实施方式中,本文提供通过模制本文提供的该生物基产品而获得的模制的产品。在其他的实施方式中,本文提供一种用于生产本文提供的生物基产品的方法,包括在生产所述生物基产品的反应中,使所述生物来源的己二酸与自身或另一化合物发生化学反应。
在某些实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的己二酸或通过其转化而获得的聚合物。在其他的实施方式中,本文提供一种用于生产聚合物的方法,包括使该生物来源的己二酸化学或酶转化为该聚合物。在仍然其他的实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的己二酸或其细胞裂解物或培养上清液的组合物。
在一些实施方式中,本文提供包括生物来源的6-ACA的培养基。在一些实施方式中,该生物来源的6-ACA通过培养一种具有如本文所提供的MMP和6-ACAP的NNOMO而得以生产。在某些实施方式中,该生物来源的6-ACA具有反映出大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一种实施方式中,该培养基从一种具有MMP和6-ACAP的NNOMO中分离。
在其他的实施方式中,本文提供生物来源的6-ACA。在一些实施方式中,该生物来源的6-ACA通过培养一种具有如本文所提供的MMP和6-ACAP的NNOMO而得以生产。在某些实施方式中,该生物来源的6-ACA具有反映出大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一些实施方式中,该生物来源的6-ACA具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值。在某些实施方式中,该生物来源的6-ACA是培养基的组分。
在某些实施方式中,本文提供一种包括本文提供的生物来源的6-ACA(例如通过培养一种具有如本文所提供的MMP和6-ACAP的NNOMO而生产的生物来源的6-ACA)的组合物。在一些实施方式中,该组合物进一步包括非所述生物来源的6-ACA的化合物。在某些实施方式中,该非所述生物来源的6-ACA的化合物是一种具有如本文所提供的MMP和6-ACAP的NNOMO的痕量细胞部分。
在一些实施方式中,本文提供一种包括本文提供的生物来源的6-ACA的生物基产品。在某些实施方式中,该生物基产品是聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品包衣/产品或口服药物包衣/产品。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少5%生物来源的6-ACA。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少10%生物来源的6-ACA。在一些实施方式中,该生物基产品包括至少20%生物来源的6-ACA。在其他的实施方式中,该生物基产品包括至少30%生物来源的6-ACA。在一些实施方式中,该生物基产品包括至少40%生物来源的6-ACA。在其他的实施方式中,该生物基产品包括至少50%生物来源的6-ACA。在一种实施方式中,该生物基产品包括作为重复单元的一部分所述生物来源的6-ACA。在另一实施方式中,本文提供通过模制本文提供的该生物基产品而获得的模制的产品。在其他的实施方式中,本文提供一种用于生产本文提供的生物基产品的方法,包括在生产所述生物基产品的反应中,使所述生物来源的6-ACA与自身或另一化合物发生化学反应。在某些实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的6-ACA或通过其转化而获得的聚合物。在其他的实施方式中,本文提供一种用于生产聚合物的方法,包括使该生物来源的6-ACA化学或酶转化为该聚合物。在仍然其他的实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的6-ACA或其细胞裂解物或培养上清液的组合物。
在一些实施方式中,本文提供包括生物来源的HMDA的培养基。在一些实施方式中,该生物来源的HMDA通过培养一种具有如本文所提供的MMP和HMDAP的NNOMO而得以生产。在某些实施方式中,该生物来源的HMDA具有反映出大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一种实施方式中,该培养基从一种具有MMP和HMDAP的NNOMO中分离。
在其他的实施方式中,本文提供生物来源的HMDA。在一些实施方式中,该生物来源的HMDA通过培养一种具有如本文所提供的MMP和HMDAP的NNOMO而得以生产。在某些实施方式中,该生物来源的HMDA具有反映出大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一些实施方式中,该生物来源的HMDA具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值。在某些实施方式中,该生物来源的HMDA是培养基的组分。
在某些实施方式中,本文提供一种包括本文提供的生物来源的HMDA(例如通过培养一种具有如本文所提供的MMP和HMDAP的NNOMO而生产的生物来源的HMDA)的组合物。在一些实施方式中,该组合物进一步包括非所述生物来源的HMDA的化合物。在某些实施方式中,该非所述生物来源的HMDA的化合物是一种具有如本文所提供的MMP和HMDAP的NNOMO的痕量细胞部分。
在一些实施方式中,本文提供一种包括本文提供的生物来源的HMDA的生物基产品。在某些实施方式中,该生物基产品是聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品包衣/产品或口服药物包衣/产品。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少5%生物来源的HMDA。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少10%生物来源的HMDA。在一些实施方式中,该生物基产品包括至少20%生物来源的HMDA。在其他的实施方式中,该生物基产品包括至少30%生物来源的HMDA。在一些实施方式中,该生物基产品包括至少40%生物来源的HMDA。在其他的实施方式中,该生物基产品包括至少50%生物来源的HMDA。在一种实施方式中,该生物基产品包括作为重复单元的一部分所述生物来源的HMDA。在另一实施方式中,本文提供通过模制本文提供的该生物基产品而获得的模制的产品。在其他的实施方式中,本文提供一种用于生产本文提供的生物基产品的方法,包括在生产所述生物基产品的反应中,使所述生物来源的HMDA与自身或另一化合物发生化学反应。在某些实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的HMDA或通过其转化而获得的聚合物。在其他的实施方式中,本文提供一种用于生产聚合物的方法,包括使该生物来源的HMDA化学或酶转化为该聚合物。在仍然其他的实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的HMDA或其细胞裂解物或培养上清液的组合物。
在一些实施方式中,本文提供包括生物来源的己内酰胺的培养基。在一些实施方式中,该生物来源的己内酰胺通过培养一种具有如本文所提供的MMP和CapP的NNOMO而得以生产。在某些实施方式中,该生物来源的己内酰胺具有反映出大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一种实施方式中,该培养基从一种具有MMP和CapP的NNOMO中分离。
在其他的实施方式中,本文提供生物来源的己内酰胺。在一些实施方式中,该生物来源的己内酰胺通过培养一种具有如本文所提供的MMP和CapP的NNOMO而得以生产。在某些实施方式中,该生物来源的己内酰胺具有反映出大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一些实施方式中,该生物来源的己内酰胺具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值。在某些实施方式中,该生物来源的己内酰胺是培养基的组分。
在某些实施方式中,本文提供一种包括本文提供的生物来源的己内酰胺(例如通过培养一种具有如本文所提供的MMP和CapP的NNOMO而生产的生物来源的己内酰胺)的组合物。在一些实施方式中,该组合物进一步包括非所述生物来源的己内酰胺的化合物。在某些实施方式中,该非所述生物来源的己内酰胺的化合物是一种具有如本文所提供的MMP和CapP的NNOMO的痕量细胞部分。
在一些实施方式中,本文提供一种包括本文提供的生物来源的己内酰胺的生物基产品。在某些实施方式中,该生物基产品是聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙(如尼龙-6或尼龙6-6)、纺织品、聚氨酯、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品包衣/产品或口服药物包衣/产品。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少5%生物来源的己内酰胺。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少10%生物来源的己内酰胺。在一些实施方式中,该生物基产品包括至少20%生物来源的己内酰胺。在其他的实施方式中,该生物基产品包括至少30%生物来源的己内酰胺。在一些实施方式中,该生物基产品包括至少40%生物来源的己内酰胺。在其他的实施方式中,该生物基产品包括至少50%生物来源的己内酰胺。在一种实施方式中,该生物基产品包括作为重复单元的一部分所述生物来源的己内酰胺。在另一实施方式中,本文提供通过模制本文提供的该生物基产品而获得的模制的产品。在其他的实施方式中,本文提供一种用于生产本文提供的生物基产品的方法,包括在生产所述生物基产品的反应中,使所述生物来源的己内酰胺与自身或另一化合物发生化学反应。在某些实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的己内酰胺或通过其转化而获得的聚合物。在其他的实施方式中,本文提供一种用于生产聚合物的方法,包括使该生物来源的己内酰胺化学或酶转化为该聚合物。在仍然其他的实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的己内酰胺或其细胞裂解物或培养上清液的组合物。
本文还提供一种生产甲醛的方法,包括在各种条件下培养本文提供的NNOMO(如包括编码EM9(1J)的外源性核酸)达足以生产甲醛的时间段。在某些实施方式中,该甲醛被消耗以提供还原当量。在其他的实施方式中,该甲醛被消耗以掺入己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺。在仍然其他的实施方式中,该甲醛被消耗以掺入另一目的产品。
本文还提供一种生产糖酵解的中间体和/或可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体的方法,包括在各种条件下培养本文提供的NNOMO(如包括编码EM9(1J)的外源性核酸)达足以生产该中间体的时间段。在一种实施方式中,该方法是一种生产糖酵解的中间体的方法。在其他的实施方式中,该方法是一种生产可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体的方法。在某些实施方式中,该中间体被消耗以提供还原当量。在其他的实施方式中,该中间体被消耗以掺入己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺。在仍然其他的实施方式中,该甲醛被消耗以掺入另一目的产品。
还原当量可以通过包含-3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶和NAD(P)依赖性甲酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的若干中心代谢反应任何一种而从糖酵解中间体中容易地获得。附加地,还原当量可以生成自戊糖磷酸途径的葡萄糖6-磷酸-1-脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶。总之,最多十二种还原当量可以从C6糖酵解中间体(如6-磷酸葡萄糖、F6P、1,6-二磷酸果糖)中获得以及最多六种还原当量可以生成自C3糖酵解中间体(如DHAP、-3-磷酸甘油醛)。
本文一般地参照新陈代谢反应、反应物或其产物,或者具体地参照一种或多种编码酶(所述酶与所参照的新陈代谢反应、反应物或产物有关或者催化所参照的新陈代谢反应、反应物或产物)的核酸或基因对本发明进行描述。除非本文另有明确规定,本领域的技术人员会理解对反应的参照也构成了对所述反应的反应物以及产物的参照。同样,除非本文另有明确规定,对反应物或产物的参照也是对反应的参照以及对任何这些新陈代谢组分的那种参照也是参照一种或者多种的编码酶或蛋白质的基因,所述酶催化所参照的反应、反应物或产物以及所述蛋白质包含在所参照的反应、反应物或产物中。同样地,考虑到熟知的新陈代谢生物化学、酶学和基因组学领域,本文对基因或编码核酸的参照也构成对相应的被编码的酶和其催化的反应;或者与所述反应,以及所述反应的反应物和产物相关的蛋白质的参照。
微生物通常缺乏合成己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺的能力,并且因此任何所述化合物被本文披露将在该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的化合物家族内;或以其他方式为本领域人员所知在该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的化合物家族内。此外,具有从本文所述的酶和示范的生化途径生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的所有必要的代谢酶功能的生物尚且未知。与此相反,本文提供的NNOMO可以生成作为产品的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺及其中间体。己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺及其中间体的生物合成在己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的化合物家族的化学合成中是特别有用的,它也顾及己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺家族化合物的进一步生物合成并且完全避免了化学合成程序。
通过确保宿主微生物包含本文提供的至少一种己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径的完全生物化学合成的功能能力而生产本文提供的能够生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的NNOMO。确保至少一种必要的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径赋予该宿主微生物己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成能力。
本文一般地参照新陈代谢反应、反应物或其产物,或者具体地参照一种或多种编码酶(所述酶与所参照的新陈代谢反应、反应物或产物有关或者催化所参照的新陈代谢反应、反应物或产物)的核酸或基因对生物和方法进行描述。除非本文另有明确规定,本领域的技术人员会理解对反应的参照也构成了对所述反应的反应物以及产物的参照。同样,除非本文另有明确规定,对反应物或产物的参照也是对反应的参照,以及对任何这些新陈代谢组分的参照也是参照一种或者多种的编码酶或蛋白质的基因,所述酶催化所参照的反应、反应物或产物以及所述蛋白质包含在所参照的反应、反应物或产物中。同样地,考虑到熟知的新陈代谢生物化学、酶学和基因组学领域,本文对基因或编码核酸的参照也构成对相应的被编码的酶和其催化的反应;或者与所述反应以及所述反应的反应物和产物相关的蛋白质的参照。
本文所述的NNOMO可以通过引入可表达的核酸来生产,该核酸编码一种或者多种的参与一种或者多种甲醇代谢、甲醛同化、甲酸再利用(同化)和/或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径的酶或蛋白质。根据选定用于生物合成的宿主微生物,可以表达用于部分或者全部的具体甲醇代谢、甲醛同化、甲酸同化和/或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径的核酸。例如,如果在所需的代谢、同化或生物合成途径中,选定的宿主存在一种或者多种的酶或蛋白质的缺陷,则将用于缺陷的一种或者多种的酶或蛋白质的可表达的核酸引入该宿主用于后续的外源性表达。替代性地,如果该选定的宿主显示出一些途径酶的内源性表达,但是在其他方面存在缺陷,则需要用于缺陷的一种或者多种的酶或蛋白质的编码核酸,以实现己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成和/或甲醇新陈代谢。因此,可以通过引入外源酶或者蛋白质活性以获得所需的代谢途径来生产本文所述的NNOMO;和/或可以通过引入与一种或者多种内源性的酶或者蛋白质一起生产所需的产品(如己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺)的一种或者多种外源酶或者蛋白质活性以获得所需的生物合成途径。
宿主微生物可以选自以及该NNOMO可以生成于,例如细菌、酵母、真菌或各种其他适用于或适合于发酵过程的微生物的任意一种。示例性的细菌包括选自如下的任何物种:肠杆菌目,肠杆菌科家族,包含大肠杆菌和克雷伯杆菌属;气单胞菌目,琥珀酸弧菌科家族,包含厌氧螺菌属;巴斯德菌目,巴斯德菌科家族,包含放线杆菌和曼氏杆菌属;根瘤菌目,慢生根瘤菌科家族,包含根瘤菌属;芽胞杆菌目,芽胞杆菌科家族,包含芽胞杆菌属;放线菌目,棒状杆菌科和链霉菌科家族,分别包含棒状杆菌属和链霉菌属;红螺菌目,醋酸杆菌科家族,包含葡糖杆菌属;鞘氨醇单胞菌目,鞘氨醇单胞菌科家族,包含酵单胞菌属;乳酸杆菌目,乳酸杆菌和链球菌科家族,分别包含乳酸杆菌属和乳球菌属;梭菌目,梭菌科家族,梭菌属;以及假单胞菌目,假单胞菌科家族,包含假单胞菌属。宿主细菌的非限制性物种包含大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、菜豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、氧化葡糖杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、萤光假单胞菌以及恶臭假单胞菌。
类似地,酵母或真菌物种的典型物种包含选自如下的任何物种:酵母菌目,酵母菌科家族,包含酵母菌属、克鲁维酵母菌属和毕赤酵母属;酵母菌目,耶罗威亚酵母菌科家族,包含耶罗威亚酵母菌属;裂殖酵母菌目,裂殖酵母菌科家族,包含裂殖酵母菌属;散囊菌目,发菌科家族,包括曲霉属;以及毛霉菌目,毛霉菌科家族,包括根霉菌属。宿主酵母或真菌的非限制性物种包含酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉、毕赤酵母、无根根霉菌、稻根霉菌、解脂耶罗维亚酵母等等。大肠杆菌是一种特别有用的宿主生物,因为其是一种适于基因工程的具有良好表征的微生物。其他特别有用的宿主生物包括酵母,如酿酒酵母。理解的是,任何适合的宿主微生物可用以引入新陈代谢和/或基因修饰,以生产所需的产品。
在一些实施方式中,该宿主微生物可以是与野生型微生物相比,具有增加的琥珀酸(丁二酸)产量的重组微生物。增加的琥珀酸产量可以通过引入宿主微生物基因和/或外源性核酸的一种或多种基因破坏而实现。增加微生物中琥珀酸产量的方法为本领域所熟知。例如,该宿主微生物可以是重组的细菌,如瘤胃细菌,其包含选自如2007年3月8日公开的美国公开号2007-0054387、现在的美国专利7,470,530和2009年8月13日公开的美国公开号2009-0203095中所述的一种或多种基因中的基因破坏:乳酸脱氢酶基因(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl)、磷酸转乙酰酶基因(pta)和乙酸激酶基因(ackA)。例如,在一个方面,该宿主微生物可以包含编码ldhA、pta和ackA的基因中的基因破坏,而不会破坏编码pfl的基因。因此,在一些方面,可以被用作宿主微生物的细菌包含但不限于曼氏菌属(如曼氏菌属LPK、曼氏菌属LPK4、曼氏菌属LPK7、曼氏菌属LPK(KCTC10558BP)、曼氏产琥珀酸菌MBEL55E(KCTC 0769BP)、曼氏产琥珀酸菌PALK(KCTC10973BP)、曼氏产琥珀酸菌ALK或曼氏产琥珀酸菌ALKt)、放线杆菌属(如产琥珀酸放线杆菌)、类杆菌属、琥珀酸单胞菌属、琥珀酸弧菌属或厌氧螺菌属(如产琥珀酸厌氧螺菌)。
用于生产具有增加的琥珀酸产量的宿主微生物的附加方法也为本领域所熟知。例如,该宿主微生物可以具有编码ldhA、pfl和磷酸丙酮酸羧化酶(ppc)的基因中的基因破坏;或替代性地/附加地编码葡萄糖磷酸转移酶(ptsG)和丙酮酸激酶(pykA和pykF)的基因中的基因破坏;或替代性地/附加地编码琥珀酸半醛脱氢酶(GabD)的基因中的基因破坏;或替代性地/附加地编码C4-二羧酸转运蛋白(DctA)的核酸的引入或扩增,该转运蛋白,如2010年12月30日公开的美国公开号2010-0330634中所述与琥珀酸的转运相关联。相应地,宿主微生物可以包含流明(rumen?)细菌、棒状杆菌属、短杆菌属或埃希氏菌属(如大肠杆菌,尤其是如2009年3月19日公开的美国公开号2009-0075352中所述的菌株W3110GFA)。仍然作为另一实施例,具有增加的琥珀酸产量的宿主微生物可以如2007年2月22日公开的美国公开号2007-0042476、2007年2月22日公开的美国公开号2007-0042477和2008年1月24日公开的美国公开号2008-0020436中所述,通过引入编码增加琥珀酸产量的酶或蛋白质的外源性核酸而生成,所述公开号披露了编码苹果酸酶B(maeB)、富马酸水合酶C(fumC)、甲酸脱氢酶D(fdhD)或甲酸脱氢酶E(fdhE)的核酸的引入。额外的有用的宿主微生物包含但不限于如WO 2009/048202中披露的可以将甘油作为碳源生产琥珀酸的微生物或如EP 2612905中所述,同时将蔗糖和甘油作为碳源,以通过由蔗糖弱化甘油的分解代谢抑制机制而生产琥珀酸的生物。
适于用作用于本文所述的途径和方法的宿主微生物的具有高琥珀酸产量的附加生物包含国际公开号WO 2010/092155和WO 2009/024294以及2010年6月24日公开的美国公开号2010-0159542中所述的那些细菌菌株以及2013年8月1日公开的国际公开号WO 2013/112939中所述的那些酵母菌株。例如,巴斯德氏菌属的细菌菌株(其是革兰氏阴性、兼性厌氧菌,能动、多晶以及经常是过氧化氢酶和氧化酶阳性的),特别是巴斯德氏菌菌株DD1及其变体是合适的宿主微生物。巴斯德氏菌菌株DD1是根据布达佩斯条约在德国DSMZ(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen undZellkulturen,GmbH)保藏的具有保藏号DSM18541的细菌菌株,以及最初从德国源牛的瘤胃中分离。DD1的改良变体被描述于WO 2010/092155中,也是合适的宿主微生物,以及包括但不限于LU15348(缺失pfl基因的DD1);LU15050(缺失ldh基因的DD1);以及LU15224(缺失pfl和ldh两种基因的DD1)。额外的宿主细菌包括属于曼氏菌属,特别是曼氏产琥珀酸菌属,以及曼氏产琥珀酸菌菌株MBEL55E及其变体的从牛瘤胃中分离的琥珀酸生产者。
如WO 2013/112939中所述,示例性宿主酵母菌株可以是包含提高琥珀酸产量和/或输出的修饰的经基因修饰的酵母细胞,并且,在一些方面,可被选择用于琥珀酸容忍性。因此,在一些实施方式中,高琥珀酸生产宿主细胞可以是包括提高琥珀酸产量和/或输出的基因修饰的酵母细胞,以及在一些方面,可以容忍增加的细胞内和/或胞外琥珀酸浓度。在一些实施方式中,经基因修饰的酵母细胞属于选自如下的属:伊萨酵母属、念珠菌属、毕赤酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、德巴利氏酵母属和复膜孢酵母属。因此,在一些实施方式中,经基因修饰的酵母细胞是选自如下的物种:东方伊萨酵母、郎比可假丝酵母、假丝酵母sorboxylosa、假丝酵母zemplinina、假丝酵母geochares、膜醭毕赤酵母、接合酵母kombuchaensis、假丝酵母sorbosivorans、马克斯克鲁维酵母、假丝酵母vanderwaltii、假丝酵母sorbophila、二孢接合酵母、接合酵母lentus、贝酵母、酵母bulderi、德巴利氏酵母castellii、博伊丁假丝酵母、埃切假丝酵母、乳酸克鲁维酵母、杰丁毕赤酵母、异常毕赤酵母、复膜孢酵母crataegensis和杰丁毕赤酵母。在一些实施方式中,经基因修饰的酵母细胞来自发酵毕赤酵母/东方伊萨酵母进化枝。
依据选定的宿主微生物的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成,甲醇代谢和/或FAP构成,本文提供的NNOMO将包含至少一种外源性表达的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺、甲醛同化、甲酸再利用和/或MMP-编码的核酸乃至用于一种或多种己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径、FAP、FRP和/或MMP的所有的编码核酸。例如,通过外源性表达相应的编码核酸在存在途径酶或者蛋白质缺陷的宿主内建立己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成。在存在己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径的所有的酶或者蛋白质缺陷的宿主内,可以包含该途径中所有的酶或者蛋白质的外源性表达,虽然理解的是,即使该宿主包含至少一种途径酶或者蛋白质,也可以表达该途径的所有的酶或者蛋白质。例如,可以包含用于生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的途径中所有的酶或者蛋白质的外源性表达。这同样适用于本文提供的MMP和FAP。
考虑到本文提供的教诲和指导,本领域的技术人员会理解以可表达的形式引入的编码核酸的数量将,至少,等于所选定的宿主微生物的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP、FAP、FRP和MMP缺陷量。因此,本文提供的NNOMO可以具有一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种甚或所有的编码本文披露的构成MMP、FAP、FRP和/或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径的酶或蛋白质的核酸。在一些实施方式中,该NNOMO还可以包含其他促进或者优化己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成;甲醛同化;甲酸再利用和/或甲醇新陈代谢或者赋予该宿主微生物其他有用的功能的基因修饰。一种这类的其他功能性可以包括例如,对一种或者多种己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径前体的合成的增强。
一般地,宿主微生物应该这样选择以便其生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径的前体,作为自然生产的分子或作为工程产物,其提供所需前体的从新生产或由该宿主微生物自然生产的前体的增加生产。宿主生物可以设计以增加前体的生产,正如本文所披露。此外,已被设计以生产所需前体的微生物可用作宿主生物并进一步被设计,以表达单独的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径或组合MMP、FAP和/或FRP的的酶或蛋白质。
在一些实施方式中,本文提供的NNOMO生成自包含合成己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺,同化甲醛,再利用甲酸和/或使甲醇新陈代谢的酶催能力的宿主。在该特定的实施方式中,其可用以增加己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径产品;FAP产品;FRP产品和/或MMP产品(如还原当量和/或甲醛)的合成或堆积以,例如促使发生己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径反应,以便生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。合成或堆积的增加可以通过,例如编码一种或多种上述的AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP;FAP;FRP和/或MMP酶或蛋白质的核酸的过表达来完成。该AdiP、6-ACAP、HMDAP、CapP、FAP、FRP和/或MMP的一种或多种酶和/或蛋白质的过表达的发生可以,例如通过一种或多种内源性基因的外源性表达或通过一种或多种异源性基因的外源性表达。因此,通过一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种乃至所有的编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径;和/或MMP酶或蛋白质的核酸的过表达,天然存在的生物可以很容易地生成为,例如生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的NNOMO。此外,非天然存在的生物可以通过造成己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺;甲醛同化;甲酸再利用和/或MMP生物合成途径中酶活性的增加的内源性基因的诱变来生成。
在特别有用的实施方式中,采用编码核酸的外源性表达。外源性表达赋予对宿主定制表达和/或调节元件的能力以及获得使用人控制的所需的表达水平的应用。然而,其他实施方式中还可以利用内源性表达,例如当连接至诱导型启动子或其他调节元件时,通过去除负调节效应子或基因启动子的诱导利用内源性表达。因此,具有天然存在的诱导型启动子的内源性基因可以通过提供适当的诱导剂上调;或者内源性基因的调节区域可设计以纳入诱导调节元件,从而允许在需要的时候调节内源性基因的上调表达。同样,可以包括诱导型启动子,作为针对引入NNOMO的外源性基因的调节元件。
理解的是,在本文提供的方法中,任何所述一种或者多种外源性核酸可被引入微生物以生产本文提供的NNOMO。该核酸可被引入以便赋予该微生物,例如己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成;甲醛同化;甲酸再利用和/或MMP。替代性地,可以引入编码核酸,以生产具有生物合成能力的中间体微生物,以催化所需的反应的一些,从而赋予己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成;甲醛同化;甲酸再利用和/或甲醇代谢能力。例如,具有己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径;FAP;FRP和/或MMP的NNOMO可以包括至少两种编码所需的酶或者蛋白质的外源性核酸。因此,应理解的是,生物合成途径、FAP、FRP和/或甲醇代谢途径的两种或两种以上酶或蛋白质的任意组合可以包含在本文提供的NNOMO中。同样,应理解的是,按照要求,生物合成途径、FAP、FRP和/或代谢途径的三种或三种以上酶或蛋白质的任意组合可以包含在本文提供的NNOMO中,只要所需的生物合成途径、FAP、FRP和/或代谢途径的酶或蛋白质的组合导致相应的所需产品的产生。同样,按照要求,本文披露的生物合成途径、FAP、FRP和/或MMP的四种或四种以上酶或蛋白质的任意组合可以包含在本文提供的NNOMO中,只要所需的生物合成、同化、再利用和/或代谢途径的酶或蛋白质的组合导致相应的所需产品的产生。在具体的实施方式中,该生物合成途径是己二酸、6-氨基己酸酯、HMDA或己内酰胺生物合成途径。
除如本文所述的甲醇的新陈代谢、甲醛的同化、甲酸的再利用和己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成之外,提供的NNOMO和方法也可以通过彼此间以及与本领域熟知的其他微生物和方法进行各种组合来应用,以通过其他路径实现产品生物合成。例如,除了使用己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产者之外,一种生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的替代性方法是通过加入另一种能够将己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中间体转化为己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的微生物。一种这样的程序包括例如,生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中间体的微生物的发酵。该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中间体然后可以用作将己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中间体转化为己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的第二微生物的底物。该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中间体可以被直接加入该第二生物的另一培养物或该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中间体生产者的原始培养物可以通过,例如细胞分离耗尽这些微生物,然后可以利用将第二生物随后加入发酵肉汤,以生产最终产品而无中间体纯化的步骤。这同样适用于本文提供的MMP、FAP和FRP。
在其他实施方式中,本文提供的NNOMO和方法在各种各样的子途径中进行组合,以实现,例如己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成。在这些实施方式中,可以将用于所需产品的生物合成途径分离到不同的微生物中,以及可以共同培养该不同的微生物,以生产最终产品。在这种生物合成方案中,一种微生物的产物是用于第二微生物的底物,直至合成最终产品。例如,可以通过构建如下微生物完成己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成:该微生物包含用于将一个途径中间体转化为另一途径中间体或产物的生物合成途径。替代性地,也可以通过利用相同器皿内的两种生物的共同培养或共同发酵从微生物生物合成生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺,其中第一种微生物生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺中间体以及第二种微生物将该中间体转化为己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。这同样适用于本文提供的MMP、FAP和FRP。
考虑到本文提供的教诲和指导,本领域的技术人员会理解存在针对该NNOMO和方法,连同其他微生物、具有子途径的其他非NNOMO的共同培养物以及本领域熟知的生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺和/或使甲醇新陈代谢的其他化学和/或生化程序的组合的各种各样的组合和排列。
用于己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺;甲醛同化;甲酸再利用或甲醇代谢途径酶或蛋白质的编码核酸的来源可以包括,例如其中被编码的基因产物能够催化参照反应的任何物种。这类物种既包括原核生物又包括真核生物,包括但不仅限于细菌(包括古生细菌和真细菌)以及真核生物(包括酵母)、植物、昆虫、动物以及哺乳动物(包括人)。针对这种源的示例性物种包括,例如大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、克鲁佛氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、氨基丁酸梭菌(Clostridiumaminobutyricum)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、斯蒂克兰德氏梭菌(Clostridium sticklandii)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonian Eutropha)、牛结核分支杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、假单胞菌属(Pseudomonas species)(包括绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens))、智人(Homo sapiens)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、类球红细菌(Rhodobacter spaeroides)、布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、勤奋生金球菌(Metallosphaerasedula)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)、玫瑰屈挠菌castenholzii(Roseiflexuscastenholzii)、赤细菌属(Erythrobacter)、加州希蒙得木(Simmondsiachinensis)、不动杆菌(Acinetobacter)种(包括乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)和baylyi不动杆菌(Acinetobacter baylyi))、牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、硫化叶菌tokodaii(Sulfolobus tokodaii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、薄肌眼虫(Euglena gracilis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、盐沼沙雷氏菌(Halobacterium salinarum)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、嗜热菌泉生古细菌(Aeropyrum pernix)、野猪(Susscrofa)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentans)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、假丝酵母(Candida)、土曲霉(Aspergillusterreus)、戊糖片球菌(Pedicoccus pentosaceus)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilus)、巴斯德氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurians)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、巴克氏真杆菌(Eubacterium barkeri)、多毛拟杆菌(Bacteroides capillosus)、Anaerotruncus colihominis、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilusm)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、非丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、具核梭杆菌(Fusobacterium nuleatum)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、海洋γ变形杆菌(marine gammaproteobacterium)、产丁酸细菌(butyrate-producing bacterium)、艾瓦诺卡氏菌(Nocardia iowensis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、烟草(Nicotiana tabacum)、稻(Oryza sativa)、地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligenus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、家鼠(Mus musculus)、克鲁维酵母(Lachancea kluyveri)、阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、牛(Bos taurus)、粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)、需氧热棒菌(Pyrobaculumaerophilum)、包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)MC2155、鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10(Mycobacterium avium subsp.ParatuberculosisK-10)、海分枝杆菌M(Mycobacterium marinum M)、微代谢冢村氏菌DSM20162(Tsukamurella paurometabola DSM 20162)、蓝菌属PCC7001(Cyanobium PCC7001)、盘基网柄菌AX4(Dictyostelium discoideum AX4),以及本文披露的或可作为相应基因的来源生物的其他示例性物种。
在某些实施方式中,用于AdiPE、6-ACAPE、HMDAPE或CapPE的编码核酸的来源包含反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、不动杆菌baylyi(Acinetobacterbaylyi)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、不动杆菌种ADP1(Acinetobacter sp.ADP1)、不动杆菌种菌株M-1(Acinetobacter sp.StrainM-1)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、Alkaliphilusmetalliredigenes QYF、闪烁古生球菌DSM 4304(Archaeoglobus fulgidus DSM4304)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、牛(Bos Taurus)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、艰难梭菌630(Clostridium difficile 630)、克鲁佛氏梭菌(Clostridium kluyveri)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032)、大肠杆菌(Escherichia coli)、大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)、薄肌眼虫(Euglena gracilis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、死海盐盒菌ATCC 43049(Haloarculamarismortui ATCC 43049)、盐沼沙雷氏菌(Halobacterium salinarum)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、智人(Homo sapiens)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、勤奋生金球菌(Metallosphaera sedula)、家鼠(Mus musculus)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas knackmussii(B13)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌种(Pseudomonas sp)、需氧热棒菌菌株IM2(Pyrobaculum aerophilum str.IM2)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonian Eutropha)、褐鼠(Rattus norvegicus)、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、链霉菌种2065(Streptomyces sp.2065)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、硫化叶菌tokodaii(Sulfolobustokodaii)、野猪(Sus scrofa)、热厌氧杆菌种X514(Thermoanaerobacter sp.X514)、腾冲嗜热厌氧杆菌MB4(Thermoanaerobacter tengcongensis MB4)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)和生枝动胶菌(Zoogloea ramigera),以及本文披露的或可作为相应基因的来源生物的其他示例性物种。
在某些实施方式中,用于MMPE的编码核酸的来源包含鲍氏不动杆菌Naval-82、产琥珀酸放线杆菌130Z(Actinobacillus succinogenes 130Z)、Allochromatium vinosum DSM 180、维涅兰德固氮菌DJ(Azotobactervinelandii DJ)、嗜碱芽孢杆菌ATCC 27647(Bacillus alcalophilus ATCC27647)、产氮芽孢杆菌LMG 9581(azotoformans LMG 9581)、凝固芽孢杆菌36D1(Bacillus coagulans 36D1)、甲醇芽孢杆菌MGA3(Bacillusmethanolicus MGA3)、甲醇芽孢杆菌PB1(Bacillus methanolicus PB1)、甲醇芽孢杆菌PB-1(Bacillus methanolicus PB-1)、史密斯芽孢杆菌(Bacillussmithii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)、吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)、稳定伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)、泰国伯克霍尔德氏菌E264(Burkholderia thailandensis E264)、伯克霍尔德氏菌目细菌Joshi_001(Burkholderiales bacterium Joshi_001)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Candidamethylica、生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、生氢氧化碳嗜热菌Z-2901(Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2901)、柄杆菌种AP07(Caulobacter sp.AP07)、丙酮丁醇梭菌ATCC 824(Clostridiumacetobutylicum ATCC 824)、尿酸梭菌(Clostridium acidurici)、食一氧化碳梭菌P7(clostridium carboxidivorans P7)、食纤维梭菌743B(Clostridiumcellulovorans 743B)、克鲁佛氏梭菌(Clostridium kluyveri)、克鲁佛氏梭菌DSM 555(Clostridium kluyveri DSM 555)、扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、扬氏梭菌DSM 13528、巴斯德氏梭菌(Clostridiumpasteurianum)、巴斯德氏梭菌DSM 525、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、产气荚膜梭菌ATCC 13124、产气荚膜梭菌菌株13(Clostridiumperfringens str.13)、梭菌phytofermentans ISDg(Clostridium phytofermentansISDg)、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067(Corynebacterium glutamicum ATCC14067)、谷氨酸棒杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)、棒状杆菌种U-96(Corynebacterium sp.U-96)、变异棒状杆菌(Corynebacteriumvariabile)、钩虫贪铜菌N-1(Cupriavidus necator N-1)、脱亚硫酸菌hafniense(Desulfitobacterium hafniense)、金属还原脱亚硫酸菌DSM 15288(Desulfitobacterium metallireducens DSM 15288)、还原脱硫肠状菌MI-1(Desulfotomaculum reducens MI-1)、沃尔维斯湾非洲脱硫弧菌菌株(Desulfovibrio africanus str.Walvis Bay)、食果糖脱硫弧菌JJ(Desulfovibriofructosovorans JJ)、普通脱硫弧菌菌株Hildenborough(Desulfovibrio vulgarisstr.Hildenborough)、普通脱硫弧菌菌株‘宫崎F’(Desulfovibrio vulgaris str.‘Miyazaki F’)、大肠杆菌、大肠杆菌K-12、大肠杆菌K-12MG1655、产黄菌frigoris(Flavobacterium frigoris)、地芽孢杆菌种Y4.1MC1(Geobacillussp.Y4.1MC1)、热反硝化地芽孢杆菌NG80-2(Geobacillus themodenitrificansNG80-2)、Geobacter bemidjiensis Bem、硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)、硫还原地杆菌PCA(Geobacter sulfurreducens PCA)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、智人、人类肠道宏基因组(human gutmetagenome)、嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)、反硝化生丝微菌ATCC 51888(Hyphomicrobium denitrificans ATCC 51888)、札氏生丝微菌(Hyphomicrobium zavarzinii)、肺炎克雷伯氏菌亚种肺炎MGH 78578(zavarzinii,Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae MGH 78578)、赖氨酸芽孢杆菌fusiformis(Lysinibacillus fusiformis)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)、百脉根中生根瘤菌MAFF303099(Mesorhizobium loti MAFF303099)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)、噬乙酸甲烷八叠球菌C2A(Methanosarcina acetivorans C2A)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马氏甲烷八叠球菌Tuc01(Methanosarcina mazei Tuc01)、海洋甲基细菌(Methylobacter marinus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、扭脱甲基杆菌AM1(Methylobacterium extorquens AM1)、荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatis)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、包皮垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、亚硝化侏儒菌salaria BD31(Nitrosopumilussalaria BD31)、加尔加亚硝化球菌Ga9.2(Nitrososphaera gargensis Ga9.2)、念珠蓝细菌种PCC 7120(Nostoc sp.PCC 7120)、皮奥里亚类芽孢杆菌KCTC3763(Paenibacillus peoriae KCTC 3763)、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、发光深海嗜压菌3TCK(Photobacterium profundum 3TCK)、毕赤酵母、Picrophilus torridus DSM9790、绿脓假单胞菌PA01、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌丁香致病变种B728a、富养罗尔斯通氏菌、富养罗尔斯通氏菌H16、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)、类球红细菌ATCC 17025、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、沼泽红假单胞菌CGA009、沼泽红假单胞菌DX-1、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、酿酒酵母、酿酒酵母S288c、肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2、白蚁塞巴鲁德菌ATCC 33386(Sebaldella termitidis ATCC 33386)、奥奈达希瓦式菌MR-1(Shewanellaoneidensis MR-1)、苜蓿中华根瘤菌1021(Sinorhizobium meliloti 1021)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocalarius)、硫磺矿硫化叶菌P-2(Sulfolobussolfataricus P-2)、集胞蓝细菌属菌株PCC 6803(Synechocystis str.PCC6803)、互营杆菌fumaroxidans(Syntrophobacter fumaroxidans)、芳香索氏菌(Thauera aromatica)、热厌氧杆菌种X514(Thermoanaerobacter sp.X514)、海栖热球菌(Thermococcus litoralis)、嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)、桃红荚硫菌(Thiocapsa roseopersicina)、哈氏弧菌ATCCBAA-1116(Vibrio harveyi ATCC BAA-1116)、自养黄色杆菌Py2(Xanthobacter autotrophicus Py2)和玉蜀黍(Zea mays),以及本文披露的或可作为相应基因的来源生物的其他示例性物种。
在某些实施方式中,用于FAPE的编码核酸的来源包含氨基氨基酸单胞菌、甲醇芽孢杆菌MGA3、甲醇芽孢杆菌PB1、枯草芽孢杆菌、博伊丁假丝酵母、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌、地芽孢杆菌属GHH01、地芽孢杆菌属M10EXG、地芽孢杆菌属Y4.1MC1、肺炎克雷伯氏菌、鞭毛甲基菌(Methylobacillus flagellates)、鞭毛甲基菌KT、荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatas)、Methylomicrobium album BG8、Methylomonas aminofaciens、食葡糖食甲基菌SIP3-4(Methylovorus glucosetrophus SIP3-4)、食甲基菌MP688、分支杆菌属菌株JC1DSM 3803、胃分枝杆菌、Ogataea angusta、Ogataea parapolymorpha DL-1(多形汉森酵母DL-1)、热球菌abyssi(Pyrococcus abyssi)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏热球菌OT3(Pyrococcus horikoshii OT3)、酿酒酵母S288c(Saccharomyces cerevisiaeS288c)和热球菌kodakaraensis(Thermococcus kodakaraensis),以及本文披露的或可作为相应基因的来源生物的其他示例性物种。
在某些实施方式中,用于FRPE的编码核酸的来源包含不动杆菌baylyi、乙酸钙不动杆菌、不动杆菌属菌株M-1、Archaeglubus fulgidus、闪烁古生球菌DSM 4304、球形节杆菌、甲醇芽孢杆菌MGA3、甲醇芽孢杆菌PB1、亚硒酸盐还原芽孢杆菌MLS10、枯草芽孢杆菌、稳定伯克霍尔德氏菌、空肠弯曲杆菌、白色念珠菌、博伊丁假丝酵母、假丝酵母methylica(Candidamethylica)、生氢氧化碳嗜热菌、短杆菌肽、克氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895、丙酮丁醇梭菌、丙酮丁醇梭菌ATCC 824、尿酸梭菌、拜氏梭菌、梭菌carboxidivoransP7、食纤维梭菌743B、克鲁佛氏梭菌、克鲁佛氏梭菌DSM555、扬氏梭菌DSM、扬氏梭菌DSM 13528、巴斯德氏梭菌、产气荚膜梭菌、梭菌phytofermentans ISDg、糖乙酸多丁醇梭菌、谷氨酸棒杆菌、棒状杆菌属、隐孢子虫parvum Iowa II、蓝菌属PCC7001、Desulfatibacillumalkenivorans AK-01、脱亚硫酸菌hafniense、非洲脱硫弧菌、食果糖脱硫弧菌JJ、盘基网柄菌AX4、大肠杆菌、薄肌眼虫、具核梭杆菌、硫还原地杆菌PCA、死海盐盒菌ATCC 43049、幽门螺杆菌、智人、肺炎克雷伯氏菌、嗜酸乳杆菌、短乳杆菌ATCC 367、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌、勤奋生金球菌、蝗绿僵菌CQMa 102(Metarhizium acridum CQMa 102)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、家鼠、鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10、牛结核分支杆菌BCG、海分枝杆菌M、包皮垢分支杆菌MC2155、皮疽诺卡氏菌IFM 10152、艾瓦诺卡氏菌(NRRL 5646种)、产甲酸草酸杆菌、产黄青霉菌、海洋伯金斯虫ATCC 50983(Perkinsus marinus ATCC 50983)、牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonasgingivalis)、牙龈红棕色单胞菌W83(Porphyromonas gingivalis W83)、恶臭假单胞菌、假单胞菌属、需氧热棒菌菌株IM2、富养罗尔斯通氏菌、富养罗尔斯通氏菌H16、褐鼠、稻根霉菌、混浊红球菌B4、酿酒酵母、酿酒酵母S288c、肠沙门氏菌、肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2、肠沙门氏菌Typhimurium、鼠伤寒沙门氏菌、粟酒裂殖酵母、变异链球菌、灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌、硫化叶菌tokodaii、互营杆菌fumaroxidans、腾冲嗜热厌氧杆菌MB4、阴道滴虫G3、布氏锥虫和微代谢冢村氏菌DSM 20162,以及本文披露的或可作为相应基因的来源生物的其他示例性物种。
然而,今天超过550个物种的完整的基因组序列是可得的(这些物种中超过一半的基因组序列在公用数据库,如NCBI中可以得到),包括395种微生物基因组和各种酵母、真菌、植物以及哺乳动物基因组,在这种情况下,编码针对近缘或远缘物种中一种或多种基因的必要的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径;甲醇代谢;甲醛同化和/或甲酸再利用活性的基因的识别(包括,例如已知基因的同系、直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换)以及生物之间基因改变的互换在本领域是常规且熟知的。因此,实现本文所述的关于特定生物(如大肠杆菌)的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成;甲醇的新陈代谢;甲醛的同化和/或甲酸的再利用的新陈代谢改变可以以同样的方式很容易地应用到其他微生物,包括原核和真核生物。考虑到本文提供的教诲和指导,本领域的技术人员会得知在一种生物中示范的新陈代谢改变可以同样地应用于其他生物。
在某些情况下,例如当替代性己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成;甲醛同化;甲酸再利用和/或甲醇代谢途径存在于不相关的物种中时,可以通过,例如来自催化相似的、但非完全相同的新陈代谢反应以取代参照反应的不相关物种的一种旁系同源物或多种旁系同源物的外源性表达,赋予该宿主物种己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成;甲醛同化;甲酸再利用和/或甲醇新陈代谢。由于不同的生物之间存在新陈代谢网络间的某些差异,本领域的技术人员会理解不同生物之间的实际的基因用法可以存在差异。然而,考虑到本文提供的教诲和指导,本领域的技术人员还会理解,本文提供的教诲和方法可以通过利用对本文那些示例性的微生物所作的同源新陈代谢改变应用于所有的微生物,以在有关的物种中构建会合成己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺;同化甲醛;再利用甲酸和/或使甲醇新陈代谢。
编码AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP酶或蛋白质的核酸分子也可以包括与本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的核酸杂交的核酸分子或与编码本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸分子。杂交条件可以包含为本领域技术人员所熟知的高度严格、中度严格或低度严格性杂交条件,如本文所述的那些条件。类似地,可以在本发明中使用的核酸分子可被描述为具有与本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的核酸或与编码本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸特定百分比的序列一致性。例如,该核酸分子可以与本文所述的核酸至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。
严格的杂交是指其中杂交的多聚核苷酸是稳定的条件。正如为本领域的技术人员已知,杂交的多聚核苷酸的稳定性被反映在杂化物的熔化温度(Tm)中。在一般情况下,杂交的多聚核苷酸的稳定性是盐浓度(如钠离子浓度)和温度的函数。杂交反应可以在较低度严格性,继之以多样化,但更高度严格性洗涤条件下进行。对杂交严格性的引用涉及这样的洗涤条件。高度严格的杂交包含仅仅允许于65℃在0.018M NaCl中形成稳定的多聚核苷酸的那些核酸序列的杂交的条件,例如,如果杂交物于65℃在0.018MNaCl中是不稳定的,如本文所考虑,其在高度严格性条件下是不稳定的。高度严格性条件可以,例如通过于42℃在50%甲酰胺、5X Denhart氏溶液、5X SSPE、0.2%SDS中杂交,然后于65℃在0.1X SSPE和0.1%SDS中洗涤而提供。非高度严格的杂交条件的杂交条件也可以被用以描述本文所披露的核酸序列。例如,短语中度严格的杂交是指等同于如下的条件:于42℃在50%甲酰胺、5X Denhart氏溶液、5X SSPE、0.2%SDS中杂交,继之以于42℃在0.2X SSPE、0.2%SDS中洗涤。短语低度严格性杂交是指等同于如下的条件:于22℃在10%甲酰胺、5X Denhart氏溶液、6X SSPE、0.2%SDS中杂交,继之以于37℃在1X SSPE、0.2%SDS中洗涤。Denhart氏溶液包含1%聚蔗糖、1%聚乙烯吡咯烷酮和1%牛血清白蛋白(BSA)。20X SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙烯酰胺四乙酸(EDTA))包含3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M(EDTA)。其他合适的低度、中度、高度严格性杂交缓冲液和条件为本领域技术人员所熟知以及被描述于,例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring HarborLaboratory,纽约(2001);以及Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley和Sons,马里兰州巴尔的摩(1999)。
编码AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP酶或蛋白质的核酸分子可具有与本文所披露的核苷酸序列至少特定的序列一致性。相应地,在本发明的一些方面,编码AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP酶或蛋白质的核酸分子具有与本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的核酸;或与编码本文中由SEQ ID号、GenBank和/或GI号披露的氨基酸序列的核酸分子杂交的核酸分子,至少65%的同一性、至少70%的同一性、至少75%的同一性、至少80%的同一性、至少85%的同一性、至少90%的同一性、至少91%的同一性、至少92%的同一性、至少93%的同一性、至少94%的同一性、至少95%的同一性、至少96%的同一性、至少97%的同一性、至少98%的同一性的核苷酸序列。
序列一致性(也称同源性或相似性)是指两种核酸分子之间或两种多肽之间的序列相似性。同一性可以通过比较每种可为比较之目的而进行比对的序列中的位置来确定。当所比较序列中的位置由相同的碱基或氨基酸占据时,则在该位置的分子是一致的。序列之间的一致性的程度是由序列共有的匹配或同源位置的数目的函数。确定其序列一致性百分比的两种序列的比对可以通过使用本领域中已知的软件程序(例如(作为举例)Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,马里兰州巴尔的摩(1999)中所述的那些)来进行。优选地,将缺省参数用于比对。本领域中熟知的可以使用的一种比对程序是设置为默认参数的BLAST。具体地,程序是使用下列缺省参数的BLASTN和BLASTP:遗传密码=标准;过滤器=无;链=两者;切断=60;期望值=10;矩阵=BLOSUM62;说明=50序列;排序=高分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+瑞士蛋白质+SP更新+PIR。这些程序的详细信息可以在国立生物技术信息中心中找到。
可以例如,通过本领域熟知的重组和检测方法操作用于构建和测试生产非天然存在的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的宿主的表达水平的方法。这类方法的描述可以见于,例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,纽约(2001);Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,马里兰州巴尔的摩(1999)。
可以利用本领域熟知的技术(包括但不限于接合、电穿孔术、化学转换法、转导、转染和超声转换)将用于生产甲醇的新陈代谢;甲醛的同化;甲酸的再利用;和/或己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生产的途径中涉及的外源性核酸序列稳定或瞬时地引入宿主细胞。对于大肠杆菌或其他原核细胞中的外源性表达,真核细胞核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码导向信号(targeting signal),如N-末端线粒体导向信号或其他导向信号,如果需要,其可以在转换进入原核宿主细胞之前被去除。例如,线粒体前导序列的去除导致了大肠杆菌中表达的上调(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于酵母或其他真核细胞中的外源性表达,可以在胞质溶胶中表达基因,而不添加前导序列;或者可以通过添加适于宿主细胞的合适的导向序列(如线粒体导向或分泌信号)将基因导向线粒体或其他细胞器或者导向分泌。因此,理解的是,对核酸序列的适当的以去除或包含导向序列的修改可被纳入外源性核酸序列中,以提供所需的特性。此外,以本领域熟知的技术可以使基因经受密码子优化,以实现蛋白质的优化表达。
表达载体可以被构建以包括如本文所示范的可操作地连接于宿主生物中功能性的表达调控序列的一种或多种己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成;甲醛同化;甲酸再利用和/或甲醇代谢途径-编码核酸。适用于所提供的宿主微生物的表达载体包括,例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体(包括可操作地用以稳定地整合到宿主染色体的载体和选择序列或标记)。此外,该表达载体可以包括一种或多种选择标记基因和适当的表达调控序列。还可以包括,例如提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或者提供培养基中没有的关键营养物的选择标记基因。表达调控序列可以包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子以及本领域熟知的诸如此类的表达调控序列。当两个或两个以上外源性编码核酸被共同表达时,两个核酸都可以被插入,例如单一表达载体或独立表达载体。对于单一载体表达,编码核酸可被可操作地连接到一个共同的表达调控序列或连接到不同的表达调控序列,如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以利用本领域熟知的方法确定新陈代谢或合成途径中涉及的外源性核酸序列的转换。这类方法包括,例如核酸分析法,如Northern印迹法或mRNA聚合酶链反应(PCR)扩增;或基因产物表达免疫印迹法;或其他合适的测试被引入的核酸序列或其相应的基因产物的表达的分析方法。本领域的技术人员理解的是,以足以生产所需产品的量来表达外源性核酸以及进一步理解的是,可以利用本领域熟知的和本文披露的方法优化表达水平以获得足够的表达。
可以利用熟知的方法进行适用于,例如己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产测试的纯化和/或测定。可以为每个设计的待测菌株培育合适的复制品,如一式三份的培养物。例如,可以监测所设计的生产宿主中产物和副产物的形成。可以通过各种方法,例如HPLC(高效液相色谱)、GC-MS(气相色谱-质谱法)和LC-MS(液相色谱-质谱法)或者其他利用本领域熟知的例行程序的合适的分析方法来分析最终产品和中间体以及其他有机化合物。也可以利用培养上清液对产物在发酵肉汤中的释放进行测试。可以利用,例如针对葡萄糖和醇的折光率检测器以及针对有机酸的紫外检测器(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))通过HPLC或本领域熟知的其他合适的测定和检测方法对副产物和残余葡萄糖进行定量。也可以利用本领域熟知的方法对来自外源性DNA序列的个别酶或蛋白质活性进行测定。用于甲醇脱氢酶(图1,步骤J)的活性的示例性测定法被提供于实施例I中。
可以利用本领域熟知的各种方法从培养物中的其他组分中分离己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。这类分离方法包括,例如萃取程序以及包括如下的方法:连续液液萃取法、全蒸发法、膜滤法、膜分离法、反渗透法、电渗析法、蒸馏法、结晶法、离心法、萃取过滤法、离子交换色谱法、体积排阻色谱法、吸附色谱法以及超滤法。所有上述方法为本领域所熟知。
本文所述的任何NNOMO可以被培养以生产和/或分泌生物合成产物或其中间体。例如,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产者可以被培养用于己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成生产。相应地,在一些实施方式中,提供具有本文所述的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺;甲醛同化;甲酸再利用和/或甲醇代谢途径中间体的培养基。在一些方面,该培养基也可以分离自本文提供的生产了该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺;甲醛同化;甲酸再利用和/或甲醇代谢途径中间体的该NNOMO。用于从培养基分离微生物的方法为本领域所熟知。示例性方法包含过滤、絮凝、沉淀、离心、沉降以及诸如此类。
在某些实施方式中,例如,为了生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺,在具有碳源和其他必需营养物的培养基中培养重组菌株。在发酵罐中保持厌氧条件以降低整个过程的消耗,这在有时候是需要的并且肯定是非常可取的。这种条件的获取可以通过,例如首先用氮喷射该培养基,然后用垫片和钳口盖密封烧瓶。对于培育不遵循厌氧的菌株,可以通过在该垫片上打一小孔进行有限通气来采用微氧或者基本上厌氧的条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。示例性的有氧和厌氧条件的描述见于,例如美国公开号2009/0047719。如本文所披露,可以以分批、补料分批或连续的方式进行发酵。如本文所披露,可以以分批、补料分批或连续的方式进行发酵。如果需要的话,发酵也可以以两个阶段进行。第一阶段可以是有氧的,以顾及高生长以及因此高生产率,继之以高6-ACA、HMDA或己内酰胺收率的厌氧阶段。
如果需要,可以将培养基的pH值保持为所需的pH值,特别是按需要通过添加碱(如NaOH或其他碱)或酸保持为中性pH值(如约7的pH值),以将培养基保持在所需的pH值。可以通过利用分光光度计(600nm)测量光密度确定生长速率,以及可以通过监测随着时间的推移碳源的消耗确定葡萄糖摄取速率。
生长培养基可以包括,例如任何可以向该NNOMO提供碳源的碳水化合物源。这类源包括,例如糖类(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和淀粉)或甘油,单独作为唯一的来源碳或组合本文所述的或本领域已知的其他的碳源。在一种实施方式中,该碳源是糖。在一种实施方式中,该碳源是含糖的生物质。在一些实施方式中,该糖是葡萄糖。在一种实施方式中,该糖是木糖。在另一实施方式中,该糖是阿拉伯糖。在一种实施方式中,该糖是半乳糖。在另一实施方式中,该糖是果糖。在其他的实施方式中,该糖是蔗糖。在一种实施方式中,该糖是淀粉。在某些实施方式中,该碳源是甘油。在一些实施方式中,该碳源是粗甘油。在一种实施方式中,该碳源是不经处理的粗甘油。在其他的实施方式中,该碳源是甘油和葡萄糖。在另一实施方式中,该碳源是甲醇和甘油。在一种实施方式中,该碳源是二氧化碳。在一种实施方式中,该碳源是甲酸。在一种实施方式中,该碳源是甲烷。在一种实施方式中,该碳源是甲醇。在某些实施方式中,甲醇被单独用作唯一的来源碳或组合本文所述的或本领域已知的其他的碳源。在具体的实施方式中,该甲醇是仅有的(唯一的)碳源。在一种实施方式中,该碳源是化学电-生成的碳(见,如Liao等人(2012)Science 335:1596)。在一种实施方式中,该化学电-生成的碳是甲醇。在一种实施方式中,该化学电-生成的碳是甲酸。在一种实施方式中,该化学电-生成的碳是甲酸和甲醇。在一种实施方式中,该碳源是碳水化合物和甲醇。在一种实施方式中,该碳源是糖和甲醇。在另一实施方式中,该碳源是糖和甘油。在其他的实施方式中,该碳源是糖和粗甘油。在仍然其他的实施方式中,该碳源是糖和不经处理的粗甘油。在一种实施方式中,该碳源是含糖的生物质和甲醇。在另一实施方式中,该碳源是含糖的生物质和甘油。在其他的实施方式中,该碳源是含糖的生物质和粗甘油。在仍然其他的实施方式中,该碳源是含糖的生物质和不经处理的粗甘油。在一些实施方式中,该碳源是含糖的生物质、甲醇和碳水化合物。其他碳水化合物源包括,例如可再生的原料和生物质。可在本文提供的方法中用作原料的示例性类型的生物质包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木素原料或原料的木素部分。这类生物质原料包含,例如用作碳源的碳水化合物底物(如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉)。考虑到本文提供的教诲和指导,本领域的技术人员会理解除上文那些示例性的原料和生物质,可再生的原料和生物质也可用以培养用于生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺和其他的途径中间体的本文提供的该微生物。
在一种实施方式中,该碳源是甘油。在某些实施方式中,该甘油碳源是粗甘油或不经进一步处理的粗甘油。在进一步的实施方式中,该碳源包括甘油或粗甘油以及还包括糖或含糖的生物质,如葡萄糖。在具体的实施方式中,发酵肉汤中甘油的浓度通过进料粗甘油或粗甘油和糖(如葡萄糖)的混合物得以维持。在某些实施方式中,糖被提供用于足够的菌株生长。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从200:1到1:200的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从100:1到1:100的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从100:1到5:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从50:1到5:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在某些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以100:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以90:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以80:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以70:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以60:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以50:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以40:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以30:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以20:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以10:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以5:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以2:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:1的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在某些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:100的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:90的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:80的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:70的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:60的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:50的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:40的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:30的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:20的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供1:10。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:5的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:2的甘油比糖的摩尔浓度比率被提供。在上文提供的比率的某些实施方式中,该糖是含糖的生物质。在上文提供的比率的某些其他的实施方式中,该甘油是粗甘油或不经进一步处理的粗甘油。在上文提供的比率的其他的实施方式中,该糖是含糖的生物质,以及该甘油是粗甘油或不经进一步处理的粗甘油。
粗甘油可以是在生物柴油的生产中产生的副产物,并可以用于发酵而没有任何进一步的处理。生物柴油的生产方法包括:(1)化学方法,其中在酸性或碱性催化剂的存在下,通过酯交换使植物油或动物油的甘油基团被低碳醇(如甲醇或乙醇)取代,以生产相应的脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯;(2)生物方法,其中将生物酶或细胞用于催化酯交换反应以及生产相应的脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯;以及(3)超临界方法,其中在没有任何催化剂的超临界溶剂系统中执行酯交换反应。粗甘油的化学组合物可因被用以生产生物柴油的工艺、酯交换效率、生物柴油的回收效率、原料中的其他杂质以及甲醇和催化剂是否被回收而变化。例如,据报道,从七种澳大利亚生物柴油生产者中收集的十一种粗甘油的化学组合物中的甘油含量的范围介于38%和96%之间,其中一些样品包含多于14%的甲醇和29%的灰分。在某些实施方式中,该粗甘油包括从5%到99%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从10%到90%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从10%到80%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从10%到70%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从10%到60%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从10%到50%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从10%到40%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从10%到30%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从10%到20%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从80%到90%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从70%到90%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从60%到90%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从50%到90%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从40%到90%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从30%到90%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从20%到90%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从20%到40%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从40%到60%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从60%到80%的甘油。在一些实施方式中,该粗甘油包括从50%到70%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括5%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括10%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括15%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括20%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括25%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括30%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括35%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括40%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括45%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括50%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括55%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括60%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括65%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括70%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括75%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括80%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括85%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括90%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括95%的甘油。在一种实施方式中,该甘油包括99%的甘油。
在一种实施方式中,该碳源是甲醇或甲酸。在某些实施方式中,甲醇在本文提供的FAP中被用作碳源。在一种实施方式中,该碳源是甲醇或甲酸。在其他的实施方式中,甲酸在本文提供的FAP中被用作碳源。在具体的实施方式中,甲醇单独在本文提供的MMP或组合本文提供的产品途径中被用作碳源。在一种实施方式中,该碳源是甲醇。在另一实施方式中,该碳源是甲酸。
在一种实施方式中,该碳源包括甲醇;以及糖(如葡萄糖)或含糖的生物质。在另一实施方式中,该碳源包括甲酸;以及糖(如葡萄糖)或含糖的生物质。在一种实施方式中,该碳源包括甲醇;甲酸;以及糖(如葡萄糖)或含糖的生物质。在具体的实施方式中,在发酵进料中该甲醇或甲酸或两者作为与糖(如葡萄糖)或包括糖的生物质混合物被提供。在某些实施方式中,糖被提供用于足够的菌株生长。
在某些实施方式中,该碳源包括甲醇和糖(如葡萄糖)。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从200:1到1:200的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从100:1到1:100的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从100:1到5:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从50:1到5:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在某些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以100:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以90:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以80:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以70:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以60:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以50:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以40:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以30:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以20:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以10:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以5:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以2:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:1的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在某些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:100的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:90的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:80的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:70的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:60的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:50的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:40的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:30的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:20的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:10的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:5的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:2的甲醇比糖的摩尔浓度比率被提供。在上文提供的比率的某些实施方式中,该糖是含糖的生物质。
在某些实施方式中,该碳源包括甲酸和糖(如葡萄糖)。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从200:1到1:200的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从100:1到1:100的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从100:1到5:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从50:1到5:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在某些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以100:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以90:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以80:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以70:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以60:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以50:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以40:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以30:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以20:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以10:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以5:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以2:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:1的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在某些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:100的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:90的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:80的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:70的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:60的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:50的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:40的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:30的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:20的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:10的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:5的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以的甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供1:2。在上文提供的比率的某些实施方式中,该糖是含糖的生物质。
在某些实施方式中,该碳源包括甲醇和甲酸的混合物;以及糖(如葡萄糖)。在某些实施方式中,糖被提供用于足够的菌株生长。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从200:1到1:200的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从100:1到1:100的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从100:1到5:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以从50:1到5:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在某些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以100:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以90:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以80:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以70:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以60:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以50:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以40:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以30:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以20:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以10:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以5:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以2:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:1的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在某些实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:100的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:90的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:80的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:70的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:60的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:50的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:40的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:30的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:20的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:10的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:5的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在一种实施方式中,该糖(如葡萄糖)以1:2的甲醇和甲酸比糖的摩尔浓度比率被提供。在上文提供的比率的某些实施方式中,该糖是含糖的生物质。
考虑到本文提供的教诲和指导,本领域的技术人员会理解,可以生产一种NNOMO,该NNOMO当在碳源(如碳水化合物)上培养时分泌生物合成的化合物。这类化合物包括,例如,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺以及在己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中的任何中间体代谢产物。所有需要的是在一种或多种所需的酶或蛋白质活性中进行设计,以实现所需化合物或中间体(包括,例如部分或全部所述己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径的包涵物)的生物合成。因此,本文提供一种NNOMO,该NNOMO当培育在碳水化合物或其他碳源上时生产和/或分泌己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺以及当培育在碳水化合物或其他碳源上时分泌己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺途径中所示的任何中间体代谢产物。本文提供的所述生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的微生物可以启动始自中间体的合成。这同样适用于甲醛同化、甲酸再利用和甲醇代谢途径中的中间体。
利用本领域熟知的方法如本文所示范构建本文提供的NNOMO,以以足以生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的量外源性表达编码己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生物合成途径和/或MMP酶或蛋白质的至少一种核酸。理解的是,在足以生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的条件下培养该微生物。遵循本文提供的教诲和指导,该NNOMO可以实现己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成,产生在约0.1-500mM或更多之间的细胞内浓度。一般地,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的细胞内浓度在约3-150mM或更多之间,特别地在约5-125mM或更多之间以及更特别地在约8-100mM之间,包括约10mM、20mM、50mM、80mM或更多。也可以从本文提供的NNOMO获得这些示例性范围的每个之间和以上的细胞内浓度。
在一些实施方式中,培养条件包括厌氧或基本上厌氧培育或维持条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。用于发酵过程的示例性的厌氧条件的描述见于本文以及,例如美国公开号US 2009/0047719。任何这些条件可以与该NNOMO以及本领域熟知的其他厌氧条件一起使用。在这种厌氧或基本上厌氧的条件下,该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产者可以合成细胞内浓度为5-100mM或更多以及本文示例性的所有其他浓度的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。理解的是,虽然上文的描述指细胞内浓度,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺可以在细胞内生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺和/或分泌产物到培养基内。
示例性的发酵过程包括但不限于补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离;以及连续发酵和连续分离。在示例性分批发酵协议中,生产生物被培养在用适当的气体喷射的适当大小的生物反应器中。在厌氧条件下,用惰性气体或气体(如氮、N2/CO2混合物、氩气、氦气以及诸如此类)的组合物喷射培养物。随着细胞生长和利用碳源,以大致平衡碳源和/或营养物的消耗量的速率将一种或多种额外的碳源和/或其他营养物进料到该生物反应器中。将该生物反应器的温度保持在期望的温度,通常在22-37摄氏度的范围内,但可以根据生产生物的生长特性和/或发酵过程的所需条件,将该温度保持较高或较低的温度下。生长持续达所需的时间段,以达到发酵罐中培养物的所需特性,例如细胞密度、产物浓度以及诸如此类。在分批发酵过程中,根据所需的培养条件,用于发酵的时间段通常在几个小时至几天,例如,8至24小时;或1、2、3、4或5天;或长达一周的范围内。pH可以根据需要控制或不受控制,在这种情况下,其中pH不受控制的培养物通常将在运行结束前降至pH 3-6。在培育期结束后,可以使发酵器内容物通过细胞分离单元(例如离心机、过滤单元以及诸如此类),以除去细胞和细胞碎片。在将所需的产品细胞内表达的情况下,如需要的话,在从发酵肉汤中分离细胞之前或之后,可以将该细胞裂解或进行酶或化学破坏,以便释放更多的产品。可以将发酵肉汤转移到产品分离单元。通过本领域中采用的标准分离程序而使产物的分离发生以从稀释的水溶液中分离出所需产物。这样的方法包括但不限于根据发酵过程的产品的化学特性,使用与水不混溶的有机溶剂(如甲苯或其他合适的溶剂,包括但不限于二乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)以及诸如此类)以如果适当,提供产物的有机溶液的液-液萃取法;标准蒸馏方法;以及诸如此类。
在示例性完全连续发酵协议中,生产生物一般首先以成批模式长大,以达到所需的细胞密度。当碳源和/或其他营养物被耗尽时,以所需的速率连续提供相同组合物的进料培养基,并且以相同的速率收回发酵液。在这种情况下,生物反应器中的产物浓度以及细胞密度一般保持不变。如以上所讨论,将发酵罐的温度保持在期望的温度。在连续发酵阶段期间,优化生产通常需要维持适当的pH范围。可以使用常规方法(包括加入适宜的酸或碱以维持所需的pH范围)监控并维持pH。连续地操作该生物反应器,根据合适和需要的情况,达延长的时间段,通常至少一周至几周乃至一个月或更长的时间。定期监测发酵液和/或培养物,包括根据需要,每天采样,以确保产品浓度和/或细胞密度的一致性。在连续模式下,发酵罐内容物随着新进料培养物的提供而被不断地去除。包含细胞、培养基和产物的出口流一般都经受连续的产物分离程序,根据需要,除去或不除去细胞和细胞碎片。在本领域中使用的连续的分离方法可以被用来从稀释的水溶液中分离产品,包含但不限于使用与水不混溶的有机溶剂(如甲苯或其他合适的溶剂,包括但不限于二乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)以及诸如此类)的液-液萃取法;标准连续蒸馏方法;以及诸如此类;或本领域熟知的其他方法。
除本文披露的培养和发酵条件之外,用于实现己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成的培育条件可以包括将渗透保护剂添加到培养条件中。在某些实施方式中,可以在渗透保护剂的存在下如本文所述维持、培养或者发酵本文提供的NNOMO。简言之,渗透保护剂指作为渗透物起作用以及帮助如本文所述的微生物经受得住渗透应力的化合物。渗透保护剂包括但不仅限于甜菜碱、氨基酸以及海藻糖。这类渗透保护剂的非限制性的实施例是甘油酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基锍基丙酸(原文拼写错误,应该是dimethylsulfoniopropionate?)、3-二甲基锍基-2-甲基丙酸、哌可酸、二甲基锍基乙酸、胆碱、L-肉毒碱和四氢嘧啶。在一个方面,该渗透保护剂是甘油酸甜菜碱。本领域的任一普通技术人员理解的是,适于保护本文所述的微生物不受渗透应力影响的渗透保护剂的量和类型将取决于所用的微生物。在培养条件下的渗透保护剂的量可以是例如,不多于约0.1mM、不多于约0.5mM、不多于约1.0mM、不多于约1.5mM、不多于约2.0mM、不多于约2.5mM、不多于约3.0mM、不多于约5.0mM、不多于约7.0mM、不多于约10mM、不多于约50mM、不多于约100mM或者不多于约500mM。
培养条件可以包括,例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如本文所描述,在厌氧或基本上厌氧的培养条件下可以获得本文提供的生物合成产物的特别有用的收率。
如本文所描述,一种用于实现己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺以及其他的途径中间体的生物合成的示例性培育条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中,本文提供的NNOMO可以在厌氧或基本上厌氧的条件下维持、培养或发酵。简言之,厌氧条件指缺乏氧的环境。基本上厌氧的条件包括,例如培养菌分批发酵或连续发酵以便培养基中溶解的氧浓度保持在0和10%的饱和度之间。基本上厌氧的条件还包括在保持在小于1%的氧气氛中的密封室内部的液体培养基中或固体琼脂上培育或静置细胞。可以通过,例如用N2/CO2混合物或一种或多种其他合适的非氧气体喷射培养菌来保持氧的百分比。
本文所述的培养条件可以按比例扩大并连续增长,以用于制造己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。示例性的培养程序包括,例如补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离;或者连续发酵和连续分离。所有这些过程都为本领域所熟知。发酵程序对于工业规模的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成生产是特别有用的。一般地以及与非连续培养程序一样,己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的连续和/或接近连续的生产将包括在足够的营养物和培养基中培养本文提供的生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的非天然存在的生物,以维持和/或接近维持指数期的生长。这种条件下的连续培养可以包括,例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天的培育或培养。此外,连续培养可以包括1周、2周、3周、4周或5周或更多周乃至数月。替代性地,如果适于具体的应用,所提供的生物可以培养数小时。理解的是,连续和/或接近连续培养的条件还可以包括这些示例性周期之间的所有的时间间隔。进一步理解的是,本文提供的所述微生物的培养时间是足以生产足够量的用于所需目的的产品的时间段。
发酵程序为本领域所熟知。简言之,可以以,例如补料分批发酵和分批分离;补料分批发酵和连续分离;或连续发酵和连续分离的方式利用用于己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物合成生产的发酵。分批和连续发酵程序的例子为本领域所熟知。
除了上文将该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产者用于相当数量的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的连续的生产的发酵程序,该己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产者还可以,例如同时经受化学合成程序,以将产物转化为其他化合物,或者产物可以从发酵培养物中分离以及后续经受化学和/或酶催转化,以将产物转化为其他化合物(如有需要)。
为生成更好的生产者,可以利用代谢建模优化培育条件。建模还可被用以设计另外优化途径应用的基因敲除(参见,例如美国公开号US2002/0012939、2003/0224363、2004/0029149、2004/0072723、2003/0059792、2002/0168654和2004/0009466;以及美国专利号7,127,379)。建模分析允许对偏移代谢对细胞生长的影响进行可靠的预测,以便更高效地生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。
一种用于识别和设计支持所需产品的生物合成的代谢改变的计算方法是OptKnock计算框架(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。OptKnock是一种代谢建模和模拟程序,该程序提出基因删除或者中断策略,其产生从基因方面来说稳定的微生物体,该微生物体超过定额地生产靶产品。因此,该计算方法可用以识别导致所需产品生物合成的替代性途径或与该NNOMO结合用于所需产品生物合成的进一步优化。本文称为OptKnock的代谢建模和模拟方法的描述见于,例如美国公开号2002/0168654、国际专利公开号PCT/US02/00660以及美国公开号2009/0047719。
另一种用于识别和设计支持产品的生物合成生产的代谢改变的计算方法是一种代谢建模和模拟系统,称为该计算方法和系统的描述见于,例如美国公开号2003/0233218和PCT/US03/18838。是一种计算系统,该系统可用以产生硅内网络模型并用以通过生物系统的化学反应模拟质量、能量或电荷的通量,以限定包含该系统中化学反应的任何以及所有可能的函数的解空间,从而确定该生物系统一系列的允许活性。大肠杆菌代谢的硅内化学计量模型可用以识别代谢途径必需的基因,如先前示范以及描述,见于,例如美国公开号2002/0012939、2003/0224363、2004/0029149、2004/0072723、2003/0059792、2002/0168654和2004/0009466以及见于美国专利号7,127,379。
考虑到本文提供的教诲和指导,本领域的技术人员将能够应用各种用于代谢模型和模拟的计算框架,以在宿主微生物中设计和实施所需化合物的生物合成。
一旦确定,通过至少一个编码该组反应内每个代谢反应的基因的功能中断在靶细胞或生物内实施该组反应,该组反应待中断以便实现所需产品的生产。一种实现该反应组的功能中断的特别有用的手段是通过删除每个编码基因。然而,在某些情况下,通过其他的遗传畸变(包括,例如调节区域如启动子或针对调节因子的顺式结合位点的突变、删除或者通过大量位置的任意处编码序列的截断)中断该反应可能是有利的。
本文示例性的方法允许生物合成地生产所需产品的细胞和生物体的构建,包括靶生化产品的生产与被设计包括所识别的基因改变的细胞或生物生长的强制偶联。代谢修饰组可包括,例如一种或多种生物合成途径酶的添加和/或一种或多种代谢反应的功能中断(包括,例如通过基因删除中断)。
如本文所披露,可将编码AdiP;6-ACAP;HMDAP或CapP;FAP;FRP;和/或MMP的所需活性的核酸引入宿主生物。在某些情况下,修饰AdiP、6-ACAP、HMDAP、CapP、FAP、FRP或MMP酶或者蛋白质的活性以提高己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺;甲醛;和/或还原当量的产量,这会是可取的。例如,可将增加蛋白质或者酶的活性的已知突变引入编码核酸分子。另外,可以采用优化方法来提高酶或者蛋白质的活性和/或降低抑制活性,例如,降低负调节因子的活性。
一种这类的优化方法是定向进化。定向进化是一种涉及引入靶向特异性基因的突变以改善和/或改变酶的特性的强有力的方法。可以通过开发和实施允许许多酶变体(如>104)的自动筛选的敏感性高通量筛选测定确定改善和/或改变的酶。通常进行迭代轮的诱变和筛选,以使酶具有优化的特性。可有助于识别进行诱变的基因区域的计算算法也已经被开发并可以显著地减少需要生成和筛选的酶变体的数目。已经开发了大量的定向进化技术(参阅Hibbert等人,Biomol.Eng 22:11-19(2005);Huisman和Lalonde,InBiocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs.717-742(2007),Patel(ed.),CRC Press;Otten和Quax.Biomol.Eng.22:1-9(2005).;以及Sen等人,Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007))以有效地创建多样化变体库并且这些方法已被成功地应用于许多酶等级范围内各种特性的改善。通过定向进化技术改善和/或改变的酶特性包括,例如选择性/特异性-针对非自然底物的转化;温度稳定性-针对鲁棒高温处理;pH值稳定性-针对较低或较高pH值条件下的生物工艺;底物或产物容忍性(tolerence)–以便可以实现高产物滴度;结合性(Km)-扩大底物结合以包括非自然底物;抑制性(Ki)–以通过产物、底物或关键的中间体去除抑制;活性(kcat)-提高酶催反应速率,以获得所需通量;表达水平-增加蛋白质收率和整个途径通量;氧稳定性-针对在有氧条件下空气敏感性酶的操作;以及厌氧活性-针对缺氧条件下需氧酶的操作。
多种示例性的方法已经被开发用于基因的诱变和多样化以靶向特异性酶的所需特性。这类方法为本领域的技术人员所熟知。任何这些方法可用以改变和/或优化AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP和/或MMP酶或蛋白质的活性。这类方法包含但不限于EpPCR,其通过降低PCR反应中DNA聚合酶的保真度引入随机点突变(Pritchard等人,J.Theor.Biol.234:497-509(2005));易错滚环扩增(epRCA)(Fujii等人,Nucleic Acids Res.32:e145(2004);以及Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006));DNA或家族改组通常涉及以核酸酶(如脱氧核糖核酸酶I或核酸内切酶V)消化两种或两种以上的变体基因,以生成随机片段池,所述随机片段在DNA聚合酶的存在下通过退火和扩展循环进行重装,以创建嵌合基因库(Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:10747-10751(1994);and Stemmer,Nature 370:389-391(1994));交错延伸(StEP)(Zhao等人,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))以及随机引物重组(RPR)(Shao等人,Nucleic Acids Res 26:681-683(1998))。
额外的方法包含异源双链重组(Volkov等人,Nucleic Acids Res.27:e18(1999);以及Volkov等人,Methods Enzymol.328:456-463(2000));临时模板随机嵌合生长(RACHITT)(Coco等人,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001));截短状模板重组延伸(RETT)(Lee等人,J.Molec.Catalysis 26:119-129(2003));简并寡核苷酸基因改组(DOGS)(Bergquist和Gibbs,Methods Mol.Biol.352:191-204(2007)以及Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005);Gibbs等人,Gene 271:13-20(2001));渐进式切割产生杂合酶(ITCHY)(Ostermeier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:3562-3567(1999)以及Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999));硫代渐进式切割产生杂合酶(THIO-ITCHY)(Lutz等人,Nucleic Acids Res.29:E16(2001));SCRATCHY(Lutz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:11248-11253(2001));随机漂变诱变(Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005));序列饱和诱变(SeSaM)(Wong等人,Biotechnol.J.3:74-82(2008);Wong等人,Nucleic Acids Res.32:e26(2004);以及Wong等人,Anal.Biochem.341:187-189(2005));合成改组(Ness等人,Nat.Biotechnol.20:1251-1255(2002));核苷酸交换和切除技术NexT(Muller等人,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))。
进一步的方法包含不依赖序列同源性的蛋白质重组(SHIPREC)(Sieber等人,Nat.Biotechnol.19:456-460(2001));基因位点饱和诱变TM(GSSMTM),其中起始材料包括在所需的突变位点包含插入和两个引物简并的超螺旋双链DNA质粒(Kretz等人,Methods Enzymol.388:3-11(2004));组合式盒式诱变(CCM),其涉及短寡核苷酸盒以大量可能的氨基酸序列改变取代有限区域的用途(Reidhaar-Olson等人Methods Enzymol.208:564-586(1991);以及Reidhaar-Olson等人Science 241:53-57(1988));以及组合式多重盒式诱变(CMCM)(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591(2001));精确诱变(LTM)(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102:8466-8471(2005));基因重装,其是一种DNA改组方法,该方法可以一次应用于多个基因或应用于创建单基因的大型嵌合体(多重突变)文库(由Verenium Corporation提供的可调基因重装TM(TGRTM));计算机模拟的蛋白质设计自动化(PDA),其是一种优化算法,所述算法固定具有特定折叠子的结构上限定的蛋白质骨架,以及为可以稳固该折叠子和整个蛋白质能量的氨基酸替代寻找序列空间,以及一般最有效地作用于具有已知的三维结构的蛋白质(Hayes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:15926-15931(2002));以及迭代饱和诱变(ISM)(Reetz等人,Nat.Protocols 2:891-903(2007);以及Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745-7751(2006))。
前述的用于诱变的任何方法可以单独或以任何组合使用。此外,所述定向进化方法的任何一个或组合可以结合适应性进化技术使用,如本文所述。
如本文所披露,可以在该微生物体培养期间(如在连续和/或接近连续的培养期间)的任何时间点收获或分离己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。一般来说,该微生物体被保持在连续和/或接近连续的培育阶段的时间越长,可以生产的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的量呈比例地更大。
因此,附加地提供一种用于生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的方法,其包含如本文所披露,培养具有一种或多种基因破坏的非天然存在的微生物体。该破坏可以发生于编码增加己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的产量的酶的一种或多种基因中,包含当该基因破坏降低或消除该酶的活性时,可选地将己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产与该微生物体的生长偶联。例如,该破坏可以赋予该非天然微生物体稳定的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生长偶联生产。
在一些实施方式中,该基因破坏可以包括完整的基因缺失。在一些实施方式中,破坏基因的其他方法包括,例如通过省略或添加寡核苷酸或通过使该基因不能操作的突变的移码。但是,本领域的技术人员将认识到由于其赋予非天然存在的生物体的稳定性,恢复到其中该基因缺失尚未发生的亲本表型的基因缺失的优点。具体地,基因破坏被选自如本文所披露的基因组。
一旦对用于破坏的基因组进行计算预测以增加己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的产量,可以对菌株进行构建、进化并测试。通过本领域中熟知的方法将包括基因缺失的基因破坏引入到宿主生物中。用于基因破坏的特别有用的方法是如本文所披露,通过同源重组。
经设计的菌株可以通过测量生长速率、底物摄取速率和/或产品/副产物的分泌速率而得以表征。培养物可以被培育并用作用于新鲜分批培养物(在指数式生长期间对其进行测量)的接种物。生长速率可以通过使用分光光度计(A600)而测量光密度来确定。培养物上清液中的葡萄糖和其他有机酸副产物的浓度可以如本文所披露,通过熟知的方法(如HPLC、GC-MS或适于分析所需产品的其他熟知的分析方法)得以确定,并被用于计算摄取和分泌速率。
包含基因破坏的菌株可以表现出不理想的生长速率,直到它们的代谢网络已经适应了它们失去的功能。为了有助于这样的调整,该菌株可自适应地进化。通过使该菌株经受适应性进化,细胞生长速率成为主要的选择压力以及突变的细胞被迫将它们的代谢通量重新分配,以增强它们的生长速率。新陈代谢的这种重新编程最近已经针对些许大肠杆菌突变体而得以证实,该突变体已经在各种底物上经受适应性进化以达到基于前述,由硅内模型所预测的生长速率(Fong和Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004))。通过适应性进化所带来的生长改善可以伴随着己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺生产的增强速率。该菌株一般以复制方式适应性进化,并行运行,以阐释可以由宿主生物表现出的进化模式的差异(Fong和Palsson,Nat.Genet.36:1056-1058(2004);Fong等人,J.Bacteriol.185:6400-6408(2003);Ibarran等人,Nature 420:186-189(2002)),该差异可以潜在地导致一种菌株比其他菌株具有优越的生产质量。进化可以根据所达到的生长改善速率而运行一段时间,典型地2-6周。在一般情况下,一旦得到稳定的表型,便停止进化。
适应性进化过程之后,新的菌株再次通过测量生长速率、底物摄取速率和/或产品/副产物的分泌速率而得以表征。通过在来自代谢建模的生产包络(envelope)侧面绘制实际的生长和生产收率而将这些结果与理论预测情况进行比较。最成功的设计/进化组合可以被选择以进一步追求,并且在实验室规模分批和持续发酵中得以表征。本文所披露的方法(如OptKnock方法)背后的生长偶联生化生产概念也应导致基因稳定的过剩生产者的生成。因此,以连续的模式保持培养物达延长的时间段,例如,一个月或以上,以评估长期稳定性。可采取周期性样品以确保保持收率和生产率。
有许多用于执行适应性进化的发达技术。示例性方法被披露于本文中。在一些实施方式中,本文提供的NNOMO的优化包含利用适应性进化技术以提高己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺产量和/或生产菌株的稳定性。
连续培养涉及小体积的培育培养物向大得多的包含新鲜生长培养基的容器的重复转移。当经培养的生物体在新容器中已经生长至饱和时,重复该过程。在文献中,在超过数年的时间内清楚地证实再生速率的持续改善的实验中,这种方法已被用来实现持续培养物的最长论证(Lenski和Travisano,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6808-6814(1994))。通常情况下,一般在指数阶段期间进行培养物的转移,因此每一天,转移量经精确计算以在未来24小时内保持指数生长。手动连续稀释便宜且易于并行化。
在连续培养物中,恒化器中的细胞生长表示稀释的极端情况,其中保留有该细胞群的非常高的部分。随着培养物生长并趋于饱和,所培育的培养物的一小部分被替换为新鲜的培养基,允许该培养物以接近其最大种群的规模而持续增长。恒化器已被用来证实按再生速率的快速改善的短周期(Dykhuizen,Methods Enzymol.613-631(1993))。虽然这些设备的潜在用途得以承认,但是传统的恒化器由于抗稀释(稳定)的变体的意外选择而均无法维持长时间对增加的再生速率的选择。这些变体能够通过粘附在该恒化器的表面而抗稀释,并且通过这样做,超越较少粘附的个体(包括那些具有较高的再生速率的个体),从而避免了该设备的预期目的(Chao和Ramsdell,J.Gen.Microbiol 20:132-138(1985))。克服这个缺点的一种可能的方式是执行具有两个培育室的设备,该室,如先前描述周期性地经历灭菌的瞬态阶段(Marliere和Mutzel,美国专利号6,686,194)。
适应性进化生产菌株的替代性方法是EvolugatorTM,其是由Evolugate,LLC(佛罗里达的盖恩斯维尔)开发的连续培养设备并且表现出比传统的进化技术显著的时间和精力的节省(de Crecy等人,.Appl.Microbiol.Biotechnol.77:489-496(2007))。
在一个方面,本文提供一种非天然存在的微生物体(NNOMO),包括:(A)甲醇代谢途径(MMP),其中所述生物体包括编码MMP酶(MMPE)的至少一种外源性核酸,该酶以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性,其中所述MMP包括:(i)甲醇脱氢酶(EM9);(ii)EM9以及甲醛活化酶,(EM10);或(iii)甲醇甲基转移酶(EM1)和亚甲基四氢叶酸还原酶(EM2);以及(B)AdiP,其中所述生物体包括编码AdiPE的至少一种外源性核酸,该AdiPE以足够的量被表达以生产己二酸,其中所述AdiP包括(i)3-氧代己二酰基-CoA硫解酶(EA1);(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;以及(v)EA11A、EA11B、EA11C或EA11D。在一种实施方式中,该AdiP包括EA11A。在另一实施方式中,该AdiP包括EA11B。在另一实施方式中,该AdiP包括EA11C。在另一实施方式中,该AdiP包括EA11D。在一种实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种或五种外源性核酸,每种均编码AdiPE。在另一实施方式中,该至少一种外源性核酸编码AdiPE是异源性核酸。
在另一方面,本文提供一种NNOMO,包括:(A)MMP,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性,其中所述MMP包括:(i)EM9;(ii)EM9和EM10;或(iii)EM1和EM2;以及(B)6-ACAP,其中所述生物体包括编码6-ACAPE的至少一种外源性核酸,该6-ACAPE以足够的量被表达以生产6-ACA,其中所述6-ACAP包括(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;以及(vi)EA6A或EA6B。在一种实施方式中,该6-ACAP包括EA6A。在另一实施方式中,该6-ACAP包括EA6B。在另一实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种、五种或六种外源性核酸,每种均编码6-ACAPE。在一种实施方式中,编码6-ACAPE的该至少一种外源性核酸是异源性核酸。在另一方面,本文提供一种NNOMO,包括:(A)MMP,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性,其中所述MMP包括:(i)EM9;(ii)EM9和EM10;或(iii)EM1和EM2;以及(B)HMDAP,其中所述生物体包括编码HMDAPE的至少一种外源性核酸,该HMDAPE以足够的量被表达以生产HMDA,其中所述HMDAP包括(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;(vi)EA6A或EA6B;(vii)EA7A或EA7B;(viii)EA9;以及(ix)EA10A或EA10B。在一种实施方式中,该HMDAP包括EA6A。在另一实施方式中,该HMDAP包括EA6B。在另一实施方式中,该HMDAP包括EA7A。在另一实施方式中,该HMDAP包括EA7B。在另一实施方式中,该HMDAP包括EA10A。在另一实施方式中,该HMDAP包括EA10B。在另一实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种外源性核酸,每种均编码HMDAPE。在另一实施方式中,编码HMDAPE的至少一种外源性核酸是异源性核酸。
在另一方面,本文提供一种NNOMO,包括:(A)MMP,其中所述生物体包括编码MMPE的至少一种外源性核酸,该MMPE以足够的量被表达以在甲醇的存在下提高还原当量的可用性,其中所述MMP包括:(i)EM9;(ii)EM9和EM10;或(iii)EM1和EM2;以及(B)CapP,其中所述生物体包括编码CapPE的至少一种外源性核酸,该CapPE以足够的量被表达以生产己内酰胺,其中所述CapP包括(1)(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;(vi)EA6A或EA6B;以及(vii)EA7A或EA7B;或(2)(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;(vi)EA6A或EA6B;以及(vii)EA8。在一种实施方式中,该CapP包括(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;(vi)EA6A或EA6B;以及(vii)EA7A或EA7B。在另一实施方式中,该CapP包括EA6A。在另一实施方式中,该CapP包括EA6B。在另一实施方式中,该CapP包括EA7A。在另一实施方式中,该CapP包括EA7B。在另一实施方式中,CapP进一步包括自发的环化作用,其将6-氨基己酰基-CoA转化为己内酰胺。在另一实施方式中,该CapP包括(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;(vi)EA6A或EA6B;以及(vii)EA8。在另一实施方式中,CapP包括EA6A。在另一实施方式中,该CapP包括EA6B。在另一实施方式中,该生物体包括两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种均编码CapPE。在另一实施方式中,至少一种外源性核酸编码CapPE是异源性核酸。
在本文提供的NNOMO的某些实施方式中,该MMP包括EM1和EM2。在一些实施方式中,该MMP包括EM9。在一些实施方式中,该MMP包括EM9和EM10。在一些实施方式中,该MMP包括EM1、EM2、EM3、EM4和EM5。在一些实施方式中,该MMP包括EM1、EM2、EM3、EM4和EM6。在一些实施方式中,该MMP包括EM9、EM3、EM4和EM5。在一些实施方式中,该MMP包括EM9、EM3、EM4和EM6。在一些实施方式中,该MMP包括EM9和EM11。在一些实施方式中,该MMP包括EM9、EM12、EM13和EM14。在一些实施方式中,该MMP包括EM9、EM13和EM14。在一些实施方式中,该MMP包括EM9、EM10、EM3、EM4和EM5。在一些实施方式中,该MMP包括EM9、EM10、EM3、EM4和EM6。在一些实施方式中,该MMP进一步包括EM8。在一些实施方式中,该MMP进一步包括EM15。在一些实施方式中,该MMP进一步包括EM16。在某些实施方式中,生物体包括两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种均编码MMPE。在一些实施方式中,编码MMPE的至少一种外源性核酸是异源性核酸。
在本文提供的NNOMO的一些实施方式中,该生物体进一步包括一种或多种基因破坏,其中所述一种或多种基因破坏发生于编码参与所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种蛋白质或酶的一种或多种内源性基因中,以及其中所述一种或多种基因破坏带来了所述微生物体中增加的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺产量。
在本文提供的NNOMO的一些实施方式中,参与:所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种内源性酶具有减毒的酶活性或表达水平。
在本文提供的NNOMO的其他实施方式中,该生物体进一步包括FAP,其中所述生物体包括编码FAPE的至少一种外源性核酸,该FAPE以足够的量被表达以生产糖酵解的中间体和/或可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体,以及其中所述FAP包括EF1和EF2。在一种实施方式中,该中间体是H6P、F6P或其组合。在本文提供的NNOMO的其他实施方式中,该生物体进一步包括FAP,其中所述生物体包括编码FAPE的至少一种外源性核酸,该FAPE以足够的量被表达以生产糖酵解的中间体和/或可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体,以及其中所述FAP包括EF3和EF4。在一些实施方式中,该中间体是DHA、DHAP或其组合。在其他的实施方式中,该生物体包括两种外源性核酸,每种均编码FAPE。在其他的实施方式中,至少一种外源性核酸是异源性核酸。
在其他的实施方式中,权利要求1至58中任一项的生物体,其中所述生物体在基本上厌氧的培养基中。在某些实施方式中,该微生物体是细菌属、酵母属或真菌属。
在一些实施方式中,本文还提供一种用于生产己二酸的方法,包括在各种条件下培养一种具有本文提供的AdiP的NNOMO达足以生产己二酸的时间段。本文还提供根据该方法生产的一种包括己二酸的生物来源或生物基产品或其中间体。
在一些实施方式中,本文还提供一种用于生产6-ACA的方法,包括在各种条件下培养一种具有本文提供的6-ACAP的NNOMO达足以生产己二酸的时间段。本文还提供根据该方法生产的一种包括6-ACA的生物来源或生物基产品或其中间体。
在一些实施方式中,本文还提供一种用于生产HMDA的方法,包括在各种条件下培养一种具有本文提供的HMDAP的NNOMO达足以生产己二酸的时间段。本文还提供根据该方法生产的一种包括HMDA的生物来源或生物基产品或其中间体。
在一些实施方式中,本文还提供一种用于生产己内酰胺的方法,包括在各种条件下培养一种具有本文提供的CapP的NNOMO达足以生产己二酸的时间段。本文还提供根据该方法生产的一种包括己内酰胺的生物来源或生物基产品或其中间体。
在某些实施方式中,该生物来源或生物基产品选自如下:聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙、尼龙-6、尼龙6-6、纺织品、聚氨酯、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、被覆物、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品、口服或其他药物包衣,以及口服或其他药物产品。
在一些实施方式中,本文还提供了根据本文提供的一种分别生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的方法而生产的生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。本文还提供一种包括该生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的培养基。在某些实施方式中,该生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺具有反映大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一些实施方式中,该培养基从具有该己二酸、6-ACA、HMDA或CapP的NNOMO中分离。在一些实施方式中,该培养基包括生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺,其中所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺具有反映大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率。在一些实施方式中,该生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值。本文还提供一种包括本文提供的所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺以及非所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的化合物的组合物。在某些实施方式中,该非所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的化合物是具有己二酸、6-ACA、HMDA或CapP的痕量细胞部分。在一些实施方式中,本文还提供包括所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的生物基产品,其中所述生物基产品是聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙、尼龙-6、尼龙6-6、纺织品、聚氨酯、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、被覆物、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品、口服或其他药物包衣、口服或其他药物产品。在某些实施方式中,该生物基产品包括至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。在一些实施方式中,该生物基产品包括作为重复单元的一部分所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。在一些实施方式中,本文还提供通过模制本文提供的生物基产品而获得的模制的产品。在一些实施方式中,本文还提供一种用于生产本文提供的生物基产品的方法,包括使所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺与自身或反应中生产所述生物基产品的另一化合物发生化学反应。在其他的实施方式中,本文提供一种包括本文提供的该生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或通过转化其而获得的聚合物。在一些实施方式中,还提供一种用于生产聚合物的方法,包括将该生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺化学或酶转化为该聚合物。在其他的实施方式中,本文提供一种包括该生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺;或其细胞裂解物或培养上清液的组合物。
本文还提供一种生产甲醛的方法,包括在各种条件下培养本文提供的NNOMO达足以生产甲醛的时间段以及可选地其中该甲醛被消耗以提供还原当量或掺入己二酸、6-ACA、HMDA、己内酰胺或目的产品。
本文还提供一种生产糖酵解的中间体和/或可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体的方法,包括在各种条件下培养本文提供的NNOMO达足以生产该中间体的时间段,以及可选地其中该中间体被消耗以提供还原当量或掺入己二酸、6-ACA、HMDA,己内酰胺或目的产品。
在某些实施方式中,该生物被培养于包括生物质、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油、甲醇、二氧化碳、甲酸、甲烷或其任何组合作为碳源的培养基中。
本申请通篇中已经引用了各种出版物。本申请中特此以引用方式并入这些出版物披露的全文(包括GenBank和GI号码公布),以便更充分地描述本发明所属的现有技术水平。虽然已经就上文提供的实施例对本发明进行了描述,但是应该理解的是,在不脱离本发明精神的情况下,可以作出各种修改。
应理解的是,本质上不影响本发明各种实施方式的效能的修改也包含在本文提供的本发明的定义中。因此,下文的实施例旨在说明而非限制本发明。
4.实施例
4.1实施例I–经由MMP生产还原当量
示例性MMP被提供于图1。
图1,步骤A-甲醇甲基转移酶(EM1)
指示为MtaA、MtaB和MtaC的3-甲基转移酶蛋白质的复合物执行所需的EM1活性(Sauer等人,Eur.J.Biochem.243:670-677(1997);Naidu和Ragsdale,J.Bacteriol.183:3276-3281(2001);Tallant和Krzycki,J.Biol.Chem.276:4485-4493(2001);Tallant和Krzycki,J.Bacteriol.179:6902-6911(1997);Tallant和Krzycki,J.Bacteriol.178:1295-1301(1996);Ragsdale,S.W.,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.39:165-195(2004))。
MtaB是一种锌蛋白,其可以催化甲基基团从甲醇转移到MtaC(一种类咕啉蛋白)。编码MtaB和MtaC的示例性基因可以被发现于产甲烷古细菌,如巴氏甲烷八叠球菌(Maeder等人,J.Bacteriol.188:7922-7931(2006)和噬乙酸甲烷八叠球菌(Galagan等人,Genome Res.12:532-542(2002),以及产乙酸菌,热醋穆尔氏菌(Das等人.,Proteins 67:167-176(2007)。在一般情况下,MtaB和MtaC基因在染色体上彼此相邻,因为它们的活性是相互紧密依赖的。巴氏甲烷八叠球菌、噬乙酸甲烷八叠球菌和热醋穆尔氏菌中各种MtaB和MtaC编码基因的蛋白质序列可以通过以下其GenBank登录号得以确认。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
MtaB1 | YP_304299 | 73668284 | 巴氏甲烷八叠球菌 |
MtaC1 | YP_304298 | 73668283 | 巴氏甲烷八叠球菌 |
MtaB2 | YP_307082 | 73671067 | 巴氏甲烷八叠球菌 |
MtaC2 | YP_307081 | 73671066 | 巴氏甲烷八叠球菌 |
MtaB3 | YP_304612 | 73668597 | 巴氏甲烷八叠球菌 |
MtaC3 | YP_304611 | 73668596 | 巴氏甲烷八叠球菌 |
MtaB1 | NP_615421 | 20089346 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
MtaB1 | NP_615422 | 20089347 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
MtaB2 | NP_619254 | 20093179 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
MtaC2 | NP_619253 | 20093178 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
MtaB3 | NP_616549 | 20090474 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
MtaC3 | NP_616550 | 20090475 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
MtaB | YP_430066 | 83590057 | 热醋穆尔氏菌 |
MtaC | YP_430065 | 83590056 | 热醋穆尔氏菌 |
MtaA | YP_430064 | 83590056 | 热醋穆尔氏菌 |
来自巴氏甲烷八叠球菌的该MtaB1和MtaC1基因YP_304299和YP_304298被克隆到大肠杆菌中并测序(Sauer等人,Eur.J.Biochem.243:670-677(1997))。这种甲醇-钴胺素甲基转移酶复合物的晶体结构也是可用的(Hagemeier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:18917-18922(2006))。巴氏甲烷八叠球菌中的MtaB基因YP_307082和YP_304612通过与YP_304299的序列同源性得以确认。在一般情况下,同源性搜索是一种确认EM1的有效手段,因为MtaB编码基因表现出与作用于替代性底物(如三甲胺、二甲胺、一甲胺或二甲硫醚)的甲基转移酶很少或没有的相似性。MtaC基因YP_307081和YP_304611基于其与MtaB基因的近似还有其与YP_304298的同源性得以确认。来自噬乙酸甲烷八叠球菌的三组MtaB和MtaC基因已经进行遗传、生理和生化表征(Pritchett和Metcalf,Mol.Microbiol.56:1183-1194(2005))。缺乏所述组的两组的突变体菌株能在甲醇上生长,而缺乏MtaB和MtaC基因的所有三组的菌株不能在甲醇上生长。这表明,各组基因在甲醇利用中起着作用。热醋穆尔氏菌MtaB基因基于与产甲烷的MtaB基因的同源性以及还通过其与甲醇诱导的类咕啉蛋白MtaC的相邻的染色体的近似得以确认,所述蛋白已结晶(Zhou等人,ActaCrystallogr.Sect.F.Struct.Biol.Cyrst.Commun.61:537-540(2005)以及通过Northern杂交和Western印迹法得以进一步表征((Das等人,Proteins67:167-176(2007))。
MtaA是锌蛋白,其催化甲基基团从MtaC到辅酶M(在产甲烷菌中)或到甲基四氢叶酸(在产乙酸菌中)的转移。MtaA还可以利用甲钴胺作为甲基供体。编码MtaA的示例性基因可以被发现于产甲烷古细菌,如巴氏甲烷八叠球菌(Maeder等人,J.Bacteriol.188:7922-7931(2006)和噬乙酸甲烷八叠球菌(Galagan等人,Genome Res.12:532-542(2002),以及产乙酸菌,热醋穆尔氏菌(Das等人.,Proteins 67:167-176(2007)。在一般情况下,催化甲基基团从CH3到MtaC的MtaA蛋白质难以通过生物信息学确认,因为它们共享与其他类咕啉蛋白甲基转移酶的相似性,并且不是临近染色体上该MtaB和MtaC基因的朝向。然而,一些MtaAn编码基因已被表征在巴氏甲烷八叠球菌和噬乙酸甲烷八叠球菌中。这些基因的蛋白质序列可以通过以下GenBank登录号得以确认。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物 |
MtaA | YP_304602 | 73668587 | 巴氏甲烷八叠球菌 |
MtaA1 | NP_619241 | 20093166 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
MtaA2 | NP_616548 | 20090473 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
来自巴氏甲烷八叠球菌的MtaA基因YP_304602被克隆、测序、并功能表达于大肠杆菌中(Harms和Thauer,Eur.J.Biochem.235:653-659(1996))。在噬乙酸甲烷八叠球菌中,在甲醇上生长需要MtaA1,而MtaA2则是可有可无的,即使MtaA2突变体中从甲醇到甲烷的产量减少(Bose等人,J.Bacteriol.190:4017-4026(2008))。巴氏甲烷八叠球菌和噬乙酸甲烷八叠球菌中有多种附加MtaA同系物,其尚未表征,但也可以催化类咕啉蛋白甲基转移酶活性。
热醋穆尔氏菌中推定MtaAn编码基因通过它们与被表征的产甲烷MtaA基因的序列相似性得以确认。具体地,三种热醋穆尔氏菌基因显示出与来自巴氏甲烷八叠球菌的YP_304602的高度同源性(>30%序列一致性)。考虑到甲基四氢叶酸和辅酶M分别在产甲烷菌和产乙酸菌中的作用,不像天然催化甲基基团从CH3-MTAC到辅酶M的转移的产甲烷MtaA蛋白质,热醋穆尔氏菌MtaA可能将甲基基团转移到甲基四氢叶酸。来自热醋穆尔氏菌的推定MtaAn编码基因的蛋白质序列可以通过以下GenBank登录号得以确认。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
MtaA | YP_430937 | 83590928 | 热醋穆尔氏菌 |
MtaA | YP_431175 | 83591166 | 热醋穆尔氏菌 |
MtaA | YP_430935 | 83590926 | 热醋穆尔氏菌 |
MtaA | YP_430064 | 83590056 | 热醋穆尔氏菌 |
图1,步骤B–亚甲基四氢叶酸还原酶(EM2)
甲基-THF到亚甲基四氢叶酸的转化由EM2被催化。在热醋穆尔氏菌中,这种酶是对氧敏感的并包含铁-硫簇(Clark和Ljungdahl,J.Biol.Chem.259:10845-10849(1984)。这种酶由大肠杆菌中的metF(Sheppard等人,J.Bacteriol.181:718-725(1999)和生氢氧化碳嗜热菌中的CHY_1233(Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005)编码。该热醋穆尔氏菌基因及其生氢氧化碳嗜热菌对应物位于由推定EM16和杂二硫化物还原酶基因分离的CODH/ACS基因簇附近。生物信息学上发现的一些附加候选基因在下面列出。在伍氏醋酸杆菌中,metF通过RnfC2被偶联到Rnf复合物(Poehlein等人,PLoS One.7:e33439)。RnfC的同系物通过BLAST搜索被发现于其他生物体中。已知Rnf复合物是可逆的复合物(Fuchs(2011)Annu.Rev.Microbiol.65:631-658)。
图1,步骤C和D–亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EM3),次甲基四氢叶酸环水解酶(EM4)
在热醋穆尔氏菌、大肠杆菌和生氢氧化碳嗜热菌中,EM4和EM3分别通过Moth_1516、folD和CHY_1878的双功能基因产物执行(Pierce等人,Environ.Microbiol.10:2550-2573(2008);Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005);D'Ari and Rabinowitz,J.Biol.Chem.266:23953-23958(1991))。同系物存在于梭菌carboxidivorans P7中。其他一些生物体也为如下表所示的这种双功能蛋白编码。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Moth_1516 | YP_430368.1 | 83590359 | 热醋穆尔氏菌 |
folD | NP_415062.1 | 16128513 | 大肠杆菌 |
CHY_1878 | YP_360698.1 | 78044829 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CcarbDRAFT_2948 | ZP_05392948.1 | 255526024 | 梭菌carboxidivorans P7 |
folD | ADK16789.1 | 300437022 | 扬氏梭菌DSM 13528 |
folD-2 | NP_951919.1 | 39995968 | 硫还原地杆菌PCA |
folD | YP_725874.1 | 113867385 | 富养罗尔斯通氏菌H16 |
folD | NP_348702.1 | 15895353 | 丙酮丁醇梭菌ATCC 824 |
folD | YP_696506.1 | 110800457 | 产气荚膜梭菌 |
MGA3_09460 | EIJ83438.1 | 387591119 | 甲醇芽孢杆菌MGA3 |
PB1_14689 | ZP_10132349.1 | 387929672 | 甲醇芽孢杆菌PB1 |
图1,步骤E–甲酰四氢叶酸去甲酰酶(EM5)
这种酶催化10-甲酰四氢叶酸(甲酰基-THF)水解为THF和甲酸。在大肠杆菌中,这种酶由purU编码以及已经超过定额地生产、纯化和表征(Nagy,等人,J.Bacteriol.3:1292-1298(1995))。同系物存在于棒状杆菌属U-96(Suzuki,等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.69(5):952-956(2005))、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、肠沙门氏菌和几种额外的生物体中。
图1,步骤F–甲酰四氢叶酸合成酶(EM6)
EM6通过耗费一份ATP而将甲酸连接到四氢叶酸。这种反应由热醋穆尔氏菌中的Moth_0109(O'brien等人,Experientia Suppl.26:249-262(1976);Lovell等人,Arch.Microbiol.149:280-285(1988);Lovell等人,Biochemistry29:5687-5694(1990))、尿酸梭菌中的FHS(Whitehead和Rabinowitz,J.Bacteriol.167:203-209(1986);Whitehead和Rabinowitz,J.Bacteriol.170:3255-3261(1988))、梭菌carboxidivorans中的CHY_2385(Wu等人,PLoSGenet.1:e65(2005))的基因产物催化。同系物存在于梭菌carboxidivorans P7中。这种酶被发现于如下所列的其他一些生物体中。
图1,步骤G–甲酸氢化酶(EM15)
EM15酶可以用来将甲酸转化为二氧化碳和氢气。示例性EM15酶可在大肠杆菌中找到。大肠杆菌EM15由氢化酶3和甲酸脱氢酶-H组成(Maedan等人,Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890(2007))。它是由fhlA的基因产物活化。(Maedan等人,Appl Microbiol Biotechnol 77:879-890(2007))。已显示,向发酵肉汤中加入的微量元素硒、镍和钼增强了EM15活性(Soini等人,Microb.Cell Fact.7:26(2008))。各种氢化酶3、EM8和转录活化子基因如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
hycA | NP_417205 | 16130632 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
hycB | NP_417204 | 16130631 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
hycC | NP_417203 | 16130630 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
hycD | NP_417202 | 16130629 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
hycE | NP_417201 | 16130628 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
hycF | NP_417200 | 16130627 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
hycG | NP_417199 | 16130626 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
hycH | NP_417198 | 16130625 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
hycI | NP_417197 | 16130624 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
fdhF | NP_418503 | 16131905 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
fhlA | NP_417211 | 16130638 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
EM15酶还存在于超嗜热古生细菌海栖热球菌中(Takacs等人,BMC.Microbiol 8:88(2008))。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
mhyC | ABW05543 | 157954626 | 海栖热球菌 |
mhyD | ABW05544 | 157954627 | 海栖热球菌 |
mhyE | ABW05545 | 157954628 | 海栖热球菌 |
myhF | ABW05546 | 157954629 | 海栖热球菌 |
myhG | ABW05547 | 157954630 | 海栖热球菌 |
myhH | ABW05548 | 157954631 | 海栖热球菌 |
fdhA | AAB94932 | 2746736 | 海栖热球菌 |
fdhB | AAB94931 | 157954625 | 海栖热球菌 |
额外的EM15系统已被发现于鼠伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、深红红螺菌、甲酸甲烷杆菌中(Vardar-Scharan等人,Microbial Biotechnology1:107-125(2008))。
图1,步骤H–氢化酶(EM16)
氢化酶酶类可以将氢气转化为质子并将电子转移到受体,如铁氧还蛋白、NAD+或NADP+。富养罗尔斯通氏菌H16将氢作为能量源,将氧作为末端电子受体。其膜结合的摄取[NiFe]-氢化酶是周质朝向的以及经由b型细胞色素连接到呼吸链(Schink和Schlegel,Biochim.Biophys.Acta,567,315-324(1979);Bernhard等人,Eur.J.Biochem.248,179–186(1997))的“耐O2”的氢化酶(Cracknell,等人Proc Nat Acad Sci,106(49)20681-20686(2009))。富养罗尔斯通氏菌还包含由Hox操纵子编码的作为细胞质并直接消耗氢而还原NAD+的耐O2的可溶EM16(Schneider和Schlegel,Biochim.Biophys.Acta 452,66–80(1976);Burgdorf,J.Bact.187(9)3122-3132(2005))。此外,可溶EM16存在于几种其他生物体中,包括硫还原地杆菌(Coppi,Microbiology 151,1239–1254(2005))、集胞蓝细菌属菌株PCC 6803(Germer,J.Biol.Chem.,284(52),36462–36472(2009))以及桃红荚硫菌(Rakhely,Appl.Environ.Microbiol.70(2)722–728(2004))。集胞蓝细菌属酶能够从氢生成NADPH。来自集胞蓝细菌属菌株PCC 6803的Hox操纵子以及由来自念珠蓝细菌属PCC 7120的Hyp操纵子编码的附加基因的过表达导致仅与Hox基因的表达相比,EM16活性得以增加(Germer,J.Biol.Chem.284(52),36462–36472(2009))。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
HoxF | NP_942727.1 | 38637753 | 富养罗尔斯通氏菌H16 |
HoxU | NP_942728.1 | 38637754 | 富养罗尔斯通氏菌H16 |
HoxY | NP_942729.1 | 38637755 | 富养罗尔斯通氏菌H16 |
HoxH | NP_942730.1 | 38637756 | 富养罗尔斯通氏菌H16 |
HoxW | NP_942731.1 | 38637757 | 富养罗尔斯通氏菌H16 |
HoxI | NP_942732.1 | 38637758 | 富养罗尔斯通氏菌H16 |
HoxE | NP_953767.1 | 39997816 | 硫还原地杆菌 |
HoxF | NP_953766.1 | 39997815 | 硫还原地杆菌 |
HoxU | NP_953765.1 | 39997814 | 硫还原地杆菌 |
HoxY | NP_953764.1 | 39997813 | 硫还原地杆菌 |
HoxH | NP_953763.1 | 39997812 | 硫还原地杆菌 |
GSU2717 | NP_953762.1 | 39997811 | 硫还原地杆菌 |
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
HoxE | NP_441418.1 | 16330690 | 集胞蓝细菌属菌株PCC |
HoxF | NP_441417.1 | 16330689 | 集胞蓝细菌属菌株PCC |
未知功能 | NP_441416.1 | 16330688 | 集胞蓝细菌属菌株PCC |
HoxU | NP_441415.1 | 16330687 | 集胞蓝细菌属菌株PCC |
HoxY | NP_441414.1 | 16330686 | 集胞蓝细菌属菌株PCC |
未知功能 | NP_441413.1 | 16330685 | 集胞蓝细菌属菌株PCC |
未知功能 | NP_441412.1 | 16330684 | 集胞蓝细菌属菌株PCC |
HoxH | NP_441411.1 | 16330683 | 集胞蓝细菌属菌株PCC |
HypF | NP_484737.1 | 17228189 | 念珠蓝细菌属PCC 7120 |
HypC | NP_484738.1 | 17228190 | 念珠蓝细菌属PCC 7120 |
HypD | NP_484739.1 | 17228191 | 念珠蓝细菌属PCC 7120 |
未知功能 | NP_484740.1 | 17228192 | 念珠蓝细菌属PCC 7120 |
HypE | NP_484741.1 | 17228193 | 念珠蓝细菌属PCC 7120 |
HypA | NP_484742.1 | 17228194 | 念珠蓝细菌属PCC 7120 |
HypB | NP_484743.1 | 17228195 | 念珠蓝细菌属PCC 7120 |
Hox1E | AAP50519.1 | 37787351 | 桃红荚硫菌 |
Hox1F | AAP50520.1 | 37787352 | 桃红荚硫菌 |
Hox1U | AAP50521.1 | 37787353 | 桃红荚硫菌 |
Hox1Y | AAP50522.1 | 37787354 | 桃红荚硫菌 |
Hox1H | AAP50523.1 | 37787355 | 桃红荚硫菌 |
大肠杆菌和其他肠道细菌编码高达四种EM16酶(Sawers,G.,AntonieVan Leeuwenhoek 66:57-88(1994);Sawers等人,J Bacteriol.164:1324-1331(1985);Sawers and Boxer,Eur.J Biochem.156:265-275(1986);Sawers等人,JBacteriol.168:398-404(1986))。考虑到酶活性的多样性,大肠杆菌或另一宿主生物体可以提供足以裂解进入的分子氢以及还原对应受体的EM16活性。大肠杆菌的内源性氢-裂解酶包括氢化酶3,一种将铁氧化还原蛋白用作受体的膜结合的酶复合物;以及氢化酶4,其还使用铁氧化还原蛋白受体。氢化酶3以及氢化酶4分别由hyc以及hyf基因簇编码。大肠杆菌中的EM16活性还依赖于hyp基因的表达,该基因的对应蛋白质在EM16复合物的装配体中被涉及(Jacobi等人,Arch.Microbiol 158:444-451(1992);Rangarajan等人,J Bacteriol.190:1447-1458(2008))。热醋穆尔氏菌和扬氏梭菌EM16适用于缺乏足够内源性EM16活性的宿主。热醋穆尔氏菌和扬氏梭菌可以将CO2作为唯一碳源而生长,这表明还原当量从H2中提取以经由Wood-Ljungdahl途径实现乙酰基-CoA合成(Drake,H.L.,J Bacteriol.150:702-709(1982);Drake和Daniel,Res Microbiol 155:869-883(2004);Kellum和Drake,JBacteriol.160:466-469(1984))。热醋穆尔氏菌具有来自大肠杆菌的几种hyp、hyc以及hyf基因的同系物。通过如下GenBank登录号确认由这些基因编码的蛋白质序列。此外,编码EM16功能的几种基因簇存在于热醋穆尔氏菌和扬氏梭菌中(见,例如US 2012/0003652)。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
HypA | NP_417206 | 16130633 | 大肠杆菌 |
HypB | NP_417207 | 16130634 | 大肠杆菌 |
HypC | NP_417208 | 16130635 | 大肠杆菌 |
HypD | NP_417209 | 16130636 | 大肠杆菌 |
HypE | NP_417210 | 226524740 | 大肠杆菌 |
HypF | NP_417192 | 16130619 | 大肠杆菌 |
HycA | NP_417205 | 16130632 | 大肠杆菌 |
HycB | NP_417204 | 16130631 | 大肠杆菌 |
HycC | NP_417203 | 16130630 | 大肠杆菌 |
HycD | NP_417202 | 16130629 | 大肠杆菌 |
HycE | NP_417201 | 16130628 | 大肠杆菌 |
HycF | NP_417200 | 16130627 | 大肠杆菌 |
HycG | NP_417199 | 16130626 | 大肠杆菌 |
HycH | NP_417198 | 16130625 | 大肠杆菌 |
HycI | NP_417197 | 16130624 | 大肠杆菌 |
HyfA | NP_416976 | 90111444 | 大肠杆菌 |
HyfB | NP_416977 | 16130407 | 大肠杆菌 |
HyfC | NP_416978 | 90111445 | 大肠杆菌 |
HyfD | NP_416979 | 16130409 | 大肠杆菌 |
HyfE | NP_416980 | 16130410 | 大肠杆菌 |
HyfF | NP_416981 | 16130411 | 大肠杆菌 |
HyfG | NP_416982 | 16130412 | 大肠杆菌 |
HyfH | NP_416983 | 16130413 | 大肠杆菌 |
HyfI | NP_416984 | 16130414 | 大肠杆菌 |
HyfJ | NP_416985 | 90111446 | 大肠杆菌 |
HyfR | NP_416986 | 90111447 | 大肠杆菌 |
热醋穆尔氏菌中,其基因与大肠杆菌EM16基因同源的蛋白质显示如下。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Moth_2175 | YP_431007 | 83590998 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2176 | YP_431008 | 83590999 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2177 | YP_431009 | 83591000 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2178 | YP_431010 | 83591001 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2179 | YP_431011 | 83591002 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2180 | YP_431012 | 83591003 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2181 | YP_431013 | 83591004 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2182 | YP_431014 | 83591005 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2183 | YP_431015 | 83591006 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2184 | YP_431016 | 83591007 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2185 | YP_431017 | 83591008 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2186 | YP_431018 | 83591009 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2187 | YP_431019 | 83591010 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2188 | YP_431020 | 83591011 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2189 | YP_431021 | 83591012 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2190 | YP_431022 | 83591013 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2191 | YP_431023 | 83591014 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2192 | YP_431024 | 83591015 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0439 | YP_429313 | 83589304 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0440 | YP_429314 | 83589305 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0441 | YP_429315 | 83589306 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0442 | YP_429316 | 83589307 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0809 | YP_429670 | 83589661 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0810 | YP_429671 | 83589662 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0811 | YP_429672 | 83589663 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0812 | YP_429673 | 83589664 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0814 | YP_429674 | 83589665 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0815 | YP_429675 | 83589666 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_0816 | YP_429676 | 83589667 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1193 | YP_430050 | 83590041 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1194 | YP_430051 | 83590042 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1195 | YP_430052 | 83590043 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1196 | YP_430053 | 83590044 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1717 | YP_430562 | 83590553 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1718 | YP_430563 | 83590554 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1719 | YP_430564 | 83590555 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1883 | YP_430726 | 83590717 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1884 | YP_430727 | 83590718 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1885 | YP_430728 | 83590719 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1886 | YP_430729 | 83590720 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1887 | YP_430730 | 83590721 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1888 | YP_430731 | 83590722 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1452 | YP_430305 | 83590296 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1453 | YP_430306 | 83590297 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1454 | YP_430307 | 83590298 | 热醋穆尔氏菌 |
来自扬氏梭菌的编码EM16酶的基因如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
CLJU_c20290 | ADK15091.1 | 300435324 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c07030 | ADK13773.1 | 300434006 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c07040 | ADK13774.1 | 300434007 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c07050 | ADK13775.1 | 300434008 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c07060 | ADK13776.1 | 300434009 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c07070 | ADK13777.1 | 300434010 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c07080 | ADK13778.1 | 300434011 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c14730 | ADK14541.1 | 300434774 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c14720 | ADK14540.1 | 300434773 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c14710 | ADK14539.1 | 300434772 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c14700 | ADK14538.1 | 300434771 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c28670 | ADK15915.1 | 300436148 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c28660 | ADK15914.1 | 300436147 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c28650 | ADK15913.1 | 300436146 | 扬氏梭菌 |
CLJU_c28640 | ADK15912.1 | 300436145 | 扬氏梭菌 |
在某些情况下,编码EM16的基因的位置邻接CODH。在深红红螺菌中,经编码的CODH/氢化酶蛋白质形成膜结合的酶复合物,该复合物已表明是这样的位点,其中质子梯度形式的能量从CO和H2O到CO2和H2的转化中生成(Fox等人,J Bacteriol.178:6200-6208(1996))。生氢氧化碳嗜热菌的CODH-I及其邻接基因已被提议基于它们与深红红螺菌CODH/氢化酶基因簇的相似性催化类似的功能作用(Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005))。生氢氧化碳嗜热菌CODH-I还显示当连接到电极时具有强烈的CO氧化和CO2还原活性(Parkin等人,J Am.Chem.Soc.129:10328-10329(2007))。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
CooL | AAC45118 | 1515468 | 深红红螺菌 |
CooX | AAC45119 | 1515469 | 深红红螺菌 |
CooU | AAC45120 | 1515470 | 深红红螺菌 |
CooH | AAC45121 | 1498746 | 深红红螺菌 |
CooF | AAC45122 | 1498747 | 深红红螺菌 |
CODH(CooS) | AAC45123 | 1498748 | 深红红螺菌 |
CooC | AAC45124 | 1498749 | 深红红螺菌 |
CooT | AAC45125 | 1498750 | 深红红螺菌 |
CooJ | AAC45126 | 1498751 | 深红红螺菌 |
CODH-I(CooS-I) | YP_360644 | 78043418 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooF | YP_360645 | 78044791 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
HypA | YP_360646 | 78044340 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooH | YP_360647 | 78043871 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooU | YP_360648 | 78044023 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooX | YP_360649 | 78043124 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooL | YP_360650 | 78043938 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooK | YP_360651 | 78044700 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooM | YP_360652 | 78043942 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooC | YP_360654.1 | 78043296 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooA-1 | YP_360655.1 | 78044021 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
一些EM16和CODH酶将电子转移到铁氧还蛋白。铁氧化还原蛋白是包含作为具有低还原电位的细胞内电子载体起作用的一种或多种铁硫簇的小型酸性蛋白质。被还原的铁氧化还原蛋白供应电子到Fe依赖性酶,如铁氧化还原蛋白-NADP+氧化还原酶、丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(PFOR)以及2-氧代戊二酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(OFOR)。嗜热氢杆菌基因fdx1编码分别通过OFOR和PFOR进行的2-氧代戊二酸以及丙酮酸的可逆羧基化所需的[4Fe-4S]型铁氧化还原蛋白(Yamamoto等人,Extremophiles 14:79-85(2010))。与硫磺矿硫化叶菌2-氧代酸:铁氧化还原蛋白还原酶相关的铁氧化还原蛋白是单体二簇[3Fe-4S][4Fe-4S]型铁氧化还原蛋白(Park等人,2006)。虽然与这种蛋白质相关的基因尚未完全测序,N-末端域具有与来自嗜酸热硫化叶菌的zfx铁氧化还原蛋白的93%同源性。大肠杆菌基因组编码生理功能未知的可溶铁氧化还原蛋白fdx。某些证据表明,这种蛋白质可以在铁硫簇装配体中起作用(Takahashi和Nakamura,1999)。额外的铁氧化还原蛋白蛋白质已被表征于幽门螺杆菌(Mukhopadhyay等人,2003)以及空肠弯曲杆菌(van Vliet等人,2001)。来自巴斯德氏梭菌的2Fe-2S铁氧化还原蛋白已被克隆以及表达于大肠杆菌(Fujinaga和Meyer,Biochemical and Biophysical Research Communications,192(3):(1993))。据预测,产乙酸菌,如热醋穆尔氏菌、梭菌属carboxidivoransP7、扬氏梭菌以及深红红螺菌编码如下所列的几种铁氧化还原蛋白。
铁氧化还原蛋白氧化还原酶将电子从铁氧化还原蛋白或黄素氧化还原蛋白转移到NAD(P)H。催化电子从被还原的铁氧化还原蛋白到NAD(P)+的可逆转移的两种酶是铁氧化还原蛋白:NAD+氧化还原酶(EC 1.18.1.3)以及铁氧化还原蛋白:NADP+氧化还原酶(FNR,EC 1.18.1.2)。铁氧化还原蛋白:NADP+氧化还原酶(FNR,EC 1.18.1.2)具有便于将电子从NADPH可逆转移到低电位受体,如铁氧化还原蛋白或黄素氧化还原蛋白的非共价结合的FAD辅因子(Blaschkowski等人,Eur.J.Biochem.123:563-569(1982);Fujii等人,1977)。由HP1164(fqrB)编码的幽门螺杆菌FNR与丙酮酸:铁氧化还原蛋白氧化还原酶(PFOR)的活性偶联,导致丙酮酸依赖性NADPH的生产(St等人,2007)。类似的酶发现于空肠弯曲杆菌(St Maurice等人,J.Bacteriol.189:4764-4773(2007))。大肠杆菌基因组中,铁氧化还原蛋白:NADP+氧化还原酶由fpr编码(Bianchi等人,1993)。铁氧化还原蛋白:NAD+氧化还原酶利用被还原的铁氧化还原蛋白以从NAD+生成NADH。在几种生物体(包括大肠杆菌)中,这种酶是多功能双加氧酶酶复合物的组分。由hcaD编码的大肠杆菌的铁氧化还原蛋白:NAD+氧化还原酶是芳香族酸利用中所涉及的3-苯基丙酸双加氧酶系统的组分(Diaz等人,1998)。在嗜热氢杆菌的细胞提取物中检测到NADH:铁氧化还原蛋白还原酶活性,虽然具有这种活性的基因尚未表明(Yoon等人,2006)。已在梭菌属carboxydivorans P7中注释额外的铁氧化还原蛋白:NAD(P)+氧化还原酶。由nfnAB编码的克鲁佛氏梭菌的NADH依赖性被还原的铁氧化还原蛋白:NADP氧化还原酶用两当量的NADPH催化伴随的铁氧化还原蛋白和NAD+的还原(Wang等人,J Bacteriol 192:5115-5123(2010))。最后,节能膜相关的Rnf型蛋白质(Seedorf等人,PNAS 105:2128-2133(2008);以及Herrmann,J.Bacteriol 190:784-791(2008))提供从被还原的铁氧化还原蛋白生成NADH或NADPH的手段。
图1,步骤I-甲酸脱氢酶(EM8)
甲酸脱氢酶(FDH;EM8)催化电子从甲酸到受体的可逆转移。具有FDH活性的酶利用各种电子载体,例如(作为举例)NADH(EC 1.2.1.2)、NADPH(EC 1.2.1.43)、醌醇(EC 1.1.5.6)、细胞色素(EC 1.2.2.3)和EM16s(EC 1.1.99.33)。来自热醋穆尔氏菌的FDH酶已被表征(Andreesen和Ljungdahl,J Bacteriol 116:867-873(1973);Li等人,J Bacteriol92:405-412(1966);Yamamoto等人,J Biol Chem.258:1826-1832(1983))。基因座Moth_2312负责编码EM8的α亚基而β亚基由Moth_2314编码(Pierce等人,Environ Microbiol(2008))。编码具有CO2还原倾向的EM8活性的另一组基因由互营杆菌fumaroxidans中的Sfum_2703到Sfum_2706编码(de Bok等人,Eur J Biochem.270:2476-2485(2003));Redan等人,PNAS105:10654-10658(2008))。推定执行相同功能的类似基因组由生氢氧化碳嗜热菌中的CHY_0731、CHY_0732和CHY_0733编码(Wu等人,PLoS Genet1:e65(2005))。EM8也被发现于许多额外的生物体中,包括梭菌carboxidivorans P7、甲醇芽孢杆菌、稳定伯克霍尔德氏菌、热醋穆尔氏菌ATCC 39073、博伊丁假丝酵母、假丝酵母methylica和酿酒酵母S288C。来自富养罗尔斯通氏菌的可溶性EM8还原NAD+(fdsG、-B、-A、-C、-D)(Oh和Bowien,1998)。
已经确认了相比NAD,对作为辅因子的NADP具有更高特异性的若干EM8酶。这种酶已经被视为NADP依赖性甲酸脱氢酶以及据报道,来自5个属种的洋葱伯克霍尔德氏菌复合物。其在多噬伯克霍尔德氏菌、稳定伯克霍尔德氏菌、吡咯伯克霍尔德氏菌和新洋葱伯克霍尔德氏菌的多个菌株中进行了测试和检验(Hatrongjit等人,Enzyme and Microbial Tech.,46:557-561(2010))。来自稳定伯克霍尔德氏菌的酶已被表征以及该酶针对甲酸、NADP和NAD的显而易见的Km据报道,分别是55.5mM、0.16mM和1.43mM。可以使用公共数据库(如NCBI、JGI和宏基因组数据库)中保藏的蛋白质的序列同源性确认更多的候选基因。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Moth_2312 | YP_431142 | 148283121 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_2314 | YP_431144 | 83591135 | 热醋穆尔氏菌 |
Sfum_2703 | YP_846816.1 | 116750129 | 互营杆菌fumaroxidans |
Sfum_2704 | YP_846817.1 | 116750130 | 互营杆菌fumaroxidans |
Sfum_2705 | YP_846818.1 | 116750131 | 互营杆菌fumaroxidans |
Sfum_2706 | YP_846819.1 | 116750132 | 互营杆菌fumaroxidans |
CHY_0731 | YP_359585.1 | 78044572 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CHY_0732 | YP_359586.1 | 78044500 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CHY_0733 | YP_359587.1 | 78044647 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CcarbDRAFT_0901 | ZP_05390901.1 | 255523938 | 梭菌carboxidivorans P7 |
CcarbDRAFT_4380 | ZP_05394380.1 | 255527512 | 梭菌carboxidivorans P7 |
fdhA,MGA3_06625 | EIJ82879.1 | 387590560 | 甲醇芽孢杆菌MGA3 |
fdhA,PB1_11719 | ZP_10131761.1 | 387929084 | 甲醇芽孢杆菌PB1 |
fdhD,MGA3_06630 | EIJ82880.1 | 387590561 | 甲醇芽孢杆菌MGA3 |
fdhD,PB1_11724 | ZP_10131762.1 | 387929085 | 甲醇芽孢杆菌PB1 |
fdh | ACF35003.1 | 194220249 | 稳定伯克霍尔德氏菌 |
fdh | ACF35004.1 | 194220251 | 吡咯伯克霍尔德氏菌 |
fdh | ACF35002.1 | 194220247 | 新洋葱伯克霍尔德氏菌 |
fdh | ACF35001.1 | 194220245 | 多噬伯克霍尔德氏菌 |
fdh | ACF35000.1 | 194220243 | 洋葱伯克霍尔德氏菌 |
FDH1 | AAC49766.1 | 2276465 | 博伊丁假丝酵母 |
fdh | CAA57036.1 | 1181204 | 假丝酵母methylica |
FDH2 | P0CF35.1 | 294956522 | 酿酒酵母S288c |
FDH1 | NP_015033.1 | 6324964 | 酿酒酵母S288c |
fdsG | YP_725156.1 | 113866667 | 富养罗尔斯通氏菌 |
fdsB | YP_725157.1 | 113866668 | 富养罗尔斯通氏菌 |
fdsA | YP_725158.1 | 113866669 | 富养罗尔斯通氏菌 |
fdsC | YP_725159.1 | 113866670 | 富养罗尔斯通氏菌 |
fdsD | YP_725160.1 | 113866671 | 富养罗尔斯通氏菌 |
图1,步骤J–甲醇脱氢酶(EM9)
NAD+依赖性EM9酶(EC 1.1.1.244)催化甲醇和NAD+转化为甲醛和NADH。具有这种活性的酶首先被表征于甲醇芽孢杆菌中(Heggeset,等人,Applied and Environmental Microbiology,78(15):5170–5181(2012))。这种酶是锌和镁依赖性的,并且该酶的活性通过act编码的活化酶得以增强(Kloosterman等人,J Biol Chem 277:34785-92(2002))。该act是Nudix水解酶。这些候选酶的一些已经被确认并显示对甲醇具有活性。额外的NAD(P)+依赖性酶可以通过序列同源性来确认。利用不同的电子受体的EM9酶也是本领域已知的。例子包括细胞色素依赖性酶,如甲基营养生物体扭脱甲基杆菌的mxaIF(Nunn等人,Nucl Acid Res 16:7722(1988))。甲烷氧化菌(例如荚膜甲基球菌)的EM9酶在与甲烷单加氧酶(MMO)的复合物中发挥功能(Myronovan等人,Biochem 45:11905-14(2006))。甲醇还可以通过醇氧化酶,如博伊丁假丝酵母的甲醇氧化酶(EC 1.1.3.13)被氧化成甲醛(Sakai等人,Gene 114:67-73(1992))。
开发了一种体内测定法以确定甲醇脱氢酶的活性。该测定法依赖于甲醛(HCHO)的检测,从而测量该酶的正向活性(甲醇的氧化)。为此,包括BDOP且缺乏frmA、frmB、frmR的菌株使用Lamba Red重组酶技术得以创建(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,697(12):6640-5(2000)。表达甲醇脱氢酶的质粒被转换进入该菌株中,然后于37℃在LB培养基+抗生素中通过振荡培育至饱和。该菌株的转换以空载体作为阴性对照物。培养物通过O.D.调整,然后1:10稀释为M9培养基+0.5%葡萄糖+抗生素并于37℃振荡培养6-8小时直至对数晚期。将甲醇加入到2%v/v以及于37℃将培养物再振荡孵育30分钟。使培养物快速离心(spin down)以及使用DETECTX甲醛检测试剂盒(Arbor Assays;Ann Arbor,密歇根州),根据制造商的说明,对上清液进行所产生的甲醛的测定。frmA、frmB、frmR的缺失产生待删除的天然甲醛利用途径,其实现了可以被用来检测NNOMO中甲醇脱氢酶活性的甲醛的形成。
用上述测定法测量几种酶的活性。四个独立的实验的结果被提供于下表1中。
表1:显示各种包括表达甲醇脱氢酶的质粒的NNOMO对甲醛(HCHO)的生产的体内测定法的结果。
图1,步骤K–自发或甲醛活化酶(EM10)
甲醛和THF到亚甲基四氢叶酸的转化可以自发地发生。这种反应的速率可由EM10来增强这也是有可能的。已在扭脱甲基杆菌AM1中确认了甲醛活化酶(Fae),其催化甲醛和四氢甲烷蝶呤缩合为亚甲基四氢甲烷蝶呤(Vorholt,等人,J.Bacteriol.,182(23),6645-6650(2000))。类似的酶存在或者可以经设计以催化甲醛和四氢叶酸缩合为亚甲基四氢叶酸,这是可能的。同系物存在于一些生物体中,包括自养黄色杆菌Py2和反硝化生丝微菌ATCC 51888。
图1,步骤L–甲醛脱氢酶(EM11)
甲醛到甲酸的氧化由EM11催化。NAD+依赖性EM11酶由恶臭假单胞菌的fdhA编码(Ito等人,J Bacteriol 176:2483-2491(1994))。额外的EM11酶包含来自札氏生丝微菌的NAD+和谷胱甘肽独立性EM11(Jerome等人,Appl Microbiol Biotechnol 77:779-88(2007))、毕赤酵母的谷胱甘肽依赖性EM11(Sungan等人,Gene 330:39-47(2004))和海洋甲基细菌的NAD(P)+依赖性EM11(Speer等人,FEMS Microbiol Lett,121(3):349-55(1994))。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
fdhA | P46154.3 | 1169603 | 恶臭假单胞菌 |
faoA | CAC85637.1 | 19912992 | 札氏生丝微菌 |
Fld1 | CCA39112.1 | 328352714 | 毕赤酵母 |
fdh | P47734.2 | 221222447 | 海洋甲基细菌 |
除了上面列出的EM11酶,用于将甲醛转化为甲酸的替代性酶和途径为本领域所知。例如,许多生物体采用谷胱甘肽依赖性甲醛氧化途径,其中甲醛在三步中经由中间体S-羟甲基谷胱甘肽和S-甲酰基谷胱甘肽被转化为甲酸(Vorholt等人,J Bacteriol 182:6645-50(2000))。这种途径的酶是S-(羟甲基)谷胱甘肽合成酶(EC 4.4.1.22)、谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(EC1.1.1.284)和S-甲酰基谷胱甘肽水解酶(EC 3.1.2.12)。
图1,步骤M–自发或S-(羟甲基)谷胱甘肽合酶(EM12)
虽然在谷胱甘肽的存在下,甲醛到S-羟甲基谷胱甘肽的转化可以自发地发生,已被Goenrich等人(Goenrich,等人,J Biol Chem 277(5);3069-72(2002))证明的是,来自脱氮副球菌的酶可以加速这种自发的缩合反应。催化甲醛和谷胱甘肽的转化的酶被纯化并命名为谷胱甘肽依赖性甲醛活化酶(Gfa)。编码被命名为gfa的酶的基因直接位于针对谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(其催化S-羟甲基谷胱甘肽的后续氧化)的基因的上游。与来自脱氮副球菌的Gfa具有序列一致性的推定蛋白也存在于类球红细菌、苜蓿中华根瘤菌和百脉根中生根瘤菌中。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Gfa | Q51669.3 | 38257308 | 脱氮副球菌 |
Gfa | ABP71667.1 | 145557054 | 类球红细菌ATCC 17025 |
Gfa | Q92WX6.1 | 38257348 | 苜蓿中华根瘤菌1021 |
Gfa | Q98LU4.2 | 38257349 | 百脉根中生根瘤菌MAFF303099 |
图1,步骤N–谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(EM13)
谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(GS-FDH)属于III级醇脱氢酶的家族。谷胱甘肽和甲醛以非酶法结合以形成羟甲基谷胱甘肽(GS-FDH催化反应的真正底物)。产品S-甲酰基谷胱甘肽进一步新陈代谢为甲酸。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
frmA | YP_488650.1 | 388476464 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
SFA1 | NP_010113.1 | 6320033 | 酿酒酵母S288c |
flhA | AAC44551.1 | 1002865 | 脱氮副球菌 |
adhI | AAB09774.1 | 986949 | 类球红细菌 |
图1,步骤O–S-甲酰基谷胱甘肽水解酶(EM14)
EM14是在细菌、植物和动物中发现的谷胱甘肽巯基酯酶。它催化S-甲酰基谷胱甘肽转化为甲酸和谷胱甘肽。脱氮副球菌的fghA基因位于与此生物体中甲醛到甲酸的氧化中涉及的两种基因gfa和flhA相同的操纵子中。在大肠杆菌中,在具有FrmR和FrmA(其是甲醛的氧化中涉及的蛋白质)的操纵子中,FrmB被编码。大肠杆菌的YeiG是混杂丝氨酸水解酶;其对底物S-甲酰基谷胱甘肽具有最高的比活性。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
frmB | NP_414889.1 | 16128340 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
yeiG | AAC75215.1 | 1788477 | 大肠杆菌K-12MG1655 |
fghA | AAC44554.1 | 1002868 | 脱氮副球菌 |
4.2实施例II–使用甲醇提高从碳水化合物到己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺的收率
用于提高还原当量的可用性的示例性MMP被提供于图1中。
己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺生产可以通过图2中所示的途径在重组生物体中实现。例如,己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺可以如图2中所示,经由己二酰基-CoA中间体生产自琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA。用于通过这种路径将琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA转化为己二酸、6-ACA、HMDA和/或己内酰胺的示例性酶包含EA1;EA2;EA3;EA4;EA5;EA6A或EA6B;EA7A或EA7B;EA8;EA9;EA10A或EA10B;以及EA11A、EA11B、EA11C或EA11D。
以下所述的是导致从共同的中心代谢物到己内酰胺、HMDA(HMDA)或6-ACA的生产的各种示例性途径。一条所述的途径必然伴有通过转移酶或合酶,6-ACA到6-氨基己酰基-CoA的活化(图2,步骤G),继之以6-氨基己酰基-CoA的自发的环化作用以形成己内酰胺(图2,步骤I)。另一条所述的途径必然伴有6-ACA到6-氨基己酰基-CoA的活化(图2,步骤G),继之以还原(图2,步骤J)和氨基化(图2,步骤K)以形成HMDA。6-氨基己酸可以替代性地被活化为6-氨基己酰-磷酸而非6-氨基己酰-CoA。6-氨基己酰-磷酸可以自发地环化以形成己内酰胺。替代性地,6-氨基己酰-磷酸可以被还原为6-ACA半醛,其然后可以被转化为HMDA。在任一这种情况下,氨基化反应可以相对快速地发生以使6-ACA半醛的环亚胺的自发形成最小化。参与酶的连接或支架代表潜在的有力的选择,以确保6-ACA半醛中间体被有效地从还原酶引导至氨基化酶。
在6-氨基己酸到HMDA的转化期间,用于使环状亚胺或己内酰胺的形成最小化甚或消除的另一种选择必然伴有将官能团(如乙酰基、琥珀酰基)加入6-氨基己酸的胺基以保护其免受环化。这类似于在大肠杆菌中从L-谷氨酸到鸟氨酸的形成。具体地,谷氨酸首先由N-乙酰基谷氨酸合成酶转化为N-乙酰基-L-谷氨酸。N-乙酰基-L-谷氨酸然后被活化为N-乙酰基谷氨酰基-磷酸,其被还原和转氨基,以形成N-乙酰基-L-鸟氨酸。然后通过N-乙酰基-L-鸟氨酸脱乙酰酶从N-乙酰基-L-鸟氨酸中除去乙酰基基团,形成L-鸟氨酸。这样的路径是必要的,因为从谷氨酸到谷氨酸-5-磷酸的形成,继之以还原至谷氨酸-5-半醛导致形成(S)-1-吡咯啉-5-羧酸(一种自发形成自谷氨酸-5-半醛的环状亚胺)。在从6-氨基己酸形成HMDA的情况下,该步骤可以涉及将6-氨基己酸乙酰化为乙酰基-6-氨基己酸、用CoA或磷酸基活化羧酸基团、还原、氨基化以及脱乙酰。
图2中所描绘的转换落入下表中示出的至少10个一般转换类别的范围。每个标签的前三个数字对应于前三位酶学委员会编号数字,其表示独立于底物特异性的一般转换类型。下面描述了每个类别中大量被生化表征的候选基因。具体列举的是当被克隆和表达时,可以被施加以催化图2中适当转换的示例性基因。
步骤 | 标签 | 功能 |
图2,步骤B | 1.1.1.a | 氧化还原酶(酮到羟基或醛到醇) |
图2,步骤E和J | 1.2.1.b | 氧化还原酶(酰基-CoA到醛) |
图2,步骤D | 1.3.1.a | 对CH-CH供体起作用的氧化还原酶 |
图2,步骤F和K | 1.4.1.a | 对氨基酸起作用的氧化还原酶 |
图2,步骤A | 2.3.1.b | 酰基转移酶 |
图2,步骤F和K | 2.6.1.a | 氨基转移酶 |
图2,步骤G和L | 2.8.3.a | 辅酶A转移酶 |
图2,步骤G和L | 6.2.1.a | 酸-硫连接酶 |
图2,步骤H | 6.3.1.a/6.3.2.a | 酰胺合酶/肽合酶 |
图2,步骤I | 无需酶 | 自发的环化作用 |
图2,步骤A–3-氧代己二酰基-CoA硫解酶(EA1)
2.3.1.b酰基转移酶.该途径的第一个步骤结合乙酰基-CoA和琥珀酰-CoA以形成3-氧代己二酰基-CoA。图2,步骤A可以涉及EA1;或者等价地,琥珀酰CoA:乙酰基CoA酰基转移酶(β-酮硫解酶)。由假单胞菌菌株B13中的pcaF(Kaschabek等人,J.Bacteriol.184:207-215(2002))、恶臭假单胞菌U中的phaD(Oliveran等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6419-6424(1998))、荧光假单胞菌ST中的paaE(Di Gennaro等人,Arch.Microbiol.188:117-125(2007)),以及来自大肠杆菌的paaJ编码的基因产物在芳族化合物(如苯乙酸或苯乙烯)的降解期间催化3-氧代己二酰基-CoA到琥珀酰-CoA和乙酰基-CoA的转化。因为β-酮硫解酶酶类催化可逆转换,这些酶可被用于3-氧代己二酰基-CoA的合成。例如,来自富养罗尔斯通氏菌的酮硫解酶phaA结合乙酰基-CoA的两种分子以形成乙酰乙酰基-CoA(Sato等人,J Biosci Bioeng 103:38-44(2007))。类似地,据已有报道,在富养罗尔斯通氏菌中,β-酮硫解酶(bktB)催化乙酰基-CoA和丙酰基-CoA的缩合以形成β-酮缬草酰基-CoA(Slater等人,J.Bacteriol.180:1979-1987(1998))。上述基因产物的蛋白质序列为本领域所熟知以及可以使用下列登录号在公共数据库(如GenBank)中获得。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
paaJ | 16129358 | NP_415915.1 | 大肠杆菌 |
pcaF | 17736947 | AAL02407 | 假单胞菌knackmussii(B13) |
phaD | 3253200 | AAC24332.1 | 恶臭假单胞菌 |
paaE | 106636097 | ABF82237.1 | 荧光假单胞菌 |
这些序列可以用来通过序列相似性搜索(例如BLASTp)在GenBank或其他数据库中确认同系蛋白质。所得的同系蛋白质以及其对应的基因序列提供附加外源性DNA序列,用于转换进入大肠杆菌或其他合适的宿主微生物体以生成生产宿主。
例如,可以使用下列的GenBank登录号找到来自大肠杆菌K12的paaJ的直系同源物。
GI号 | GenBank ID | 生物体 |
152970031 | YP_001335140.1 | 肺炎克雷伯氏菌 |
157371321 | YP_001479310.1 | 变形斑病沙雷氏菌 |
3253200 | AAC24332.1 | 恶臭假单胞菌 |
例如,可以使用下列的GenBank登录号找到来自假单胞菌knackmussii的pcaF的直系同源物。
GI号 | GenBank ID | 生物体 |
4530443 | AAD22035.1 | 链霉菌属2065 |
24982839 | AAN67000.1 | 恶臭假单胞菌 |
115589162 | ABJ15177.1 | 绿脓假单胞菌 |
用于酮硫解酶步骤的其他天然候选基因包含可以催化2乙酰基-CoA分子的可逆缩合的atoB(Sato等人,J.Biosci.Bioengineer.103:38-44(2007)),以及其同系物yqeF。非天然候选基因包含来自富养罗尔斯通氏菌的phaA(Sato等人,同上,2007)和bktB(Slater等人,J.Bacteriol.180:1979-1987(1998)),以及来自丙酮丁醇梭菌的两种酮硫解酶thiA和thiB(Winzer等人,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2:531-541(2000))。每个这些示例性基因产物的蛋白质序列可以使用下列的GenBank登录号找到:
基因名 | GenBank ID | 生物体 |
atoB | NP_416728.1 | 大肠杆菌 |
yqeF | NP_417321.2 | 大肠杆菌 |
phaA | YP_725941 | 富养罗尔斯通氏菌 |
bktB | AAC38322.1 | 富养罗尔斯通氏菌 |
thiA | NP_349476.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
thiB | NP_149242.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
ortA(α) | 126698017 | YP_001086914.1 | 艰难梭菌630 |
ortB(β) | 126698018 | YP_001086915.1 | 艰难梭菌630 |
Amet_2368(α) | 150390132 | YP_001320181.1 | 嗜碱metalliredigenes QYF |
Amet_2369(β) | 150390133 | YP_001320182.1 | 嗜碱metalliredigenes QYF |
Teth514_1478(α) | 167040116 | YP_001663101.1 | 热厌氧杆菌属X514 |
Teth514_1479(β) | 167040117 | YP_001663102.1 | 热厌氧杆菌属X514 |
TTE1235(α) | 20807687 | NP_622858.1 | 腾冲嗜热厌氧杆菌MB4 |
thrC(β) | 20807688 | NP_622859.1 | 腾冲嗜热厌氧杆菌MB4 |
2-氨基-4-氧代戊酸酯(AKP)硫解酶或AKP硫解酶(AKPT)酶类提供了用于执行图2中的步骤A的附加候选酶。AKPT是参与斯蒂克兰德氏梭菌中鸟氨酸降解的吡哆醛磷酸依赖性酶(Jeng等人,Biochemistry13:2898-2903(1974);Kenklies等人,Microbiology 145:819-826(1999))。编码AKPT的α和β亚基(or-2(ortA)和or-3(ortB))的基因簇最近得以确认以及该酶的生化特性得以表征(Fonknechten等人,J.Bacteriol.In Press(2009))。该酶能够在两个方向上运行并与丙氨酸的D-异构体天然地发生反应。来自斯蒂克兰德氏梭菌的AKPT已经被表征,但其蛋白质序列还没有被公布。具有较高的序列同源性的酶被发现于艰难梭菌、嗜碱metalliredigenes QYF、热厌氧杆菌属X514和腾冲嗜热厌氧杆菌MB4中(Fonknechten等人,同上)。
图2,步骤B–3-氧代己二酰基-CoA还原酶(EA2)
1.1.1.a氧化还原酶.图2中所描述的某些转换涉及将酮功能性转化为羟基基团的氧化还原酶。例如,图2步骤B涉及3-氧代酰基-CoA到3-羟基酰基-CoA的还原反应。
可以将3-氧代酰基-CoA分子(如3-氧代己二酰基-CoA)转化为3-羟基酰基-CoA分子(如3-羟基己二酰基-CoA)的示例性酶包含其天然的生理作用在于脂肪酸β-氧化或苯乙酸分解代谢的酶。例如,在大肠杆菌中,由fadB和fadj编码的两种脂肪酸氧化复合物的亚基作为3-羟基酰基-CoA脱氢酶发挥作用(Binstock等人,Methods Enzymol.71:403-411(1981))。此外,由恶臭假单胞菌U中的phaC(Oliveran等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6419-6424(1998))和荧光假单胞菌ST中的paaC(Di Gennaro等人,Arch.Microbiol.188:117-125(2007))编码的基因产物在苯乙酸或苯乙烯的分解代谢期间,催化图2中步骤B逆反应,即3-羟基己二酰基-CoA的氧化以形成3-氧代己二酰基-CoA。注意,通过这样的酶催化的反应是可逆的。类似的转换还通过丙酮丁醇梭菌中的hbd的基因产物进行(Atsumi等人,Metab.Eng.(2007年9月14日Epub);Boynton等人,J.Bacteriol.178:3015-3024(1996))。这种酶将乙酰乙酰基-CoA转化为3-羟基丁酰基-CoA。此外,鉴于大肠杆菌中paaH与苯乙酸降解操纵子中的其他基因的接近(Nogales等人,Microbiology 153:357-365(2007))以及paaH突变体不能在苯乙酸上生长的事实(Ismail等人,Eur.J Biochem.270:3047-3054(2003)),预计大肠杆菌paaH基因编码3-羟基酰基-CoA脱氢酶。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
fadB | 119811 | P21177.2 | 大肠杆菌 |
fadJ | 3334437 | P77399.1 | 大肠杆菌 |
paaH | 16129356 | NP_415913.1 | 大肠杆菌 |
phaC | 26990000 | NP_745425.1 | 恶臭假单胞菌 |
paaC | 106636095 | ABF82235.1 | 荧光假单胞菌 |
能够将3-氧代酰基-CoA分子转化为其相应的3-羟基酰基-CoA分子的附加示例性氧化还原酶包含3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶。由hbd编码的来自丙酮丁醇梭菌的酶已被克隆以及功能表达于大肠杆菌(Youngleson等人,J.Bacteriol.171:6800-6807(1989))。附加候选基因包含克鲁佛氏梭菌中的Hbd1(C-末端域)和Hbd2(N-末端域)(Hillmer等人,FEBS Lett.21:351-354(1972))以及牛中的HSD17B10(Wakil等人,J.Biol.Chem.207:631-638(1954)))。被证实将乙酰乙酰基-CoA还原为3-羟基丁酰基-CoA的仍然其他候选基因是来自生枝动胶菌的phbB(Ploux等人,Eur.J Biochem.174:177-182(1988))以及来自类球红细菌的phaB(Alber等人,Mol.Microbiol61:297-309(2006))。前一种基因是NADPH依赖性的,其核苷酸序列已被测定(Peoples等人,Mol.Microbiol 3:349-357(1989))以及该基因已被表达于大肠杆菌。关于该基因的底物特异性研究得到的结论是,除了乙酰乙酰基-CoA之外,它还可以接受3-氧代丙酰基-CoA作为底物(Ploux等人同上)。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
hbd | 18266893 | P52041.2 | 丙酮丁醇梭菌 |
Hbd2 | 146348271 | EDK34807.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
Hbd1 | 146345976 | EDK32512.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
HSD17B10 | 3183024 | O02691.3 | 牛 |
phbB | 130017 | P23238.1 | 生枝动胶菌 |
phaB | 146278501 | YP_001168660.1 | 类球红细菌 |
许多类似酶已被发现于梭菌属的其他属种以及勤奋生金球菌中(Berg等人,Science 318:1782-1786(2007))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
hbd | 15895965 | NP_349314.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
hbd | 20162442 | AAM14586.1 | 拜氏梭菌 |
Msed_1423 | 146304189 | YP_001191505 | 勤奋生金球菌 |
Msed_0399 | 146303184 | YP_001190500 | 勤奋生金球菌 |
Msed_0389 | 146303174 | YP_001190490 | 勤奋生金球菌 |
Msed_1993 | 146304741 | YP_001192057 | 勤奋生金球菌 |
图2,步骤C–3-羟基己二酰基-CoA脱水酶(EA3)
图2,步骤C可以涉及EA3。来自丙酮丁醇梭菌的crt的基因产物催化3-羟基丁酰基-CoA脱水为巴豆酰基-CoA(见图2)(Atsumi等人,Metab.Eng.(2007年9月14日Epub);Boynton等人,J.Bacteriol.178:3015-3024(1996))。这种基因的同系物是执行图2中示范的合成途径中第三个步骤(步骤C)的强力候选者。此外,鉴于这样的酶转换的可逆性,已知催化烯酰基-CoA化合物中双键的羟基化的基因代表额外的候选者。例如,恶臭假单胞菌的烯酰基-CoA水合酶phaA以及phaB被认为执行苯乙酸分解代谢过程中双键的羟基化(Olivera等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6419-6424(1998))以及因此代表用于纳入大肠杆菌的附加候选酶。这些基因的缺失妨碍了恶臭假单胞菌中的苯乙酸降解。来自荧光假单胞菌的paaA以及paaB催化类似的转换(Oliveran等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6419-6424(1998))。最后,许多大肠杆菌基因已经显示具有烯酰基-CoA水合酶功能,包括maoC(Park和Lee,J.Bacteriol.185:5391-5397(2003))、paaF(Ismail等人,Eur.J.Biochem.270:3047-3054(2003);Park和Lee,Biotechnol.Bioeng.86:681-686(2004);Park和Lee,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:335-346(2004))以及paaG(Ismail等人,同上,2003;Park和Lee,同上,2003;Park和Lee,同上,2004)。每个这些示例性基因产物的蛋白质序列可以使用下列的GenBank登录号找到:
基因名 | GenBank ID | 生物体 |
maoC | NP_415905.1 | 大肠杆菌 |
paaF | NP_415911.1 | 大肠杆菌 |
paaG | NP_415912.1 | 大肠杆菌 |
crt | NP_349318.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
paaA | NP_745427.1 | 恶臭假单胞菌 |
paaB | NP_745426.1 | 恶臭假单胞菌 |
phaA | ABF82233.1 | 荧光假单胞菌 |
phaB | ABF82234.1 | 荧光假单胞菌 |
替代性地,β氧化基因是用于己二酸合成中前三个步骤的候选基因。用于拟议己二酸合成途径的候选基因也包含大肠杆菌的天然脂肪酸氧化基因及其在其他生物体中的同系物。大肠杆菌基因fadA和fadB编码显示出酮酰基-CoA硫解酶、3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶活性的多酶复合物(Yang等人,Biochem.30:6788-6795(1991);Yang等人,J.Biol.Chem.265:10424-10429(1990);Yang等人,J.Biol.Chem.266:16255(1991);Nakahigashi和Inokuchi,Nucl.Acids Res.18:4937(1990))。这些活性在机理上类似于图2中所示的前三个转换。fadI和fadJ基因编码类似的功能并仅在厌氧的条件下被天然表达(Campbell等人,Mol.Microbiol.47:793-805(2003))。这些基因产物天然地运行以降解短中长链脂肪酸-酰基-CoA化合物为乙酰基-CoA,而不是如图2中所提议,将琥珀酰-CoA和乙酰基-CoA转换为5-羧基-2-戊烯酰基-CoA。但是,众所周知的是,酮酰基-CoA硫解酶、3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶催化可逆的变换。此外,定向进化和相关的方法可以适用于定制大肠杆菌的天然β氧化机制的底物特异性。因此,这些酶或其同系物可以应用于己二酸生产。如果天然基因运行以在活体内降解己二酸或其前体,适当的基因修饰则使得这些功能减弱或消除。然而,这可能不是必要的,因为已经描述了用于在大肠杆菌中生产聚[(R)-3-羟基丁酸]的方法,其涉及通过敲除负调节子fadR来活化fadB;以及共表达来自富养罗尔斯通氏菌的非天然酮硫解酶(Sato等人,J.Biosci.Bioeng.103:38-44(2007))。这项工作清楚地表明,β氧化酶,特别是编码3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶活性的fadB的基因产物,可以作为途径的一部分发挥功能,以从乙酰基-CoA前体生产较长链的分子。每个这些示例性基因产物的蛋白质序列可以使用下列的GenBank登录号找到:
基因名 | GenBank ID | 生物体 |
fadA | YP_026272.1 | 大肠杆菌 |
fadB | NP_418288.1 | 大肠杆菌 |
fadI | NP_416844.1 | 大肠杆菌 |
fadJ | NP_416843.1 | 大肠杆菌 |
fadR | NP_415705.1 | 大肠杆菌 |
图2,步骤D-5-羧基-2-戊烯酰基-CoA还原酶(EA4)
1.3.1.a作用于CH-CH供体的氧化还原酶.图2,步骤D涉及通过EA4从5-羧基-2-戊烯酰基-CoA到己二酰基-CoA的转化。烯酰基-CoA还原酶酶是适用于这种转换的酶。
虽然酮硫解酶、脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶步骤通常是可逆的,烯酰基-CoA还原酶步骤在生理条件下几乎总是氧化和不可逆的(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。在大肠杆菌中,FadE催化这种可能不可逆的转换(Campbell和Cronan,J.Bacteriol.184:3759-3764(2002))。该途径可涉及一种还原2-烯酰基-CoA中间体的酶,而不是,例如将仅将酰基-CoA氧化为2-烯酰基-CoA化合物的FadE。此外,虽然已经表明大肠杆菌天然具有用于烯酰基-CoA还原的酶(Mizugaki等人,J.Biochem.92:1649-1654(1982);Nishimaki等人,J.Biochem.95:1315-1321(1984)),没有具有这种功能的大肠杆菌基因已经被生化表征。
一种示例性烯酰基-CoA还原酶是来自丙酮丁醇梭菌的bcd的基因产物(Boynton等人,J Bacteriol.178:3015-3024(1996);Atsumi等人,Metab.Eng.200810(6):305-311(2008)(2007年9月14日Epub),其天然地催化巴豆酰基-CoA还原为丁酰基-CoA。这种酶的活性可以通过表达bcd结合以编码电子传递黄素蛋白的丙酮丁醇梭菌etfAB基因的表达得以增强。用于烯酰基-CoA还原酶步骤的附加候选酶是来自薄肌眼虫的线粒体烯酰基-CoA还原酶(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。去除其线粒体靶向前导序列之后衍生自这种序列的构建体被克隆于大肠杆菌中,产生活性酶(Hoffmeister等人,同上)。这种表达真核基因(特别是在原核生物中那些具有可以将基因产物靶向特定的胞内区室的前导序列的基因)的方法为本领域技术人员所熟知。来自齿垢密螺旋体的这种基因TDE0597的密切同系物代表已被克隆并表达在大肠杆菌中的第三种烯酰基-CoA还原酶(Tucci等人,FEBS Letters 581:1561-1566(2007))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
bcd | 15895968 | NP_349317.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
etfA | 15895966 | NP_349315.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
etfB | 15895967 | NP_349316.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
TER | 62287512 | Q5EU90.1 | 薄肌眼虫 |
TDE0597 | 42526113 | NP_971211.1 | 齿垢密螺旋体 |
图2,步骤E-己二酰基-CoA还原酶(醛形成)(EA5)
1.2.1.b氧化还原酶(酰基-CoA到醛).己二酰基-CoA到己二酸半醛的转换(图2,步骤E)可以涉及能够将酰基-CoA还原为其相应的醛的酰基-CoA脱氢酶。编码这种酶的示例性基因包含编码脂肪酰基-CoA还原酶(Reiser等人,J.Bacteriology 179:2969-2975(1997))、不动杆菌属M-1脂肪酰基-CoA还原酶(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002))的乙酸钙不动杆菌acr1以及编码CoA-和NADP-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的克鲁佛氏梭菌中sucD基因(Sohling等人,J.Bacteriol.178:871-880(1996))。牙龈红棕色单胞菌的SucD是另一琥珀酸半醛脱氢酶(Takahashi等人,J.Bacteriol.182:4704-4710(2000))。由bphG编码的假单胞菌属中将乙醛脱氢酶酰基化的酶也是另一候选酶,因为它已被证实可将乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛氧化并酰基化(Powlowski等人,J Bacteriol.175:377-385(1993))。除了将乙酰基-CoA还原为乙醇,由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰基-CoA(Kazahayan等人,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972);Koo等人,Biotechnol Lett.27:505-510(2005))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
acr1 | 50086359 | YP_047869.1 | 乙酸钙不动杆菌 |
acr1 | 1684886 | AAC45217 | 不动杆菌baylyi |
acr1 | 18857901 | BAB85476.1 | 不动杆菌属菌株M-1 |
sucD | 172046062 | P38947.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
sucD | 34540484 | NP_904963.1 | 牙龈红棕色单胞菌 |
bphG | 425213 | BAA03892.1 | 假单胞菌属 |
adhE | 55818563 | AAV66076.1 | 肠膜明串珠菌 |
额外的将酰基-CoA转化为其相应的醛的酶型是将丙二酰基-CoA转化为丙二酸半醛的丙二酰基-CoA还原酶。丙二酰基-CoA还原酶是在嗜热酸古生细菌中通过3-羟基丙酸循环的自养碳固定中的关键酶(Berg等人,Science 318:1782-1786(2007);Thauer R.K.,Science 318:1732-1733(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子并已经被表征在生金球菌属和硫化叶菌菌种中(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006);Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。该酶由勤奋生金球菌中的Msed_0709编码(Alber等人,同上;Berg等人,同上)。来自硫化叶菌tokodaii的编码丙二酰基-CoA还原酶的基因被克隆并异源表达在大肠杆菌中(Alber等人,同上)。这种酶也已显示催化甲基丙二酰基-CoA到其相应的醛的转化(WO 2007/141208)。虽然这些酶的醛脱氢酶功能性与来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶相似,但是几乎没有序列相似性。两种丙二酰基-CoA还原酶候选酶具有相对于天冬氨酸半醛脱氢酶(一种催化天冬氨酰基-4-磷酸到天冬氨酸半醛的还原和同时发生的脱磷酸作用)的高度序列相似性。额外的候选基因可以通过蛋白质序列同源性发现于其他的生物体中,包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌,以及已被列入下文。CoA-酰基化醛脱氢酶的仍然另一候选基因是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth等人,Appl Environ Microbiol 65:4973-4980(1999))。已有报告称,这种酶将乙酰基-CoA和丁酰基-CoA还原为它们相应的醛。这种基因非常类似于编码鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE(Toth等人,同上)。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
Msed_0709 | 146303492 | YP_001190808.1 | 勤奋生金球菌 |
mcr | 15922498 | NP_378167.1 | 硫化叶菌tokodaii |
asd-2 | 15898958 | NP_343563.1 | 硫磺矿硫化叶菌 |
Saci_2370 | 70608071 | YP_256941.1 | 嗜酸热硫化叶菌 |
Ald | 49473535 | AAT66436 | 拜氏梭菌 |
eutE | 687645 | AAA80209 | 鼠伤寒沙门氏菌 |
eutE | 2498347 | P77445 | 大肠杆菌 |
图2,步骤F-6-ACA转氨酶(EA6A)或6-ACA脱氢酶(EA6B)
1.4.1.a作用于氨基酸的氧化还原酶.图2,步骤F描绘了涉及己二酸半醛到6-ACA的转化的还原氨基化。
作用于氨基酸的大多数氧化还原酶催化将NAD+或NADP+作为受体的α-氨基酸的氧化脱氨,尽管反应通常是可逆的。作用于氨基酸的示例性氧化还原酶包括由gdhA编码的谷氨酸脱氢酶(脱氨)、由ldh编码的亮氨酸脱氢酶(脱氨)和由nadX编码的天冬氨酸脱氢酶(脱氨)。来自大肠杆菌的gdhA基因产物(McPherson等人,Nucleic.Acids Res.11:5257-5266(1983);Korber等人,J.Mol.Biol.234:1270-1273(1993))、来自海栖热袍菌的gdh(Kort等人,Extremophiles 1:52-60(1997);Lebbink等人,J.Mol.Biol.280:287-296(1998);Lebbink等人,J.Mol.Biol.289:357-369(1999))和来自盐沼沙雷氏菌的gdhA1(Ingoldsby等人,Gene.349:237-244(2005))催化谷氨酸到2-酮戊二酸和氨的可逆的相互转化,同时分别有利于NADP(H)、NAD(H)或两者。蜡状芽孢杆菌的ldh基因编码具有包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和2-氨基丁酸酯的广泛底物的LeuDH蛋白质(Stoyan等人,J.Biotechnol54:77-80(1997);Ansorge等人,Biotechnol Bioeng.68:557-562(2000))。用于编码天冬氨酸脱氢酶的来自海栖热袍菌的nadX基因参与NAD的生物合成(Yang等人,J.Biol.Chem.278:8804-8808(2003))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
gdhA | 118547 | P00370 | 大肠杆菌 |
gdh | 6226595 | P96110.4 | 海栖热袍菌 |
gdhA1 | 15789827 | NP_279651.1 | 盐沼沙雷氏菌 |
ldh | 61222614 | P0A393 | 蜡样芽胞杆菌 |
nadX | 15644391 | NP_229443.1 | 海栖热袍菌 |
由lysDH基因编码的赖氨酸6-脱氢酶(脱氨)催化L-赖氨酸的ε-氨基团的氧化脱氨以形成2-氨基己二酸-6-半醛,其反过来非酶环化以形成Δ1-哌啶-6-羧酸(Misono等人,J.Bacteriol.150:398-401(1982))。示例性的酶可以被发现于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Heydari等人,Appl Environ.Microbiol70:937-942(2004))、根癌土壤杆菌(Hashimoto等人,J Biochem 106:76-80(1989);Misono等人,同上)和反硝化无色杆菌(Ruldeekulthamrong等人,BMB.Rep.41:790-795(2008))中。考虑到己二酸半醛和2-氨基己二酸-6-半醛之间的结构相似性,这样的酶是用于将己二酸半醛转化为6-ACA的特别好的候选酶。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
lysDH | 13429872 | BAB39707 | 嗜热脂肪地芽孢杆菌 |
lysDH | 15888285 | NP_353966 | 根癌土壤杆菌 |
lysDH | 74026644 | AAZ94428 | 反硝化无色杆菌 |
2.6.1.a转氨酶.图2的步骤F也可以,在某些实施方式中,涉及6-醛转氨基为胺。这种转换可以由γ-氨基丁酸转氨酶(GABA转氨酶)催化。一种大肠杆菌的GABA转氨酶由gabT编码并将氨基从谷氨酸转移至琥珀半醛的末端醛(Bartsch等人,J.Bacteriol.172:7035-7042(1990))。puuE的基因产物催化大肠杆菌中的另一种4-氨基丁酸转氨酶(Kuriharan等人,J.Biol.Chem.280:4602-4608(2005))。家鼠、荧光假单胞菌和野猪中的GABA转氨酶已显示与6-氨基己酸反应(Cooper,Methods Enzymol.113:80-82(1985);Scott等人,J.Biol.Chem.234:932-936(1959))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
gabT | 16130576 | NP_417148.1 | 大肠杆菌 |
puuE | 16129263 | NP_415818.1 | 大肠杆菌 |
abat | 37202121 | NP_766549.2 | 家鼠 |
gabT | 70733692 | YP_257332.1 | 荧光假单胞菌 |
abat | 47523600 | NP_999428.1 | 野猪 |
额外的候选酶包含腐胺转氨酶或其他二胺转氨酶。这样的酶特别适合于执行6-ACA半醛到HMDA的转化。大肠杆菌腐胺转氨酶由ygjG基因编码以及经纯化的酶也能够使尸胺和亚精胺转氨基(Samsonovan等人,BMCMicrobiol 3:2(2003))。此外,具有非2-酮戊二酸(如丙酮酸、2-氧代丁酸酯)的氨基受体的这种酶对1,7-二氨基庚烷的活性已被报道(Samsonovan等人,同上;Kim,K.H.,J Biol Chem 239:783-786(1964))。以丙酮酸而非α-酮戊二酸作为氨基受体的具有更高活性的腐胺转氨酶是绿脓假单胞菌的spuC基因(Lu等人,J Bacteriol 184:3765-3773(2002))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
ygjG | 145698310 | NP_417544 | 大肠杆菌 |
spuC | 9946143 | AAG03688 | 绿脓假单胞菌 |
仍然额外的候选酶包含β-丙氨酸/α-酮戊二酸转氨酶,其从β-丙氨酸生产丙二酸半醛(WO08027742)。克鲁维酵母中SkPYD4的基因产物也显示出优先使用β-丙氨酸作为氨基供体(Andersen等人,FEBS.J.274:1804-1817(2007))。SkUGA1编码酿酒酵母GABA转氨酶UGA1的同系物(Ramos等人,Eur.J.Biochem.,149:401-404(1985)),而SkPYD4编码参与β-丙氨酸和GABA转氨基的酶(Andersen等人,同上)。3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶催化甲基丙酸半醛到3-氨基-2-甲基丙酸甲酯的转化。这种酶已被表征于褐鼠和野猪中并且由Abat编码(Tamaki等人,Methods Enzymol,324:376-389(2000))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
SkyPYD4 | 98626772 | ABF58893.1 | 克鲁维酵母 |
SkUGA1 | 98626792 | ABF58894.1 | 克鲁维酵母 |
UGA1 | 6321456 | NP_011533.1 | 酿酒酵母 |
Abat | 122065191 | P50554.3 | 褐鼠 |
Abat | 120968 | P80147.2 | 野猪 |
图2,步骤G-6-氨基己酰基-CoA/酰基-CoA转移酶(EA7A)或6-氨基己酰基-CoA合酶(EA7B)
2.8.3.a辅酶-A转移酶.CoA转移酶催化CoA部分从一个分子到另一个分子的可逆反应。例如,图2的步骤G可以通过6-氨基己酰基-CoA/酰基CoA转移酶催化。用于这些步骤的一种候选酶是由假单胞菌中的pcaI和pcaJ编码的两单位酶,其已经显示具有3-氧代己二酰基-CoA/琥珀酸转移酶活性((Kaschabek和Reineke,J.Bacteriol.177:320-325(1995);以及Kaschabek.和Reineke,J.Bacteriol.175:6075-6081(1993))。基于同源性的类似的酶还存在于不动杆菌属ADP1(Kowalchuk等人,Gene 146:23-30(1994))和天蓝色链霉菌中。额外的示例性琥珀酰-CoA:3:氧代酸-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy-Theulaz等人,J.Biol.Chem.272:25659-25667(1997))和枯草芽孢杆菌(Stols等人,Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007))中。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
pcaI | 24985644 | AAN69545.1 | 恶臭假单胞菌 |
pcaJ | 26990657 | NP_746082.1 | 恶臭假单胞菌 |
pcaI | 50084858 | YP_046368.1 | 不动杆菌属ADP1 |
pcaJ | 141776 | AAC37147.1 | 不动杆菌属ADP1 |
pcaI | 21224997 | NP_630776.1 | 天蓝色链霉菌 |
pcaJ | 21224996 | NP_630775.1 | 天蓝色链霉菌 |
HPAG1_0676 | 108563101 | YP_627417 | 幽门螺杆菌 |
HPAG1_0677 | 108563102 | YP_627418 | 幽门螺杆菌 |
ScoA | 16080950 | NP_391778 | 枯草芽孢杆菌 |
ScoB | 16080949 | NP_391777 | 枯草芽孢杆菌 |
可以将乙酸用作CoA受体的3-氧代酰基-CoA转移酶是由大肠杆菌atoA(α亚基)和atoD(β亚基)基因编码的乙酰乙酰基-CoA转移酶(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res Commun.33:902-908(1968);Korolev等人,Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58:2116-2121(2002))。这种酶也已经显示将CoA部分从各种支链和直链酰基-CoA底物转移至醋酸,包括异丁酸(Matthies等人,Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,同上)和丁酸酯(Vanderwinkel等人,同上)。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032(Duncan等人,Appl EnvironMicrobiol 68:5186-5190(2002)))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人,Appl EnvironMicrobiol 56:1576-1583(1990)))以及糖乙酸多丁醇梭菌(Kosakan等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
atoA | 2492994 | P76459.1 | 大肠杆菌K12 |
atoD | 2492990 | P76458.1 | 大肠杆菌K12 |
actA | 62391407 | YP_226809.1 | 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 |
cg0592 | 62389399 | YP_224801.1 | 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 |
ctfA | 15004866 | NP_149326.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
ctfB | 15004867 | NP_149327.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
ctfA | 31075384 | AAP42564.1 | 糖乙酸多丁醇梭菌 |
ctfB | 31075385 | AAP42565.1 | 糖乙酸多丁醇梭菌 |
上述酶还可显示出对6-ACA和6-氨基己酰基-CoA的所需活性(图2,步骤G)。然而,用于催化额外的示例性候选转移酶包括克鲁佛氏梭菌的cat1、cat2以及cat3的基因产物,其已经显示分别具有琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰基-CoA以及丁酰基-CoA转移酶活性(Seedorf等人,同上;Sohling等人,Eur.J Biochem.212:121-127(1993);Sohling等人,J Bacteriol.178:871-880(1996))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
cat1 | 729048 | P38946.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
cat2 | 172046066 | P38942.2 | 克鲁佛氏梭菌 |
cat3 | 146349050 | EDK35586.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的酶-戊烯二酸-CoA-转移酶(EC2.8.3.12)与二酸戊烯二酰基-CoA和3-丁烯酰基-CoA反应(Mack等人,FEBSLett.405:209-212(1997))。编码这种酶的基因是gctA以及gctB。这种酶对于其他CoA衍生物(包括戊二酰基-CoA、2-羟基戊二酰基-CoA、己二酰基-CoA以及丙烯酰基-CoA)具有减少的但可检测到的活性(Buckel等人,Eur.J.Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆以及表达于大肠杆菌(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
gctA | 559392 | CAA57199.1 | 发酵氨基酸球菌 |
gctB | 559393 | CAA57200.1 | 发酵氨基酸球菌 |
6.2.1.a酸-硫醇连接酶.图2的步骤G也可以涉及酸-硫醇连接酶或合成酶功能性(术语连接酶、合成酶和合酶在本文中互换并且指相同的酶类别)。编码酶以执行这些转化的示例性基因包含天然地形成琥珀酰-CoA合成酶复合物的大肠杆菌的sucCD基因。这种酶复合物在活体内可逆的反应中,天然地催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA并伴随消耗一份ATP(Buck等人,Biochem.24:6245-6252(1985))。考虑到琥珀酸和己二酸之间的结构类似性,也就是,两者是直链二羧酸,期望sucCD酶对己二酰基-CoA的一些活性是合理的。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
sucC | 16128703 | NP_415256.1 | 大肠杆菌 |
sucD | 1786949 | AAC73823.1 | 大肠杆菌 |
额外的示例性CoA-连接酶包含其序列仍未得以表征的大鼠二羧酸-CoA连接酶(Vamecq等人,Biochemical Journal 230:683-693(1985)),两种经表征的来自产黄青霉菌的苯基乙酸-CoA连接酶(Lamas-Maceiras等人,Biochem.J.395:147-155(2005);Wang等人,Biochem Biophy Res Commun360(2):453-458(2007))、来自恶臭假单胞菌的苯基乙酸-CoA连接酶(Martinez-Blanco等人,J.Biol.Chem.265:7084-7090(1990))的任一种,以及来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酸酯-CoA连接酶(Bower等人,J.Bacteriol.178(14):4122-4130(1996))。额外的候选酶是天然地催化乙酰乙酸酯到乙酰乙酰基-CoA的ATP依赖性转化的来自家鼠(Hasegawan等人,BiochimBiophys Acta 1779:414-419(2008))和智人(Ohgami等人,Biochem Pharmacol65:989-994(2003))的乙酰乙酰基-CoA合成酶。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
phl | 77019264 | CAJ15517.1 | 产黄青霉菌 |
phlB | 152002983 | ABS19624.1 | 产黄青霉菌 |
paaF | 22711873 | AAC24333.2 | 恶臭假单胞菌 |
bioW | 50812281 | NP_390902.2 | 枯草芽孢杆菌 |
AACS | 21313520 | NP_084486.1 | 家鼠 |
AACS | 31982927 | NP_076417.2 | 智人 |
形成ADP的乙酰基-CoA合成酶(ACD,EC 6.2.1.13)是将酰基-CoA酯类到其对应的酸的转化与伴随的ATP合成偶联的酶。具有广泛底物特异性的几种酶已经被描述于文献中。由AF1211编码的来自闪烁古生球菌的ACD I显示对各种直链和支链底物(包含乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、丁酰基-CoA、醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、琥珀酸、富马酸、苯基醋酸、吲哚醋酸)起作用(Musfeldt等人,J Bacteriol 184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶(释为琥珀酰-CoA合成酶)接受丙酸、丁酸以及支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物,以及显示按向前和逆向方向运行(Brasen等人,Arch Microbiol 182:277-287(2004))。由来自超嗜热泉古菌需氧热棒菌的PAE3250编码的ACD显示与乙酰基-CoA、异丁酰基-CoA(优选的底物)以及苯基乙酰基-CoA反应的所有被表征的ACD的最广泛的底物范围(Brasen等人,同上)。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌以及需氧热棒菌的酶均已被克隆,功能表达以及表征于大肠杆菌(Musfeldt等人,同上;Brasen等人,同上)。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
AF1211 | 11498810 | NP_070039.1 | 闪烁古生球菌DSM 4304 |
Scs | 55377722 | YP_135572.1 | 死海盐盒菌ATCC 43049 |
PAE3250 | 18313937 | NP_560604.1 | 需氧热棒菌菌株IM2 |
还有另一种选择是采用具有纯连接酶或合成酶活性的一组酶。例如,磷酸转己二酰酶和己二酸激酶酶类由来自丙酮丁醇梭菌的buk1、buk2和ptb的基因产物催化(Walter等人,Gene 134:107-111(1993);Huang等人,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2:33-38(2000))。该ptb基因编码可以将丁酰基-CoA转化为丁酰基-磷酸,其然后经由buk基因产物的任一种转化为丁酸,伴随ATP的生成的酶。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
ptb | 15896327 | NP_349676 | 丙酮丁醇梭菌 |
buk1 | 15896326 | NP_349675 | 丙酮丁醇梭菌 |
buk2 | 20137415 | Q97II1 | 丙酮丁醇梭菌 |
图2,步骤H–酰胺水解酶(EA8)
6.3.1.a/6.3.2.a酰胺合成酶/肽合成酶.6-ACA到己内酰胺的直接变化(图2,步骤h)可涉及分子内肽键的形成。在翻译过程中将氨基酸组装成蛋白质的核糖体是自然界最丰富的形成肽键的催化剂。非核糖肽合成酶是不包含信使mRNA的形成肽键的催化剂(Schwarzer等人,Nat Prod.Rep.20:275-287(2003))。能够形成肽键的附加酶包含来自绿针假单胞菌的酰基-CoA合成酶(Abe等人,J Biol Chem 283:11312-11321(2008))、来自大肠杆菌的γ-谷酰基腐胺(Kuriharan等人,J Biol Chem 283:19981-19990(2008))和来自带小棒链霉菌的β-内酰胺合成酶(Bachmann等人,Proc Natl Acad Sci U SA 95:9082-9086(1998);Bachmann等人,Biochemistry 39:11187-11193(2000);Miller等人,Nat Struct.Biol 8:684-689(2001);Miller等人,Proc NatlAcad Sci U S A 99:14752-14757(2002);Tahlan等人,Antimicrob.Agents.Chemother.48:930-939(2004))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
acsA | 60650089 | BAD90933 | 绿针假单胞菌 |
puuA | 87081870 | AAC74379 | 大肠杆菌 |
bls | 41016784 | Q9R8E3 | 带小棒链霉菌 |
图2,步骤I–自发的环化作用
6-氨基己酰基-CoA到己内酰胺的转化可以通过自发的环化作用发生。因为-6-氨基己酰基-CoA可以自发环化成己内酰胺,这消除了这一步骤对专用酶的需要。发现形成吡咯烷酮的4-氨基丁酰基-CoA的类似的自发环化作用(Ohsugi等人,J Biol Chem 256:7642-7651(1981))。
图2,步骤J-6-氨基己酰基-CoA还原酶(醛形成)(EA9)
1.2.1.b氧化还原酶(酰基-CoA到醛).6-氨基己酰基-CoA到6-ACA半醛的转换(图2,步骤J)可涉及能够将酰基-CoA还原为其相应的醛的酰基-CoA脱氢酶。编码这类酶的示例性基因包含编码脂肪酰基-CoA还原酶(Reiser等人,J.Bacteriology 179:2969-2975(1997))和不动细菌属M-1脂肪酰基-CoA还原酶(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002))的乙酸钙不动杆菌acr1以及编码CoA-和NADP-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的克鲁佛氏梭菌中sucD基因(Sohling等人,J.Bacteriol.178:871-880(1996))。牙龈红棕色单胞菌的sucD是另一种琥珀酸半醛脱氢酶(Takahashi等人,J.Bacteriol.182:4704-4710(2000))。由bphG编码的假单胞菌属中将乙醛脱氢酶酰基化的酶也是另一种候选酶,因为它已被证实可将乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛氧化并酰基化(Powlowski等人,J Bacteriol.175:377-385(1993))。除了将乙酰基-CoA还原为乙醇,由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰基-CoA(Kazahayan等人,J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972);Koo等人,Biotechnol Lett.27:505-510(2005))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
acr1 | 50086359 | YP_047869.1 | 乙酸钙不动杆菌 |
acr1 | 1684886 | AAC45217 | 不动杆菌baylyi |
acr1 | 18857901 | BAB85476.1 | 不动杆菌属菌株M-1 |
sucD | 172046062 | P38947.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
sucD | 34540484 | NP_904963.1 | 牙龈红棕色单胞菌 |
bphG | 425213 | BAA03892.1 | 假单胞菌属 |
adhE | 55818563 | AAV66076.1 | 肠膜明串珠菌 |
额外的将酰基-CoA转化为其相应的醛的酶型是将丙二酰基-CoA转化为丙二酸半醛的丙二酰基-CoA还原酶。丙二酰基-CoA还原酶是在嗜热酸古生细菌中通过3-羟基丙酸循环的自养碳固定中的关键酶(Berg等人,同上;Thauer R.K.,Science 318:1732-1733(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子并已经被表征在生金球菌属和硫化叶菌菌种中(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006);Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。该酶由勤奋生金球菌中的Msed_0709编码(Alber等人,同上;Berg等人,同上)。来自硫化叶菌tokodaii的编码丙二酰基-CoA还原酶的基因被克隆并异源表达在大肠杆菌中(Alber等人,同上)。这种酶也已显示催化甲基丙二酰基-CoA到其相应的醛的转化(WO/2007/141208)。虽然这些酶的醛脱氢酶功能性与来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶相似,但是几乎没有序列相似性。两种丙二酰基-CoA还原酶候选酶具有相对于天冬氨酸半醛脱氢酶(一种催化天冬氨酰基-4-磷酸到天冬氨酸半醛的还原和同时发生的脱磷酸作用)的高度序列相似性。额外的候选基因可以通过蛋白质序列同源性发现于其他的生物体中,包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌,以及已被列入下文。CoA-酰基化醛脱氢酶的仍然另一候选基因是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth等人,Appl Environ Microbiol 65:4973-4980(1999))。已有报告称,这种酶将乙酰基-CoA和丁酰基-CoA还原为它们相应的醛。这种基因非常类似于编码鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE(Toth等人,同上)。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
Msed_0709 | 146303492 | YP_001190808.1 | 勤奋生金球菌 |
mcr | 15922498 | NP_378167.1 | 硫化叶菌tokodaii |
asd-2 | 15898958 | NP_343563.1 | 硫磺矿硫化叶菌 |
Saci_2370 | 70608071 | YP_256941.1 | 嗜酸热硫化叶菌 |
Ald | 49473535 | AAT66436 | 拜氏梭菌 |
eutE | 687645 | AAA80209 | 鼠伤寒沙门氏菌 |
eutE | 2498347 | P77445 | 大肠杆菌 |
图2,步骤K-HMDA转氨酶(EA10A)或HMDA脱氢酶(EA10B)
1.4.1.a作用于氨基酸的氧化还原酶.图2的步骤K描绘了还原氨基化以及必然伴有6-ACA半醛到HMDA的转化。
作用于氨基酸的大多数氧化还原酶催化将NAD+或NADP+作为受体的α-氨基酸的氧化脱氨,尽管反应通常是可逆的。作用于氨基酸的示例性氧化还原酶包括由gdhA编码的谷氨酸脱氢酶(脱氨)、由ldh编码的亮氨酸脱氢酶(脱氨)和由nadX编码的天冬氨酸脱氢酶(脱氨)。来自大肠杆菌的gdhA基因产物(McPherson等人,Nucleic.Acids Res.11:5257-5266(1983);Korber等人,J.Mol.Biol.234:1270-1273(1993))、来自海栖热袍菌的gdh(Kort等人,Extremophiles 1:52-60(1997);Lebbink等人,J.Mol.Biol.280:287-296(1998);Lebbink等人,J.Mol.Biol.289:357-369(1999))和来自盐沼沙雷氏菌的gdhA1(Ingoldsby等人,Gene.349:237-244(2005))催化谷氨酸到2-酮戊二酸和氨的可逆的相互转化,同时分别有利于NADP(H)、NAD(H)或两者。蜡状芽孢杆菌的ldh基因编码具有包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和2-氨基丁酸酯的广泛底物的LeuDH蛋白质(Stoyan等人,J.Biotechnol54:77-80(1997);Ansorge等人,Biotechnol Bioeng.68:557-562(2000))。用于编码天冬氨酸脱氢酶的来自海栖热袍菌的nadX基因参与NAD的生物合成(Yang等人,J.Biol.Chem.278:8804-8808(2003))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
gdhA | 118547 | P00370 | 大肠杆菌 |
gdh | 6226595 | P96110.4 | 海栖热袍菌 |
gdhA1 | 15789827 | NP_279651.1 | 盐沼沙雷氏菌 |
ldh | 61222614 | P0A393 | 蜡样芽胞杆菌 |
nadX | 15644391 | NP_229443.1 | 海栖热袍菌 |
由lysDH基因编码的赖氨酸6-脱氢酶(脱氨)催化L-赖氨酸的ε-氨基团的氧化脱氨以形成2-氨基己二酸-6-半醛,其反过来非酶环化以形成Δ1-哌啶-6-羧酸(Misono等人,J.Bacteriol.150:398-401(1982))。示例性的酶可以被发现于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Heydari等人,Appl Environ.Microbiol70:937-942(2004))、根癌土壤杆菌(Hashimoto等人,J Biochem 106:76-80(1989);Misono等人,同上)和反硝化无色杆菌(Ruldeekulthamrong等人,BMB.Rep.41:790-795(2008))中。考虑到己二酸半醛和2-氨基己二酸-6-半醛之间的结构相似性,这样的酶是用于将己二酸半醛转化为6-ACA的特别好的候选酶。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
lysDH | 13429872 | BAB39707 | 嗜热脂肪地芽孢杆菌 |
lysDH | 15888285 | NP_353966 | 根癌土壤杆菌 |
lysDH | 74026644 | AAZ94428 | 反硝化无色杆菌 |
2.6.1.a转氨酶.图2的步骤K,在某些实施方式中,可以涉及6-醛转氨基为胺。这种转换可以由γ-氨基丁酸转氨酶(GABA转氨酶)催化。一种大肠杆菌的GABA转氨酶由gabT编码并将氨基从谷氨酸转移至琥珀半醛的末端醛(Bartsch等人,J.Bacteriol.172:7035-7042(1990))。puuE的基因产物催化大肠杆菌中的另一种4-氨基丁酸转氨酶(Kuriharan等人,J.Biol.Chem.280:4602-4608(2005))。家鼠、荧光假单胞菌和野猪中的GABA转氨酶已显示与6-氨基己酸反应(Cooper,Methods Enzymol.113:80-82(1985);Scott等人,J.Biol.Chem.234:932-936(1959))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
gabT | 16130576 | NP_417148.1 | 大肠杆菌 |
puuE | 16129263 | NP_415818.1 | 大肠杆菌 |
abat | 37202121 | NP_766549.2 | 家鼠 |
gabT | 70733692 | YP_257332.1 | 荧光假单胞菌 |
abat | 47523600 | NP_999428.1 | 野猪 |
额外的候选酶包含腐胺转氨酶或其他二胺转氨酶。这样的酶特别适合于执行6-ACA半醛到HMDA的转化。大肠杆菌腐胺转氨酶由ygjG基因编码以及经纯化的酶也能够使尸胺和亚精胺转氨基(Samsonovan等人,BMCMicrobiol 3:2(2003))。此外,具有非2-酮戊二酸(如丙酮酸、2-氧代丁酸酯)的氨基受体的这种酶对1,7-二氨基庚烷的活性已被报道(Samsonovan等人,同上;Kim,K.H.,J Biol Chem 239:783-786(1964))。以丙酮酸而非α-酮戊二酸作为氨基受体的具有更高活性的腐胺转氨酶是绿脓假单胞菌的spuC基因(Lu等人,J Bacteriol 184:3765-3773(2002))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
ygjG | 145698310 | NP_417544 | 大肠杆菌 |
spuC | 9946143 | AAG03688 | 绿脓假单胞菌 |
仍然额外的候选酶包含β-丙氨酸/α-酮戊二酸转氨酶,其从β-丙氨酸生产丙二酸半醛(WO08027742)。克鲁维酵母中SkPYD4的基因产物也显示出优先使用β-丙氨酸作为氨基供体(Andersen等人,FEBS.J.274:1804-1817(2007))。SkUGA1编码酿酒酵母GABA转氨酶UGA1的同系物(Ramos等人,Eur.J.Biochem.,149:401-404(1985)),而SkPYD4编码参与β-丙氨酸和GABA转氨基的酶(Andersen等人,同上)。3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶催化甲基丙酸半醛到3-氨基-2-甲基丙酸甲酯的转化。这种酶已被表征于褐鼠和野猪中并且由Abat编码(Tamaki等人,Methods Enzymol,324:376-389(2000))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
SkyPYD4 | 98626772 | ABF58893.1 | 克鲁维酵母 |
SkUGA1 | 98626792 | ABF58894.1 | 克鲁维酵母 |
UGA1 | 6321456 | NP_011533.1 | 酿酒酵母 |
Abat | 122065191 | P50554.3 | 褐鼠 |
Abat | 120968 | P80147.2 | 野猪 |
图2,步骤L-己二酰基-CoA水解酶(EA11A)、己二酰基-CoA连接酶(EA11B)、己二酰基-CoA转移酶(EA11C)或磷酸转己二酰酶/己二酸激酶(EA11D)
图2,步骤L可以涉及己二酰基-CoA合成酶(也称为己二酸-CoA连接酶)、EA11D、己二酰基-CoA:乙酰基-CoA转移酶或EA11A。从能量的角度来看,己二酸合成途径中最后步骤需要由可以节省存储在己二酰基-CoA的硫酯键中的ATP当量的酶或酶对来催化。如果它们表现出对己二酰基-CoA的活性,大肠杆菌的sucC和sucD基因的产物或其同系物可以潜在地催化图2中所示的最终转换。该sucCD基因在活体内可逆的反应中,天然地形成琥珀酰-CoA合成酶复合物,其催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA并伴随消耗一份ATP(Buck等人,Biochem.24:6245-6252(1985))。考虑到琥珀酸和己二酸之间的结构类似性,也就是,两者是直链二羧酸,期望sucCD酶对己二酰基-CoA的一些活性是合理的。当以相反的生理方式运行时,表现出EA11B活性的酶可以在此使用AMP和PPi作为辅因子,等效地进行从己二酰基-CoA到己二酸的ATP生成生产。示例性CoA-连接酶包含其序列仍未得以表征的大鼠二羧酸-CoA连接酶(Vamecq等人,Biochem.J.230:683-693(1985)),两种经表征的来自产黄青霉菌的苯基乙酸-CoA连接酶(Lamas-Maceiras等人,Biochem.J.395,147-155(2005);Wang等人,Biochem.Biophy.Res.Commun.360:453-458(2007))、来自恶臭假单胞菌的苯基乙酸-CoA连接酶(Martinez-Blanco等人,J.Biol.Chem.265:7084-7090(1990))的任一种,以及来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酸酯-CoA连接酶(Bower等人,J.Bacteriol.178:4122-4130(1996))。每个这些示例性基因产物的蛋白质序列可以使用下列的GI号和/或GenBank标示符找到:
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
sucC | 16128703 | NP_415256.1 | 大肠杆菌 |
sucD | 1786949 | AAC73823.1 | 大肠杆菌 |
另一种选择是使用EA11D,其由来自丙酮丁醇梭菌的buk1、buk2和ptb的基因产物;或其同系物催化(Walter等人,Gene 134:107-111(1993);Huang等人,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2:33-38(2000))。该ptb基因编码可以将丁酰基-CoA转化为丁酰基-磷酸,其然后经由buk基因产物的任一种转化为丁酸,伴随ATP的生成的酶。类似的转换组,也就是,己二酰基-CoA至己二酰基-磷酸的转化,继之以己二酰基-磷酸到己二酸的转化,可以由buk1、buk2和ptb基因产物执行。每个这些示例性基因产物的蛋白质序列可以使用下列的GI号和/或GenBank标示符找到:
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
ptb | 15896327 | NP_349676 | 丙酮丁醇梭菌 |
buk1 | 15896326 | NP_349675 | 丙酮丁醇梭菌 |
buk2 | 20137415 | Q97II1 | 丙酮丁醇梭菌 |
替代性地,可以应用能够将CoA基团从己二酰基-CoA转移到乙酸的乙酰基转移酶。用于催化类似转换的是克鲁佛氏梭菌的cat1、cat2以及cat3的基因产物,其已经显示分别具有琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰基-CoA以及丁酰基-CoA转移酶活性(Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996);Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:2128-2133(2008))。每个这些示例性基因产物的蛋白质序列可以使用下列的GI号和/或GenBank标示符找到:
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
cat1 | 729048 | P38946.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
cat2 | 172046066 | P38942.2 | 克鲁佛氏梭菌 |
cat3 | 146349050 | EDK35586.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
最后,虽然从能量的角度来看不是合乎需要的,己二酰基-CoA到己二酸的转化也可以通过酰基-CoA水解酶或等效地硫酯酶执行。顶级大肠杆菌候选基因是tesB(Naggert等人,J.Biol.Chem.266:11044-11050(1991)),其显示出与人acot8的高度相似性,该人acot8是具有对己二酰基-CoA的活性的二羧酸乙酰基转移酶(Westin等人,J.Biol.Chem.280:38125-38132(2005))。这种活性也已经被表征于大鼠肝脏(Deana,Biochem.Int.26:767-773(1992))。每个这些示例性基因产物的蛋白质序列可以使用下列的GI号和/或GenBank标示符找到:
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
tesB | 16128437 | NP_414986 | 大肠杆菌 |
acot8 | 3191970 | CAA15502 | 智人 |
acot8 | 51036669 | NP_570112 | 褐鼠 |
其他的天然候选基因包含tesA(Bonner和Bloch,J.Biol.Chem.247:3123-3133(1972))、ybgC(Kuznetsovan等人,FEMS Microbiol.Rev.29:263-279(2005);Zhuang等人,FEBS Lett.516:161-163(2002))、paaI(Song等人,J.Biol.Chem.281:11028-11038(2006))和ybdB(Leduc等人,J.Bacteriol.189:7112-7126(2007))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
tesA | 16128478 | NP_415027 | 大肠杆菌 |
ybgC | 16128711 | NP_415264 | 大肠杆菌 |
paaI | 16129357 | NP_415914 | 大肠杆菌 |
ybdB | 16128580 | NP_415129 | 大肠杆菌 |
2.8.3.a辅酶-A转移酶.CoA转移酶催化CoA部分从一个分子到另一个分子的可逆反应。例如,图2的步骤L可以通过EA11C催化。用于这个步骤的一种候选酶是由假单胞菌中的pcaI和pcaJ编码的两单位酶,其已经显示具有3-氧代己二酰基-CoA/琥珀酸转移酶活性(Kaschabek和Reineke,J.Bacteriol.177:320-325(1995);以及Kaschabek.和Reineke,J.Bacteriol.175:6075-6081(1993))。基于同源性的类似的酶还存在于不动杆菌属ADP1(Kowalchuk等人,Gene 146:23-30(1994))和天蓝色链霉菌中。额外的示例性琥珀酰-CoA:3:氧代酸-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy-Theulaz等人,J.Biol.Chem.272:25659-25667(1997))和枯草芽孢杆菌(Stols等人,Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007))中。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
pcaI | 24985644 | AAN69545.1 | 恶臭假单胞菌 |
pcaJ | 26990657 | NP_746082.1 | 恶臭假单胞菌 |
pcaI | 50084858 | YP_046368.1 | 不动杆菌属ADP1 |
pcaJ | 141776 | AAC37147.1 | 不动杆菌属ADP1 |
pcaI | 21224997 | NP_630776.1 | 天蓝色链霉菌 |
pcaJ | 21224996 | NP_630775.1 | 天蓝色链霉菌 |
HPAG1_0676 | 108563101 | YP_627417 | 幽门螺杆菌 |
HPAG1_0677 | 108563102 | YP_627418 | 幽门螺杆菌 |
ScoA | 16080950 | NP_391778 | 枯草芽孢杆菌 |
ScoB | 16080949 | NP_391777 | 枯草芽孢杆菌 |
可以将乙酸用作CoA受体的3-氧代酰基-CoA转移酶是由大肠杆菌atoA(α亚基)和atoD(β亚基)基因编码的乙酰乙酰基-CoA转移酶(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res Commun.33:902-908(1968);Korolev等人,Acta Crystallogr.D Biol Crystallogr.58:2116-2121(2002))。这种酶也已经显示将CoA部分从各种支链和直链酰基-CoA底物转移至醋酸,包括异丁酸(Matthies等人,Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))和丁酸酯(Vanderwinkel等人,同上)。类似的酶存在于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Duncan等人,Appl Environ Microbiol 68:5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人,Appl Environ Microbiol 56:1576-1583(1990))以及糖乙酸多丁醇梭菌(Kosakan等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
atoA | 2492994 | P76459.1 | 大肠杆菌K12 |
atoD | 2492990 | P76458.1 | 大肠杆菌K12 |
actA | 62391407 | YP_226809.1 | 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 |
cg0592 | 62389399 | YP_224801.1 | 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032 |
ctfA | 15004866 | NP_149326.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
ctfB | 15004867 | NP_149327.1 | 丙酮丁醇梭菌 |
ctfA | 31075384 | AAP42564.1 | 糖乙酸多丁醇梭菌 |
ctfB | 31075385 | AAP42565.1 | 糖乙酸多丁醇梭菌 |
上述酶还可显示出对己二酰基-CoA和己二酸的所需活性(图2,步骤L)。然而,用于催化额外的示例性候选转移酶包括克鲁佛氏梭菌的cat1、cat2以及cat3的基因产物,其已经显示分别具有琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰基-CoA以及丁酰基-CoA转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 105:2128-2133(2008);Sohling等人,Eur.J Biochem.212:121-127(1993);Sohling等人,J Bacteriol.178:871-880(1996))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
cat1 | 729048 | P38946.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
cat2 | 172046066 | P38942.2 | 克鲁佛氏梭菌 |
cat3 | 146349050 | EDK35586.1 | 克鲁佛氏梭菌 |
来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的酶-戊烯二酸-CoA-转移酶(EC2.8.3.12)与二酸戊烯二酰基-CoA和3-丁烯酰基-CoA反应(Mack等人,FEBSLett.405:209-212(1997))。编码这种酶的基因是gctA以及gctB。这种酶对于其他CoA衍生物(包括戊二酰基-CoA、2-羟基戊二酰基-CoA、己二酰基-CoA以及丙烯酰基-CoA)具有减少的但可检测到的活性(Buckel等人,Eur.J.Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆以及表达于大肠杆菌(Mack等人,Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。
基因名 | GI号 | GenBank ID | 生物体 |
gctA | 559392 | CAA57199.1 | 发酵氨基酸球菌 |
gctB | 559393 | CAA57200.1 | 发酵氨基酸球菌 |
图5,步骤T-PEP羧化酶(EFR16A)或PEP羧基激酶(EFR16B)
磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸的羧基化通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化。示例性PEP羧化酶由大肠杆菌中的ppc(Kai等人,Arch.Biochem.Biophys.414:170-179(2003))、扭脱甲基杆菌AM1中的ppcA(Arps等人,J.Bacteriol.175:3776-3783(1993))以及谷氨酸棒杆菌中的ppc(Eikmanns等人,Mol.Gen.Genet.218:330-339(1989))编码。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Ppc | NP_418391 | 16131794 | 大肠杆菌 |
ppcA | AAB58883 | 28572162 | 扭脱甲基杆菌 |
Ppc | ABB53270 | 80973080 | 谷氨酸棒杆菌 |
用于将磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸的替代性酶是PEP羧激酶,其在羧基化PEP的同时形成ATP。在大多数生物体中,PEP羧激酶起葡萄糖异生的功能以及将草酰乙酸转化为PEP并消耗一份ATP。酿酒酵母是一种这样的生物体,其原生PEP羧激酶PCK1起葡萄糖异生作用(Valdes-Hevia等人,FEBS Lett.258:313-316(1989))。大肠杆菌是另一种这样的生物体,因为PEP羧激酶在生产草酰乙酸中的作用被认为相比于不形成ATP的PEP羧化酶是次要的,这可能是由于PEP羧激酶碳酸氢钠的Km较高(Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.70:1238-1241(2004))。然而,原生大肠杆菌PEP羧激酶从PEP到草酰乙酸的活性最近已在大肠杆菌K-12的ppc突变体中得到证实(Kwon等人,J.Microbiol.Biotechnol.16:1448-1452(2006))。这些菌株表现出没有生长缺陷以及已经以高NaHCO3浓度提高了琥珀酸产量。适应性进化后,大肠杆菌的突变株可以采用Pck作为主导CO2固定酶(Zhang等人,2009)。在某些生物体,尤其是瘤胃细菌中,PEP羧激酶在从PEP到草酰乙酸的生产以及ATP的生成中非常有效。已被克隆进入大肠杆菌的PEP羧激酶基因的例子包括那些来自产琥珀酸曼氏杆菌(Lee等人,Biotechnol.Bioprocess Eng.7:95-99(2002)),产琥珀酸厌氧螺菌(Laivenieks等人,Appl.Environ.Microbiol.63:2273-2280(1997))以及琥珀酸放线杆菌(Kim等人.同上)的例子。由流感嗜血杆菌编码的PEP羧激酶在从PEP到草酰乙酸的形成中有效。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
PCK1 | NP_013023 | 6322950 | 酿酒酵母 |
pck | NP_417862.1 | 16131280 | 大肠杆菌 |
pckA | YP_089485.1 | 52426348 | 产琥珀酸曼氏杆菌 |
pckA | O09460.1 | 3122621 | 产琥珀酸厌氧螺菌 |
pckA | Q6W6X5 | 75440571 | 琥珀酸放线杆菌 |
pckA | P43923.1 | 1172573 | 流感嗜血杆菌 |
图5,步骤U-丙酮酸羧化酶(EFR17)
丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)直接将丙酮酸转化为草酰乙酸并消耗一份ATP。丙酮酸羧化酶由酿酒酵母中的PYC1(Walker等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.176:1210-1217(1991))和PYC2(Walker等人,同上),以及包皮垢分支杆菌中的pyc(Mukhopadhyay和Purwantini,Biochim.Biophys.Acta 1475:191-206(2000))编码。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
PYC1 | NP_011453 | 6321376 | 酿酒酵母 |
PYC2 | NP_009777 | 6319695 | 酿酒酵母 |
Pyc | YP_890857.1 | 118470447 | 包皮垢分枝杆菌 |
图5,步骤V-苹果酸脱氢酶(EFR18)
苹果酸脱氢酶将草酰乙酸转化为苹果酸。示例性酶被发现于若干生物体中,包含大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和稻根霉菌。来自酿酒酵母的MDH1、MDH2和MDH3已知分别定位至线粒体、细胞溶质以及过氧物酶体。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
mdh | AAC76268.1 | 1789632 | 大肠杆菌 |
MDH1 | NP_012838.1 | 6322765 | 酿酒酵母 |
MDH2 | NP_014515.2 | 116006499 | 酿酒酵母 |
MDH3 | NP_010205.1 | 6320125 | 酿酒酵母 |
mdh | NP_390790.1 | 16079964 | 枯草芽孢杆菌 |
MDH | ADG65261.1 | 296011196 | 稻根霉菌 |
图5,步骤W-苹果酸酶(EFR19)
苹果酸酶可以应用于将CO2以及丙酮酸转化为苹果酸并消耗一份还原当量。用于此目的的苹果酸酶可以包括但不仅限于苹果酸酶(依赖NAD的)以及苹果酸酶(依赖NADP的)。例如,大肠杆菌苹果酸酶的一种(Takeo,J.Biochem.66:379-387(1969))或具有较高活性的类似酶可以被表达以实现丙酮酸以及CO2到苹果酸的转化。通过将碳固定到与PEP相对的丙酮酸,苹果酸酶使得来自PEP的高能量磷酸键能够通过丙酮酸激酶得以保存,从而在丙酮酸的形成中或通过用于葡萄糖转运的磷酸转移酶系统生成ATP。虽然通常认为苹果酸酶按从苹果酸形成丙酮酸的方向运行,由maeA编码的依赖NAD的酶的过表达已被证实提高大肠杆菌中琥珀酸产量,同时通过按碳固定方向运行在厌氧条件下恢复致死的Δpfl-ΔldhA表型(Stols和Donnelly,Appl.Environ.Microbiol.63(7)2695-2701(1997))。对来自猪蛔虫的苹果酸酶在大肠杆菌中的过表达进行类似的观察(Stols等人,Appl.Biochem.Biotechnol.63-65(1),153-158(1997))。由maeB编码的第二大肠杆菌苹果酸酶是依赖NADP的以及还对草酰乙酸以及其他α-酮酸脱羧(Iwakura等人,J.Biochem.85(5):1355-65(1979))。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
maeA | NP_415996 | 90111281 | 大肠杆菌 |
maeB | NP_416958 | 16130388 | 大肠杆菌 |
NAD-ME | P27443 | 126732 | 猪蛔虫 |
图5,步骤X-富马酸酶(EFR20A)、富马酸还原酶(EFR20B)、琥珀酰-CoA合成酶(EFR20C)、琥珀酰-CoA连接酶(EFR20D)、琥珀酰-CoA转移酶(EFR20E)
富马酸水合酶(EC 4.2.1.2)催化富马酸到苹果酸的可逆水合作用。在不同的氧可用性条件下调节大肠杆菌由fumA、fumB和fumC编码的三种富马酸酶。FumB对氧灵敏以及在厌氧条件下具有活性。FumA在微厌氧条件下具有活性,以及FumC在有氧的生长条件下具有活性(Tseng等人,J.Bacteriol.183:461-467(2001);Woods等人,Biochim.Biophys.Acta 954:14-26(1988);Guest等人,J.Gen.Microbiol.131:2971-2984(1985))。酿酒酵母包含编码富马酸酶的基因的一个副本FUM1,其产物固定到细胞溶质以及线粒体(Sass等人,J.Biol.Chem.278:45109-45116(2003))。额外的富马酸酶发现于空肠弯曲杆菌(Smith等人,Int.J.Biochem.Cell.Biol.31:961-975(1999))、嗜热栖热菌(Mizobatan等人,Arch.Biochem.Biophys.355:49-55(1998))以及褐鼠(Kobayashi等人,J.Biochem.89:1923-1931(1981))。具有高度序列同源性的类似酶包括来自拟南芥的fum1、来自稻根霉菌的FUM1以及来自谷氨酸棒杆菌的fumC。来自Pelotomaculum thermopropionicum的MmcBC富马酸酶是具有两种亚基的另一类别的富马酸酶(Shimoyama等人,FEMSMicrobiol.Lett.270:207-213(2007))。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
fumA | NP_416129.1 | 16129570 | 大肠杆菌 |
fumB | NP_418546.1 | 16131948 | 大肠杆菌 |
fumC | NP_416128.1 | 16129569 | 大肠杆菌 |
FUM1 | NP_015061 | 6324993 | 酿酒酵母 |
fumC | Q8NRN8.1 | 39931596 | 谷氨酸棒杆菌 |
fumC | O69294.1 | 9789756 | 空肠弯曲杆菌 |
fumC | P84127 | 75427690 | 嗜热栖热菌 |
fumH | P14408.1 | 120605 | 褐鼠 |
MmcB | YP_001211906 | 147677691 | Pelotomaculum thermopropionicum |
MmcC | YP_001211907 | 147677692 | Pelotomaculum thermopropionicum |
FUM1 | ADG65260.1 | 296011194 | 稻根霉菌 |
富马酸还原酶催化富马酸还原为琥珀酸。大肠杆菌的由四种亚基(由frdABCD编码)组成的富马酸还原酶是膜结合的以及在厌氧条件下具有活性。用于这种反应的电子供体是甲基萘醌类以及这种反应中产生的两种质子并不有助于质子梯度(Iverson等人,Science 284:1961-1966(1999))。酵母基因组编码由FRDS1(Enomoto等人,DNA Res.3:263-267(1996))以及FRDS2(Muratsubaki等人,Arch.Biochem.Biophys.352:175-181(1998))编码的两种可溶富马酸还原酶同工酶,该同工酶分别固定到细胞溶质和原线粒体)以及被用于葡萄糖上的厌氧培育(Arikawan等人,FEMS Microbiol.Lett.165:111-116(1998))。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
FRDS1 | P32614 | 418423 | 酿酒酵母 |
FRDS2 | NP_012585 | 6322511 | 酿酒酵母 |
frdA | NP_418578.1 | 16131979 | 大肠杆菌 |
frdB | NP_418577.1 | 16131978 | 大肠杆菌 |
frdC | NP_418576.1 | 16131977 | 大肠杆菌 |
frdD | NP_418475.1 | 16131877 | 大肠杆菌 |
从琥珀酸到琥珀酰-CoA的ATP依赖性酰基化由琥珀酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.5)催化。酿酒酵母LSC1和LSC2基因以及大肠杆菌的sucC和sucD基因的产物天然地形成琥珀酰-CoA合成酶复合体,该复合体在活体内可逆的反应中,天然地催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA并伴随消耗一份ATP(Buck等人,Biochemistry 24:6245-6252(1985))。这些蛋白质确认如下:
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
LSC1 | NP_014785 | 6324716 | 酿酒酵母 |
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
LSC2 | NP_011760 | 6321683 | 酿酒酵母 |
sucC | NP_415256.1 | 16128703 | 大肠杆菌 |
sucD | AAC73823.1 | 1786949 | 大肠杆菌 |
琥珀酰-CoA转移酶催化琥珀酰-CoA到琥珀酸的转化同时将CoA部分转移到CoA受体分子。许多转移酶具有广泛的特异性以及可以将CoA受体用作多样酸,尤其用作醋酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、2-甲基乙酰醋酸、3-酮己酸、3-酮戊酸、戊酸、巴豆酸、3-巯基丙酸、丙酸、乙烯醋酸以及丁酸。
琥珀酸到琥珀酰-CoA的转化可以通过转移酶进行,这无需直接消耗ATP或GTP。这种类型的反应常见于许多生物体中。琥珀酸到琥珀酰-CoA的转化还可以通过琥珀酰-CoA:乙酰基-CoA转移酶催化。克鲁佛氏梭菌的cat1的基因产物已经显示具有琥珀酰-CoA:乙酰基-CoA转移酶活性(Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996))。另外,该活性存在于阴道滴虫(van Grinsven等人,2008)以及布氏锥虫(Riviere等人,2004)。在变体TCA循环中,由aarC编码的来自醋化醋杆菌的琥珀酰-CoA:醋酸CoA-转移酶替代琥珀酰-CoA合成酶(Mullins等人,2008)。类似的琥珀酰-CoA转移酶活性还存在于阴道滴虫(van Grinsven等人,2008)、布氏锥虫(Riviere等人,2004)以及克鲁佛氏梭菌(Sohling和Gottschalk,1996c)中。由恶臭假单胞菌中的pcaI以及pcaJ编码的β-酮己二酸:琥珀酰-CoA转移酶仍是另一种候选酶(Kaschabek等人,2002)。上述蛋白质确认如下。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
cat1 | P38946.1 | 729048 | 克鲁佛氏梭菌 |
TVAG_395550 | XP_001330176 | 123975034 | 阴道滴虫G3 |
Tb11.02.0290 | XP_828352 | 71754875 | 布氏锥虫 |
pcaI | AAN69545.1 | 24985644 | 恶臭假单胞菌 |
pcaJ | NP_746082.1 | 26990657 | 恶臭假单胞菌 |
aarC | ACD85596.1 | 189233555 | 醋化醋杆菌 |
将琥珀酸转化为琥珀酰-CoA同时将3-酮酰基-CoA转化为3-酮酸的附加示例性转移酶是琥珀酰-CoA:3:酮酸-CoA转移酶(EC 2.8.3.5)。示例性琥珀酰-CoA:3:酮酸-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy-Theulaz等人,1997)、枯草芽孢杆菌以及智人(Fukao等人,2000;Tanakan等人,2002)中。上述蛋白质确认如下。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
HPAG1_0676 | YP_627417 | 108563101 | 幽门螺杆菌 |
HPAG1_0677 | YP_627418 | 108563102 | 幽门螺杆菌 |
ScoA | NP_391778 | 16080950 | 枯草芽孢杆菌 |
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
ScoB | NP_391777 | 16080949 | 枯草芽孢杆菌 |
OXCT1 | NP_000427 | 4557817 | 智人 |
OXCT2 | NP_071403 | 11545841 | 智人 |
图5,步骤Y-3-氧代己二酰基-CoA硫解酶(EA1)
ACCOA和琥珀酰-CoA到3-氧代己二酰基-CoA的转化可以如图2,步骤A如上所提供的,由3-氧代己二酰基-CoA硫解酶催化。该3-氧代己二酰基-CoA然后可以如图2中所提供,被用于到己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其中间体的随后转化。
4.3实施例III–将从甲醇氧化生产的甲醛用于形成用于生物体质的形成的中心代谢途径的中间体的方法
本文提供将从甲醇氧化生产的甲醛(见,如图1,步骤J)用于某些中心代谢途径的中间体的形成的示例性途径,该途径可以被用于生物质的形成。用于提高还原当量的可用性,以及从甲醇生产甲醛(步骤J)的示例性MMP被提供于图1中。
可以利用从甲醇氧化生产的甲醛(如图1中所提供)的一种示例性途径如图3中所示,其涉及甲醛和5-磷酸-D-核酮糖的缩合以通过EF1形成H6P(图3,步骤A)。为了最大活性,该酶可以使用Mg2+或Mn2+,虽然其他的金属离子是有用的,以及甚至非金属离子依赖性机制被考虑到。H6p通过EF2被转化为F6P(图3,步骤B)。
涉及对从甲醇氧化生产的甲醛(如图1中所提供)的解毒和同化的另一示例性途径如图4中所示以及通过DHA继续进行。EF3是一种特殊的转酮醇酶,其首先将甘油醛基团从-5-磷酸木酮糖转移到甲醛,导致DHA和-3-磷酸甘油醛(G3P)(其是糖酵解中的中间体)的形成(图4,步骤A)。从DHA合酶获得的DHA然后可以进一步被磷酸化以通过EF4形成DHAP(图4,步骤B)。DHAP可以被同化进入糖酵解和若干其他的途径。
图3,步骤A和B-H6P合酶(EF1)(步骤A)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2)(步骤B)
EF1和EF2两种酶均被发现在几种生物体(包括其中它们已经纯化的甲烷氧化细菌和甲基营养生物)中(Kato等人,2006,BioSci BiotechnolBiochem.70(1):10-21)。此外,这些酶已被报道在异养生物(如枯草芽孢杆菌)中,它们还被报道参与甲醛解毒(Mitsui等人,2003,AEM 69(10):6128-32,Yasuedan等人,1999.J Bac 181(23):7154-60)。来自甲基营养细菌的胃分枝杆菌MB19的这两种酶的基因已被融合以及包含hps-phi构建体的大肠杆菌菌株显示对甲醛的更有效的利用(Oritan等人,2007,Appl MicrobiolBiotechnol.76:439–445)。在一些生物体中,这两种酶作为双功能的融合型式天然地存在。
己酮糖-6-磷酸合酶的示例性候选基因是:
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Hps | AAR39392.1 | 40074227 | 甲醇芽孢杆菌MGA3 |
Hps | EIJ81375.1 | 387589055 | 甲醇芽孢杆菌PB1 |
RmpA | BAA83096.1 | 5706381 | 甲基单胞菌aminofaciens |
RmpA | BAA90546.1 | 6899861 | 胃分枝杆菌 |
YckG | BAA08980.1 | 1805418 | 枯草芽孢杆菌 |
Hps | YP_544362.1 | 91774606 | 鞭毛甲基菌 |
Hps | YP_545763.1 | 91776007 | 鞭毛甲基菌 |
Hps | AAG29505.1 | 11093955 | 氨基氨基酸单胞菌 |
SgbH | YP_004038706.1 | 313200048 | 食甲基菌MP688 |
Hps | YP_003050044.1 | 253997981 | 食葡糖食甲基菌SIP3-4 |
Hps | YP_003990382.1 | 312112066 | 地芽孢杆菌属Y4.1MC1 |
Hps | gb|AAR91478.1 | 40795504 | 地芽孢杆菌属M10EXG |
Hps | YP_007402409.1 | 448238351 | 地芽孢杆菌属GHH01 |
EF2的示例性候选基因是:
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Phi | AAR39393.1 | 40074228 | 甲醇芽孢杆菌MGA3 |
Phi | EIJ81376.1 | 387589056 | 甲醇芽孢杆菌PB1 |
Phi | BAA83098.1 | 5706383 | 甲基单胞菌aminofaciens |
RmpB | BAA90545.1 | 6899860 | 胃分枝杆菌 |
Phi | YP_545762.1 | 91776006 | 鞭毛甲基菌KT |
Phi | YP_003051269.1 | 253999206 | 食葡糖食甲基菌SIP3-4 |
Phi | YP_003990383.1 | 312112067 | 地芽孢杆菌属Y4.1MC1 |
Phi | YP_007402408.1 | 448238350 | 地芽孢杆菌属GHH01 |
其中这两种功能均已经融合成单一的开放阅读框架的候选酶包括如下:
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
PH1938 | NP_143767.1 | 14591680 | 掘越氏热球菌OT3 |
PF0220 | NP_577949.1 | 18976592 | 激烈热球菌 |
TK0475 | YP_182888.1 | 57640410 | 热球菌kodakaraensis |
PAB1222 | NP_127388.1 | 14521911 | 热球菌abyssi |
MCA2738 | YP_115138.1 | 53803128 | 荚膜甲基球菌 |
Metal_3152 | EIC30826.1 | 380884949 | 甲基微菌album BG8 |
实验系统经设计以测试结合核酮糖单磷酸(RuMP)途径的酶类H6P合酶(HPS)和6-磷酸-3-果糖异构酶(PHI)的甲醇脱氢酶(MeDH)将甲醇碳同化进入糖酵解途径和TCA循环的能力。大肠杆菌菌株ECh-7150(ΔlacIA、ΔpflB、ΔptsI、ΔPpckA(pckA)、ΔPglk(glk)、glk::glfB、ΔhycE、ΔfrmR、ΔfrmA、ΔfrmB)被构建以去除由FrmA和FRMB酶编码的谷胱甘肽依赖性甲醛解毒能力。然后用包含或缺乏编码HPS和PHI酶的融合的基因2616An的质粒pZA23S变体转换这种菌株。然后用包含基因2315L(编码活性MeDH)或基因2315RIP2(编码催化地无活性的MeDH)或无基因插入的pZS*13S变体分别转换这两种经转换的菌株。基因2315和2616是来自甲醇芽孢杆菌MGA3的NAD依赖性甲醇脱氢酶的内部命名以及2616是如Oritan等人(2007)Appl Microbiol Biotechnol 76:439-45中所述的融合的phs-hpi构建体。
以一式四份将所得的六种菌株需氧培养于5ml基本培养基中,该培养基包含1%阿拉伯糖和0.6M 13C-甲醇以及100μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml卡那霉素来维持质粒的选择,以及1mM IPTG以诱导甲醇脱氢酶和HPS-PHI融合酶的表达。经过37℃下18小时的孵育,通过分光光度法以600nM波长测量细胞密度以及将每种培养基的澄清样品提交进行分析以检测将被标记的甲醇碳纳入到TCA-循环衍生的代谢物的证据。可以通过删除与核酮糖-5-磷酸媲美的基因araD而使标签进一步富集。
衍生自本实验中提供的经标记的甲醇的13C碳被发现在TCA-循环衍生的氨基酸谷氨酸(和其他一些TCA化合物和产物途径中间体)方面是显著富集的,但只被发现于一起表达催化活性的MeDH 2315L和HPS-PHI融合2616A的菌株中(数据未示出)。而且,该菌株的生长显著地比表达催化活性的MeDH但缺乏HPS-PHI融合的表达的菌株更好(数据未示出),这表明HPS-PHI酶能够降低在该菌株的背景下不能通过其它手段解毒的甲醛的生长抑制水平。这些结果表明,活性MeDH和RuMP途径的酶的共表达可有效地同化甲醇衍生性碳以及将其引导到TCA-循环衍生性产品中。
图4,步骤A-DHA合酶(EF3)
涉及对从甲醇氧化生产的甲醛(如图1中所提供)的解毒和同化的另一示例性途径如图4中所示以及通过DHA继续进行。EF3是一种特殊的转酮醇酶,其首先将甘油醛基团从-5-磷酸木酮糖转移到甲醛,导致DHA和-3-磷酸甘油醛(G3P)(其是糖酵解中的中间体)的形成(图4,步骤A)。从EF3获得的DHA然后可以进一步被磷酸化以通过EF4形成DHAP(图4,步骤B)。DHAP可以被同化进入糖酵解和若干其他的途径。
博伊丁假丝酵母中的EF3酶将硫胺素焦磷酸和Mg2+用作辅因子并被定位于过氧化物酶体。来自甲醇培育氧化碳细菌,分支杆菌属菌株JC1DSM3803的酶也被发现具有EF3和激酶活性(Ro等人,1997,JBac179(19):6041-7)。来自这种生物体的EF3也具有与来自博伊丁假丝酵母的酶类似的辅因子要求。据报道,甲醛和5-磷酸木酮糖的Km分别为1.86mM和33.3mM。其他几种分枝杆菌(仅排除结核分支杆菌)可以将甲醇用作唯一的碳和能量的来源以及被报道使用EF3(Part等人,2003,JBac 185(1):142-7)。
图4,步骤B-DHA激酶(EF4)
从EF3获得的DHA经进一步磷酸化以通过EF4形成DHAP。DHAP可以被同化进入糖酵解和若干其他的途径。已从Ogataea angusta中纯化EF4至同质性(Bystrkh,1983,Biokhimiia,48(10):1611-6)。将DHA以及,在较小的程度上,将甘油醛磷酸化的酶是139kDa的均二聚体蛋白。ATP是该酶优选的磷酸基团供体。当使用ITP、GTP、CTP和UTP时,活性降低到约30%。在若干生物体(如肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌(Daniel等人,1995,JBac 177(15):4392-40))中,DHA作为甘油的氧化结果而形成并通过已被表征的肺炎克雷伯氏菌的激酶EF4被转化成DHAP(Jonathan等人,1984,JBac 160(1):55-60)。其对具有4μM的Km的DHA具有非常的特异性,以及具有两种针对ATP显而易见的Km值,一种是25至35μM,而另一种是200至300μM。DHA也可以通过甘油激酶磷酸化,但是来自肺炎克雷伯氏菌的EF4在几个方面不同于甘油激酶。虽然这两种酶可以使DHA磷酸化,但是EF4不使甘油磷酸化,它也不受1,6-二磷酸果糖的抑制。在酿酒酵母中,EF4(I和II)参与从DHA的毒性作用中挽救细胞(Molin等人,2003,J Biol Chem.17;278(3):1415-23)。
在大肠杆菌中,EF4由三种亚基DhaK、DhaL和DhaM组成以及其与磷酸转移酶系统(PTS)的功能类似在于其将磷酸烯醇丙酮酸用作磷酸供体(Gutknecht等人,2001,EMBO J.20(10):2480-6)。其不同之处在于不参与转运。磷酸化反应需要PTS系统的EI和HPr蛋白的存在。DhaM亚基在多个位点被磷酸化。DhaK包含底物结合位点(Garcia-Alles等人,2004,43(41):13037-45;Siebold等人,2003,PNAS.100(14):8188-92)。大肠杆菌酶DHA的Km已被报道为6μM。K亚基类似于弗氏柠檬酸杆菌和真核生物的N末端一半的ATP依赖性EF4。
用于这种步骤的示例性EF4候选基因是:
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
DAK1 | P54838.1 | 1706391 | 酿酒酵母S288c |
DAK2 | P43550.1 | 1169289 | 酿酒酵母S288c |
D186_20916 | ZP_16280678.1 | 421847542 | 弗氏柠檬酸杆菌 |
DAK2 | ZP_18488498.1 | 425085405 | 肺炎克雷伯氏菌 |
DAK | AAC27705.1 | 3171001 | Ogataea angusta |
DhaK | NP_415718.6 | 162135900 | 大肠杆菌 |
DhaL | NP_415717.1 | 16129162 | 大肠杆菌 |
DhaM | NP_415716.4 | 226524708 | 大肠杆菌 |
4.4实施例IV-用于处理CO和厌氧的培养物的方法
本实施例描述了被用于处理厌氧的培养物的方法。
A.厌氧室和条件.示例性厌氧培养室可以从市场上购得(见,例如,加利福尼亚州霍桑的Vacuum Atmospheres Company;马萨诸塞州纽伯里波特的MBraun)。条件包括1ppm或以下的O2浓度和1个大气压的纯N2。在一个实施例中,使用了3个氧洗涤器/催化剂再生器,以及该培养室包括O2电极(如加利福尼亚州工业市的Teledyne)。几乎所有的项目和试剂都在该培养室的气锁中循环四次,然后打开内室门。在引入该培养室之前,用纯N2对体积>5mL的试剂鼓泡。手套更换频率为2次/年,以及当该培养室显示出对氧含量的变化反应越来越迟钝时,定期回收催化剂容器。通过螺线管启动的单向阀控制该培养室的压力。此结构元件允许以高于周围环境的水平设置室压以允许非常小的管转移通过排压阀。
厌氧培养室达到了一贯非常低的以及对氧高度灵敏的厌氧条件所需的O2含量。然而,细胞的生长和处理通常并不需要这样的预防措施。在替代性厌氧培养室配置中,可以将铂或钯作为在混合物中需要一些氢气的催化剂。可以通过鼓泡器,而不使用螺线管阀控制压力释放。不使用基于仪器的O2监测,转而可以使用测试条。
B.厌氧微生物学.血清或培养基瓶配有厚厚的橡皮塞以及用铝钳口盖密封瓶子。以常规方式制作培养基(如Terrific Broth)并分装到大小适当的血清瓶中。用氮气喷射瓶子~30分钟进行中度鼓泡。这从培养基中除去大部分的氧,并且在此步骤之后,用橡皮塞(如新泽西州瓦恩兰Bellco公司的Bellco 20mm垫片塞)和钳口密封盖(Bellco 20mm)盖好每个瓶子。然后,利用慢速(液体)排气周期对培养基的瓶子高压灭菌。至少有时,可以用针戳穿塞子以在高压灭菌过程中实现排气;从高压灭菌器中取出后,需要立即除去所述针。通过注射器和针将剩余的培养基成组分(例如缓冲液或抗生素)加入无菌培养基。加入还原剂之前,用氮气(或取决于用途,用CO)平衡瓶子30–60min。添加还原剂,如100×150mM硫化钠,200mM的半胱氨酸-HCl。这通过如下制作:称取硫化钠放入干燥的烧杯中并称取半胱氨酸放入血清瓶中,将所述烧杯和血清瓶放入厌氧培养室,将硫化钠溶解于厌氧水,然后将其加入血清瓶中的半胱氨酸中。当硫化钠溶液接触半胱氨酸后生成硫化氢气体时立即塞好瓶子。当注入培养物时,用注射器式滤器来消毒溶液。通过注射器针头添加其他组分,如B12(10μM氰钴胺素)、氯化镍(在培养室厌氧水中通过40mM原液制作成20μM最终浓度并通过高压灭菌或在注入培养物后通过使用注射器式滤器灭菌的NiCl2)和硫酸亚铁铵(所需最终浓度为100μM—在培养室厌氧水中作为100-1000x的原液制作并通过高压灭菌或在注入培养物后通过使用注射器式滤器灭菌)。用厌氧条件下培育的50mL预培养物接种1L的瓶子,以便在厌氧条件下更快地培育。通过添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至最终浓度0.2mM对载体中的pA1-lacO1启动子进行诱导约3消失。
可以使用连续加气同时鼓泡而在较大的瓶中进行大规模培养物培育。带有金属鼓泡器的橡皮塞在培养基添加之后被置于瓶内并用氮气喷射30min或更长时间,然后设置瓶子的其余部分。将所有的瓶子放在一起,以便无菌滤器会对鼓泡的气体消毒以及瓶子上的软管可用小的C夹进行压缩。用磁搅拌棒搅拌培养基和细胞。一旦添加了所有的培养基组分和细胞,在室内空气中(但向瓶子中持续喷射氮)于孵化器中孵育瓶子。
可以使用连续加气同时鼓泡而在较大的瓶中进行大规模培养物培育。带有金属鼓泡器的橡皮塞在培养基添加之后被置于瓶内并用氮气喷射30min或更长时间,然后设置瓶子的其余部分。将所有的瓶子放在一起,以便无菌滤器会对鼓泡的气体消毒以及瓶子上的软管可用小的C夹进行压缩。用磁搅拌棒搅拌培养基和细胞。一旦添加了所有的培养基组分和细胞,在室内空气中(但向瓶子中持续喷射氮)于孵化器中孵育瓶子。(与上一段重复)
4.5实施例V–用于甲醇到CO2转化的体内标记测定法
本实施例描述微生物体中的功能性甲醇途径。
具有功能性还原TCA分支和丙酮酸甲酸裂解酶缺失的菌株被有氧培育在LB培养基过夜,继之以接种包含IPTG的M9高种培养基以及有氧培育达4小时。在存在和不存在甲醛脱氢酶或甲酸脱氢酶的条件下,这些菌株具有甲醇脱氢酶/ACT对。ACT是一种活化剂蛋白(Nudix水解酶)。此时,菌株经沉淀,再悬浮于包含2%13CH3OH的新鲜M9培养基高种培养基中,以及被密封在厌氧小瓶中。用氮以及于37℃培育达40小时的菌株取代顶空。培育之后,对顶空进行13CO2分析。对培养基进行残留甲醇以及BDO和副产物的检查。所有表达甲醇脱氢酶(MeDH)突变体和MeDH/ACT对的构建体生长至比包含空载体对照物的菌株略低的OD。这可能是由于这些构建体的高表达(数据未显示)。一种构建体(2315/2317)显示出相对于存在FalDH、FDH或没有共表达的蛋白的条件下的对照物,显著的标记的CO2堆积。这显示了大肠杆菌中的功能性MeOH途径以及内源性谷胱甘肽依赖性甲醛解毒基因(frmAB)足以承载当前MeDH/ACT构建体生成的通量。
2315是来自甲醇芽孢杆菌MGA3的MEDH的内部实验室称呼(GenBank登录号:EIJ77596.1;GI号:387585261),以及2317是来自相同生物体的活化子蛋白的内部实验室称呼(基因座标签:MGA3_09170;GenBank登录号:EIJ83380;GI号:387591061)。
对来自甲醇芽孢杆菌的NADH依赖性甲醇脱氢酶的序列分析将该酶置于醇脱氢酶家族III中。它不包含任何色氨酸残基,导致低的消光系数(18,500M-1,cm-1),并应通过考马斯染色在SDS凝胶上进行检测。
该酶已经被表征为多亚基复合物,其从包含一个Zn和1-2Mg原子/亚基的43kDa亚基中建造得到。电子显微镜术和沉降研究确定其为十倍体,其中具有五倍对称性的两个环被堆叠在彼此的顶部(Vonck等人,J.Biol.Chem.266:3949-3954,1991)。其被描述为包含紧密而非共价结合的辅因子,并要求外源性NAD+作为e--受体以衡量活体外活性。活体外活性的强烈增加(10-40倍)在活化子蛋白(ACT)的存在下被观察到,该ACT是一种均二聚体(21kDa亚基)并包含一个Zn和一个Mg原子/亚基。
活化的机理由Kloosterman等人,J.Biol.Chem.277:34785-34792,2002研究,这表示ACT是Nudix水解酶;由Hektor等人,J.Biol.Chem.277:46966-46973,2002研究,这说明MeDH中残基S97至G或T的突变改变了活化特性以及对于辅因子的亲和力。虽然残基G15和D88的突变没有显著的影响,但也暗示了残基G13的稳定性以及残基G95、D100和K103的活性作用。这两份文件一起提出了一个假说,其中ACT切割结合了MeDH的NAD+。MeDH使AMP被结合并以增加的周转量进入活化周期。
ACT和MeDH之间的化学计量比没有在文献中很好地定义。Kloosterman等人,同上将针对充分的活体外活化的二聚体Act比十倍体MeDH的比率确定为10:1。与此相反,Arfman等人J.Biol.Chem.266:3955-3960,1991确定活体外最大的3:1的比率以及针对显著活化的1:6的比率,但观察到对稀释的高灵敏度。基于这两种蛋白在芽孢杆菌中的表达,作者估计体内的比率约为1:17.5。
然而,我们利用纯化的活化剂蛋白(2317A)和甲醇脱氢酶(2315A)的活体外实验显示ACT比MeDH的比率为10:1。使用5M甲醇、2mM NAD和10μM的甲醇脱氢酶2315A(pH 7.4)进行这种活体外试验。
4.6实施例VI–甲酸再利用(同化)途径
本实施例描述了微生物体中功能性甲醇途径。
本实施例描述了用于将丙酮酸转化为甲醛,以及可选地组合生产乙酰基-CoA和/或再生产丙酮酸的酶途径。
图5,步骤E-甲酸还原酶(EFR1)
甲酸到甲醛的转化可以通过甲酸还原酶执行(步骤E,图1)。适用于这些转换的酶是来自艾瓦诺卡氏菌的芳基-醛脱氢酶或等效地,羧酸还原酶。羧酸还原酶催化羧酸到其对应的醛的镁、ATP和NADPH依赖性还原反应(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。由car编码的这种酶被克隆和功能表达于大肠杆菌(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。npt基因产物的表达经由转录后修饰改善了该酶的活性。npt基因编码将钝化脱辅基酶转化为活性全酶的特异性磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)。这种酶的天然底物是香草酸,以及该酶显示对芳香族和脂肪族底物的广泛接受性(Venkitasubramanian等人,in Biocatalysisin the Pharmaceutical and Biotechnology Industires,ed.R.N.Patel,Chapter 15,pp.425-440,CRC Press LLC,Boca Raton,FL.(2006))。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Car | AAR91681.1 | 40796035 | 艾瓦诺卡氏菌(NRRL 5646属) |
Npt | ABI83656.1 | 114848891 | 艾瓦诺卡氏菌(NRRL 5646属) |
额外的car和npt基因可以基于序列同源性得到确认。
发现于灰色链霉菌的另一种候选酶由griC和griD基因编码。认为,这种酶将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化为3-氨基-4-羟基苯甲醛,因为griC或者griD的删除导致细胞外3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸(3-氨基-4-羟基苯甲酸代谢的一种分路产物)的堆积(Suzuki,等人,J.Antibiot.60(6):380-387(2007))。griC和griD与SGR_665(一种在序列上类似于艾瓦诺卡氏菌npt的酶)的共表达会是有益处的。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
griC | YP_001825755.1 | 182438036 | 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350 |
grid | YP_001825756.1 | 182438037 | 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350 |
一种具有类似特性的酶α-氨基己二酸还原酶(AAR,EC 1.2.1.31)参与一些真菌物种中的赖氨酸生物合成途径。这种酶天然地将α-氨基己二酸还原为α-氨基己二酸半醛。首先通过依赖ATP的腺苷酸形成活化羧基基团,然后通过NAD(P)H还原所述腺苷酸以收获醛和AMP。如同CAR,这种酶利用镁并需要通过PPTase进行活化。用于AAR及其相应的PPTase的候选酶发现于酿酒酵母(Morris等人,Gene 98:141-145(1991))、白色念珠菌(Guo等人,Mol.Genet.Genomics 269:271-279(2003))以及粟酒裂殖酵母(Ford等人,Curr.Genet.28:131-137(1995))中。来自粟酒裂殖酵母的AAR当表达于大肠杆菌中时显示出显著的活性(Guo等人,Yeast 21:1279-1288(2004))。来自产黄青霉的AAR接受S-羧基甲基-L-半胱氨酸作为替代性底物,但是不与己二酸、L-谷氨酸或者二氨基庚二酸反应(Hijarrubian等人,J.Biol.Chem.278:8250-8256(2003))。迄今为止还未确认编码产黄青霉PPTase的基因。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
LYS2 | AAA34747.1 | 171867 | 酿酒酵母 |
LYS5 | P50113.1 | 1708896 | 酿酒酵母 |
LYS2 | AAC02241.1 | 2853226 | 白色念珠菌 |
LYS5 | AAO26020.1 | 28136195 | 白色念珠菌 |
Lys1p | P40976.3 | 13124791 | 粟酒裂殖酵母 |
Lys7p | Q10474.1 | 1723561 | 粟酒裂殖酵母 |
Lys2 | CAA74300.1 | 3282044 | 产黄青霉菌 |
Tani等人(Agric Biol Chem,1978,42:63-68;Agric Biol Chem,1974,38:2057-2058)显示来自大肠杆菌菌株B的纯化酶能够将不同有机酸的钠盐(如甲酸盐、羟乙酸盐、醋酸盐等)还原为它们各自的醛(例如甲醛、乙醇醛、乙醛等)。在由Tani等人(1978)审查的三种纯化的酶中,仅“A”同工酶表现出将甲酸盐还原为甲醛。总的来说,这一组酶最初被称为乙醇醛脱氢酶;然而,它们的新还原酶活性引导作者提议乙醇酸还原酶为更合适的名称(Moritan等人,Agric Biol Chem,1979,43:185-186)。Moritan等人(AgricBiol Chem,1979,43:185-186)随后显示,乙醇酸还原酶活性在微生物体中是相对普遍的,被发现于例如:假单胞菌属、土壤杆菌属、埃希氏菌属、产黄菌属、微球菌属、金黄色葡萄球菌属、芽孢杆菌属以及其它菌属。不希望受任何特定理论的束缚,据信,某些这些乙醇酸还原酶能够将甲酸盐还原为甲醛。
任何这些CAR或CAR样酶可以表现出甲酸还原酶活性或可以经设计以这样做。
图5,步骤F-甲酸连接酶(EFR2A)、甲酸转移酶(EFR2B)、甲酸合成酶(EFR2C)
甲酸到甲酰基-CoA的酰基化通过具有甲酸转移酶、合成酶或连接酶活性的酶得以催化(步骤F,图1)。甲酸转移酶酶类已被确认于若干生物体中,包含大肠杆菌(Toyota,等人,J Bacteriol.2008Apr;190(7):2556-64)、产甲酸草酸杆菌(Toyota,等人,J Bacteriol.2008Apr;190(7):2556-64;Baetz等人,J Bacteriol.1990Jul;172(7):3537-40;Ricagno,等人,EMBO J.2003Jul1;22(13):3210-9))和嗜酸乳杆菌(Azcarate-Peril,等人,Appl.Environ.Microbiol.200672(3)1891-1899)。同系物存在于若干其他的生物体中。作用于甲酸转移酶的CoA-供体的酶还可以被表达以确保CoA-供体的有效再生。例如,如果草酰基-CoA是用于甲酸转移酶的CoA-供体底物,可能需要额外的转移酶、合成酶或连接酶以实现从草酸到草酸基-CoA的有效再生。类似地,如果琥珀酰-CoA或乙酰基-CoA是用于甲酸转移酶的CoA供体底物,可能需要额外的转移酶、合成酶或连接酶以实现分别从琥珀酸到琥珀酰-CoA或从乙酸到乙酰基-CoA的有效再生。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
YfdW | NP_416875.1 | 16130306 | 大肠杆菌 |
frc | O06644.3 | 21542067 | 产甲酸草酸杆菌 |
frc | ZP_04021099.1 | 227903294 | 嗜酸乳杆菌 |
合适的CoA-供体再生或甲酸转移酶酶类由克鲁佛氏梭菌的cat1、cat2和cat3的基因产物编码。这些酶已经分别显示出琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰基-CoA以及丁酰基-CoA转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:2128-2133(2008);Sohling和Gottschalk,J Bacteriol 178:871-880(1996))。类似的CoA转移酶活性还存在于阴道滴虫(van Grinsven等人,J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008))以及布氏锥虫(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004))中。能够进行所需的转化的仍然另一种转移酶是丁酰基-CoA:乙酰乙酸CoA-转移酶。示例性酶可以被发现于具核梭杆菌(Barker等人,J.Bacteriol.152(1):201-7(1982))、梭菌SB4(Barker等人,J.Biol.Chem.253(4):1219-25(1978))和丙酮丁醇梭菌(Wiesenborn等人,Appl.Environ.Microbiol.55(2):323-9(1989))中。虽然在这些文献中没有为丁酰基-CoA:乙酰乙酸CoA-转移酶提供具体的基因序列,但是基因FN0272和FN0273已经被注释为丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶(Kapatral等人,J.Bact.184(7)2005-2018(2002))。具核梭杆菌中的同系物如FN1857和FN1856还可能具有所需的乙酰乙酰基-CoA转移酶活性。FN1857和FN1856被定位于临近参与赖氨酸发酵的许多其他的基因以及因此非常可能编码乙酰乙酸:丁酸CoA转移酶(Kreimeyer,等人,J.Biol.Chem.282(10)7191-7197(2007))。来自牙龈红棕色单胞菌和腾冲嗜热厌氧杆菌的附加候选者可以以类似的方式得以确认(Kreimeyer,等人,J.Biol.Chem.282(10)7191-7197(2007))。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Cat1 | P38946.1 | 729048 | 克鲁佛氏梭菌 |
Cat2 | P38942.2 | 1705614 | 克鲁佛氏梭菌 |
Cat3 | EDK35586.1 | 146349050 | 克鲁佛氏梭菌 |
TVAG_395550 | XP_001330176 | 123975034 | 阴道滴虫G3 |
Tb11.02.0290 | XP_828352 | 71754875 | 布氏锥虫 |
FN0272 | NP_603179.1 | 19703617 | 具核梭杆菌 |
FN0273 | NP_603180.1 | 19703618 | 具核梭杆菌 |
FN1857 | NP_602657.1 | 19705162 | 具核梭杆菌 |
FN1856 | NP_602656.1 | 19705161 | 具核梭杆菌 |
PG1066 | NP_905281.1 | 34540802 | 牙龈红棕色单胞菌W83 |
PG1075 | NP_905290.1 | 34540811 | 牙龈红棕色单胞菌W83 |
TTE0720 | NP_622378.1 | 20807207 | 腾冲嗜热厌氧杆菌MB4 |
TTE0721 | NP_622379.1 | 20807208 | 腾冲嗜热厌氧杆菌MB4 |
相关的额外的转移酶酶类包含来自大肠杆菌的atoAD(Hanai等人,ApplEnviron Microbiol 73:7814-7818(2007))、来自丙酮丁醇梭菌的ctfAB(Jojiman等人,Appl Microbiol Biotechnol 77:1219-1224(2008))和来自糖乙酸多丁醇梭菌的ctfAB(Kosakan等人,Biosci.Biotechnol Biochem.71:58-68(2007))的基因产物。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
AtoA | P76459.1 | 2492994 | 大肠杆菌 |
AtoD | P76458.1 | 2492990 | 大肠杆菌 |
CtfA | NP_149326.1 | 15004866 | 丙酮丁醇梭菌 |
CtfB | NP_149327.1 | 15004867 | 丙酮丁醇梭菌 |
CtfA | AAP42564.1 | 31075384 | 糖乙酸多丁醇梭菌 |
CtfB | AAP42565.1 | 31075385 | 糖乙酸多丁醇梭菌 |
琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶天然地将琥珀酸转化为琥珀酰-CoA同时将3-酮酰基-CoA转化为3-酮酸。示例性琥珀酰-CoA:3:酮酸-CoA转移酶存在于幽门螺杆菌(Corthesy-Theulaz等人,J.Biol.Chem.272:25659-25667(1997))、枯草芽孢杆菌(Stols等人,Protein.Expr.Purif.53:396-403(2007))以及智人(Fukao等人,Genomics 68:144-151(2000);Tanakan等人,Mol.Hum.Reprod.8:16-23(2002))中。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
HPAG1_0676 | YP_627417 | 108563101 | 幽门螺杆菌 |
HPAG1_0677 | YP_627418 | 108563102 | 幽门螺杆菌 |
ScoA | NP_391778 | 16080950 | 枯草芽孢杆菌 |
ScoB | NP_391777 | 16080949 | 枯草芽孢杆菌 |
OXCT1 | NP_000427 | 4557817 | 智人 |
OXCT2 | NP_071403 | 11545841 | 智人 |
催化甲酸到甲酰基-CoA活化反应的两种额外的酶是形成AMP的甲酰基-CoA合成酶以及形成ADP的甲酰基-CoA合成酶。已知作用于乙酸的示例性酶被发现于大肠杆菌(Brown等人,J.Gen.Microbiol.102:327-336(1977))、富养罗尔斯通氏菌(Priefert和Steinbuchel,J.Bacteriol.174:6590-6599(1992))、热自养甲烷杆菌(Ingram-Smith和Smith,Archaea2:95-107(2007))、肠沙门氏菌(Gulick等人,Biochemistry 42:2866-2873(2003))以及酿酒酵母(Jogl和Tong,Biochemistry 43:1425-1431(2004))。这类酶也可以将甲酸天然地酰基化或可以经设计以这样做。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
acs | AAC77039.1 | 1790505 | 大肠杆菌 |
acoE | AAA21945.1 | 141890 | 富养罗尔斯通氏菌 |
acs1 | ABC87079.1 | 86169671 | 热自养甲烷杆菌 |
acs1 | AAL23099.1 | 16422835 | 肠沙门氏菌 |
ACS1 | Q01574.2 | 257050994 | 酿酒酵母 |
形成ADP的乙酰基-CoA合成酶(ACD,EC 6.2.1.13)是将酰基-CoA酯类到其对应的酸的转化与伴随的ATP合成偶联的酶。具有广泛底物特异性的几种酶已经被描述于文献中。由AF1211编码的来自闪烁古生球菌的ACD I显示对各种直链和支链底物(包含乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、丁酰基-CoA、醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、琥珀酸、富马酸、苯基醋酸、吲哚醋酸)起作用(Musfeldt等人,J Bacteriol 184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶(释为琥珀酰-CoA合成酶)接受丙酸、丁酸以及支链酸(异戊酸和异丁酸)作为底物,以及显示按向前和逆向方向运行(Brasen等人,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。由来自超嗜热泉古菌需氧热棒菌的PAE3250编码的ACD显示与乙酰基-CoA、异丁酰基-CoA(优选的底物)以及苯基乙酰基-CoA反应的所有被表征的ACD的最广泛的底物范围(Brasen等人,同上(2004))。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌以及需氧热棒菌的酶均已被克隆,功能表达以及表征于大肠杆菌(Musfeldt等人,同上;Brasen等人,同上(2004))。额外的候选酶包括由大肠杆菌的sucCD编码的琥珀酰-CoA合成酶(Buck等人,Biochemistry 24:6245-6252(1985))以及来自恶臭假单胞菌的酰基-CoA连接酶(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。这类酶也可以将甲酸天然地酰基化或可以经设计以这样做。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
AF1211 | NP_070039.1 | 11498810 | 闪烁古生球菌DSM 4304 |
AF1983 | NP_070807.1 | 11499565 | 闪烁古生球菌DSM 4304 |
scs | YP_135572.1 | 55377722 | 死海盐盒菌ATCC 43049 |
PAE3250 | NP_560604.1 | 18313937 | 需氧热棒菌菌株IM2 |
sucC | NP_415256.1 | 16128703 | 大肠杆菌 |
sucD | AAC73823.1 | 1786949 | 大肠杆菌 |
paaF | AAC24333.2 | 22711873 | 恶臭假单胞菌 |
一种用于将CoA部分添加至甲酸的替代性方法是应用酶对,如磷酸盐-转移酰基转移酶和激酶。这些活性实现了甲酰基-CoA的纯形成,同时消耗ATP。示例性磷酸盐-转移酰基转移酶是由pta编码的磷酸转乙酰酶。来自大肠杆菌的pta基因编码可将乙酰基-CoA转化为乙酰基-磷酸以及将乙酰基-磷酸转化为乙酰基-CoA的酶(Suzuki,T.Biochim.Biophys.Acta 191:559-569(1969))。这种酶还可以利用丙酰基-CoA取代乙酰基-CoA,在工艺中形成丙酸(Hesslinger等人Mol.Microbiol 27:477-492(1998))。同系物存在于包含肠沙门氏菌和短杆菌肽的若干其他的生物体中。这类酶也可以将甲酸天然地磷酸化或可以经设计以这样做。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Pta | NP_416800.1 | 16130232 | 大肠杆菌 |
Pta | NP_461280.1 | 16765665 | 肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2 |
PAT2 | XP_001694504.1 | 159472743 | 短杆菌肽 |
PAT1 | XP_001691787.1 | 159467202 | 短杆菌肽 |
示例性乙酸激酶是由ackA编码的大肠杆菌乙酸激酶(Skarstedt和Silverstein J.Biol.Chem.251:6775-6783(1976))。同系物存在于包含肠沙门氏菌和短杆菌肽的若干其他的生物体中。可能的是,这类酶天然具有甲酸激酶活性或可以经设计以具有这种活性。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
AckA | NP_416799.1 | 16130231 | 大肠杆菌 |
AckA | NP_461279.1 | 16765664 | 肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2 |
ACK1 | XP_001694505.1 | 159472745 | 短杆菌肽 |
ACK2 | XP_001691682.1 | 159466992 | 短杆菌肽 |
甲酸到甲酰基-CoA的酰基化也可以通过甲酸连接酶执行。例如,酿酒酵母的LSC1和LSC2基因以及大肠杆菌的sucC和sucD基因的产物天然地形成琥珀酰-CoA连接酶复合体,该复合体在活体内可逆的反应中,催化琥珀酸形成琥珀酰-CoA并伴随消耗一份ATP(Gruys等人,1999年9月28日提交的美国专利号5,958,745)。这类酶也可以将甲酸天然地酰基化或可以经设计以这样做。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
SucC | NP_415256.1 | 16128703 | 大肠杆菌 |
SucD | AAC73823.1 | 1786949 | 大肠杆菌 |
LSC1 | NP_014785 | 6324716 | 酿酒酵母 |
LSC2 | NP_011760 | 6321683 | 酿酒酵母 |
额外的示例性CoA-连接酶包含其序列仍未得以表征的大鼠二羧酸-CoA连接酶(Vamecq等人,Biochemical J.230:683-693(1985)),两种经表征的来自产黄青霉菌的苯基乙酸-CoA连接酶(Lamas-Maceiras等人,Biochem.J.395:147-155(2005);Wang等人,Biochem Biophy Res Commun360(2):453-458(2007))、来自恶臭假单胞菌的苯基乙酸-CoA连接酶(Martinez-Blanco等人,J.Biol.Chem.265:7084-7090(1990))的任一种,以及来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酸酯-CoA连接酶(Bower等人,J.Bacteriol.178(14):4122-4130(1996))。额外的候选酶是天然地催化乙酰乙酸酯到乙酰乙酰基-CoA的ATP依赖性转化的来自家鼠(Hasegawan等人,Biochim.Biophys.Acta 1779:414-419(2008))和智人(Ohgami等人,Biochem.Pharmacol.65:989-994(2003))的乙酰乙酰基-CoA合成酶。4-羟基丁酰基-CoA合成酶活性已被证实在勤奋生金球菌(Berg等人,Science 318:1782-1786(2007))中。这种功能已被试验地分配给Msed_1422基因。这类酶也可以将甲酸天然地酰基化或可以经设计以这样做。关于这些蛋白质和基因的信息如下所示。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Phl | CAJ15517.1 | 77019264 | 产黄青霉菌 |
PhlB | ABS19624.1 | 152002983 | 产黄青霉菌 |
PaaF | AAC24333.2 | 22711873 | 恶臭假单胞菌 |
BioW | NP_390902.2 | 50812281 | 枯草芽孢杆菌 |
AACS | NP_084486.1 | 21313520 | 家鼠 |
AACS | NP_076417.2 | 31982927 | 智人 |
Msed_1422 | YP_001191504 | 146304188 | 勤奋生金球菌 |
图5,步骤G-甲酰基-CoA还原酶(EFR3)
若干酰基-CoA脱氢酶能够将酰基-CoA(如甲酰基-CoA)还原为其相应的醛(如甲醛)(步骤F,图1)。编码这类酶的示例性基因包含编码脂肪酰基-CoA还原酶(Reiser和Somerville,J.Bacteriol.179:2969-2975(1997)和不动细菌属M-1脂肪酰基-CoA还原酶(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.68:1192-1195(2002))的乙酸钙不动杆菌acr1以及编码CoA-和NADP-依赖性琥珀酸半醛脱氢酶的克鲁佛氏梭菌中sucD基因(Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996);Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.1778:871-880(1996))。牙龈红棕色单胞菌的sucD是另一种琥珀酸半醛脱氢酶(Takahashi等人,J.Bacteriol.182:4704-4710(2000))。由bphG编码的假单胞菌属中将乙醛脱氢酶酰基化的酶也是另一种候选酶,因为它已被证实可将乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛氧化并酰基化(Powlowski等人,J.Bacteriol.175:377-385(1993))。除了将乙酰基-CoA还原为乙醇,由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶已经显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰基-CoA(Kazahayan等人,J.Gen.Appl.Microbiol.18:45-55(1972);Koo等人,Biotechnol.Lett.27:505-510(2005))。丁醛脱氢酶催化生溶剂性生物体,如糖乙酸多丁醇梭菌(Kosakan等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.71:58-68(2007))中的类似反应,丁酰基-CoA到丁醛的转化。额外的醛脱氢酶候选酶被发现于Desulfatibacillum alkenivorans、克氏柠檬酸杆菌、肠沙门氏菌、短乳杆菌和亚硒酸盐还原芽孢杆菌。这类酶或许能够将甲酰基-CoA天然地转化为甲醛或可以经设计以这样做。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
acr1 | YP_047869.1 | 50086355 | 乙酸钙不动杆菌 |
acr1 | AAC45217 | 1684886 | 不动杆菌baylyi |
acr1 | BAB85476.1 | 18857901 | 不动杆菌属菌株M-1 |
sucD | P38947.1 | 172046062 | 克鲁佛氏梭菌 |
sucD | NP_904963.1 | 34540484 | 牙龈红棕色单胞菌 |
bphG | BAA03892.1 | 425213 | 假单胞菌属 |
adhE | AAV66076.1 | 55818563 | 肠膜明串珠菌 |
Bld | AAP42563.1 | 31075383 | 糖乙酸多丁醇梭菌 |
Ald | ACL06658.1 | 218764192 | Desulfatibacillum alkenivorans AK-01 |
Ald | YP_001452373 | 157145054 | 克氏柠檬酸杆菌ATCC BAA-895 |
pduP | NP_460996.1 | 16765381 | 肠沙门氏菌Typhimurium |
pduP | ABJ64680.1 | 116099531 | 短乳杆菌ATCC 367 |
BselDRAFT_1651 | ZP_02169447 | 163762382 | 亚硒酸盐还原芽孢杆菌MLS10 |
额外的将酰基-CoA转化为其相应的醛的酶型是将丙二酰基-CoA转化为丙二酸半醛的丙二酰基-CoA还原酶。丙二酰基-CoA还原酶是在嗜热酸古生细菌中通过3-羟基丙酸循环的自养碳固定中的关键酶(Berg等人,Science 318:1782-1786(2007);Thauer,Science 318:1732-1733(2007))。该酶利用NADPH作为辅因子并已经被表征在生金球菌属和硫化叶菌菌种中(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006);Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。该酶由勤奋生金球菌中的Msed_0709编码(Alber等人,同上(2006);Berg等人,Science 318:1782-1786(2007))。来自硫化叶菌tokodaii的编码丙二酰基-CoA还原酶的基因被克隆并异源表达在大肠杆菌中(Alber等人,J.Bacteriol.188:8551-8559(2006))。这种酶也已显示催化甲基丙二酰基-CoA到其相应的醛的转化(WO 2007/141208(2007))。虽然这些酶的醛脱氢酶功能性与来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶相似,但是几乎没有序列相似性。两种丙二酰基-CoA还原酶候选酶具有相对于天冬氨酸半醛脱氢酶(一种催化天冬氨酰基-4-磷酸到天冬氨酸半醛的还原和同时发生的脱磷酸作用)的高度序列相似性。额外的候选基因可以通过蛋白质序列同源性发现于其他的生物体中,包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌,以及已被列入下文。CoA-酰基化醛脱氢酶的仍然另一候选基因是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth等人,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999))。已有报告称,这种酶将乙酰基-CoA和丁酰基-CoA还原为它们相应的醛。这种基因非常类似于编码鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE(Toth等人,同上)。这类酶或许能够将甲酰基-CoA天然地转化为甲醛或可以经设计以这样做。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Msed_0709 | YP_001190808.1 | 146303492 | 勤奋生金球菌 |
Mcr | NP_378167.1 | 15922498 | 硫化叶菌tokodaii |
asd-2 | NP_343563.1 | 15898958 | 硫磺矿硫化叶菌 |
Saci_2370 | YP_256941.1 | 70608071 | 嗜酸热硫化叶菌 |
Ald | AAT66436 | 9473535 | 拜氏梭菌 |
eutE | AAA80209 | 687645 | 鼠伤寒沙门氏菌 |
eutE | P77445 | 2498347 | 大肠杆菌 |
图5,步骤N-丝氨酸脱氨酶(EFR10)
甲酰四氢叶酸合成酶通过耗费一份ATP而将甲酸连接到四氢叶酸。这种反应由热醋穆尔氏菌中的Moth_0109(O'brien等人,Experientia Suppl.26:249-262(1976);Lovell等人,Arch.Microbiol.149:280-285(1988);Lovell等人,Biochemistry 29:5687-5694(1990))、尿酸梭菌中的FHS(Whitehead和Rabinowitz,J.Bacteriol.167:203-209(1986);Whitehead和Rabinowitz,J.Bacteriol.170:3255-3261(1988))、梭菌carboxidivorans中的CHY_2385(Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005))的基因产物催化。同系物存在于梭菌carboxidivorans P7中。这种酶被发现于如下所列的其他一些生物体中。
图5,步骤I和J-甲酰四氢叶酸合成酶(EFR5)和亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EFR6)
在热醋穆尔氏菌、大肠杆菌和生氢氧化碳嗜热菌中,次甲基四氢叶酸环水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶分别通过Moth_1516、folD和CHY_1878的双功能基因产物执行(Pierce等人,Environ.Microbiol.10:2550-2573(2008);Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005);D'Ari and Rabinowitz,J.Biol.Chem.266:23953-23958(1991))。同系物存在于梭菌carboxidivorans P7中。其他一些生物体也为如下表所示的这种双功能蛋白编码。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Moth_1516 | YP_430368.1 | 83590359 | 热醋穆尔氏菌 |
folD | NP_415062.1 | 16128513 | 大肠杆菌 |
CHY_1878 | YP_360698.1 | 78044829 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CcarbDRAFT_2948 | ZP_05392948.1 | 255526024 | 梭菌carboxidivorans P7 |
folD | ADK16789.1 | 300437022 | 扬氏梭菌DSM 13528 |
folD-2 | NP_951919.1 | 39995968 | 硫还原地杆菌PCA |
folD | YP_725874.1 | 113867385 | 富养罗尔斯通氏菌H16 |
folD | NP_348702.1 | 15895353 | 丙酮丁醇梭菌ATCC 824 |
folD | YP_696506.1 | 110800457 | 产气荚膜梭菌 |
MGA3_09460 | EIJ83438.1 | 387591119 | 甲醇芽孢杆菌MGA3 |
PB1_14689 | ZP_10132349.1 | 387929672 | 甲醇芽孢杆菌PB1 |
图5,步骤K-甲醛形成酶(EFR7)或自发
亚甲基-THF或活性甲醛将自发地分解为甲醛和THF(Thorndike和Beck,Cancer Res.1977,37(4)1125-32;Ordonez和Caraballo,Psychopharmacol Commun.19751(3)253-60;Kallen和Jencks,1966,J BiolChem 241(24)5851-63)。为了实现更高的速率,可以应用甲醛形成酶。这类活性可以通过设计从THF和甲醛供体可逆地形成亚甲基-THF的酶而获得,以释放自由甲醛。这类酶包含甘氨酸分裂系统酶,其天然地将甲醛基团从亚甲基-THF转移到甘氨酸(见针对候选酶的图1步骤L)。额外的酶包含丝氨酸羟甲基转移酶(见针对候选酶的图1步骤M)、二甲基甘氨酸脱氢酶(Porter,等人,Arch Biochem Biophys.1985,243(2)396-407;Brizio等人,2004,(37)2,434–442)、肌氨酸脱氢酶(Porter,等人,Arch Biochem Biophys.1985,243(2)396-407)和二甲基甘氨酸氧化酶(Leys,等人,2003,The EMBOJournal 22(16)4038-4048)。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
dmgo | ZP_09278452.1 | 359775109 | 球形节杆菌 |
dmgo | YP_002778684.1 | 226360906 | 混浊红球菌B4 |
dmgo | EFY87157.1 | 322695347 | 蝗绿僵菌CQMa 102 |
shd | AAD53398.2 | 5902974 | 智人 |
shd | NP_446116.1 | GI:25742657 | 褐鼠 |
dmgdh | NP_037523.2 | 24797151 | 智人 |
dmgdh | Q63342.1 | 2498527 | 褐鼠 |
图5,步骤L-甘氨酸分裂系统(EFR8)
5,10-亚甲基四氢叶酸和CO2到甘氨酸的可逆NAD(P)H依赖性转化由甘氨酸分裂复合物催化,该复合物也被称为甘氨酸分裂系统,由如下四种蛋白质组分组成:P、H、T和L。该甘氨酸分裂复合物参与生物体(如大肠杆菌)中甘氨酸分解代谢和真核生物中甘氨酸生物合成(Kikuchi等人,ProcJpn Acad Ser 84:246(2008))。大肠杆菌的甘氨酸分裂系统由如下四种基因编码的:gcvPHT和lpdA(Okamuran等人,Eur J Biochem 216:539-48(1993);Heil等人,Microbiol 148:2203-14(2002))。按甘氨酸生物合成方向的该甘氨酸分裂系统的活性已经在酿酒酵母活体内得以证实(Maaheimo等人,Eur JBiochem 268:2464-79(2001))。酵母GCV由GCV1、GCV2、GCV3和LPD1编码。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
gcvP | AAC75941.1 | 1789269 | 大肠杆菌 |
gcvT | AAC75943.1 | 1789272 | 大肠杆菌 |
gcvH | AAC75942.1 | 1789271 | 大肠杆菌 |
lpdA | AAC73227.1 | 1786307 | 大肠杆菌 |
GCV1 | NP_010302.1 | 6320222 | 酿酒酵母 |
GCV2 | NP_013914.1 | 6323843 | 酿酒酵母 |
GCV3 | NP_009355.3 | 269970294 | 酿酒酵母 |
LPD1 | NP_116635.1 | 14318501 | 酿酒酵母 |
图5,步骤M-丝氨酸羟甲基转移酶(EFR9)
甘氨酸到丝氨酸的转化通过丝氨酸羟甲基转移酶(也称为甘氨酸羟甲基转移酶)催化。这种酶将甘氨酸和5,10-亚甲基四氢叶酸可逆地转化为丝氨酸和THF。丝氨酸甲基转移酶具有若干副反应,包含3-羟基酸到甘氨酸和醛的可逆分裂,以及5,10-次甲基-THF到5-甲酰基-THF的水解。这种酶由大肠杆菌的glyA编码(Plamann等人,Gene 22:9-18(1983))。酿酒酵母的丝氨酸羟甲基转移酶包含SHM1(线粒体)和SHM2(细胞溶质)(McNeil等人,J Biol Chem 269:9155-65(1994))。已经对谷氨酸棒杆菌和扭脱甲基杆菌中的类似的酶进行了研究(Chistoserdovan等人,J Bacteriol 176:6759-62(1994);Schweitzer等人,J Biotechnol 139:214-21(2009))。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
glyA | AAC75604.1 | 1788902 | 大肠杆菌 |
SHM1 | NP_009822.2 | 37362622 | 酿酒酵母 |
SHM2 | NP_013159.1 | 6323087 | 酿酒酵母 |
glyA | AAA64456.1 | 496116 | 扭脱甲基杆菌 |
glyA | AAK60516.1 | 14334055 | 谷氨酸棒杆菌 |
图5,步骤N-丝氨酸脱氨酶(EFR10)
丝氨酸可以通过丝氨酸脱氨酶而脱氨基化为丙酮酸。丝氨酸脱氨酶酶类存在于若干生物体中,包括尿酸梭菌(Carter,等人,1972,J Bacteriol.,109(2)757-763)、大肠杆菌(Cicchillo等人,2004,J Biol Chem.,279(31)32418-25)和棒状杆菌属(Netzer等人,Appl Environ Microbiol.2004Dec;70(12):7148-55)。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
sdaA | YP_490075.1 | 388477887 | 大肠杆菌 |
sdaB | YP_491005.1 | 388478813 | 大肠杆菌 |
tdcG | YP_491301.1 | 388479109 | 大肠杆菌 |
tdcB | YP_491307.1 | 388479115 | 大肠杆菌 |
sdaA | YP_225930.1 | 62390528 | 棒状杆菌属 |
图5,步骤O-亚甲基四氢叶酸还原酶(EFR11)
在热醋穆尔氏菌中,这种酶是对氧敏感的并包含铁-硫簇(Clark和Ljungdahl,J.Biol.Chem.259:10845-10849(1984)。这种酶由大肠杆菌中的metF(Sheppard等人,J.Bacteriol.181:718-725(1999)和生氢氧化碳嗜热菌中的CHY_1233(Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005)编码。该热醋穆尔氏菌基因及其生氢氧化碳嗜热菌对应物位于由推定氢化酶和杂二硫化物还原酶基因分离的CODH/ACS基因簇附近。生物信息学上发现的一些附加候选基因在下面列出。在伍氏醋酸杆菌中,metF通过RnfC2被偶联到Rnf复合物(Poehlein等人,PLoS One.7:e33439)。RnfC的同系物通过BLAST搜索被发现于其他生物体中。已知Rnf复合物是可逆的复合物(Fuchs(2011)Annu.Rev.Microbiol.65:631-658)。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Moth_1191 | YP_430048.1 | 83590039 | 热醋穆尔氏菌 |
Moth_1192 | YP_430049.1 | 83590040 | 热醋穆尔氏菌 |
metF | NP_418376.1 | 16131779 | 大肠杆菌 |
CHY_1233 | YP_360071.1 | 78044792 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CLJU_c37610 | YP_003781889.1 | 300856905 | 扬氏梭菌DSM 13528 |
DesfrDRAFT_3717 | ZP_07335241.1 | 303248996 | 食果糖脱硫弧菌JJ |
CcarbDRAFT_2950 | ZP_05392950.1 | 255526026 | 梭菌carboxidivoransP7 |
Ccel74_010100023124 | ZP_07633513.1 | 307691067 | 食纤维梭菌743B |
Cphy_3110 | YP_001560205.1 | 160881237 | 梭菌phytofermentans ISDg |
图5,步骤P-乙酰基-CoA合酶(EFR12)
乙酰基-CoA合成酶是Wood-Ljungdahl途径的羰基分支的中心酶。它催化了从一氧化碳,辅酶A以及来自甲基化类咕啉-铁-硫蛋白的甲基基团到乙酰基-CoA的合成。该类咕啉-铁-硫蛋白经由甲基转移酶通过甲基四氢叶酸甲基化。外来宿主中的表达必然伴有引入一种或多种下列蛋白及其相应的活性:甲基四氢叶酸:类咕啉蛋白甲基转移酶(AcsE)、类咕啉铁-硫蛋白(AcsD)、镍-蛋白装配蛋白(AcsF)、铁氧化还原蛋白(Orf7)、乙酰基-CoA合成酶(AcsB和AcsC)、一氧化碳脱氢酶(AcsA)和镍-蛋白装配蛋白(CooC)。
用于一氧化碳脱氢酶/乙酰基-CoA合成酶活性的基因典型地他停留在可以是扩展的操纵子的天然基因组的有限区域中(Ragsdale,S.W.,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.39:165-195(2004);Morton等人,J.Biol.Chem.266:23824-23828(1991);Roberts等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:32-36(1989)。来自产乙酸菌热醋穆尔氏菌的这种操纵子中的每种基因已被克隆并积极地表达于大肠杆菌中(Morton等人,同上;Roberts等人,同上;Lus等人,J.Biol.Chem.268:5605-5614(1993)。这些基因的蛋白质序列可以通过以下GenBank登录号得以确认。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
AcsE | YP_430054 | 83590045 | 热醋穆尔氏菌 |
AcsD | YP_430055 | 83590046 | 热醋穆尔氏菌 |
AcsF | YP_430056 | 83590047 | 热醋穆尔氏菌 |
Orf7 | YP_430057 | 83590048 | 热醋穆尔氏菌 |
AcsC | YP_430058 | 83590049 | 热醋穆尔氏菌 |
AcsB | YP_430059 | 83590050 | 热醋穆尔氏菌 |
AcsA | YP_430060 | 83590051 | 热醋穆尔氏菌 |
CooC | YP_430061 | 83590052 | 热醋穆尔氏菌 |
类氢细菌生氢氧化碳嗜热菌可以通过乙酰基-CoA合成酶将一氧化碳用作培育衬底(Wu等人,PLoS Genet.1:e65(2005))。在菌株Z-2901中,乙酰基-CoA合成酶复合物由于移码突变而缺乏一氧化碳脱氢酶(Wu等人,同上(2005)),而在菌株DSM 6008中,功能性未移码的全长型式的蛋白质已经被纯化(Svetlitchnyi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:446-451(2004))。来自菌株Z-2901的生氢氧化碳嗜热菌基因的蛋白质序列可以通过以下GenBank登录号得以确认。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
AcsE | YP_360065 | 78044202 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
AcsD | YP_360064 | 78042962 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
AcsF | YP_360063 | 78044060 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
Orf7 | YP_360062 | 78044449 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
AcsC | YP_360061 | 78043584 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
AcsB | YP_360060 | 78042742 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
CooC | YP_360059 | 78044249 | 生氢氧化碳嗜热菌 |
同源ACS/CODH基因也可以被发现于梭菌carboxidivorans P7的草拟基因组组装中。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
AcsA | ZP_05392944.1 | 255526020 | 梭菌carboxidivorans P7 |
CooC | ZP_05392945.1 | 255526021 | 梭菌carboxidivorans P7 |
AcsF | ZP_05392952.1 | 255526028 | 梭菌carboxidivorans P7 |
AcsD | ZP_05392953.1 | 255526029 | 梭菌carboxidivorans P7 |
AcsC | ZP_05392954.1 | 255526030 | 梭菌carboxidivorans P7 |
AcsE | ZP_05392955.1 | 255526031 | 梭菌carboxidivorans P7 |
AcsB | ZP_05392956.1 | 255526032 | 梭菌carboxidivorans P7 |
Orf7 | ZP_05392958.1 | 255526034 | 梭菌carboxidivorans P7 |
产甲烷古细菌噬乙酸甲烷八叠球菌还可以生长在一氧化碳上,显示出乙酰基-CoA合酶/一氧化碳脱氢酶活性,以及生产乙酸和甲酸两者(Lessner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:17921-17926(2006))。这种生物体包含编码ACS/CODH活性的两组基因(Rother和Metcalf,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:16929-16934(2004))。两组噬乙酸甲烷八叠球菌基因的蛋白质序列可以通过以下GenBank登录号得以确认。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
AcsC | NP_618736 | 20092661 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsD | NP_618735 | 20092660 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsF,CooC | NP_618734 | 20092659 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsB | NP_618733 | 20092658 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsEps | NP_618732 | 20092657 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsA | NP_618731 | 20092656 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsC | NP_615961 | 20089886 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsD | NP_615962 | 20089887 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsF,CooC | NP_615963 | 20089888 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsB | NP_615964 | 20089889 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsEps | NP_615965 | 20089890 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsA | NP_615966 | 20089891 | 噬乙酸甲烷八叠球菌 |
AcsC、AcsD、AcsB、AcsEps和AcsA蛋白质通常被称为产甲烷CODH/ACS的γ、δ、β、ε和α亚基。ε编码基因的同系物不存在于产乙酸菌(如热醋穆尔氏菌)或产氢细菌(如生氢氧化碳嗜热菌)中。噬乙酸甲烷八叠球菌中存在两种活性CODH/ACS操纵子的假设包含催化性能(即Km、Vmax、Kcat),该性能有利于实现各种刺激物以诱发CODH/ACS表达的氧化碳嗜热菌或解乙酸菌培育或差异基因调控(Rother等人,Arch.Microbiol.188:463-472(2007))。
图5,步骤Q-丙酮酸甲酸裂解酶(EFR13)
由大肠杆菌中的pflB编码的丙酮酸甲酸裂解酶(PFL,EC 2.3.1.54)可以将丙酮酸转化为乙酰基-CoA和甲酸。PFL的活性可以通过由pflA编码的活化酶提高(Knappe等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 81:1332-1335(1984);Wong等人,Biochemistry 32:14102-14110(1993))。酮酸甲酸裂解酶(EC2.3.1.-),也被称为2-丁酮酸甲酸-裂解酶(KFL)和丙酮酸甲酸-裂解酶4是大肠杆菌中tdcE的基因产物。这种酶在厌氧的苏氨酸降解期间催化2-丁酮酸转化为丙酰基-CoA和甲酸,以及也可以在厌氧的分解代谢中取代丙酮酸甲酸裂解酶(Simanshu等人,J Biosci.32:1195-1206(2007))。该酶是对氧敏感的以及,像PflB,可能需要通过PFL-AE的翻译后修饰以在活性位点活化甘氨酰基(Hesslinger等人,Mol.Microbiol 27:477-492(1998))。由pflD编码的来自Archaeglubus fulgidus的丙酮酸甲酸裂解酶已被克隆,表达于大肠杆菌以及被表征(Lehtio等人,Protein Eng Des Sel 17:545-552(2004))。晶体结构的Archaeglubus fulgidus和大肠杆菌酶已被拆分(Lehtio等人,J Mol.Biol.357:221-235(2006);Leppanen等人,Structure.7:733-744(1999))。额外的PFL和PFL-AE候选酶被发现于乳酸乳球菌(Melchiorsen等人,Appl Microbiol Biotechnol 58:338-344(2002))和变异链球菌(Takahashi-Abbe等人,Oral.Microbiol Immunol.18:293-297(2003))、短杆菌肽(Hemschemeier等人,Eukaryot.Cell 7:518-526(2008b);Atteian等人,J.Biol.Chem.281:9909-9918(2006))和巴斯德氏梭菌(Weidner等人,JBacteriol.178:2440-2444(1996))中。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
pflB | NP_415423 | 16128870 | 大肠杆菌 |
pflA | NP_415422.1 | 16128869 | 大肠杆菌 |
tdcE | AAT48170.1 | 48994926 | 大肠杆菌 |
pflD | NP_070278.1 | 11499044 | Archaeglubus fulgidus |
Pfl | CAA03993 | 2407931 | 乳酸乳球菌 |
Pfl | BAA09085 | 1129082 | 变异链球菌 |
PFL1 | XP_001689719.1 | 159462978 | 短杆菌肽 |
pflA1 | XP_001700657.1 | 159485246 | 短杆菌肽 |
Pfl | Q46266.1 | 2500058 | 巴斯德氏梭菌 |
Act | CAA63749.1 | 1072362 | 巴斯德氏梭菌 |
图5,步骤R-丙酮酸脱氢酶(EFR14A)、丙酮酸铁氧化还原蛋白氧化还原酶(EFR14B)、丙酮酸:NADP+氧化还原酶(EFR14C)
丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物催化丙酮酸到乙酰基-CoA的转化(图2H)。大肠杆菌PDH复合物由基因aceEF和lpdA编码。酶工程努力已经改善了厌氧条件下的大肠杆菌PDH酶活性(Kim等人,J.Bacteriol.190:3851-3858(2008);Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007);Zhou等人,Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。与大肠杆菌PDH形成对照,枯草芽孢杆菌复合物具有活性并为厌氧条件下的培育所需(Nakano等人,179:6749-6755(1997))。在甘油上培育期间表征的肺炎克雷伯氏菌PDH在厌氧条件下也具有活性(Menzel等人,56:135-142(1997))。来自牛肾(Zhou等人,98:14802-14807(2001))的晶体结构的酶复合物以及来自维涅兰德固氮菌的E2催化域是可得的(Mattevi等人,Science.255:1544-1550(1992))。一些哺乳动物PDH酶复合物可以在替换底物(如2-氧代丁酸酯)上反应。褐鼠PDH和BCKAD的比较动力学表示,BCKAD对作为底物的2-氧代丁酸酯具有更高的活性(Paxton等人,Biochem.J.234:295-303(1986))。酿酒酵母PDH复合物可以由结合E1(PDA1,PDB1)、E3(LPD1)和蛋白质X(PDX1)组分的E2(LAT1)核组成(Pronk等人,Yeast 12:1607-1633(1996))。酿酒酵母的该PDH复合物通过涉及PKP1(PDH激酶I)、PTC5(PDH磷酸酶I)、PKP2和PTC6的E1的磷酸化进行调节。这些调节剂的修饰还可以提高PDH活性。细胞溶质中硫辛酰连接酶(大肠杆菌的LplA和酿酒酵母中的AIM22)与PDH的共表达可能是活化该PDH酶复合物所必须的。通过修饰代谢途径或用硫辛酸补充培养基而增加胞质硫辛酸的提供也可以改善PDH活性。
基因 | 登录号 | GI号 | 生物体 |
aceE | NP_414656.1 | 16128107 | 大肠杆菌 |
aceF | NP_414657.1 | 16128108 | 大肠杆菌 |
lpd | NP_414658.1 | 16128109 | 大肠杆菌 |
lplA | NP_418803.1 | 16132203 | 大肠杆菌 |
pdhA | P21881.1 | 3123238 | 枯草芽孢杆菌 |
pdhB | P21882.1 | 129068 | 枯草芽孢杆菌 |
pdhC | P21883.2 | 129054 | 枯草芽孢杆菌 |
pdhD | P21880.1 | 118672 | 枯草芽孢杆菌 |
aceE | YP_001333808.1 | 152968699 | 肺炎克雷伯氏菌 |
aceF | YP_001333809.1 | 152968700 | 肺炎克雷伯氏菌 |
lpdA | YP_001333810.1 | 152968701 | 肺炎克雷伯氏菌 |
Pdha1 | NP_001004072.2 | 124430510 | 褐鼠 |
Pdha2 | NP_446446.1 | 16758900 | 褐鼠 |
Dlat | NP_112287.1 | 78365255 | 褐鼠 |
Dld | NP_955417.1 | 40786469 | 褐鼠 |
LAT1 | NP_014328 | 6324258 | 酿酒酵母 |
PDA1 | NP_011105 | 37362644 | 酿酒酵母 |
PDB1 | NP_009780 | 6319698 | 酿酒酵母 |
LPD1 | NP_116635 | 14318501 | 酿酒酵母 |
PDX1 | NP_011709 | 6321632 | 酿酒酵母 |
AIM22 | NP_012489.2 | 83578101 | 酿酒酵母 |
一些生物体将2-酮酸氧化还原酶家族(OFOR)中的酶用作上述大型多酶PDH复合物的替代以催化2-酮酸的酰基化氧化脱羧作用。与该PDH复合物不同,PFOR酶包含铁-硫簇,利用不同的辅因子以及将铁氧化还原蛋白或黄素氧化还原蛋白用作电子受体而取代NAD(P)H。丙酮酸铁氧化还原蛋白氧化还原酶(PFOR)可以催化丙酮酸的氧化以形成乙酰基-CoA(图2H)。来自非洲脱硫弧菌的PFOR已被克隆以及表达于大肠杆菌,产生当存在氧时保持数日稳定的活性重组酶(Pieulle等人,J Bacteriol.179:5684-5692(1997))。PFOR中氧稳定性比较少见以及认为,氧稳定性的赋予通过非洲脱硫弧菌酶的多肽链中的60残基延伸而实现。热醋穆尔氏菌PFOR也被很好地表征(Menon等人,Biochemistry 36:8484-8494(1997))以及甚至显示在自养生长期间在丙酮酸合成的方向上具有高活性(Furdui等人,JBiol Chem.275:28494-28499(2000))。进一步,大肠杆菌具有未表征的开放阅读框架ydbK,其编码与热醋穆尔氏菌PFOR具有51%一致性的蛋白质。已经对大肠杆菌中丙酮酸氧化还原酶活性的证据进行描述(Blaschkowski等人,Eur.J Biochem.123:563-569(1982))。几种附加PFOR酶被描述于Ragsdale,Chem.Rev.103:2333-2346(2003)。最后,黄素氧化还原蛋白还原酶(例如,来自幽门螺杆菌或空肠弯曲杆菌的fqrB)(St Maurice等人,J.Bacteriol.189:4764-4773(2007)))或Rnf型蛋白质(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U S.A.105:2128-2133(2008);Herrmann等人,J.Bacteriol.190:784-791(2008))提供一种从PFOR生成的被还原的铁氧化还原蛋白生成NADH或NADPH的手段。这些蛋白质确认如下。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
Por | CAA70873.1 | 1770208 | 非洲脱硫弧菌 |
Por | YP_428946.1 | 83588937 | 热醋穆尔氏菌 |
ydbK | NP_415896.1 | 16129339 | 大肠杆菌 |
fqrB | NP_207955.1 | 15645778 | 幽门螺杆菌 |
fqrB | YP_001482096.1 | 157414840 | 空肠弯曲杆菌 |
RnfC | EDK33306.1 | 146346770 | 克鲁佛氏梭菌 |
RnfD | EDK33307.1 | 146346771 | 克鲁佛氏梭菌 |
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
RnfG | EDK33308.1 | 146346772 | 克鲁佛氏梭菌 |
RnfE | EDK33309.1 | 146346773 | 克鲁佛氏梭菌 |
RnfA | EDK33310.1 | 146346774 | 克鲁佛氏梭菌 |
RnfB | EDK33311.1 | 146346775 | 克鲁佛氏梭菌 |
丙酮酸:NADP氧化还原酶(PNO)催化丙酮酸到乙酰基-CoA的转化。这种酶由单一的基因编码以及活性酶酶是均二聚体,与上述的多亚基PDH酶复合物形成对比。来自薄肌眼虫的该酶通过其辅因子硫胺素焦磷酸得以稳定(Nakazawan等人,Arch Biochem Biophys 411:183-8(2003))。这种酶的线粒体靶向序列可被去除以表达于细胞溶质中。薄肌眼虫的PNO蛋白质和其他的NADP依赖性丙酮酸:NADP+氧化还原酶酶被列入下表中。
蛋白质 | GenBank ID | GI号 | 生物体 |
PNO | Q94IN5.1 | 33112418 | 薄肌眼虫 |
cgd4_690 | XP_625673.1 | 66356990 | 隐孢子虫parvum Iowa II |
TPP_PFOR_PNO | XP_002765111.11 | 294867463 | 海洋伯金斯虫ATCC 50983 |
图5,步骤-甲酸脱氢酶(EFR15)
甲酸脱氢酶(FDH)催化电子从甲酸到受体的可逆转移。具有FDH活性的酶利用各种电子载体,例如(作为举例)NADH(EC 1.2.1.2)、NADPH(EC 1.2.1.43)、醌醇(EC 1.1.5.6)、细胞色素(EC 1.2.2.3)和氢化酶(EC1.1.99.33)。来自热醋穆尔氏菌的FDH酶已被表征(Andreesen和Ljungdahl,J Bacteriol 116:867-873(1973);Li等人,J Bacteriol 92:405-412(1966);Yamamoto等人,J Biol Chem.258:1826-1832(1983))。基因座Moth_2312负责编码甲酸脱氢酶的α亚基而β亚基由Moth_2314编码(Pierce等人,EnvironMicrobiol(2008))。编码具有CO2还原倾向的甲酸脱氢酶活性的另一组基因由互营杆菌fumaroxidans中的Sfum_2703到Sfum_2706编码(de Bok等人,Eur J Biochem.270:2476-2485(2003));Redan等人,PNAS 105:10654-10658(2008))。推定执行相同功能的类似基因组由生氢氧化碳嗜热菌中的CHY_0731、CHY_0732和CHY_0733编码(Wu等人,PLoS Genet 1:e65(2005))。甲酸脱氢酶也被发现于许多额外的生物体中,包括梭菌carboxidivorans P7、甲醇芽孢杆菌、稳定伯克霍尔德氏菌、热醋穆尔氏菌ATCC 39073、博伊丁假丝酵母、假丝酵母methylica和酿酒酵母S288C。来自富养罗尔斯通氏菌的可溶性甲酸脱氢酶还原NAD+(fdsG、-B、-A、-C、-D)(Oh和Bowien,1998)。
*****
本申请通篇中已经引用了各种出版物。本申请中特此以引用方式并入这些出版物披露的全文(包括GenBank和GI号码公布),以便更充分地描述本发明所属的现有技术水平。虽然已经就上文提供的实施例对本发明进行了描述,但是应该理解的是,在不脱离本发明精神的情况下,可以作出各种修改。
Claims (23)
1.一种非天然存在的微生物体(NNOMO),包含:
(A)甲醇代谢途径(MMP),其中所述生物体包含编码MMP酶(MMPE)的至少一种外源性核酸,所述酶以足够的量被表达以提高在甲醇的存在下还原当量的可用性,其中所述MMP包括:
(i)甲醇脱氢酶(EM9);
(ii)EM9和甲醛活化酶(EM10);或
(iii)甲醇甲基转移酶(EM1)和亚甲基四氢叶酸还原酶(EM2);以及
(B)(i)己二酸途径(AdiP),
(ii)6-氨基己酸酯(6-ACA)途径(6-ACAP),
(iii)六亚甲基二胺(HMDA)途径(HMDAP)或
(iv)己内酰胺途径(CapP)。
2.根据权利要求1所述的生物体,其中
(a)所述生物体包含AdiP,以及其中
(1)所述生物体包含编码AdiP酶(AdiPE)的至少一种外源性核酸,所述酶以足够的量被表达以生产己二酸,其中所述AdiP包含(i)3-氧代己二酰基-CoA硫解酶(EA1);(ii)3-氧代己二酰基-CoA还原酶(EA2);(iii)3-羟基己二酰基-CoA脱水酶(EA3);(iv)5-羧基-2-戊烯酰基-CoA还原酶(EA4);以及(v)己二酰基-CoA水解酶(EA11A)、己二酰基-CoA连接酶(EA11B)、己二酰基-CoA转移酶(EA11C)或磷酸转己二酰酶/己二酸激酶(EA11D),
(2)所述生物体包含两种、三种、四种或五种外源性核酸,每种均编码AdiPE;和/或
(3)编码AdiPE的所述至少一种外源性核酸是异源性核酸;
(b)所述生物体包含6-ACAP,以及其中
(1)所述生物体包含编码6-ACAP酶(6-ACAPE)的至少一种外源性核酸,所述酶以足够的量被表达以生产6-ACA,其中所述6-ACAP包含(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)己二酰基-CoA还原酶(醛形成)(EA5);以及(vi)6-ACA转氨酶(EA6A)或6-ACA脱氢酶(EA6B);
(2)所述生物体包含两种、三种、四种,五种或六种外源性核酸,每种均编码6-ACAPE;和/或
(3)编码6-ACAPE的所述至少一种外源性核酸是异源性核酸;
(c)所述生物体包括HMDAP,以及其中
(1)所述生物体包含编码HMDA途径酶(HMDAPE)的至少一种外源性核酸,所述酶以足够的量被表达以生产HMDA,其中所述HMDAP包含(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;(vi)EA6A或EA6B;(vii)6-氨基己酰基-CoA/酰基-CoA转移酶(EA7A)或6-氨基己酰基-CoA合酶(EA7B);(viii)6-氨基己酰基-CoA还原酶(醛形成)(EA9);以及(ix)HMDA转氨酶(EA10A)或HMDA脱氢酶(EA10B);
(2)所述生物体包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种外源性核酸,每种均编码HMDAPE;和/或
(3)编码HMDAPE的所述至少一种外源性核酸是异源性核酸;或
(d)所述生物体包含CapP,以及其中
(1)所述生物包含编码CapP酶(CapPE)的至少一种外源性核酸,所述酶以足够的量被表达以生产己内酰胺,其中所述CapP包含
(a)(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;(vi)EA6A或EA6B;以及(vii)EA7A或EA7B;或
(b)(i)EA1;(ii)EA2;(iii)EA3;(iv)EA4;(v)EA5;(vi)EA6A或EA6B;以及(vii)酰胺水解酶(EA8);
其中所述CapP可选地进一步包括将6-氨基己酰基-CoA转化为己内酰胺的自发的环化作用;
(2)所述生物包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种均编码CapPE;和/或
(3)编码CapPE的所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
3.根据权利要求1或2所述的生物体,其中,所述MMP包含:
(i)EM1、EM2、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EM3)、次甲基四氢叶酸环水解酶(EM4)和甲酰四氢叶酸去甲酰酶(EM5);
(ii)EM1、EM2、EM3、EM4和甲酰四氢叶酸合成酶(EM6);
(iii)EM9、EM3、EM4和EM5;
(iv)EM9、EM3、EM4和EM6;
(v)EM9和甲醛脱氢酶(EM11);
(vi)EM9、S-(羟甲基)谷胱甘肽合酶(EM12)、EM13和S-甲酰基谷胱甘肽水解酶(EM14);
(vii)EM9、EM13和EM14;
(viii)EM9、EM10、EM3、EM4和EM5;或
(ix)EM9、EM10、EM3、EM4和EM6;
其中,所述MMP可选地进一步包含(i)甲酸脱氢酶(EM8);(ii)甲酸氢化酶(EM15);或(iii)EM15和EM16。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的生物体,其中:
(a)所述生物体包含两种、三种、四种、五种、六种或七种外源性核酸,每种均编码MMPE;和/或
(b)编码MMPE的所述至少一种外源性核酸是异源性核酸。
(c)所述生物体包含一种或多种基因破坏,其中所述一种或多种基因破坏发生在编码参与所述微生物对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种蛋白质或酶的一种或多种内源性基因,以及其中所述一种或多种基因破坏带来了所述微生物体中增加的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺产量。
(d)参与:所述微生物体对乙醇、甘油、乙酸、乳酸、甲酸、CO2和/或氨基酸的天然生产的一种或多种内源性酶具有减毒的酶活性或表达水平。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的生物体,进一步包含甲醛同化途径(FAP),其中所述生物体包含编码FAP酶(FAPE)的至少一种外源性核酸,所述酶以足够的量被表达以生产糖酵解的中间体和/或可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体,以及其中
(A)(i)所述FAP包含6-磷酸己酮糖(H6P)合成酶(EF1)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(EF2);
(ii)所述FAP包含二羟基丙酮(DHA)合成酶(EF3)以及可选地进一步包括DHA激酶(EF4);或
(iii)所述FAP包括EF1、EF2、EF3以及可选地进一步EF4;和/或所述中间体可选地是(i)H6P、6-磷酸果糖(F6P)或其组合;或(ii)DHA、DHAP或其组合;以及/或
(C)所述生物体可选地包含两种外源性核酸,每种均编码FAPE。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的生物体,其中
(a)所述至少一种外源性核酸是异源性核酸;
(b)所述生物体在基本上厌氧的培养基中;和/或
(c)所述生物体是细菌属、酵母属或真菌属。
7.一种用于生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的方法,包括在各种条件下培养权利要求1至6中任一项所述的生物体达到足以生产己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的时间段;
(i)其中所述方法可选地进一步包括将所述己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺与培养物中的其他组分分离,其中所述分离可选地包括萃取法、
连续液液萃取法、全蒸发法、膜滤法、膜分离法、反渗透法、电渗析法、蒸馏法、结晶法、离心法、萃取过滤法、离子交换色谱法、体积排阻色谱法、吸附色谱法或超滤法;和/或
(ii)其中所述生物体可选地是Crabtree阳性的真核生物,以及其中所述生物体被培养于包括葡萄糖的培养基中。
8.一种生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其中间体,其根据权利要求7的方法生产;
其中,所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺可选地具有反映大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率;和/或所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺可选地具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值。
9.一种包含权利要求8所述的所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的培养基,其中
所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺可选地具有反映大气二氧化碳摄取源的碳-12、碳-13和碳-14同位素比率;
所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺可选地具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的Fm值;和/或
所述培养基可选地与具有AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP的NNOMO分离。
10.一种包含权利要求8所述的所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的组合物和一种非所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的化合物;
其中,所述非所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺的化合物可选地是一种具有AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP的NNOMO的痕量细胞部分。
11.一种生物基产品,其包含权利要求8所述的所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其中间体。
12.根据权利要求11所述的生物基产品,其中,所述生物来源的或生物基产品如下,其中所述生物来源的或生物基产品选自如下:聚合物、塑料、环氧树脂、尼龙、尼龙-6、尼龙6-6、纺织品、聚氨酯、增塑剂、不饱和聚酯、纤维、聚酯多元醇、聚氨酯、润滑剂成分、PVC、食品添加剂、食品成分、调味剂、凝胶佐剂、食品、口服或其他药物包衣,以及口服或其他药物产品;或者其任何组合。
13.权利要求11或12所述的生物基产品,其中所述生物基产品包含
(a)至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺;以及/或
(b)作为重复单元的一部分所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺。
14.一种通过模制权利要求11至13中任一项所述的生物基产品获得的模制的产品。
15.一种用于生产权利要求11至13中任一项所述的生物基产品的方法,包括在生产所述生物基产品的反应中,使所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺与自身或另一化合物发生化学反应。
16.一种包含权利要求8所述的所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或通过其转化而获得的聚合物。
17.一种用于生产聚合物的方法,包括将权利要求8所述的所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺化学或酶转化为所述聚合物。
18.一种包含权利要求8所述的所述生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或其细胞裂解物或培养上清液的组合物。
19.一种生产甲醛的方法,其包括在各种条件下培养权利要求1至6中任一项所述的生物体达足以生产甲醛的时间段;以及可选地其中所述甲醛被消耗以提供还原当量或掺入生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或目的产品。
20.一种生产糖酵解的中间体和/或可以被用于生物质的形成的代谢途径的中间体的方法,包括在各种条件下培养权利要求5或6中任一项所述的生物体达到足以生产所述中间体的时间段以及可选地其中所述中间体被消耗以提供还原当量或掺入生物来源的己二酸、6-ACA、HMDA或己内酰胺或目的产品。
21.根据权利要求19或20所述的方法,其中,所述生物体被培养于包括生物质、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油、甲醇、二氧化碳、甲酸、甲烷或其任何组合作为碳源的培养基中。
22.根据权利要求1至6中任一项所述的生物体,其中,所述AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP进一步包括(i)PEP羧化酶(EFR16A)或PEP羧基激酶(EFR16B);(ii)丙酮酸羧化酶(EFR17);(iii)苹果酸脱氢酶(EFR18);(iv)苹果酸酶(EFR19);以及/或(v)富马酸酶(EFR20A)、富马酸还原酶(EFR20B)、琥珀酰-CoA合成酶(EFR20C)、琥珀酰-CoA连接酶(EFR20D)或琥珀酰-CoA转移酶(EFR20E);其中可选地所述AdiP、6-ACAP、HMDAP或CapP包括(1)(i)EFR16A或EF16B;(ii)EFR18;以及(iii)EFR20A、EFR20B、EFR20C、EFR20D或EFR20E;(2)(i)EFR17、(ii)EFR18以及(iii)EFR20A、EFR20B、EFR20C、EFR20D或EFR20E;或(3)(i)EFR19和(ii)EFR20A、EFR20B、EFR20C、EFR20D或EFR20E。
23.根据权利要求1至6或22中任一项所述的生物体,其进一步包括甲酸再利用途径(FRP),以及其中:
(i)所述生物体包括编码FRP酶(FRPE)的至少一种外源性核酸,所述酶以足够的量被表达以生产甲醛、丙酮酸或乙酰基-CoA,其中所述FRP包括:(1)甲酸还原酶(EFR1);(2)(i)甲酸连接酶(EFR2A)、甲酸转移酶(EFR2B)或甲酸合成酶(EFR2C)和(ii)甲酰基-CoA还原酶(EFR3);(3)(i)甲酰四氢叶酸合成酶(EFR4);(ii)次甲基四氢叶酸环水解酶(EFR5);(iii)亚甲基四氢叶酸脱氢酶(EFR6)和(iv)甲醛形成酶(EFR7)或自发;(6)(i)EFR4、(ii)EFR5、(iii)EFR6、(iv)甘氨酸分裂系统(EFR8)、(v)丝氨酸羟甲基转移酶(EFR9)和(vi)丝氨酸脱氨酶(EFR10);(7)(i)EFR1、(ii)EFR4、(iii)EFR5、(iv)EFR6、(v)EFR8、(vi)EFR9和(vii)EFR10;(8)(i)EFR2A、EFR2B或EFR2C;(ii)EFR3;(iii)EFR4;(iv)EFR5;(v)EFR6;(vi)EFR8;(vii)EFR9和(viii)EFR10;(9)(i)EFR7或自发的;(ii)EFR4;(iii)EFR5;(iv)EFR6;(v)EFR8;(vi)EFR9和(vii)EFR10;以及(10)(i)EFR4;(ii)EFR5;(iii)EFR6;(iv)亚甲基四氢叶酸还原酶(EFR11)和(v)乙酰基-CoA合酶(EFR12);
(ii)所述生物体包括两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种外源性核酸,每种均编码FRPE;和/或
(iii)编码FRPE的所述至少一种外源性核酸是异源性核酸;
其中,可选地所述FRP进一步包括(i)丙酮酸甲酸裂解酶(EFR13);(ii)丙酮酸脱氢酶(EFR14A)、丙酮酸铁氧化还原蛋白氧化还原酶(EFR14B)或丙酮酸:NADP+氧化还原酶(EFR14C);(iii)甲酸脱氢酶(EFR15);或(iv)EFR14A、EFR14B或EFR14C;以及EFR15。
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